Yöntem makalesi
Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.
İnsülin reseptörleri (IR'ler) tüm dokularda ve tüm hücre tiplerinde yaygın olarak eksprese edilir. Alternatif ekzon 11 eklemesi nedeniyle 12 amino asit ile farklılık gösteren, işlevsel olarak farklı iki izoformda - IR-A ve IR-B - bulunur. Bu izoformlar, gelişim, yaşlanma ve hastalık boyunca değişen nispi bollukları ile dokuya ve hücreye özgü ekspresyon modelleri sergiler. Yüksek dizi benzerlikleri nedeniyle, geleneksel immünolojik yöntemler kullanılarak IR-A ve IR-B'yi ayırt etmek zor olmuştur. Burada, dokuda IR-A ve IR-B ekspresyonunun görselleştirilmesini sağlayan yeni bir Dubleks in situ hibridizasyon (ISH) testini açıklıyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, her iki izoformun da murin koroid pleksusunda eksprese edilirken, IR-A'nın baskın olduğunu ilk kez gösterdik. Bu yöntem, insülin reseptörü izoformlarının farklı dokular arasında in situ mekansal dağılımını araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Gerçek zamanlı qPCR, tek hücreli in vitro kültürlerde IR-A ve IR-B transkriptlerini tespit edebilirken, karmaşık dokular içinde uzamsal lokalizasyon kapasitesinden yoksundur, bu da Duplex ISH tekniğinin gerekliliğini ve faydasını vurgular.
İnsülin reseptörü (IR), insülinin çeşitli fizyolojik etkilerine aracılık eden tek geçişli bir transmembran enzimatik reseptördür. Her bir monomerin bir disülfid bağı ile bağlanmış iki peptit zincirinden oluştuğu bir dimerik protein olarak işlev görür: Ligand bağlama alanını içeren hücre dışı α-alt birim ve hücre içi dizisi içsel tirozin kinaz aktivitesine sahip olan transmembran β-alt birim1. Ekzon 11'in alternatif eklenmesi yoluyla, IR geninin transkripsiyonu iki IR mRNA varyantına yol açar. IR-A, ekzon 11'den yoksundur, IR-B ise onu korur. Sonuç olarak, IR-A ve IR-B, α-alt biriminin C-terminaline yakın bir 12....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm hayvan prosedürleri, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından tamamen akredite edilmiş olan Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller, NIA Intramural Araştırma Programı (IRP/NIA) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Fareler, 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında, aksi belirtilmedikçe suya ve standart yemeğe ad libitum erişimi olan sıcaklık kontrollü bir tesiste barındırıldı. C57BL / 6J erkek fareler Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi ve 3-4 aylıkken deneyler için kul....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
İnsülin reseptörü (IR), fonksiyonel bir heterotetramer oluşturan iki hücre dışı α-alt birim ve iki transmembran β-alt birimden oluşan bir transmembran tirozin kinaz reseptörüdür. α-alt birimler insülin bağlanmasına aracılık ederken, β-alt birimler, aşağı akış sinyalizasyonunu başlatan içsel tirozin kinaz aktivitesine sahiptir. Ekzon 11'in IR mRNA alternatif eklenmesi, IR, IR-A ve IR-B'nin iki izoformunu üretir. Bu nedenle, IR-B, α-alt biriminin C-terminal bölgesi içinde ekzon 11 tarafında.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Beyinde, insülin reseptörlerinin (IR) ekspresyonu heterojendir ve koku soğanı, hipotalamus, hipokampus ve koroid pleksus10 gibi bölgelerde yüksek yoğunluklar gözlenir. Belirli beyin bölgelerindeki ve hücre tiplerindeki varyant ekspresyon modellerinin kapsamlı karakterizasyonu, insülin ve IGF-II sinyalinin sinaptik plastisite, öğrenme ve hafızadaki spesifik rollerini incelememizi ve anlamamızı sağlayan çok önemli bilgiler sağlayacaktır12. Ek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu çalışma Intramural Araştırma Programı/Ulusal Yaşlanma Enstitüsü/Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amonyum Suyu | Elektron Mikroskobu Bilimi | 26754-4A | |
| BaseScope Dulplex Tespit Reaktifi Kiti | ACD Biyografisi | 323810 | |
| BaseScope Dulplex Duplex Pozitif Kontrol Sondası- Fare(mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZ | ACD Biyografisi | 700121 | |
| BaseScope Dulplex Duplex Pozitif Kontrol Probu-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZ | ACD Biyografisi | 700141 | |
| Gill Hematoksilen I | Sigma-Aldrich | GHS132-1L | |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488 | Davetli | A32731 Serisi | |
| HybEZ FIRIN, Tepsi, Sepet ve Yıkama Tepsisi | ACD Biyografisi | 321721, 310012, 321716, 321717 | |
| ImmEdge Hidrofobik Bariyer Kalemi | Vektör Laboratuvarı | H-4000 Serisi | |
| INSR izoform A ve B probları: BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2 | ACD Biyografisi | 717411, 717421-C2 | |
| İnsülin Reseptör antikoru | Hücre Sinyalizasyonu | 23413 | |
| RNAscope 10x Hedef Hedefleme | ACD Biyografisi | 322000 | |
| RNAscope Hidrojen Peroksit, Proteaz Plus | ACD Biyografisi | 322381 | |
| Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) 20x | Fisher Bilimsel | BP1325-1 Serisi | |
| SuperFrost Plus slaytları | Fisher Bilimsel | 12-550-18 | |
| VectaMount Kalıcı Montaj Ortamı | Vektör Laboratuvarı | H-5000 Serisi |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste