Yöntem makalesi

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

843 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68677

⸱

15 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Özet

İnsülin reseptörleri (IR'ler) tüm dokularda ve tüm hücre tiplerinde yaygın olarak eksprese edilir. Alternatif ekzon 11 eklemesi nedeniyle 12 amino asit ile farklılık gösteren, işlevsel olarak farklı iki izoformda - IR-A ve IR-B - bulunur. Bu izoformlar, gelişim, yaşlanma ve hastalık boyunca değişen nispi bollukları ile dokuya ve hücreye özgü ekspresyon modelleri sergiler. Yüksek dizi benzerlikleri nedeniyle, geleneksel immünolojik yöntemler kullanılarak IR-A ve IR-B'yi ayırt etmek zor olmuştur. Burada, dokuda IR-A ve IR-B ekspresyonunun görselleştirilmesini sağlayan yeni bir Dubleks in situ hibridizasyon (ISH) testini açıklıyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, her iki izoformun da murin koroid pleksusunda eksprese edilirken, IR-A'nın baskın olduğunu ilk kez gösterdik. Bu yöntem, insülin reseptörü izoformlarının farklı dokular arasında in situ mekansal dağılımını araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Gerçek zamanlı qPCR, tek hücreli in vitro kültürlerde IR-A ve IR-B transkriptlerini tespit edebilirken, karmaşık dokular içinde uzamsal lokalizasyon kapasitesinden yoksundur, bu da Duplex ISH tekniğinin gerekliliğini ve faydasını vurgular.

Giriş

İnsülin reseptörü (IR), insülinin çeşitli fizyolojik etkilerine aracılık eden tek geçişli bir transmembran enzimatik reseptördür. Her bir monomerin bir disülfid bağı ile bağlanmış iki peptit zincirinden oluştuğu bir dimerik protein olarak işlev görür: Ligand bağlama alanını içeren hücre dışı α-alt birim ve hücre içi dizisi içsel tirozin kinaz aktivitesine sahip olan transmembran β-alt birim1. Ekzon 11'in alternatif eklenmesi yoluyla, IR geninin transkripsiyonu iki IR mRNA varyantına yol açar. IR-A, ekzon 11'den yoksundur, IR-B ise onu korur. Sonuç olarak, IR-A ve IR-B, α-alt biriminin C-terminaline yakın bir 12-amino asit dizisi ile farklılık gösterir, bu da olgun insülinin yanı sıra büyüme faktörlerinin farklı bağlanmasına ve değişen aşağı akış sinyalleme özelliklerine neden olur. Her iki varyant da insülin için benzer afinite sergilerken, IR-A, IR-B'ye kıyasla insülin benzeri büyüme faktörü-II (IGF-II) ve proinsülin için daha yüksek bir afiniteye sahiptir. IR-A ve IR-B'nin ekspresyon paternleri, doku ve hücre tipine ve hastalık durumuna2 bağlı olarak değişir.

Dokulardaki ve hastalıklardaki farklı ifadeleri, fizyoloji ve patolojiye benzersiz katkılarının altını çizer. Beyin omurilik sıvısı (BOS) üreten ve kan-BOS bariyerinin bir parçasını oluşturan özel bir yapı olan koroid pleksus (CP), özellikle iltihaplanma sırasında besin taşınması, atık temizleme ve nöroproteksiyonda kritik bir rol oynar. Her iki IR izoformu da CP'de ifade edilir, burada muhtemelen BOS hacmini ve bileşimini düzenlerler. IR-A, IGF-II tarafından yüksek afiniteli bağlanması yoluyla, muhtemelen CP epitelinde hücresel proliferasyonu ve doku onarımını teşvik eder. Öte yandan IR-B, kan-BOS bariyeri boyunca insülin taşınmasında rol oynar ve astrositler, nöronlar, glia ve glikoz homeostazı için beyinde insülin mevcudiyetini destekler 3,4.

Pre-diyabetik IR seviyeleri, Alzheimer hastalığı (AD) için genetik risk altında olan asemptomatik bireylerde yüksek BOS tau ile ilişkilendirilmiştir5 ve IR-A / IR-B oranındaki değişiklikler insülin direnci, yaşlanma ve kansere ve diğer patolojilere katkıda bulunabilecek artmış proliferatif aktivite faktörleri ile ilişkilendirilmiştir6. IR-A ve IR-B'nin izoforma özgü ekspresyon paternlerinin belirlenmesi, karmaşık merkezi sinir sistemi bozuklukları için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yönelik kritik bir adımı temsil eder. Bununla birlikte, immün boyama ve qPCR gibi mevcut yaklaşımlar sınırlıdır: Doğrulanmış antikorların eksikliği nedeniyle tüm proteinler güvenilir bir şekilde immüno-etiketli olamaz ve qPCR oldukça spesifik olsa da, uzamsal çözünürlükten yoksundur.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, RNAscope platformu BaseScope'a dayalı gelişmiş bir RNA algılama teknolojisi olan Duplex in situ hibridizasyonun (ISH) kullanılmasını kullandık. Bu test, hedef RNA'ya tandem bağlanma gerektiren benzersiz bir çift-Z prob tasarımı kullanır ve düşük bolluktaki transkriptler için bile yüksek özgüllük ve hassasiyet sağlar. Floresan veya kromojenik sinyal, çoklu prob bağlama olayları yoluyla güçlendirilir, bu da algılamayı geliştirir ve arka planı azaltır7. Standart RNAscope'tan farklı olarak, bu test kısa RNA dizilerini (50-300 baz) tespit etmek için optimize edilmiştir, bu da onu alternatif birleştirme olaylarını, tek nükleotid varyantlarını ve beyin gibi karmaşık dokulardaki nadir transkriptleri tanımlamak için özellikle uygun hale getirir8.

Bu test, hedefleri parlak alan altında aynı anda farklı yeşil (C1) ve kırmızı (C2) kromojenik sinyaller olarak görselleştirir. %4 paraformaldehit (PFA) veya %10 nötral tamponlu formalin (NBF) içinde sabitlenmiş ve 5 μm-15 μm'de (dondurulmuş/FFPE) kesitli, düşük-yüksek bollukta RNA içeren dokular kullanılarak başarı sağlar. RNA bozunması, aşırı fiksasyon ve prob hatalarına karşı hassasiyet nedeniyle, özgüllüğü en üst düzeye çıkarmak ve arka planı en aza indirmek için ön arıtmayı, prob tasarımını ve kontrolleri optimize etmemiz gerekiyor. Burada, murin CP'sindeki IR-A ve IR-B'nin ekspresyon modellerini karakterize etmek için bu Dubleks ISH testini uyguladık ve IR izoformlarının mekansal biyolojisi ve beyin sağlığı ve hastalığındaki olası rolleri hakkında yeni bilgiler sunduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından tamamen akredite edilmiş olan Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller, NIA Intramural Araştırma Programı (IRP/NIA) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Fareler, 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında, aksi belirtilmedikçe suya ve standart yemeğe ad libitum erişimi olan sıcaklık kontrollü bir tesiste barındırıldı. C57BL / 6J erkek fareler Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi ve 3-4 aylıkken deneyler için kullanıldı.

1. Sabit donmuş numune hazırlama

  1. Fareyi 1x PBS'de taze hazırlanmış %4 PFA ile perfüze edin ve tüm beyni 4 °C'de 17-24 saat boyunca taze hazırlanmış %4 PFA'ya yerleştirin.
    NOT: Doku, 24 saatten fazla olmamak üzere% 4 PFA'ya (her beyin için 10 mL) yerleştirilir.
  2. Dokuyu kabın dibine batana kadar 4 ° C'de 1x PBS'de% 10 (10 mL) sükroz içine daldırın. Daha sonra dokuyu sırayla %20 sükroza ve son olarak %30 sükroza aktarın ve her adımda batmasına izin verin.
    NOT: Dokunun batması için gereken süre doku tipine ve boyutuna göre değişir. Beyin dokusu için yaklaşık 18 saat sürer.
  3. Dokuyu OCT gömme ortamında dondurun ve doku bloklarını -80 °C'de hava geçirmez bir kapta saklayın.
  4. Korontal olarak formaldehitle sabitlenmiş donmuş beyin dokularını 10 μm'lik dilimler halinde ayırın ve kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Bölümleri pozitif yüklü mikroskop slaytlarına monte edin; Diğer slayt tipleri doku kaybına neden olabilir. Slaytlar hemen kullanılmayacaksa, -80 °C'de 3 aya kadar saklayın.

2. Dubleks tespit testinden önce bölüm ön işlemi

  1. Tahlil gününde, slaytları 1x PBS'de 5 dakika boyunca yıkayın, kalan OCT'yi çıkarmak için sürgülü rafı hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirin.
  2. Slaytları 60 °C'de 30 dakika pişirin.
  3. Slaytları 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1x PBS'de önceden soğutulmuş% 4 PFA'da sonradan sabitleyin.
  4. Slaytları bir EtOH serisi aracılığıyla sırayla aktarın: RT'de 5 dakika boyunca %50 EtOH, RT'de 5 dakika boyunca %70 EtOH, RT'de 5 dakika boyunca %100 EtOH, RT'de 5 dakika boyunca tekrar %100 EtOH.
  5. RT'de 5 dakika boyunca havayla kuruyan slaytlar.
  6. Her bölüme 2-4 damla hidrojen peroksit uygulayın ve RT'de 10 dakika inkübe edin. Damıtılmış su ile bir kez durulayın.
  7. Bir beherde 700 mL taze 1x Hedef Alma solüsyonu hazırlayın. Folyo ile örtün ve tutarlı bir kaynama noktasına getirin (99–100 °C).
    NOT: Kullanmadan önce 30 dakikadan fazla kaynatmayın. Bu arada fırını ( Malzeme Tablosuna bakın) 40 °C'ye ısıtın.
  8. Sürgülü rafı dikkatlice kaynayan Hedef Alma çözeltisine daldırın ve 5 dakika inkübe edin. Sıcaklığı 98–102 °C arasında tutun ve yakından izleyin.
    NOT: Doku tipine bağlı olarak kaynama süresinin ayarlanması (5–15 dk) gerekebilir.
  9. Sıcak sürgülü rafı hemen damıtılmış su dolu bir tabağa aktarın ve rafı 3-5 kat yukarı ve aşağı hareket ettirin. Taze damıtılmış su ile tekrarlayın.
  10. Slaytları taze %100 EtOH ile durulayın, 3–5 kat yukarı ve aşağı hareket ettirin. Havayla kuruyan slaytlar.
  11. Her doku bölümünün etrafını 2-3 kez çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Bariyerin RT'de tamamen kurumasını bekleyin.
  12. Slaytları Toplu Slayt Tepsisi'ne yerleştirin. Her bölüme Proteaz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve dokunun tamamen kaplandığından emin olun. 40 °C fırında 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Proteaz inkübasyon süresi, doku tipine ve hedef gene bağlı olarak ayarlama gerektirebilir.
  13. Sürgülü tepsiyi fırından çıkarın ve damıtılmış suya koyun. Slaytları 2 dakika boyunca yukarı ve aşağı hareket ettirerek nazikçe yıkayın, bu adımı taze damıtılmış su ile 2x tekrarlayın.

3. Dubleks algılama testi

  1. Sonda
    1. Pozitif ve negatif kontrol probları için iki ek bölüm hazırlayın.
    2. Hedef prob ile aynı sayıda ZZ çiftine sahip kontrol problarını seçin. 1 ZZ çifti için bir Pozitif kontrol ve bir Negatif kontrol kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    3. Kullanmadan önce, probları 40 °C'de 10 dakika dengeleyin ve AMP1-12 reaktiflerini RT'ye getirin.
  2. Prob Hibridizasyonu,
    1. C2 probunu kısa bir süre aşağı çevirin ve C1 probu ile 1:50 oranında karıştırın. Her bölümü tamamen kaplayacak kadar prob (100–200 μL) karışımı ekleyin ve slaytları 40 °C'de 2 saat fırında inkübe edin. Slaytları RT'de 1x Yıkama tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    2. Temel Kapsam Dubleks AMP1 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP1 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    3. Temel Kapsam Dubleks AMP2 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP2 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    4. Temel Kapsam Dubleks AMP3 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP3 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
        NOT: 15 dakikalık inkübasyon süresini aşmayın.
    5. Temel Kapsam Dubleks AMP4 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP4 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    6. Temel Kapsam Dubleks AMP5 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP5 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    7. Temel Kapsam Dubleks AMP6 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP6 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
        NOT: AMP3'e gelince, 15 dakikalık inkübasyon süresini aşmayın.
    8. Temel Kapsam Dubleks AMP7 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP7 (100–200 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
        1. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
          NOT: AMP7 ile oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
    9. Temel Kapsam Dubleks AMP8 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP8 (100–200 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
        NOT: RT'de 15 dakika boyunca AMP8 inkübasyonu ile inkübe edin.
    10. Kırmızı Sinyal Algılama (C2)
      1. Fast Red-B'yi kısaca döndürün ve Fast Red-A ile 1:60 oranında karıştırın.
      2. Her bölüme (100–200 μL) uygulayın, tepsiyi örtün ve karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin.
      3. 1x yıkama tamponunda 2 kez yıkayın.
        NOT: 5 dakika içinde karışık Hızlı Kırmızı çözelti kullanın. Işıktan (güneş ışığı veya UV) koruyun.
    11. Temel Kapsam Dubleks AMP9 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP9 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    12. Temel Kapsam Dubleks AMP10 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP10 (100–200 μL) ekleyin. Fırına geri dönün ve 40 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
    13. Temel Kapsam Dubleks AMP11 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP11 (100–200 μL) ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
        NOT: AMP11 ile RT'de 30 dakika inkübe edin.
    14. Temel Kapsam Dubleks AMP12 Uygulaması
      1. Slaytlardaki fazla yıkama tamponunu çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde AMP12 (100–200 μL) ekleyin. RT'de 15 dakika inkübe edin.
      2. 1x Yıkama Tamponunda 2 x 2 dakika yıkayın.
        NOT: 15 dakikalık inkübasyon süresini aşmayın.
    15. Yeşil Sinyal Algılama (C1)
      1. Fast Green-B tüpünü kısaca döndürün ve Fast Green-A ile 1:50 oranında karıştırın.
      2. YEŞİL solüsyonu her bölüme (100–200 μL) uygulayın, tepsiyi kapatın ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
      3. 1x Yıkama Tamponunda 5 dakika yıkayın ve damıtılmış suda kısa bir süre durulayın.
        NOT: 5 dakika içinde karışık Hızlı Yeşil çözelti kullanın. Işıktan koruyun. Yeşil B'nin A'ya oranı 1:50'dir. Hem KIRMIZI hem de YEŞİL yüzeyler alkole duyarlıdır. Alkol içeren herhangi bir reaktif kullanmayın.

4. Karşı leke

  1. Slaytları, bölümler mor görünene kadar RT'de 1 dakika boyunca% 50 Hematoksilen boyama çözeltisine daldırın.
  2. Musluk suyunda yukarı ve aşağı hareket ettirerek 3–5 kez durulayın. Arka plan temizlenene kadar taze musluk suyuyla tekrarlayın, ancak bölümler mor kalır.
  3. Slaytları %0,02 Amonyak suyuna batırın, bölümler maviye dönene kadar 3 kez yukarı ve aşağı kaydırın.
  4. Musluk suyunda 3–5 kez tekrar durulayın.

5. Montaj

  1. Slaytları 60 °C kuru fırında ~15 dakika tamamen kurulayın.
  2. Slaytları taze ksilene batırın.
    NOT: Montaj ortamı oldukça viskoz olduğundan, montajdan önce ksilene kısa bir daldırma, ortamın doku bölümü boyunca daha düzgün yayılmasını kolaylaştırır ve lamel altında hava kabarcıklarının oluşumunu azaltır.
  3. Kabarcıkları önleyerek sürgü ve lamel üzerine montaj ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın.
  4. Slaytları en az 5 dakika havayla kurutun.

6. Örnekleri değerlendirin

  1. Kesitleri standart bir parlak alan mikroskobu altında 20x veya 40x büyütmede görüntüleyin. (Şekil 1).
    NOT: Pozitif kontroller hücrelerde noktalama işaretleri göstermelidir. 20x büyütmede 20 hücre başına 1'den fazla nokta yoksa negatif kontroller kabul edilebilir.

7. Puanlama (isteğe bağlı)

  1. Hücre başına RNA noktalarını ölçmek için görüntü analiz yazılımı (örneğin, Halo veya QuPath) kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsülin reseptörü (IR), fonksiyonel bir heterotetramer oluşturan iki hücre dışı α-alt birim ve iki transmembran β-alt birimden oluşan bir transmembran tirozin kinaz reseptörüdür. α-alt birimler insülin bağlanmasına aracılık ederken, β-alt birimler, aşağı akış sinyalizasyonunu başlatan içsel tirozin kinaz aktivitesine sahiptir. Ekzon 11'in IR mRNA alternatif eklenmesi, IR, IR-A ve IR-B'nin iki izoformunu üretir. Bu nedenle, IR-B, α-alt biriminin C-terminal bölgesi içinde ekzon 11 tarafında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Beyinde, insülin reseptörlerinin (IR) ekspresyonu heterojendir ve koku soğanı, hipotalamus, hipokampus ve koroid pleksus10 gibi bölgelerde yüksek yoğunluklar gözlenir. Belirli beyin bölgelerindeki ve hücre tiplerindeki varyant ekspresyon modellerinin kapsamlı karakterizasyonu, insülin ve IGF-II sinyalinin sinaptik plastisite, öğrenme ve hafızadaki spesifik rollerini incelememizi ve anlamamızı sağlayan çok önemli bilgiler sağlayacaktır12. Ek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Intramural Araştırma Programı/Ulusal Yaşlanma Enstitüsü/Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amonyum SuyuElektron Mikroskobu Bilimi 26754-4A
BaseScope Dulplex Tespit Reaktifi KitiACD Biyografisi323810
BaseScope Dulplex Duplex Pozitif Kontrol Sondası- Fare(mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZACD Biyografisi700121
BaseScope Dulplex Duplex Pozitif Kontrol Probu-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZACD Biyografisi700141
Gill Hematoksilen ISigma-AldrichGHS132-1L
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488DavetliA32731 Serisi
HybEZ FIRIN, Tepsi, Sepet ve Yıkama TepsisiACD Biyografisi321721, 310012, 321716, 321717
ImmEdge Hidrofobik Bariyer KalemiVektör LaboratuvarıH-4000 Serisi
INSR izoform A ve B probları: BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2ACD Biyografisi717411, 717421-C2
İnsülin Reseptör antikoruHücre Sinyalizasyonu 23413
RNAscope 10x Hedef HedeflemeACD Biyografisi322000
RNAscope Hidrojen Peroksit, Proteaz PlusACD Biyografisi322381
Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) 20xFisher BilimselBP1325-1 Serisi
SuperFrost Plus slaytlarıFisher Bilimsel12-550-18
VectaMount Kalıcı Montaj OrtamıVektör LaboratuvarıH-5000 Serisi

Kaynaklar

  1. Häring, H. U. The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance. Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).
  2. Benecke, H., Flier, J. S., Moller, D. E. Alternatively spliced variants of the insulin receptor protein: expression in normal and diabetic human tissues. J Clin Invest. 89 (6), 2066-2070 (1992).
  3. Vella, V., Malaguarnera, R., Nicolosi, M. L., Morrione, A., Belfiore, A. Insulin/IGF signalling and discoidin domain receptors: an emerging functional connection. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (11), 118522(2019).
  4. Galal, M. A., et al. Insulin receptor isoforms and insulin growth factor-like receptors: implications in cell signaling, carcinogenesis, and chemoresistance. Int J Mol Sci. 24 (19), 15006(2023).
  5. Starks, E. J., et al. Insulin resistance is associated with higher cerebrospinal fluid tau levels in asymptomatic APOEɛ4 carriers. J Alzheimers Dis. 46 (2), 525-533 (2015).
  6. Belfiore, A., et al. Insulin receptor isoforms in physiology and disease: an updated view. Endocr Rev. 38 (5), 379-431 (2017).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. https://acdbio.com/basescope-duplex-assay (2025).
  9. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074.e21 (2021).
  10. Schulingkamp, R. J., Pagano, T. C., Hung, D., Raffa, R. B. Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Biobehav Rev. 24 (8), 855-872 (2000).
  11. Milstein, J. L., Ferris, H. A. The brain as an insulin-sensitive metabolic organ. Mol Metab. 52, 101234(2021).
  12. Moruzzi, N., et al. Tissue-specific expression of insulin receptor isoforms in obesity/type 2 diabetes mouse models. J Cell Mol Med. 25 (10), 4800-4813 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ns lin Resept r zoformlarIR AIR BD pleks ISHRNA Hibritleme AnaliziKoroid PleksusUzamsal Gen Ekspresyonu

İlgili makaleler