Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Özet

Bu protokol, çift katmanlı bir mikroakışkan çip üretmek ve hızlı oksijen salınımları altında mikrobiyal büyümeyi analiz etmek için bir yöntem sunar. Cihazın performansı, sıvı kanallarında oksijen algılama ve mikrobiyal yetiştirme yoluyla doğrulandı.

Özet

Hızlandırılmış mikroskopi ile birleştirilmiş mikroakışkanlar kullanan mikrobiyal tek hücreli analiz, geleneksel yetiştirme ve analitik platformlardan elde edilemeyen içgörüler sunarak, mekansal-zamansal çözünürlüğe sahip kapalı ortamlarda mikrobiyal büyüme davranışını araştırmak için umut vaat ediyor. Oksijen, mikrobiyal büyümenin belirlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, mikroakışkanlar kullanılarak yapılan mikrobiyal analizde saniye aralığında zamansal kontrol uygulanmamıştır. Kısa bir süre önce, onlarca saniye aralığında geçici oksijen kontrolü sağlayan çift katmanlı bir PDMS mikroakışkan çip geliştirdik. Çip, gazlama için bir üst katman ve yetiştirme ve sıvı perfüzyonu için bir alt katman içerir. İki katman, ince bir ara PDMS membranı ile ayrılır ve iki katman arasında hızlı gaz değişimine izin verir. Bu metodolojik makalede, çip üretimi, karakterizasyonu ve çip kullanılarak mikrobiyal yetiştirme prosedürünü açıklıyoruz. Temsili sonuçlar olarak, onlarca saniyede hızlı oksijen değiştirme kabiliyetini, mikrobiyal ekimi ve sabit ve salınımlı oksijen koşulları altında zamana bağlı büyüme analizini gösteriyoruz. Bu protokol, mikroakışkan kurulumlarında temporal oksijen kontrolünü uygulamakla ilgilenen araştırmacılara yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Oksijen, özellikle oksidatif stres tepkisi, demir homeostazı ve patojenik enfeksiyonlar gibi hücresel süreçleri etkileyen çeşitli çevresel faktörler arasında mikrobiyal büyüme ve fizyoloji ile yakından bağlantılıdır ^1,2,3. Geleneksel olarak, mikrobiyal yetiştirme, ortam koşulları altında veya belirli oksijen seviyelerinde minimum kontrol ile gerçekleştirilmiştir. Öte yandan, gerçekçi senaryolarda, oksijen ortamları çoğu durumda genellikle sabit değildir, ancak zaman içinde dalgalanır. Örneğin, mikroplar, sıvı hareketi ve mikrobiyal^{hareketlilik nedeniyle} çevrede hareket ederken sucul sistemlerde saniyeler ila dakikalar içinde değişen oksijen seviyelerine maruz kalabilirler^. Benzer şekilde, endüstriyel biyoreaktörler de yetersiz karıştırma nedeniyle homojen olmayan oksijen ortamları oluşturur, bu da mikrobiyal büyümeyi ve nihai verimi etkiler ^7,8. Bu tür dinamik koşullara mikrobiyal tepkileri incelemek, ekolojik süreçleri anlamak ve biyoteknolojik uygulamaları geliştirmek için hayati önem taşır.

Escherichia coli (E. coli) gibi fakültatif anaeroblar, oksijen mevcudiyetine bağlı olarak aerobik ve anaerobik yollar arasında geçiş yapabilir ^9,10. Önceki araştırmalar bu metabolik uyarlanabilirliği araştırmış olsa da, çoğu çalışma, mikropların sıklıkla karşılaştığı hızlı değişiklikleri kopyalayamayan^geleneksel yetiştirme sistemlerini kullanan tek oksijen kaymalarına odaklanmaktadır 9,11,12,13,14. Sonuç olarak, mikropların sık sık değişen oksijen seviyelerine fizyolojik olarak nasıl tepki verdiğine dair sınırlı bir anlayış vardır.

Belirtildiği gibi, geleneksel laboratuvar kurulumları, hızlı oksijen dalgalanmalarını taklit etmek için gereken hassasiyet ve hızdan yoksundur ve sürekli, yüksek çözünürlüklü izlemeyi desteklemez. Bunu ele almak için, yakın zamanda hızlı oksijen kontrolüne ve tek hücreli görüntülemeye izin veren çift katmanlı polidimetilsiloksan (PDMS) çipine sahip özel bir mikroakışkan platform geliştirdik¹⁵. Burada, hızlı oksijen salınımları oluşturan ve kontrollü oksijen koşulları altında mikrobiyal tek hücreli büyüme analizine olanak tanıyan çift katmanlı bir mikroakışkan çip üretmek için protokoller sunuyoruz. Çip iki katmandan oluşur - gaz perfüzyonu için bir üst katman ve sıvı perfüzyonu ve mikrobiyal yetiştirme için bir alt katman. İki katman arasındaki ara ince zar, hızlı gaz değişimine izin verir. Bir gösteri olarak, E. coli MG1655 geliştirilen çipte yetiştirildi. Sabit ve salınımlı oksijen koşulları altındaki büyüme analiz edildi.

Protokol

1. Kalıp hazırlama

1. 3D baskı ile üst katman için bir kalıp hazırlayın. Elde edilen PDMS üst tabakasının pürüzsüz bir yüzeyini sağlamak için üst tabaka kalıbını pürüzsüz bir yüzeyle imal edin. Stereolitografi (SLA) 3D baskı kullanmanızı öneririz.
   1. Kalıbı 3D CAD yazılımı ile tasarlayın (Şekil 1A). Tasarımın, alttaki sıvı kanallarıyla örtüşen gaz kanalları içerdiğinden emin olun. Bu tasarım sürecini, alt katmanı tasarlamaya paralel olarak gerçekleştirin (adım 1.2.1).
   2. SLA 3D baskı kullanarak kalıbı yazdırın. Kalan reçineyi baskılı kalıptan çıkarın ve 30 dakika boyunca bir izopropil alkol (IPA) banyosunda yıkayın (Şekil 1B).
   3. Reçine tipine ve geometrisine bağlı olarak kalıbı uygun süre ve sıcaklıkta 405 nm ışığa maruz bırakarak kürleme sonrası gerçekleştirin.
   4. Kalıpta kalan kürlenmemiş reçineyi çıkarmak için kalıbın bir ultrason banyosunda 15 dakika IPA'da ıslanmasına izin verin, aksi takdirde PDMS kürlenmesini engelleyebilir.
2. Alt tabaka için bir silikon gofret kalıbı hazırlayın.
   1. Mikroakışkan çipi CAD düzen editörü ile tasarlayın (Şekil 1C). Tasarımın girişleri, sıvı kanallarını ve çıkışları içerdiğinden emin olun.
   2. Önceki makalede açıklandığı gibi iki katmanlı fotolitografi kullanarak bir silikon gofret kalıbı oluşturun (Şekil 1D)¹⁶.
      NOT: Alt katmandaki kanallar μm boyutundadır ve hassas imalat gerektirirken, üst katmandaki kanallar mm boyutundadır. SLA 3D baskı, daha kısa üretim süresi ve dolayısıyla daha hızlı prototipleme sunduğundan, SLA baskı, üst katman kalıbı için oldukça büyük yapılar imal etmek için kullanıldı. Alt katman, hassas imalatı sağlamak için fotolitografi ile üretildi. Üst katmandaki kanalların da μm aralığında olması ve hassasiyet gerektirmesi durumunda, fotolitografi kullanarak da bir kalıp üretmeyi düşünün.

2. PDMS çift katmanlı mikroakışkan çip imalatı

1. Baz ve kürleme maddesini 10:1 oranında iyice karıştırarak PDMS ön kürleme solüsyonunu hazırlayın. Karışımı 1 saat boyunca bir desikatörde gazdan arındırın.
2. Üst tabaka kalıbını IPA ile temizleyin ve basınçlı hava kullanarak kurulayın.
3. PDMS'yi üst katman kalıbına dökün, ardından 80 °C'de 20 dakika süreyle termal kürleme yapın (1^{. kürleme} adımı, Şekil 1E). 1^{. kürleme} adımı, tam olarak kürlenmemişken PDMS'nin soyulmasına, kesilmesine ve delinmesine izin verir.
4. 20 dakikalık ısıtmadan sonra PDMS'nin yapışkanlığını elle veya cımbızla kontrol edin. PDMS hala yapışkansa, ısıtma süresini ayarlayın.
5. PDMS'yi üst katman kalıbından soyun ve tek parçalar halinde kesin (burada 20 mm x 18 mm). Gaz girişleri için zımba delikleri (çap = 0,75 mm) (Şekil 1F). IPA ile durulayarak, basınçlı hava ile kurutarak ve yapışkan bant yapıştırarak üst tabakanın alt yüzeyini temizleyin.
6. Alt tabaka kalıbını IPA ile temizleyin ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Alt katman kalıbını bir spin kaplayıcı üzerine sabitleyin ve kalıbın ortasına PDMS'yi dökün. Hava kabarcıklarını azaltmak için PDMS'yi gofretin yakınına dökün. PDMS döküldükten sonra herhangi bir hava kabarcığı bulunursa, temiz cımbız veya iğneler kullanarak bunları dış tarafa doğru hareket ettirin.
7. PDMS'yi alt katman kalıbına 1000 sn boyunca 60 rpm'de döndürün, ardından 80 °C'de 10 dakika boyunca termal kürleme yapın (1^{. kürleme} adımı, Şekil 1G). 10 dakika sonra PDMS yapışkanlığını elle veya cımbızla kontrol edin ve gerekirse ısıtma süresini ayarlayın.
8. Üst katman PDMS parçalarını kalıp üzerindeki alt PDMS katmanına yerleştirin ve üst ve alt katmanların yüzey tutturmasını sağlamak için üstten sıkıca bastırın (Şekil 1H).
9. PDMS'yi en az 1 saat (2^{. kürleme} adımı) 80 °C'de tamamen termal olarak kürleyin. 2^{. kürleme} adımı, üst ve alt katmanların geri dönüşümsüz bir şekilde birbirine bağlandığı son PDMS kürlemesine izin verir (Şekil 1H).
10. PDMS alt tabakasını yavaşça parçalara ayırın. Tüm PDMS çipini kalıptan dikkatlice soyun (Şekil 1H).
    NOT: PDMS talaşlarının kalıptan soyulması zorsa, soyma prosedürünü kolaylaştırmak için alt tabaka kalıbının silanizasyon ve kimyasal yüzey kaplaması gibi daha fazla yüzey işlemini düşünün. Soyulma sırasında üst ve alt katmanlar ayrılırsa, 1^{. kürleme} adımı için süreyi kısaltmayı düşünün.
11. Sıvı kanallarının her iki ucundaki sıvı girişleri ve çıkışları için delikler (çap = 0.5 mm) açın (Şekil 1H). IPA ile durulayarak, basınçlı hava ile kurutarak ve bant yapıştırarak çipin alt yüzeyini dikkatlice temizleyin.
12. Yüzeyi plazma oksidasyonu ile aktive ettikten sonra çipi 0,175 mm kalınlığında bir kapak camı ile yapıştırın (25 s, Şekil 1H).
13. Çipi cam alt tabakaya yerleştirdikten sonra, PDMS membran alt tabakasının cama düzgün şekilde bağlandığından emin olmak için üst tabakayı basınçlı hava ile yıkayın.
14. Yapışma stabilitesini artırmak için yapıştırılmış çipi 80 °C'de 10 s ila 1 dakika ısıtın.
    NOT: Yukarıda bahsedilen PDMS kürleme adımı ve gerekli kürleme süresi, kalıp kalınlığı, ekipman ve ortam koşulları gibi çeşitli parametrelerden etkilenebilir. Bu nedenle, önerilen protokolün uygulamaya uymaması durumunda kürlenme süresini buna göre ayarlayın.

3. Deney düzeneği

NOT: Standart deney düzeneği olarak tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera, bir floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) kamerası (frekans alanı) ve bir sıcaklık inkübatörü ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılır. FLIM kameraya modüle edilmiş bir uyarma lazer kaynağı (445 nm, 100 mW) bağlanır. Gaz kontrolü için üç kütle akış kontrolörü (azot, oksijen ve karbon dioksit) kullanılır. Orta perfüzyon için şırınga pompaları kullanılır.

1. Gaz (giriş) ve sıvı (giriş ve çıkış) perfüzyonu için hortumları hazırlayın. Deneyden önce istenen sıcaklığa ulaşmak için inkübatörü açın (burada 37 °C).
2. İstediğiniz bir objektif lensi seçin (burada, oksijen algılama için 20x ve mikrobiyal gözlem için 100x) ve gerekirse daldırma yağı ekleyin. Çift katmanlı çipi yapışkanlı bir talaş tutucuya sabitleyin.

4. Çip üzerinde oksijen kontrolü ve algılama

1. Uygun konsantrasyonda oksijene duyarlı bir boya çözeltisi hazırlayın (burada, 3 mM tris (2,2'-bipiridil) diklororutenyum (II) hekzahidrat, RTDP).
2. Bilinen bir kullanım ömrüne sahip bir referans slaytı kullanarak FLIM kamerayı kalibre edin (burada 3.75 ns). FLIM kamera ile sinyal yoğunluğunu ölçün ve daha iyi kalibrasyon için 0,68 - 0,72 sinyal yoğunluğu elde etmek için pozlama süresini veya mikroskop açıklığını ayarlayın.
3. Talaş tutucuyu mikroskop tablasına sabitleyin. Uygun hortumları sıvı girişine ve çıkışına bağlayın. Bir şırınga pompası (burada 100 nL/dak) kullanarak oksijene duyarlı boya çözeltisini sabit bir akış hızında perfüze etmeye başlayın.
4. Gaz girişini ve kütle akış kontrol cihazlarını uygun boru ile bağlayın. Kontrollü oksijen konsantrasyonu ile gazı yıkamaya başlayın (burada %0 veya ! oksijen, toplam kütle akış hızı 600 mL/dak).
5. Oksijen yokluğunda (τ₀) ve bilinen başka bir oksijen konsantrasyonunda (burada !'de) faz ömrünü ölçün. Oksijen varlığında floresan söndürmeyi tanımlayan Stern-Volmer denklemini aşağıdaki gibi kullanarak su verme sabitini (K_q) hesaplayın. Alternatif olarak, floresan yoğunluğu (I) kullanılabilir; Bununla birlikte, yoğunluğa dayalı ölçüm, ışık kaynağı yoğunluğundaki değişikliklerden, foto ağartmadan vb. etkilenebilir.
   
   NOT: Özellikle %0 kadar düşük oksijen tükenme seviyelerini hedeflerken, doğru kalibrasyonu sağlamak için gazla yıkamaya başladıktan sonra birkaç dakika beklemeniz önerilir. Daha fazla hassasiyet için, işlemi oksijen tutucular veya ek bir sızdırmaz hazne kurulumu gibi ek oksijen tüketme yöntemleriyle desteklemeyi düşünün.
6. Faz ömrünü ölçün ve Stern-Volmer denklemini kullanarak karşılık gelen oksijen konsantrasyonunu hesaplayın. Salınımlı oksijen koşulları oluşturmak için, nitrojen ve oksijen için hacimsel akış hızlarının ayarlanmasını otomatikleştirmek için herhangi bir cihaz kontrol sistemini kullanın.

5. Bakteri kültürü hazırlığı

1. . İstenen bir organizmayı (burada, E. coli MG1655, şişe başına bir kriyo şişesinden kullanıma hazır tek boncuk) istenen bir ortamda (burada, 10 g / L pepton, 5 g / L maya özütü ve 10 g / L NaCl içeren LB ortamı) aşılayarak bir ön kültür başlatın ve gece boyunca inkübe edin (burada, 150 rpm'de 37 ° C).
2. Elde edilen optik yoğunluğu 600 nm'de (OD₆₀₀) bir fotometre kullanarak ölçün.
3. Ön kültürü aşılayarak LB ortamında bir sonraki kültürü başlatın (burada ilk OD₆₀₀ = 0.3 veya 0.0001). Kültürü üstel büyüme aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.
   NOT: Çip üzerinde yetiştirme ortamı, birinci ön kültür ortamından farklıysa, organizmaların kendilerini yeni bir ortama alıştırmalarına izin vermek için yonga üzerinde yetiştirme ortamı ile ikinci bir ön kültür yapılması arzu edilir¹⁶.
4. Kültürü uygun bir optik yoğunluğa seyrelterek bir tohumlama çözeltisi hazırlayın. Bir sonraki adım için tohumlama çözeltisini 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın. E. coli için, tohumlama çözeltisinin optik yoğunluğu (OD₆₀₀) 0.5 civarındaydı.

6. Kontrollü oksijen koşulları altında çip üzerinde mikrobiyal yetiştirme ve hızlandırılmış görüntüleme

1. Talaş tutucuyu mikroskop tablasına sabitleyin. Talaş tutucunun ve PDMS çipinin inkübatörde (burada 37 °C) birkaç saat ısınmasına izin verin, çünkü bu, sıcaklığa bağlı yer değiştirme nedeniyle zaman atlamalı görüntüleme sırasında bulanıklaşma riskini azaltacaktır.
2. Yetiştiriciliğe başlamadan önce, toplam akış hızını ve karbondioksit akış hızını sabit tutarken oksijen ve nitrojen kütle akışının hacimsel yüzdesini ayarlayarak istenen başlangıç oksijen konsantrasyonu ile gazlamaya başlayın.
3. Çipin gaz girişini ve kütle akış kontrolörlerini bağlayın.
4. Şırıngayı tohumlama çözeltisi ile sıvı çıkışına bağlayarak ve şırıngayı manuel olarak iterek organizmayı çipin içine tohumlayın. Hücrelerin yetiştirme odalarında başarılı bir şekilde hapsolup olmadığını mikroskopla kontrol edin.
5. Hücre aşılamasından sonra, şırıngayı çıkarın ve taze ortamla birlikte başka bir şırıngayı sıvı girişine bağlayın. Orta besleme kanalında kalan hücreleri temizlemek için şırıngayı manuel olarak itin.
6. Şırınga pompası ile ortamı sabit bir akış hızında (burada 100 nL/dak) perfüze etmeye başlayın. Yeterli bir akış hızı olduğundan emin olun, çünkü yetersiz bir oran haznenin kurumasına neden olabilir. Yeterli akış hızı, akışkan kanalının geometrisi ve üst katman kanalındaki gaz akış hızı dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir.
7. Zaman atlamalı görüntü alımını başlatın. Salınımlı oksijen koşulları altında yetiştirme için, görüntü alımı başladığı anda kütle akış kontrolörlerinin otomatik kontrolünü başlatın. Gaz kontrolünün başlatılmasında ve görüntü alınmasında herhangi bir gecikme olması durumunda, daha sonraki görüntü veri analizi için gecikmeyi dikkate alın.

7. Görüntü veri analizi

1. Zaman atlamalı görüntüyü, her konum için bir görüntü yığını olarak kaydedin.
2. Görüntü analiz programlarını kullanarak ekili koloniyi döndürmek, hizalamak ve kırpmak için görüntüyü önceden işleyin. Önceden işlenmiş örnekler. TIF görüntüleri burada mevcuttur: https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747¹⁵
3. Hücreleri segmentlere ayırın ve hücre numarası, uzunluk, alan, floresan yoğunluğu vb. gibi ilgili değerleri çıkarın. Büyüme davranışlarını daha fazla analiz edin. Örnek Python betiklerini burada bulabilirsiniz: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Sonuçlar

PDMS çift katmanlı çip imalatı
Fabrikasyon çift katmanlı çip, görselleştirme için renkli gaz kanalları (kırmızı) ve sıvı kanalları (mavi) ile Şekil 2A'da gösterilmiştir. Çip, paralel deneylere izin vermek için üç özdeş sıvı kanalına ve üst üste binen gaz kanallarına sahiptir. Akışkan kanalı, bir dizi yetiştirme odasına sahip bir yetiştirme alanına sahiptir (Şekil 2A(i)). Hücreler yetiştirme odalarının içinde hapsedilir ve tek katmanlı bir formatta büyümelerine izin verilir, bu da yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme ve yüksek görüntü elde etme oranı sağlar. Çipin enine kesiti, 3 mm kalınlığında bir üst katmanı ve 65 μm kalınlığında bir alt katmanı gösterir ve ara PDMS membranı aracılığıyla gaz kanalından sıvı kanalına hızlı gaz difüzyonu sağlar (Şekil 2A (ii-ii')).

Çip üzerinde oksijen kontrolü
Geliştirilen çipin gaz değişim kabiliyeti, FLIM ve oksijene duyarlı boya¹⁵ kullanılarak test edildi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, sıvı kanalındaki oksijen konsantrasyonu, oksijen konsantrasyonu ! ile %0 arasında kaydırıldığında onlarca saniye içinde ya karşılık gelen bir azalma ya da artış gösterdi. Bu oksijen ölçüm sonuçları, onlarca saniye içinde hızlı oksijen salınımının, geliştirilen çift katmanlı mikroakışkan çipte tekrarlanabileceğini göstermektedir.

Sabit oksijen koşulları altında mikrobiyal yetiştirme
Çip ilk olarak, çeşitli oksijen konsantrasyonları ile sabit gaz koşulları altında fakültatif anaerob E. coli büyümesini karakterize etmek için kullanıldı. Ön deneylerde karbondioksit tükenmesi altında E. coli'nin sınırlı büyümesini gözlemlediğimiz için (veriler gösterilmemiştir) her zaman besleme gazına karbondioksit eklenmiştir. Şekil 3A ve Şekil 3B, sırasıyla aerobik (! oksijen kaynağı) ve anaerobik (%0 oksijen kaynağı) koşullar altında E. coli'nin temsili faz kontrast görüntülerini göstermektedir. 3 saatlik ekimden sonra, aerobik koşullar altında yetiştirilen E. coli, anaerobik koşullara kıyasla daha büyük kolonilerle sonuçlandı. Kantitatif analiz ayrıca, Şekil 3C'deki büyüme eğrilerinde gösterildiği gibi, oksijen mevcudiyetine bağlı olarak koloni büyüklüğünde (A_kolonisi) farklı artış oranlarını gösterir. Bir_koloninin, farklı koloniler ve koşullar üzerinde karşılaştırmaya izin vermek için başlangıç alanına göre normalleştirildiğini unutmayın. Üstel büyüme oranı μ, büyüme eğrisinden aşağıdaki gibi belirlenebilir ve Şekil 3D'de özetlenebilir.

Sonuçlar, cihazın hedeflenen konsantrasyonlarda oksijeni kontrol etme ve elde edilen hızlandırılmış görüntülerden karşılık gelen mikrobiyal büyümeyi etkili bir şekilde analiz etme yeteneğini doğrular.

Salınımlı oksijen koşulları altında mikrobiyal yetiştirme
Son olarak, E. coli, salınımlı oksijen koşulları altında, aerobik ve anaerobik gazlama fazları arasında bir anahtarlama aralığı T' ile geçiş yapılarak yetiştirildi. Salınımlı oksijen koşullarıyla bağlantılı olarak zamana bağlı büyüme analizi yeteneğini test etmek için 60 dakika ile 1 dakika arasında çeşitli T'ler incelendi. Şekil 4, T' = 60, 30, 10, 5, 2 ve 1 dakika ile salınımlı oksijen koşulları altında niceliksel E. coli büyümesini göstermektedir. A_kolonisine dayalı büyüme eğrisine ek olarak, _Δt'μ anlık büyüme hızı da aşağıdaki gibi zamana bağlı içgörüler elde etmek için belirlenir.

Sabit aerobik ve anaerobik koşullar altındaki büyüme oranları da büyüme referansları olarak Şekil 4'te noktalı çizgilerle (%₂₁, μ μ_%0) gösterilmiştir. E. coli büyümesi, salınımlı gaz koşullarına yanıt olarak farklı dinamikler sundu. Örneğin, gazlama fazı aerobik koşullardan anaerobik koşullara geçirildikten sonra (T' = 60 dakika), büyüme (i) tepki fazı: büyüme hızında ani düşüş, ardından (ii) toparlanma fazı: büyüme hızında kademeli artış ve (iii) stabilizasyon fazı: _{%μ 0} civarında büyüme stabilizasyonu. E. coli büyüme dinamikleri, 1 dakika gibi kısa bir sürede çeşitli T'ler altında zamansal olarak başarılı bir şekilde çözüldü, burada E. coli, büyümeyi değişen gaz koşullarına adapte etmek için sınırlı süre nedeniyle yukarı ve aşağı monoton bir büyüme hızı gösterdi. Ayrıca, büyüme davranışı sadece koloni düzeyinde değil, aynı zamanda tek hücre düzeyinde de analiz edilebilir. Şekil 5, çeşitli anahtarlama aralıklarında T' oksijen salınımları altında tek hücreli alanın gelişimini göstermektedir. Tek hücreli büyüme, izleme analizi olmadan komşu grafikleri takip ederek çıkarılabilir. Tek hücre düzeyindeki büyüme davranışı, Şekil 4'teki koloni düzeyinde gözlemlenene benzer; aerobik gazlama fazı sırasında daha hızlı bir alan artışı ve gaz değiştirme olayında büyüme hızında net bir değişiklik. Buradaki sonuçlar, salınımlı gaz koşulları altında mikropları yetiştirme ve mikrobiyal büyümeyi oksijen mevcudiyeti ile ilişkili olarak zamana bağlı bir şekilde analiz etme yeteneğini göstermektedir.

Şekil 1: Çift katmanlı çip üretim prosedürü. Prosedür (A, C) kalıp tasarımı, (B, D) kalıp imalatı, (EG) PDMS kalıplama ve (H) çip montajı ile başlar. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fabrikasyon çift katmanlı çip ve oksijen kontrol kabiliyeti. (A) Görselleştirme için renkli gaz kanalları (kırmızı) ve sıvı kanalları (mavi) içeren fabrikasyon çipin temsili görüntüsü sunulur. SEM görüntüsü, her iki taraftaki sıvı kanallarına bağlı bir dizi yetiştirme odasını gösteren (i) 'de gösterilmiştir (ölçek çubuğu 100 μm). Çipin enine kesiti, 3 mm kalınlığındaki üst katmanı ve 65 μm kalınlığındaki alt katmanı gösteren (ii-ii') ile gösterilmiştir. (B) Aerobik (! oksijen) ve anaerobik (%0 oksijen) koşullar arasında geçiş yapıldıktan sonra sıvı kanalında ölçülen oksijen konsantrasyonu. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sabit oksijen koşulları altında E. coli yetiştiriciliği. (A) Hücreler 3 saat boyunca aerobik olarak (% 21 oksijen kaynağı) yetiştirilir ve faz kontrast mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış görüntüler elde edilir. (B) Hücreler anaerobik olarak yetiştirilir (%0 oksijen kaynağı) ve 3 saat boyunca hızlandırılmış görüntüler elde edilir. (C) Çeşitli sabit oksijen koşulları altında hücre büyümesi, A_kolonisine dayalı olarak çizilir. (D) Üstel büyüme oranı hesaplanır ve özetlenir. Tüm ölçek çubukları = 5 μm. Veriler ortalama ± S.D. n = 35 koloni (%0), 27 (%0.1), 21 (%0.5), 16 (%1), 13 (%5), 13 (), 29 (!) olarak ifade edilmiştir. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Salınımlı oksijen koşulları altında E. coli yetiştiriciliği. Çeşitli salınımlı oksijen koşulları altında hücre büyümesi incelenir (T', aerobik ve anaerobik koşullar arasındaki geçiş aralığı). A_kolonisine dayalı hücre büyümesi zaman içinde çizilir (üstte) ve _{μ Δt}, zamanla çözülmüş veri yorumlamasına izin vermek için zaman içinde çizilir (altta). Veriler ortalama ± S.D. n = 5 koloni (60 dk), 3 (30 dk), 4 (10 dk), 4 (5 dk), 4 (2 dk), 5 (1 dk) olarak ifade edilmiştir. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Salınımlı oksijen koşulları altında yetiştirilen E. coli'nin tek hücreli alanı (tek hücreli ). Veriler, her bir anahtarlama aralığı T'den temsili bir koloniden alınmıştır. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Çift katmanlı bir mikroakışkan sistemin üretilmesi ve çalıştırılması için protokol, yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip hızla salınan oksijen koşulları altında mikrobiyal büyümeyi gözlemlemek için sağlandı. Hızlandırılmış görüntüleme ile birleştiğinde, bu platform, kontrollü oksijen koşulları altında mikroorganizmaların çip üzerinde yetiştirilmesini ve gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayarak, oksijen mevcudiyeti ile ilişkili olarak mikrobiyal büyümenin analizine olanak tanır.

Bu protokolde, üst ve alt katmanlar ayrı ayrı hazırlanır ve daha sonra tek bir çip haline getirilir. Bu modüler konsept, iki katmanlı konfigürasyonları değiştirerek çeşitli çip tasarımlarına izin verir. Üst ve alt katman kalıpları için farklı imalat yöntemleri kullanıldı - SLA, üst için 3D baskı ve alt için fotolitografi - ilgili boyut ve doğruluk gereksinimlerine göre. Bu yaklaşım, üretim sürecinin genel verimliliğini artırır. İki katmanın montajı, iki aşamalı bir PDMS kürleme işlemi ile gerçekleştirilir. Kalıp kalınlığı ve yerel ısıtma koşulları PDMS kürleme sonuçlarını etkileyebileceğinden, tasarıma göre ilk kürleme adımı için ısıtma süresini optimize etmek önemlidir.

Hızlı oksijen geçişi elde etmek için PDMS'nin yüksek hava geçirgenliğine sahip olmasından yararlanıyoruz. Öte yandan, oksijen kontrolünün hassasiyeti, özellikle düşük oksijen seviyelerinde, oksijenin PDMS yoluyla pasif difüzyonundan da etkilenebilir. Bu sınırlamayı telafi etmek için protokole daha fazla iyileştirme eklenebilir. Örneğin, oksijen sensörünün kalibrasyon metodunun iyileştirilmesi için fırsatlar vardır. Gösterilen protokolde sensör, PDMS çift katmanlı çip kullanılarak %0 ve %21 oksijen seviyeleri olmak üzere iki referans noktasında kalibre edilir. Sonuç olarak, oksijen algılamanın hassasiyeti, kalibrasyon için oksijeni tükenmiş doğru koşullar yaratma yeteneğine dayanır. Protokolde belirtildiği gibi, özellikle %0 kadar düşük oksijen tükenme seviyelerini hedeflerken, doğru kalibrasyonu sağlamak için gazla yıkamaya başladıktan sonra birkaç dakika beklemeniz önerilir. Bununla birlikte, hava geçirgen PDMS çipindeki olası sızıntılar veya hava tutulması nedeniyle bu görev zordur. Kalibrasyon doğruluğu, oksijen süpürücü kimyasallar kullanılarak veya çipi sıkıca kapatılmış, gazı tükenmiş bir hazneye^17,18 koyarak daha da geliştirilebilir. Bu takviyeler, kesinlikle anaerobik ve düşük oksijenli koşullar altında mikrobiyal davranışın daha sağlam ve kesin bir analizine izin verebilir.

Gösterilen cihaz, çeşitli araştırma alanları için ilgi çekici olacaktır. Örneğin, oksijen mevcudiyetinin mekansal-zamansal olarak homojen olmadığı varsayılan endüstriyel biyoreaktörlerde oksijen koşullarının çoğaltılması için faydalı olacaktır 7,8,19,20. Çift katmanlı çipin kullanılması, araştırmacıların, geleneksel yetiştirme kurulumlarında mümkün olmayan, hızla dalgalanan oksijen ortamları altında mikrobiyal davranışı karakterize etmelerine ve anlamalarına olanak tanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Clewin 5	WieWeb yazılımı, Hollanda	YOK	Düzen düzenleyici
CMOS kamera	Nikon, Japonya	DS-Qi2
Kapak camı	Schott AG, Almanya	D263 Biyografi	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Femto plazma temizleyici	Diener Electronics, Almanya	-	Çip plazma yapıştırma
3B Formu	Formlabs, ABD	-	3D yazıcı
Ömür boyu referans	Starna Scientific, Birleşik Krallık	UMM-SFG
Kütle akış kontrolörü	Vö gtlin Instruments GmbH, İsviçre	GSC-A9SA-BB22 Serisi	azot, oksijen
Kütle akış kontrolörü	Vö gtlin Instruments GmbH, İsviçre	GSC-A9SA-BB21	karbondioksit
Model v3 reçine	Formlabs, ABD	RS-F2-DMBE-03	3D baskı reçinesi
NaCl	Carl Roth, Almanya	3957.1	LB orta bileşen
Nikon Eclipse Ti-E 2 fotoğraf makinesi	Nikon, Japonya	-	Ters mikroskop
pco.flim kamera	PCO AG, Almanya	-
pco.flim lazer	Omicron-Laserprodukte GmbH, Almanya	-
Pepton	Carl Roth, Almanya	8986.1	LB orta bileşen
Plan Apo λ	Nikon, Japonya	-	100x yağ, 20x
Polidimetilsiloksan (PDMS)	Dow Kimya Şirketi, ABD	Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti
Delme aleti, Φ 0,50 mm	Dünya Hassas Aletler, ABD	504528
Delme aleti, Φ 0,75 mm	Dünya Hassas Aletler, ABD	504529
ROTI Store kriyo şişesi	Carl Roth, Almanya	-
Solidworks 2016 x64 Sürümü	Dassault Systems, Fransa	YOK	3D CAD
Yüzey döndürme kaplayıcı	APT Otomasyon, Almanya	DÖNDÜRME150i	PDMS eğirme kaplama
Şırınga pompası	CETONI, Almanya	neMESYS
Sıcaklık inkübatörü	Okolab, İtalya	-	Mikroskop ekipmanları
tris(2,2'-bipiridil)diklororutenyum(II)heksahidrat, (RTDP)	Acros Organics, Belçika	208750010
Boru	Saint-Gobain, Fransa	Tygon F-4040-A	Gaz giriş boruları
Boru	Saint-Gobain, Fransa	Tygon AAD04103	Akışkan boruları
Maya özü	Carl Roth, Almanya	2363.3	LB orta bileşen