Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

649 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

17 Ekim 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Bu makalede

Özet

Bu makale, 3D Flipwell mühendisliğine ve kullanımına rehberlik edecek temel adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ko-kültür ek yığınlarının nasıl bir araya getirileceğini ve bağırsak mukozal ortamını modellemek için bağırsak bakterileri, bağırsak epiteli ve makrofajların tabakalı katmanlarını birlikte kültürlemek için nasıl kullanılacağını açıklıyor ve gösteriyoruz.

Özet

Bakteriyel sekretomun bağışıklık hücresi polarizasyonu ve bağırsak mukozal homeostazındaki rollerini incelemek için, arka arkaya istiflenmiş bir formatta ticari olarak temin edilebilen ekleri kullanarak 3 boyutlu bir ortak kültür modeli geliştirdik. Bu sisteme 3D Flipwells adını verdik ve bağırsak mukozal mikro ortamını özetlemek için bakterileri, kolon epitelini ve bağışıklık hücrelerini tabakalı katmanlarda başarılı bir şekilde birlikte kültürledik. Bu ko-kültür sistemi, zarın bir tarafında kolon epitel hücrelerinin ve diğer tarafında farklılaşmamış yapışık olmayan monositlerin tohumlanmasını sağlayarak, kolon epitel polarizasyonunun, mukus oluşumunun ve monosit-makrofaj farklılaşmasının ve polarizasyonunun, önceden farklılaşmış makrofajların ayrılmasına ve yeniden kaplanmasına gerek kalmadan tek bir ko-kültür içinde senkronize ilerlemesine izin verir. Bu sistemin inşası kolaydır ve yalnızca birkaç hazır malzeme ve araç gerektirir. Ko-kültür bileşenlerinin, nitrik oksit sentazın (NOS) bir kofaktörü olan BH4'ün (tetrahidrobiopterin) endojen öncüsü olan sepiapterine (SEP) tepkilerini analiz ederek faydasını test ettik. 3D Flipwell'in SEP tedavisinin bağırsak bakterileri tarafından biyofilm oluşumunu, kolon epiteli tarafından mukus üretimini ve makrofajların pro-immünojenik polarizasyonunu indüklediğini gösterdik. Bu, SEP'nin farklı hücresel bileşenler arasındaki karışma yoluyla mukozal savunma mekanizmasının aktivasyonunu tetiklediğini gösterdi. Bağışıklık hücresinin yeniden programlanmasına yol açan mukozal iletişimin rolünü araştırmak ve bu ortak kültür sisteminin yeni immünomodülatör tedavileri taramak için faydasını değerlendirmek için daha fazla deneye ihtiyaç vardır.

Giriş

Bağışıklık hücresi-bağırsak mikrobiyomu karışması, farklı hastalık tedavilerinin etkinliğini büyük ölçüde etkiler. Böyle bir karışma, konakçı metabolik anormallikleri, diyet değişiklikleri, hastalık tezahürü ve farmakolojik tedavi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere dış uyaranlarla belirgin şekilde değiştirilir. Bu değişiklikler, disbiyoz 1,2,3 olarak adlandırılan bir durum olan mikroflora bileşiminde bir dengesizliğe yol açabilir.

Bağırsaktaki mikroplar ve konakçı bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri daha iyi anlamak için, bağırsak mukozal ortamını özetlemek amacıyla farklı gruplar tarafından ayrıntılı ortak kültür sistemleri geliştirilmiştir. Kim ve ark.4 tarafından geliştirilen çip üzerinde bağırsak sisteminden, özel bir emici substrat5 kullanan daha karmaşık bir montaja kadar, bu ko-kültür sistemlerinin oluşturulması kolay değildir ve ko-kültür substratı tarafından absorpsiyonları nedeniyle salgılanan bileşenlerin tam spektrumunu koruyamazlar. Noel ve ark. böylece bağırsak mukozasını modellemek için üretilmesi nispeten daha kolay olan alternatif bir ortak kültür sistemi geliştirdi6. Bu yeni sistem, membranın bir tarafına eklenmiş kolon epitel hücreleri ve diğer tarafında önceden farklılaşmış makrofajlar içeren tek bir kültür eki kullanır6. Bununla birlikte, önceden farklılaşmış makrofajların tohumlanması, onların başka bir yerde önceden farklılaşmasını ve ayrışmalarını ve bir ko-kültüre dönüşmelerini gerektirir, bu da potansiyel olarak hücresel bütünlüklerini ve canlılıklarını etkiler.

Bu önceki sistemlere iyileştirmeler ekleyerek, 3D Flipwell sistemi 7,8 olarak adlandırdığımız yeni bir üç boyutlu (3D) çok katmanlı ortak kültür sistemi geliştirdik. Bu sistem, tek bir ortak kültür içinde kolon epitel polarizasyonunun, mukus oluşumunun, makrofaj farklılaşmasının ve polarizasyonun senkronize ilerlemesine izin veren, arka arkaya istiflenmiş hücre kültürü eklerinden oluşur. Bu sistem, bağırsak mukozal ortamındaki değişiklikleri ve bağırsak bakterileri, epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelememizi sağlar. Ek olarak, bu sistem bakteriyel metabolitler, toksinler, diyet besinleri ve farmasötikler dahil olmak üzere dış uyaranların bağırsak mukozası ve vücudun geri kalanı üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir 7,8.

Yeni ko-kültür ekleme sistemini kullanarak, farklı hücresel bileşenlerin, nitrik oksit sentazın (NOS) bir kofaktörü olan BH4'ün (tetrahidrobiopterin) endojen öncüsü olan sepiapterine (SEP) tepkilerini inceledik. Daha önce SEP'in, tümörle ilişkili makrofajları pro-immünojenik tip 9,10,11,12'ye yeniden programlayarak meme tümörü mikroçevresi üzerinde pro-immünojenik aktiviteler uyguladığını göstermiştik. SEP'in bağırsak bakterileri tarafından biyofilm oluşumu, kolon epiteli tarafından mukus üretimi ve ko-kültürlerde makrofajların pro-immünojenik polarizasyonu gibi eşzamanlı olayları indüklediğini ve mukozal savunma mekanizmasınınaktivasyonunu gösterdiğini gösterdik 7. Bu bulgular, bağırsak mukozal mikro ortamının modellenmesinde bu yeni ortak kültür sisteminin faydasını desteklemektedir7.

Bu protokolün genel amacı, bağırsak mukozal ortamını modellemek için bağırsak bakterileri, bağırsak epiteli, mukus ve bağışıklık hücrelerinden oluşan bu yeni ortak kültürün oluşturulması için adım adım talimatlar sağlamaktır. Ayrıca, örneğin SEP tedavisi gibi bir dış uyaranın etkisi altında birlikte kültürlenmiş hücrelerin karışmasını nasıl görselleştirebileceğimizi de gösteriyoruz. Ko-kültürde farklı hücreler arasındaki etkileşimleri kolaylaştıran salgılanan hücresel bileşenleri belirlemek ve ayrıca yeni terapötiklerin yüksek verimli taraması için bu ko-kültür modelinin faydasını test etmek için bu ko-kültür sistemini kullanan daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Ayrıca, bağırsak mukozal ortamının fizyolojik durumunu elde etmek için, bu ortak kültür sistemi daha fazla değişiklik gerektirecektir. Örneğin, aerobik memeli hücrelerini anaerobik bakterilerle birlikte kültürlemek için, bu bakterilerin oksijeni uzaklaştıran anaerobik ortamda ayrı ayrı kültürlenmesi veya başka bir yerde bildirildiği gibi oksijen girişini önleyen sıvı parafin ile kaplanması gerekir. Bu ortak kültür sisteminin bu kadar gelişmiş faydası ve uygulaması, daha fazla araştırmayı gerektirecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. 3D Flipwell mühendisliği

  1. Tüm çalışmalar bir hücre kültürü kabini içinde yapılmalıdır. Tüm malzemeleri kabinin içine yerleştirin.
  2. Petri kabının kapağını açın ve bir kenara koyun. Neşter bıçağını koruyucu kılıfından açın ve Petri kabının tabanının kenarına yerleştirin. Steriliteyi sağlayın.
    DİKKAT: Neşter bıçağının dikkatli kullanılması gerekir. Gerekirse ellerinizi korumak için kesilmeye dayanıklı, elyaf takviyeli eldivenler kullanın.
  3. 12 oyuklu ticari ek parçanın steril koruyucu ambalajını açın. Steriliteyi sağlayın. Bir dizi steril cımbız alın. Ek parçayı yavaşça tutun ve ambalajından çıkarın.
  4. Ek parçayı, alt kısmı yukarı bakacak şekilde tutun. Diğer elinizle steril neşter bıçağını alın ve ek parçaya getirin.
  5. C şeklinde bir hareket kullanarak membranı kenardan delin ve neşter bıçağını plastik duvara yakın kalacak şekilde kesici ucun alt kısmı etrafında yavaşça kaydırın.
  6. PET membranı kesin ve membranı çıkarmak için ikinci cımbız setini kullanın. Membranı atın.
  7. Ek parçanın kenarını ve kenarını temizlemek için beyaz membran talaşlarını kazımak için neşter bıçağını kullanın. Yeni hazırlanan ek parçayı dikkatlice orijinal steril paketine geri koyun.
  8. Ardından, silikon yapışkan tüpü alın ve bir açıklık yapmak için meme ucunu neşter bıçağıyla kesin. Bu açıklık 3 mm genişliğinde olmalıdır.
  9. Yapıştırıcıyı kağıt havlunun üzerine sıkarak boncuk boyutunu test edin. Boncuk 2-3 mm kalınlığında olmalıdır. Boncuk 2 mm'den azsa ve tüpten sıkılması zorsa nozulu ayarlayın.
    1. Tutkal boncuğunu uygulamanın ve yaymanın başka bir yolu da ucu kesilmiş 200 μL'lik bir pipet ucu kullanmaktır. Makasla 3-4 mm kesin ve yapıştırıcıyı ek parçanın kenarına yaymak için bir spatula kullanın.
  10. Koruyucu kapağı ikinci parçadan soyun ve bir kenara koyun. Steril forsepsleri alın, ikinci parçayı membran yukarı bakacak şekilde ambalajından alın.
  11. Membrana dokunmamaya dikkat ederek, 2-3 mm'lik ince bir silikon boncuğu kesici ucun alt kısmına yavaşça yayın.
  12. İkinci steril forseps setini alın ve ilk parçayı (membransız) koruyucu paketinden dikkatlice kaldırın.
  13. Alt jantların hizalanması için iki ek parçayı aşağıdan alta bir araya getirin. Fazla yapıştırıcı eklemden dışarı çıkmaya zorlanabilir. Yapıştırıcıyı kurumaya bırakın. Tutkal tamamen kuruduktan sonra (24-72 saat) kesilebilir. Bu isteğe bağlıdır.
    NOT: Son Flipwell Ortak Kültür Ekleme (FCI) yığınının ortasında yalnızca bir PET membranı bulunmalıdır. Ticari eklerin L şeklindeki kulplarının birbirinden 180° uzakta (saat 3 ve 6 konumlarında) yerleştirilecek şekilde konumlandırılması en iyisidir. Markaya bağlı olarak 24-72 saat olabilen kuruma süresi için silikon yapıştırıcı üreticisinin tavsiyelerine uyun. Çoğu silikon bazlı yapıştırıcı için 72 saatlik kuruma süresi tercih edilir. Tutkal ayrıca UV sterilizasyonu ile sadece 24 saat kurutulabilir.
  14. FCI yığını yapıştırıldığında, kuruması için orijinal steril paketin içine veya derin bir Petri kabının içine yerleştirin. Yığın tertibatını kapatmak için belirtilen Petri kaplarının kapağını kullanın.
  15. Yığın düzeneklerini sterilize etmek için Petri kabı kapağını açın. FCI yığınını belirtilen derin Petri kabı kenarının kenarına vermek için steril forseps kullanın.
  16. BSC kabininin cam kanadını kapatın. UV ışığını açın. Güvenlik için kabinden uzaklaşın ve membranın her iki tarafını 30 dakika-1 saat sterilize edin. Her sterilizasyon döngüsü tamamlandığında UV ışığını kapatın.
  17. Petri kabı kapağını (belirtildiği gibi) ek yığınlarla birlikte Petri kabının üzerine yerleştirin ve bir kenara koyun.

2. Kollajen kaplamadan önce sızıntı testi

  1. Petri kabı kapağını çıkarın. 500 μL steril PBS veya steril deiyonize su ekleyin.
    NOT: Görsel yardım için, FCI yığınlarının bütünlüğünü görselleştirmeye yardımcı olmak için DMEM kullanıldı.
  2. Petri kabını kapatın. Bir gece dinlendirin. Sabah FCI bütünlüğünü kontrol edin. Sızıntı tespit edilirse FCI'ları atın. Gerektiğinde yeni kesici uç yığınları oluşturun.
  3. Test için kullanılan sıvıyı (PBS veya su) aspire edin. Petri kabını bir kapakla kapatın.
  4. Yığınların BSC içinde kurumasını bekleyin (1-2 saat). FCI'ları kullanıma hazır olana kadar bir BSC'de saklayın veya yapışık hücreleri tohumlamak için kolajen ile kaplamaya devam edin.

3. Flipwell membranının kolajen kaplaması

  1. 3 mg/mL'de sağlanan kolajen çözeltisini 100 μg/mL'de 1:30 seyreltmeye seyrelterek kolajen çözeltisinin çalışma stoğunu hazırlayın. Bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL steril deiyonize suya 33 μL ticari olarak üretilmiş kollajen çözeltisi ekleyin. Vorteksleyerek karıştırın.
    NOT: Daha büyük bir hacim için, membranın her iki tarafında kaplanacak kesici uç yığınlarının sayısına bağlı olarak ölçeği büyütün ve 15 mL konik tüp kullanın. Bunu her seferinde taze yapın. Çalışan stoğu tekrar kullanmayın.
  2. Petri kabının kapağını açın. Flipwell'in Petri kabının kenarından sarkmasına izin verin. Ek yığının bir tarafına dikkatlice 200 μL kollajen solüsyonu ekleyin.
  3. 1 saat bekletin. Kollajen çözeltisini aspire edin. 200 μL steril PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin.
  4. Petri kabını kapakla kapatın ve membranın kabin içinde 60 dakika kurumasını bekleyin. Membran kuruduğunda, steril forseps/cımbızı alın ve Flipwell'i karşı tarafa çevirin ve Petri kabının kenarından sarkmasına izin verin.
  5. Membranın kaplanmamış (şimdi üst) tarafına 200 μL kollajen çözeltisi ekleyin. 1 saat bekletin.
  6. Kollajen çözeltisini aspire edin. 200 μL steril PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin. Petri kabını bir kapakla kapatın ve membranın kabinin içinde 60 dakika kurumasını bekleyin. FCI yığınının gece boyunca kurumasını bekleyin veya aynı gün tohumlayın.
    NOT: Kollajen kaplamanın bütünlüğü uzun saklama koşullarında test edilmemiştir. Flipwell'ler önceden kaplandıktan sonra 24 saat içinde kullanılmalıdır.

4. Bakteri kültürleri için bakteri eki yapısı

  1. BSC'nin içine iki set steril forseps ve 24 oyuklu ekleri yerleştirin. Ek parçaları dikkatlice açın ve steril ambalajlarının içinde bırakın.
  2. Steril cımbızla ek parçayı steril paketinden kaldırın. İkinci cımbız/forseps seti ile ek parçanın altındaki küçük plastik ayakları kırın.
  3. 24 oyuklu ek parçayı, steril FCI yığınlarından birinin veya orijinal 12 oyuklu ek parçaların içine yerleştirerek test edin.
  4. Ek parça kuyuya kaymıyorsa, jant ve ayakların birleştiği janttan daha fazla plastik malzeme koparmak için tekrar cımbız kullanın.
  5. 24 oyuklu kesici uç, 12 oyuklu kesici uç yuvasının içine kayabilene kadar uyumu tekrar test edin. Ek parçayı steril paketinin içine veya steril bir Petri kabının içine yerleştirin.
  6. Ek parçayı UV ile sterilize edin veya etanolleyin (isteğe bağlı). Kullanıma hazır olana kadar paketi tekrar kapatın veya Petri kabının kapağıyla kapatın.

5. İğne yapımı

  1. Aletleri ve tüm malzemeleri bir BSC'nin içine getirin. Burun pensesi ile bir iğneyi dikkatlice tutun.
  2. Bir cetvel kullanarak iğne üzerindeki her kıvrımın yerini ölçün. İkinci burun pensesi seti ile iğneyi seçilen yerden tutun ve iğneyi bükün.
  3. İkinci bükümü oluşturun. İğneyi bükmek için, iğneyi pense ile tabandan ve U şeklindeki kıvrımdan tutun ve 4-5 mm'lik bir büküm oluşturmak için ters yönde çevirin. Bu adım, hava kabarcığının giderilmesi için iğnenin Flipwell'in içine kolayca yerleştirilmesi açısından kritik öneme sahiptir.
  4. İğneyi steril 3 veya 5 mm'lik bir şırıngaya yapıştırın. İğneyi ve şırınga tabanını 50 mL'lik konik bir tüp içinde 20 mL% 70 -% 95 etanol içinde sterilize edin.
  5. İğnenin ve şırınga tabanının sterilize edildiğinden emin olmak için etanolü iğne ve şırıngadan çekin.
  6. Şırıngayı ve iğneyi etanol içeren konik tüpten çıkarın ve bir Petri kabına koyarak kurumaya bırakın. İğneyi kuruması için hava ile boşaltın ve birkaç dakika kurumaya bırakın.

6. Kolon epiteli Caco-2:HT29-MTX-E12 hücre hatlarının tohumlanması

  1. Caco-2 ve HT29-MTX hücre hatlarını, deneyden 2-3 hafta önce, ilgili büyüme ortamlarında ayrı 100 mm TC kaplı kaplarda kültürlemeye başlayın.
    1. HT-29-MTX ortamı için, yüksek glikoz (4.5 g/L) ile 440 mL DMEM ve 50 mL %10 (h:v) ısıyla inaktive edilmiş FBS, 5 mL %1 (h:v) Pen Strep ve 5 mL HEPES 10 mM nihai konsantrasyon içeren %1 (h:v) Glutamax ortamı kullanın.
    2. Caco-2 ortamı için, yüksek glikoz (4.5 g/L) ve 50 mL %10 (h:h) ısıyla inaktive edilmiş FBS, 5 mL %1 (h:v) Pen Strep ve 5 mL esansiyel olmayan amino asit içeren 440 mL DMEM ve %1 (h:h) Glutamax ortamı kullanın.
      NOT: Doku kültürü kaplı 12 oyuklu plaka kuyucukları kullanarak Caco-2 hücre hattı için tohumlama yoğunluğunu belirleyin. Başlangıç tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak %100 birleşmeye kadar olan gün sayısını hesaplayın. Kılavuz olarak bir tohumlama yoğunluğu sağlıyoruz; ancak bu, büyüme ortamı formülasyonuna, satıcıya ve kullanılan FBS'ye göre değişecektir. Bu adım, THP-1 hücreleri kaplandıktan ve bakteriyel/SEP tedavileri gerçekleştirildikten sonra Flipwell'in bağırsak epitel tarafı için tek katmanlı bir tabaka sağlamak için kritik öneme sahiptir.
  2. Caco-2 ve HT-29 hücrelerini geçmek için kültür ortamını aspire edin. 10 mL PBS ile yıkayın.
  3. 2 mL %0.25 Tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri tripsinize edin. %5CO2 ile 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
  4. Plakalara hücre tipine uygun büyüme ortamından 7 mL ekleyin. Hücreleri steril 15 mL'lik konik tüpleri ayırmak için aktarın.
  5. Oda sıcaklığında 500 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile peletleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin.
  6. Peleti 1 mL önceden ısıtılmış DMEM bazlı HT-29 ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hemasitometre veya hücre sayacı ile sayın.
  7. İstenilen sayıda Flipwell için gereken hücre sayısına bağlı olarak, iki hücre tipi Caco-2:HT-29 hücresini yeni bir 15 mL veya 50 mL konik tüpte 9:1 oranında birleştirin.
  8. Aşağıdaki adımlar için kolajen önceden kaplanmış Flipwell'leri kullanın. Kolajen ile kaplanmış FCI yığınlarını derin Petri kabının kenarına asın.
  9. Flipwell'in apikal tarafı başınacm2 başına 500 μL 7,5 x 104 hücre (2,6 x 105 hücre/12 kuyucuklu ek) tohumlayın. Kullanılan yığın sayısına göre başlangıç hücresi sayılarını hesaplayın. Bu, her iki hücre tipini de 9:1 oranında içerecektir.
  10. Düzenekleri bir Petri kabı kapağıyla kapatın. 37 °C'de %5CO2 ile inkübe edin 2 hücreler bağlanana kadar gece boyunca. Hücreler kültürde 7-10 gün civarında mukus üretmeye başlar. Kültürleri korumak için medyayı gün aşırı değiştirin.
    NOT: Tedavilerle birlikte kültürdeki toplam günlerin önceden hesaplanması gerekir. Çevirme ve ilk tohumlama yoğunluğu bu süreye bağlı olacaktır.

7. THP-1 hücrelerinin tohumlanmasına hazırlanırken 3D Flipwell'in çevrilmesi

  1. Caco-2:HT-29 hücreleri bağlanıp çoğalmaya başladığında (tam birleşme, kullanılan ortama/FBS'ye ve kültür süresine göre tahmin edilmelidir), ancak %100 birleşme noktasında olmadığında, Flipwell'i zarın diğer tarafındaki THP-1 hücrelerini tohumlamak için çevirin.
    NOT: THP-1 hücrelerinin bu noktaya kadar ayrı bir kültürde genişletilmesi gerekir ve ihtiyaç duyulan tam hücre sayıları, kullanılan FCI yığınlarının sayısına göre tahmin edilecektir.
  2. Petri kabının kapağını açın ve DMEM ortamını FCI yığınının apikal (bağırsak epiteli) tarafından aspire edin.
  3. Steril forseps kullanarak Flipwell'i kancasından dikkatlice kaldırın ve 180° döndürün. İkinci steril forseps seti ile FCI yığınını şimdi yukarı bakan diğer kancadan tutun.
  4. Düzeneği tekrar Petri kabına indirin ve kancayı Petri kabının kenarına asın. THP-1 hücrelerini tohumlamaya hazır değilseniz, derin Petri kabına ortam seviyesini yükseltmek ve zarın hemen üstüne getirmek için yeterli ortam ekleyin.
    NOT: Flipwell bu konumda stabil olmalıdır ve THP-1 hücreleri ile tohumlama ve ortam ilavesi hemen düşünülmelidir. Bu adımlar hızlı bir şekilde yapılır. THP-1 hücrelerinin sayılması ve kaplanmaya hazır olması gerekir. THP1 hücreleri, daha fazla stabilite ve nihai ağırlık için FCI yığınını ağırlaştırmak üzere ilk önce tohumlandı. DMEM ortamı daha sonra ortam seviyesini zarın alt tarafına getirmek için derin Petri kabına eklendi. Özel yapım iğne daha sonra hava kabarcığını çıkarmak için kullanıldı, bu da FCI yığınını daha da stabilize etti ve son hacim ayarlamalarına izin verdi.
  5. Aşağıdaki adımda açıklandığı gibi hava kabarcığını çıkarmak için iğneyi kullanın.

8. Hava kabarcığının giderilmesi

  1. İğneyi ve şırıngayı etanol içinde önceden sterilize edin ve kullanmadan önce havayla kurutun (bkz. adım 5). Şırınga pistonunu daldırın.
  2. FCI yığınını steril forseps ile kolundan tutun. İğneyi dikkatlice kesici uç tertibatının içine ve altına indirin ve gavaj iğnesinin yumuşak ucunu hava kabarcığına kadar çok nazikçe yerleştirin.
  3. Şırınga pistonunu dikkatlice ve çok yavaş bir şekilde yukarı çekin ve hava kabarcığının yavaşça kaybolmasını izleyin. Hava kabarcığının çapı yaklaşık 2 mm olduğunda durun, bu da kolon epitel hücreleri için iyi DMEM kapsamını korumak için yeterlidir.
  4. İğneyi ve şırıngayı Flipwell'den dikkatlice çıkarın. Derin Petri kabındaki diğer kesici uç tertibatına geçin.

9. THP-1 tohumlama ve PMA tedavisi

  1. 420 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 ortamı, 50 mL %10 (h:h) ısıyla inaktive edilmiş FBS, 5 mL Glutamax %1 (h:v), 5 mL HEPES (10 mM nihai konsantrasyon), 11 mL Glikoz (4.5 g/L nihai konsantrasyon) ve 5 mL Pen-Strep (%1 v:v) ile THP1 ortamı yapın.
    NOT: THP-1 hücrelerinin, eklere eklenmeden önce birkaç gün boyunca RPMI bazlı kültür ortamında büyütülmesi gerekir. Tohumlamadan önce hücre sayısı hesaplamaları yapın ve kullanılacak FCI yığınlarının sayısına göre ölçeği artırın.
  2. Hücre süspansiyonunu 500 μL hacme göre ve 500 μL THP-1 ortamı başına 0,5 x10 6 hücrede hazırlayın. Farklılaşma ve polarizasyon için PMA'nın kullanılması gerekiyorsa, bunu RPMI ortamına 100 ng/μL'de ekleyin.
    1. PMA yapmak için, 5 mg/mL stok çözeltisi yapmak üzere 1 mL DMSO içinde 5 mg forbol miristat asetatı (PMA) sulandırın. Vorteksleyerek karıştırın. Her biri 20 μL'de mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve -20 °C'de saklayın.
    2. PMA'yı kullanmak için, 99 μL (1:100) tam büyüme ortamında 1 μL 5 mg/mL stoğu seyrelterek 50 μg/mL'de çalışan bir stok yapın. 500 μL ortama 1 μL çalışma stoğu veya 10 mL ortama 20 μL çalışma stoğu ekleyin.
  3. THP-1 hücrelerini RT'de pelet için 5 dakika boyunca 94 x g'da santrifüjleyin. 5-10 mL RPMI ortamında yeniden askıya alın. THP-1 hücrelerini tercih edilen herhangi bir sayma yöntemiyle sayın.
  4. RT'de 5 dakika boyunca 94 x g'da tekrar santrifüjleyin. 500 μL THP-1 ortamı başına 0,5 x10 6 hücrede yeniden süspanse edin.
  5. Ko-kültür ekleme yığınının apikal tarafına 500 μL THP-1 hücre süspansiyonu ekleyin. Derin kuyu Petri kabına medya ekleyerek kolon epitel hücreleri için HT-29 ortamını ayarlayın.
  6. Gerekirse 8. adıma göre hava kabarcığını bir gavaj iğnesi ile çıkarın. Her iki hücre tipini de hücre kültürü inkübatöründe 37°C, %5CO2, %100 nemde, THP-1 hücreleri bağlanana (gece boyunca) ve 1-2 gün çoğalana kadar kültürleyin.
  7. SEP veya diğer ilaçlarla tedavi yapmaya veya bakteri eklerine hazırlanmaya hazırlanın (bkz. adım 4). Bir sonraki FCI yığın dönüşünden 1 gün önce bakteri yetiştirmeye başlayın.

10. SEP ve bakteri ekleri için ikinci Flipwell Flip ve hava kabarcığı giderme

  1. Petri kabının kapağını açın. RPMI ortamını apikal taraftan aspire edin. Flipwell'i steril cımbızla kolundan tutun ve yığını kaldırın.
  2. Yığını baş aşağı döndürün. İkinci cımbız setini kullanarak yığın tertibatını mevcut koldan tutun.
  3. Yığını yeni bir steril derin kuyu Petri kabına indirin ve kenarın üzerine asın. Şimdi epikal/bağırsak epitel tarafına 500 μL DMEM ortamı ekleyin.
  4. Ortam zarın tam üstüne gelene kadar derin Petri kabına yeterli miktarda RPMI ortamı ekleyin. RPMI hacminin yaklaşık 40-55 mL olduğu tahmin ediliyordu, ancak derin Petri kabı başına kullanılan FCI yığınlarının sayısına bağlı olarak değişecektir.
  5. 8. adımı kullanarak hava kabarcığını 2-3 mm kabarcık bırakarak çıkarın. Gerekirse RPMI ortamını ayarlayın. Plakayı örtün.
  6. Kolon epitel hücreleri mukus üretmeye başlayana kadar kültür. Medyayı kısmen gün aşırı değiştirin.
    NOT: Kolon epitel hücreleri yeterince uzun süre kültürlenmişse ve zaten mukus üretmişse, bakteri ekine veya tedavilerine geçebilirler. Alt bölmedeki medyanın ek parçanın membranının alt tarafının altına girmesine izin vermeyin. Medya seviyesini membranda tutmak için daha fazla DMEM medyası ekleyin. Medyayı değiştirmek için ideal yöntem, medyanın yarısını bazolateral bölmeden çıkarmak ve hava sızmasını önlemek için apikal bölmede az miktarda medya bırakmaktır.
  7. SEP uygulamaları için, bakteri kültürü kullanılmıyorsa, bu sırada kuyucuklara 100 μM'lik nihai konsantrasyona SEP ekleyin. Bakteri kültürü ve insert kullanılıyorsa, bakteri kültürüne SEP ekleyin. Bakteri kültürü için 11. adıma bakın.
    1. SEP yapmak için 84,3 mL DMSO'ya 100 mg L-Sepiapterin ekleyin ve vorteksleyerek karıştırın. Her biri 100 μL'de mikrosantrifüj tüplerine alikot. -20 °C'de saklayın. Kesici uç montajı başına 500 μL ortam başına 1 μL'de SEP alikotları kullanın (100 μM'lik nihai konsantrasyon).

11. Bakteri kültürünün başlatılması (isteğe bağlı)

  1. Bakteriyel metabolitlerin bağışıklık hücreleri, mukus ve kolon epiteli üzerindeki etkisini incelemek için, ek tertibatının apikal tarafına bir bakteri eki ekleyin. Bakteriyel insert yapımı için 4. adımı izleyin. Bacillus subtilis'i bakteri eki kullanımından bir gün önce kültürledik.
  2. Miller LB'yi bakteri eki kullanımından 2 gün önce yapın ve otoklavlayın. LB yapmak için 6.25 g Miller LB'yi 250 mL'lik bir cam şişede 500 mL deiyonize su ile birleştirin. Alüminyum folyo ile kaplayın. Otoklav, RT'ye soğutun. Steril LB'yi 4 °C veya RT'de saklayabilir.
  3. Bakteri eki kullanımından bir gün önce gliserol stoğundan Bacillus subtilis bakterilerini büyütmeye başlayın.
  4. Bakteri kültürünü başlatmak için, steril 50 mL'lik konik bir tüp içinde donmuş bir gliserol stoğundan 10 mL Miller LB'yi Bacillus subtilis ile aşılayın. Gliserol stoğunun çözülmesine izin vermeyin.
  5. Steril 200 μL'lik bir uç kullanarak gliserol stoğundan az miktarda bakteri toplayın. Ucu steril 50 mL konik tüpte 10 mL LB'ye çıkarın.
  6. SEP kullanıyorsanız, tedaviye 20 μL SEP stoğu ile başlayın (nihai konsantrasyon 100 μM olmalıdır). 50 mL konik tüp starter kültüründeki 10 mL bakteri kültürüne doğrudan ekleyin.
  7. Kültür Bacillus subtilis , 220 rpm ve 37 °C'de çalkalanan bir inkübatörde 8 saat boyunca. Günün sonunda ikinci SEP tedavisini ekleyin - bakterilerle 10 mL LB'ye 100 μM'lik nihai konsantrasyona 20 μL SEP ekleyin.
  8. Gece boyunca 220 rpm, 37 °C'de kültür. Ertesi sabah Bacillus subtilis ile 10 mL LB'ye 20 μL SEP'in üçüncü tedavisini ekleyin ve bakteri eklerini yapmaya hazır olana kadar çalkalamaya devam edin.

12. Flipwell'e bakteri ekinin eklenmesi (isteğe bağlı)

  1. Bakteri eki yapımını adım 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Adım 11'de açıklandığı gibi bakteri kültürü gerçekleştirin.
    NOT: Ayrı bir hücre kültürü kabini varsa, bu en iyi sonucu verecektir. Aksi takdirde, bir hücre kültürü kabini içindeki çalışma alanını ikiye bölün. Bakteri ve hücre kültürlerini ayrı tutun. Hücre kültürleri, hücre kültürü inkübatörüne geri gönderilmemelidir. Bu yöntem uygulandıktan sonra BSC'nin sterilize edilmesi ve 24 saat veya daha uzun süre UV'ye maruz bırakılması gerekecektir.
  2. Aşağıdaki adımlar için iki çift steril forseps kullanın. Aşağıdaki tüm adımlar BSC'de yapılmalıdır.
  3. Forseps ile önceden hazırlanmış steril 24 oyuklu ek parçayı ambalajından kaldırın. Ek parçayı steril bir Petri kabının içine yerleştirin ve kapağı kapatın.
  4. Gereken bakteri eki sayısı için tekrarlayın. Flipwell'li Petri kabını inkübatörden BSC'ye aktarın ve bakteri ekleriyle birlikte kabın karşı tarafına koyun.
  5. Bakteri girişine izin vermek için Flipwell'in apikal (üst) tarafından 300 μL DMEM ortamı çıkarın. FCI yığınının üst tarafında yaklaşık 200 μL bırakın. Petri kabı kapağını kesici uç tertibatlarının üzerine yerleştirin.
  6. 24 oyuklu bakteri eklerine 50-100 μL B.subtilis kültürü ekleyin. Bakteri ekinin dış duvarını ve kenarını dökmemeye veya kirletmemeye dikkat edin. OD600, kültürün büyüme aşamasını izlemek için alınabilir.
  7. Steril forseps ile bakteri ekini kültürle kaldırın ve dikkatlice Flipwell'in üst tarafına yerleştirin. Kolu döndürün ve FCI yığınının kenarına asın. Yığını ikinci steril forseps seti ile tutun.
  8. FCI yığınlarının geri kalanı için tekrarlayın. Petri kabını kapatın ve BSC'nin içinde 3 saat dinlendirin. İnkübatörün içine getirmeyin.
  9. 3 saat sonra, bakteri ekini Flipwell'den çıkarmak için steril forseps kullanın. Kesici uç montajlarının geri kalanı için tekrarlayın. Bakteri eklerini atın.
    NOT: Bakterileri ve bakteri eklerini kurumun biyolojik olarak tehlikeli atık imha politikalarına ve güvenlik ve sağlık yönergelerine göre atın. Bakteriyel bileşenler veya bakterilerin kendisi incelenmedi.
  10. Mukozal, epitelyal ve immün hücresel bölmelerdeki değişiklikleri analiz etmek için zarları yıkamaya ve görüntülemeye hazırlamaya devam edin.
  11. DMEM ortamını Flipwell tepesinden aspire edin. 500 μL steril PBS ile yıkayın. Forseps kullanarak FCI yığınını Petri kabından kaldırın ve yeni bir Petri kabına aktarın.
  12. Flipwell'i çevirin ve Petri kabının kenarına asın. Membranı 500 μL steril PBS ile yıkayın.
  13. Depolama gerekiyorsa, FCI yığınlarını kısa süreli (30 dakika-gece boyunca) 50 mL'lik konik bir tüp içinde steril PBS'de saklayın.
    NOT: Bundan sonra hangi görüntüleme yönteminin kullanılacağını ve hem elektron mikroskobu hem de floresan antikor etiketlemesi için zarın yarıya indirilip kesilmeyeceğini belirlemek önemlidir.

13. Flipwell'i taramalı elektron mikroskobu (SEM) için parçalara ayırma

NOT: SEP/bakteriyel tedavilerden sonra kolon epitel hücrelerinde ve makrofajlarda morfolojik değişiklikleri incelemek için, membranları bir fiksasyon tamponuna sabitledik ve ardından taramalı elektron mikroskobu (SEM) için Flipwell'leri demonte ettik. PFA fiksatif olarak kullanıldı; Bununla birlikte, glutaraldehit de kullanılabilir. Tercih ettikleri fiksasyon tamponu, spesifik dehidrasyon adımları ve ilk fiksasyon tamponu konsantrasyonları hakkında Mikroskopi Çekirdeğine danışmak önemlidir. Depolama gerekiyorsa membranlar fiksasyon tamponunda saklanabilir. İş BSC dışında yapılabilir. Görüntüleme Çekirdeği membranı yapıştıracaksa, ikiye bölünebilir ve her iki tarafı ayrı ayrı görüntüleyecek şekilde konumlandırılabilir.

  1. Solvente dayanıklı bir işaretleyici kullanarak, FCI yığınının plastik kenarlarını kullanılan hücre tipini kodlayan bir sembolle etiketleyin. Alternatif olarak, kullanılan hücre tipini etiketlemek için zarı doğrudan bir nokta, onay işareti veya x ile etiketleyin.
  2. Flipwell'i sökmeden 50 mL'lik konik bir tüpün içine yerleştirin. Yığını batırmaya yetecek kadar %4 PFA ekleyin. Gece boyunca %4 PFA'da tutun.
    1. %4 PFA (metanol içermeyen) yapmak için 40 g paraformaldehiti 800 mL 1x PBS içinde çözün. %0.4 PFA yapmak için, 4 g paraformaldehiti 800 mL 1x PBS içinde çözün veya 100 mL %4 PFA'yı 900 mL 1x PBS'ye ekleyerek %4 PFA'yı 1:10 oranında 1x PBS ile seyreltin.
  3. Daha uzun depolama için PFA'yı %0,4 ile değiştirin. Depolama süresi ve arabellekler için Mikroskopi Çekirdeğine danışın.
  4. Flipwell'i sökmek için iki elinizle tutun ve yığının yapıştırılmış her bir parçasını çevirin. Yığın iki parçaya ayrılacaktır: bir parça membrana sahip olacak ve diğeri membransız ek parça olacaktır. Ek parçayı membran olmadan atın.
  5. Ek parçayı membranla birlikte döndürün ve membran yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Hangi tarafın hangi hücre tipine sahip olduğunu bilmek için zarı zarın kenarında küçük bir nokta veya x ile etiketleyebilir.
  6. Ek parçayı forseps ile duvardan tutun. Membranı bir neşter bıçağıyla dikkatlice kesin ve 1,7 mL'lik bir tüpün veya 500 μL-1 mL% 0.4 -% 4 PFA çözeltisi içeren küçük bir cam şişenin içine yerleştirin.
  7. Dehidrasyon adımları ve görüntüleme için mikroskopi çekirdeğine gönderin. Dehidrasyon adımları Beamer ve ark.7'de açıklanmıştır.
  8. PFA'yı veya diğer fiksatifleri, kuruluşun öngörülen tehlikeli atık imha politikalarına ve sağlık ve güvenlik yönergelerine göre atın.

14. Konfokal mikroskopi için Flipwell'i parçalara ayırmak için büyük damlacık yöntemi

NOT: Membranları boyamak ve görüntülemek için yeni bir yöntem oluşturuldu. Ko-kültür ekleme yığını, 50 mL'lik konik bir tüp içinde yapılan ilk fiksasyon, geçirgenleştirme ve bloke etme adımlarıyla bozulmadan tutuldu. Membranın her iki tarafını görüntülemek için immünofloresan etiketleme ve konfokal mikroskopi kullanıldı. Gece inkübasyon adımları için yeni adlandırılan 12 oyuklu plaka yöntemi kullanıldı ve demonte parçanın tabanını boyamak için büyük bir damlacık yöntemi kullanıldı. Membran ile her iki tarafı görüntülemek için konfokal Z-yığını kullanıldı. Lekeli membranlar iki dairesel cam lamel arasına sıkıştırıldı ve sandviç düzenek, ticari olarak yapılmış yuvarlak haznenin iki metal halkası arasına ortada yerleştirildi. Ticari görüntüleme yazılımı ile çoklu foton lazer taramalı konfokal mikroskop kullanıldı.

  1. Membranı yıkamak için, ko-kültür eki yığınını doğrudan 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve 15 mL steril PBS ekleyin veya her iki tarafı ayrı ayrı yıkayın (aşağıda açıklanmıştır).
  2. DMEM'i aspire edin ve apikal tarafa 300 μL steril PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin ve yığını Petri kabından dikkatlice çıkarın.
  3. Flipwell'i çevirin ve FCI yığınının şimdi yukarı bakan RPM'sine 300 μL PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin.
  4. Solvente dayanıklı bir işaretleyici kullanarak, hangi tarafın hangi hücre tipine sahip olduğunu bilmek için yığının üst ve alt tarafını etiketleyin.
  5. Flipwell'i 50 mL'lik steril konik bir tüpün içine yerleştirin. 10 dakika boyunca ilk fiksasyon tamponu olarak 15 mL steril% 4 PFA ekleyin. Gece boyunca inkübasyon gerekiyorsa, PBS'de 15 mL %0.4 PFA ile değiştirin, örtün ve gece boyunca bırakın.
  6. İmmün boyamaya devam etmek için, büyük damlacık yöntemi için bir tezgah alanı açın.
    10 x 14 inçlik plastik sargı parçalarını yırtın ve pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için köşelerden tezgaha bantlayın.
  7. 200 μL'lik bir pipet kullanarak 200 μL PBS içeren büyük bir damlacık oluşturun. Ek parçalara ayırmak için kesici uç tertibatını çevirerek çıkarın.
  8. Solvente dayanıklı bir işaretleyici kullanarak, boyama ve görüntüleme için hangi hücre tipinin kullanıldığını bilmek için zarın bir tarafının kenarına yakın küçük bir nokta yerleştirin.
  9. Membranlı ek parçada hala yapıştırıcı kalıntısı varsa, ek tabandaki kalan silikon contayı çıkarın. Bu, ek parçanın aşağıdaki adımlar için dik kalmasını sağlamak için yapılır.
  10. FCI yığınını (THP-1 hücreleri ile) 200 μL'lik büyük PBS damlasının üzerine dikkatlice yerleştirin. Kolon epitel hücreleri ile üst tarafa 200 μL geçirgenleştirme tamponu ekleyin ve 10 dakika bekletin.
    1. Geçirgenleştirme tamponunu hazırlamak için PBS'de %0.1 v/v Triton-X100 kullanın.
  11. 200 μL PBS'yi aspire edin ve ekleyin. Bu yıkamayı 2 kez tekrarlayın. 250 μL engelleme tamponu ile yeni bir damlacık oluşturun.
    1. Blokaj tamponu yapmak için, 5 mL 1x PBS'ye (son %5 serum) 250 μL normal keçi serumu ekleyin. 15 μL Triton-X100 ekleyin (son %0,3 v:v). İyice karıştırın ve 4 °C'de 1-2 gün saklayın.
  12. Ek parçayı engelleme arabelleğinin üstüne yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin. PBS'yi apikal taraftan aspire edin ve ekin üstüne 200 μL bloke edici tampon ekleyin. Membranın her iki tarafı da artık gece boyunca antikor boyaması için hazırdır.

15. İmmünofloresan (IF) boyama

NOT: Boyama, 12 oyuklu bir plaka yöntemi kullanılarak gece boyunca veya büyük bir damlacık yöntemi kullanılarak tezgahta yapılır.

  1. Membranın her iki tarafını gece boyunca 4 °C'de veya RT'de tezgahta boyamak için kullanılacak gerekli antikorları hazırlayın. Tüm antikorları PBS'de %1 BSA içinde 1:100 oranında seyreltin. Alternatif olarak, ideal konsantrasyonları ve antikor seyreltme tamponunu belirlemek için üreticinin tavsiyelerine uyun ve boyamayı optimize edin.
  2. Büyük damlacık yöntemi
    1. Tezgahın üstüne plastik bir örtü kullanarak büyük bir dikdörtgen oluşturun ve köşeleri bantlayın. Büyük bir damlacık oluşturmak için plastiğin üzerine seyreltilmiş 200 μL antikor pipetleyin. Ekleme membranını büyük damlacığın üzerine yerleştirin.
    2. Ek parçanın üstüne 200 μL birincil Ab ekleyin. RT'de 2 saat inkübe edin.
  3. 12 oyuklu plaka yöntemi
    1. Gece boyunca 12 oyuklu bir plaka yöntemi kullanıyorsanız, ek parçanın üstüne 300 μL birincil antikor ekleyin.
    2. 12 oyuklu plakanın kuyucuğuna 300 μL birincil antikor ekleyin. Ek parçayı damlacığın üstündeki 12 oyuklu plakanın içine yerleştirin. Plakayı bir kapakla kapatın ve gece boyunca 4 °C'ye koyun.
  4. Boyama tamamlandığında, membranın her iki tarafını PBS ile yıkayın. Bir pipet ve 200 μL'lik bir uç kullanarak, ek parçanın alt tarafını 200 μL PBS ile 3 kez dikkatlice durulayın. Ek parçanın üst kısmı için, üstüne 200 μL PBS ekleyerek, aspire ederek ve yıkamayı 3 kez tekrarlayarak yıkayın.
  5. Tüm ikincil antikorları hazırlayın (lütfen kullanılan spesifik antikorlar için Malzeme Tablosuna bakın) üreticinin tavsiyelerine göre veya PBS veya diğerlerinde %1 BSA'da 1:1000 seyreltme yapın. İkincil antikor boyamanın karanlıkta yapılması gerekir; Işıksız bir ortam yaratmak için bir karton kutu veya bir dolabın çekmecesini kullanın.
  6. Büyük damlacık yöntemi veya 12 oyuklu plaka yöntemi kullanarak yeni bir steril plaka hazırlayın. Karanlık bir ortamda RT'de 2 saat inkübe edin. 15.4'te açıklandığı gibi yıkayın.

16: Konfokal görüntüleme için hazırlık

  1. Membran henüz 14. adımda açıklandığı gibi etiketlenmemişse, hücre tipi konumunu bilmek için etiketleyin. Herhangi bir yere solvente dayanıklı bir işaretleyici ile küçük bir işaret (nokta, x, çek vb.) yerleştirin (kenar tercih edilir).
  2. Yuvarlak lamellerin saklama kabından dikkatlice çıkarılması ve tezgah yüzeyine yavaşça yerleştirilmesi gerekmektedir.
  3. DAPI'yi PBS'de 1:100 seyreltmede seyreltin. DAPI'yi damlacık dağıtıcı ile dağıtmak için, lamellerin ortasına 1-3 damlacık ekleyin. Aksi takdirde, lamellerin ortasına 1-3 damla DAPI pipetleyin.
  4. Ek parçayı forseps ile tutun. Membranı bir neşter bıçağıyla jant/alt kenar boyunca dairesel hareketlerle dikkatlice kesin. Membranın tezgahın üzerine düşmesine izin vermeyin. Plastik parçayı tezgahın üzerine yerleştirin ve son lifleri neşter bıçağıyla keserken zarı forseps ile tutun.
  5. Ek parçayı DAPI'nin üstüne yerleştirin. Membranın her iki tarafında DAPI olması için membranın üstüne 1-3 damla DAPI (1:100 seyreltme) dağıtın.
  6. İkinci tur lamel kızını parmaklarınızla kaldırın (KKD giyin). Lamel çok kırılgan olduğu için forseps kullanmayın.
  7. İkinci lamel ile birinci lamel üzerine hizalayın ve dikkatlice membranın üzerine indirin.
  8. Solvente dayanıklı bir işaretleyici kullanarak, hücre tipini/yönünü kodlamak için gerekirse lamel tarafını dikkatlice etiketleyin (isteğe bağlı). Membran etiketlenmişse bu adımı atlayın.
  9. Görüntülenecek lamellerin sayısına ve mevcut metal halkaların sayısına bağlı olarak, yuvarlak lamelleri görüntüleme için bir arada tutmak için lamelleri ticari olarak yapılmış metal halkalar arasına monte edin veya görüntülemeye kadar karanlıkta saklayın.
  10. Görüntülemek için, lamel membranı hücre odasının metal halkaları arasına monte edin ve konfokal mikroskop tutucusuna yerleştirin. Yuvarlak lamellerin görüntülenmesi için hangi tutucunun gerekli olabileceğini görmeden önce konfokal mikroskopi çekirdeği ile iletişime geçin.
  11. Görüntülemeye hazır olduğunuzda, her sandviçi bir alüminyum folyoya sarın ve tesise götürün.
  12. Z-yığını özelliğini kullanarak, kullanılan floroforlara bağlı olarak uygun dalga boyunu kullanarak membranın her iki tarafını ayrı ayrı tarayın. İkinci tarafı çevirin ve görüntüleyin. Lamelleri saklamak için 4 °C'de karanlıkta tutun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bağırsak bakterileri, kolon epiteli ve makrofajların Flipwell ko-kültürlerinin biyolojik uygunluğunu belirlemek için, kontrol DMSO'suna kıyasla nitrik oksit 9,10,11 üretimini teşvik etmek için ko-kültürleri arginin metabolizmasının bir modülatörü olan sepiapterin (SEP) ile tedavi ettik. SEP tedavisinin immünofloresan (IF) mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak ko-kültürlerin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bağırsak mukozal mimarisini in vitro olarak yeniden oluşturmak için, bağırsak bakterilerinin tabakalı katmanlarını, mukus üreten kolon epitel hücrelerini ve makrofajları içeren basit bir ortak kültür sistemi tasarladık. Bu çoklu ko-kültür sistemi, bakteriyel sekretom, bağırsak epiteli ve makrofajlar arasındaki karışmanın immünojenik yeniden programlama ve mukozal savunma mekanizmalarını indükleme üzerindeki etkilerini incelememize izin verdi.

3D Flipw...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Yazarlar, yasaların izin verdiği en geniş ölçüde, açık veya zımni tüm garantileri reddeder. Yazarlar hiçbir koşulda, herhangi bir tüzük, sözleşme, haksız fiil veya başka herhangi bir yasal teori kapsamında, Flipwell'lerin yapımında aletlerin kullanımından, BSL reaktiflerinin, hücre hatlarının, bakteri kültürlerinin kullanımından, Flipwell sisteminin anaerobik bir odada anaerobik ortamda kullanılmasından kaynaklanan veya bunlarla ilgili herhangi bir özel, arızi, dolaylı, cezai, çoklu veya sonuç olarak ortaya çıkan zararlardan sorumlu tutulamaz. Bu sorumluluk sınırlaması, burada açıkça açıklanmayan, belirtilmemiş herhangi bir Flipwell kullanım şeklini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir.

Teşekkürler

Birincil yazar, mükemmel mentorluk becerileri, uzun mesafelerde sürekli rehberlik ve destek ve harika öğrenme fırsatlarını teşvik eden becerikli ve sürekli proje tasarımı için Dr. Saori Furuta'ya içten şükranlarını sunar. Yazarlar ayrıca mikrobiyoloji uzmanlığı ve rehberliği için Dr. Vandana Sharma'ya ve THP-1 makrofajlarının hazırlanması için Dr. Veani R. Fernando'ya teşekkür eder.  Ek olarak, yazarlar Dr. Elektron Mikroskobu Tesisi'nden Andrew Kleinhenz ve William T. Gunning'e ve EM görüntüleme için yapıcı öneriler için Toledo Üniversitesi Enstrümantasyon Merkezi'nden Cassandra Zamora ve Kristin Kirschbaum'a teşekkür eder. Bu çalışma, Toledo Üniversitesi Sağlık Bilimleri Kampüsü, Tıp ve Yaşam Bilimleri Fakültesi, Kanser Biyolojisi Bölümü'nden SF'ye başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir; Ohio Kanser Yeniden Arama Hibesi (Proje #: 5017) SF'ye; Tıbbi Araştırma Derneği (Toledo Vakfı, #206298) Ödülü SF'ye; Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursu (RSG-18-238-01-CSM) SF'ye; ve SF'ye Ulusal Kanser Enstitüsü Araştırma Bursu (R01CA248304).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,4 PFA (tarife bakınız: Reagents and Solutions)Metinde anlatılır
10 ml'lik serolojik pipetCorning4488
12 kuyulu TC Plakası,  Yardımcı OyuncuCorning3513
15 ml'lik konik tüpler, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 µ l ipuçları USA Scientific1111-1700
24 kuyuklu insertler - 24 kuyu plakalar için kültür insertleri, PET 0.4 ve mikro; m BrandTech Scientific782710
3D Flipwell'ler hazır yapılmış, UV ile sterilize edilmiş ve nbsp;Laboratuvarda yap
%4 PFA (tarife bakınız: Reagents and Solutions)Metinde anlatılır
50 mM Sepiapterin stoku (SEP, Reaktifler ve Çözelti içindeki tarife bakınız)Kariyer Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
50 ml'lik konik tüplerGreiner Bio-One227261
5 ml'lik serolojik pipetCorning4487
%70-95 etanol (etil alkol)Decon Labs04-355-151
Alüminyum folyoFisher Scientific01-213-100
Hayvan Besleme İğneleri, 20 kalibre 1.5" uzunluk, tek kullanım Fisher Scientific01-208-87
Antikor Sulandırma Tamponu (Reaktif ve Çözeltiler içindeki tarife bakınız)Metinde anlatılır
Attofluor Hücre Odası ThermoFisher ScientificA7816
Otoklav bantFisher Scientific15-901-111
Bacillus subtilis wt (3A1T) gliserol stokunda suşları ()Bacillus Genetik Stok Merkezi (https:// bgsc. org/
BioGrip Pembe Nitril pudrasız lateks serbest eldivenEn Kaliteli ÜretimP2810
Bloklama Tamponu (Reagentler ve Çözeltiler - PBS'de %10 Normal Keçi Serumu içindeki tarife bakınız)Metinde anlatılır
Bloklama Tamponu (Reaktifler ve Çözümler bölümünde tarife bakınız)Metinde anlatılır
Brightfield mikroskobu (Nikon veya eşdeğeri) Eclipse Ts2NikonTS2
Caco-2 hücreleriATCCHTB-37
Hücre kültürü kuluçka makinesi, 37 derece ve derece; C, %5 CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Santrifüj (Eppendorf, Santrifüj 5804/5804 R veya eşdeğeriEppendorf22622501
Santrifüj tüpleri 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
12 kuyruklu plaka, PET, 0.4 ve mikro için kültür insertleri; m, sterilBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
DAPI VectaShield montaj ortamıVektör LaboratuvarlarıH-1000
Derin Petri kabı tabanları, 100 x 25 mm Derin Polistiren Üst Üstlenebilir Petri Kabı, steril ve nbsp;USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Yardım XPDrummond 4-000-101
Eppendorf 5804 50 ml konik tüpler için salıncak kovalı rotorlu santrifüjEppendorf22622501
Forseps, paslanmaz çelik, steril otoklavlı, 2x setVWR82027-438
Penset, paslanmaz çelik, steril otoklav, 2x set, Numune PensetlerVWR82027-438
Cam şişe 500 mlCorning 4980-500
Hemacytometer (Kapak kaymaları olan Neubauer)Thermo Fisher Scientific50-312-90
HT-29-MTX-E12 hücreleriMillipore Sigma12040401
ImmunoPen (isteğe bağlı)Fisher Scientific4021761EA
Kevlar bazlı veya diğer kesilmeye dayanıklı eldivenler (isteğe bağlı)Donanım mağazası veya Amazon
Laboratuvar bandı veya nakliye bandıFisher Scientific 159015R
Laminar Akış Başlığı 1300 Seri A2 BSC Sınıf IIThermoFisher Scientific1375
UV ışığı ile Laminar akış başlığı SterilGARDBaker ŞirketiSG403A-HE
İşatörler çözücü geçirmeVWR52877-310 veya 95042-566
Caco-2 hücreleri için ortam (DMEM Yüksek Glukoz bazlı, tarife Reagentler ve Çözeltiler bölümünde bakınız) 'de tanımlanmıştır; Metin
HT-29 hücreleri için ortam (DMEM Yüksek Glukoz, tarife Reaktifler ve Çözeltiler bölümünde bakınız)Metinde anlatılır
THP-1 hücreleri için ortam (RPMI, tarife bakınız: Reaktifler ve Çözümler)Metinde anlatılır
Mikrosantrifüj tüpü, 1.7 ml, steril & nbsp;Alkali ScientificC3017-ST
Mikrosantrifüj tüpleriThermo Fisher3451
Miller LB medyası (Reagents and Solutions'daki tarife bakınız)Sigma-Aldrich  L3522
İğneli burun penseleri, 2x setDonanım mağazası veya Amazon
Nitril tozsuz lateks serbest eldiven Aurelia MuhteşemMidSci92885
Petri kabı kapakları, steril Falcon Petri Dish steril 100x15 mm tarzıCorning Inc351029
Phorbol miristat asetat (PMA) (100 ng/μ l, Reagents and Solutions'da tarife bakınız) InvivoGenKısa Kısaca-pma
Pipet uçları (10 & mikro; L, 200 &Micro; L, 1000 &Micro; l) PurePoint veya eşdeğeriAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Plastik sargıBakkal
Purecol çalışan kollagenaz çözeltisi (100 µ g/mL)Gelişmiş BioMatrix5005-100ML
Yuvarlak kapak kağıtları #1 1 oz (Corning Float Cam veya Fisherbrand)Corning veya Fisherbrand50143822 veya 12-546-2 25CIR-2
Skalpel bıçakları, steril, tek kullanımlık Mopec veya Tüy #10AJ136 veya 2975#10
Sepiapterin (SEP, 100 & micro; M, Reaktifler ve Çözelti bölümünde tarife bakınız)Kariyer Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
220 rpm, 37° için sarsıntı kuluçka makinesi; CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
Silikon Yapıştırıcı Loctite Şeffaf Silikon IDH veya 3M Deniz Sınıfı Silikon Sızdırmazlık Maddesi Burun ucu ile şeffafLoctite veya 3M1745658 ya da PN08019
Tek kanallı pipet Eppendorf Research Plus, 200 µ lEppendorf
Tek kanallı pipetler (10 & mikro; L, 200 &Micro; L, 1000 &Micro; l)Eppendorf2231001122
Spektrofotometre NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Steril deionize su   
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen steril fosfat tamponlu serin (PBS)Fisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Luer-Lok Ucu ile 3 ml veya 5 ml şırıngaBD309585 ya da 309603
THP-1 hücreleriATCCTIB-202
Transfer pipetleri, sterilFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Tripan mavi çözeltisiVWR97063-702
Tripsin-EDTA %0,25Thermo Fisher Scientific25200-056
Kimwipes Professional LintGuard Anti-Stat Polyshield ile WipesKimberly-Clark34120
Birincil Antikorlar: 
Anti-insan CD163Abcam156769
İnsan karşıtı CD68Novus BiologicalsNB100-683-0.1 mg
Anti-insan CD80, E3Q9VHücre Sinyal Teknolojileri15416
İnsan karşıtı CK20 Yaşam TeknolojileriPA5-82875
İnsan karşıtı MUC2 (996/1)ThermoFisherMA5-12345
ikincil antikorlar:
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG (CD80 ve CK20 için)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Keçi Fare Karşıtı IgG (MUC2 ve CD68 veya CD163 için)ThermoFisherA11005
Reaktifler ve Çözümler:   
Caco-2 Orta:
yüksek glikozlu DMEM (4.5g/L) ve %1 (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS %10 (v:v) ısıyla inaktif edilmişSigmaF2242-500ML
Caco-2 ortamı için temel olmayan amino asitler %1Thermo Fisher Scientific11140076
Pen Streptokok %1 (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Orta
yüksek glikozlu DMEM (4.5g/L) ve %1 (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS %10 (v:v) ısıyla inaktif edilmişSigmaF2242-500ML
HEPES (10 mM nihai konsantrasyon)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Streptokok %1 (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Orta:
FBS (%10 v:v) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumuSigma F2242-500ML
Glikoz (4.5 g/L nihai konsantrasyon)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax %1 (v:v)  2 mM son konsantrasyonThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (10 mM nihai konsantrasyon)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Streptokok %1 (v:v)SigmaF2242-500ML
Roswell Park Anıt Enstitüsü (RPMI)-1640 ortaThermo Fisher Scientific11875119
Sodyum Piruvat (1 mM nihai konsantrasyon)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol çalışan kollajenaz çözeltisi (1:30 100 ve mikro dereceye seyreltme; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30'dan 100'e kadar ve mikro; g/ml Gelişmiş BioMatrix5005-100ML
steril deiyonize su
L-Sepiapterin stok çözeltisi (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)Kariyer Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Phorbol miristat asetat stok çözeltisi (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenKısa Kısaca-pma
BSA %1 sığır serum albümini Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
İkincil antikorla aynı türden normal serumSigma NS02L-1ML
ParaformaldehitSigma-Aldrich441244

Kaynaklar

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Ko-KültürBağırsak Mukozal ModeliBakteriyel Sekretomİmmün Hücre PolarizasyonuKolon Epitel HücreleriMakrofaj PolarizasyonuBiyofilm OluşumuSepiapterin Tedavisiİmmünofloresan Boyama
Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.