Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, 3D Flipwell mühendisliğine ve kullanımına rehberlik edecek temel adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ko-kültür ek yığınlarının nasıl bir araya getirileceğini ve bağırsak mukozal ortamını modellemek için bağırsak bakterileri, bağırsak epiteli ve makrofajların tabakalı katmanlarını birlikte kültürlemek için nasıl kullanılacağını açıklıyor ve gösteriyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel sekretomun bağışıklık hücresi polarizasyonu ve bağırsak mukozal homeostazındaki rollerini incelemek için, arka arkaya istiflenmiş bir formatta ticari olarak temin edilebilen ekleri kullanarak 3 boyutlu bir ortak kültür modeli geliştirdik. Bu sisteme 3D Flipwells adını verdik ve bağırsak mukozal mikro ortamını özetlemek için bakterileri, kolon epitelini ve bağışıklık hücrelerini tabakalı katmanlarda başarılı bir şekilde birlikte kültürledik. Bu ko-kültür sistemi, zarın bir tarafında kolon epitel hücrelerinin ve diğer tarafında farklılaşmamış yapışık olmayan monositlerin tohumlanmasını sağlayarak, kolon epitel polarizasyonunun, mukus oluşumunun ve monosit-makrofaj farklılaşmasının ve polarizasyonunun, önceden farklılaşmış makrofajların ayrılmasına ve yeniden kaplanmasına gerek kalmadan tek bir ko-kültür içinde senkronize ilerlemesine izin verir. Bu sistemin inşası kolaydır ve yalnızca birkaç hazır malzeme ve araç gerektirir. Ko-kültür bileşenlerinin, nitrik oksit sentazın (NOS) bir kofaktörü olan BH_4'ün (tetrahidrobiopterin) endojen öncüsü olan sepiapterine (SEP) tepkilerini analiz ederek faydasını test ettik. 3D Flipwell'in SEP tedavisinin bağırsak bakterileri tarafından biyofilm oluşumunu, kolon epiteli tarafından mukus üretimini ve makrofajların pro-immünojenik polarizasyonunu indüklediğini gösterdik. Bu, SEP'nin farklı hücresel bileşenler arasındaki karışma yoluyla mukozal savunma mekanizmasının aktivasyonunu tetiklediğini gösterdi. Bağışıklık hücresinin yeniden programlanmasına yol açan mukozal iletişimin rolünü araştırmak ve bu ortak kültür sisteminin yeni immünomodülatör tedavileri taramak için faydasını değerlendirmek için daha fazla deneye ihtiyaç vardır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık hücresi-bağırsak mikrobiyomu karışması, farklı hastalık tedavilerinin etkinliğini büyük ölçüde etkiler. Böyle bir karışma, konakçı metabolik anormallikleri, diyet değişiklikleri, hastalık tezahürü ve farmakolojik tedavi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere dış uyaranlarla belirgin şekilde değiştirilir. Bu değişiklikler, disbiyoz ^1,2,3 olarak adlandırılan bir durum olan mikroflora bileşiminde bir dengesizliğe yol açabilir.

Bağırsaktaki mikroplar ve konakçı bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D Flipwell mühendisliği

Tüm çalışmalar bir hücre kültürü kabini içinde yapılmalıdır. Tüm malzemeleri kabinin içine yerleştirin.
Petri kabının kapağını açın ve bir kenara koyun. Neşter bıçağını koruyucu kılıfından açın ve Petri kabının tabanının kenarına yerleştirin. Steriliteyi sağlayın.
DİKKAT: Neşter bıçağının dikkatli kullanılması gerekir. Gerekirse ellerinizi korumak için kesilmeye dayanıklı, elyaf takviyeli eldivenler kullanın.
12 oyuklu ticari ek parçanın steril koruyucu ambalajını açın. Steriliteyi sağlayın. Bir dizi steril cımbız alın. Ek parçayı yavaşça tutun ve ambalajı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak bakterileri, kolon epiteli ve makrofajların Flipwell ko-kültürlerinin biyolojik uygunluğunu belirlemek için, kontrol DMSO'suna kıyasla nitrik oksit ^9,10,11 üretimini teşvik etmek için ko-kültürleri arginin metabolizmasının bir modülatörü olan sepiapterin (SEP) ile tedavi ettik. SEP tedavisinin immünofloresan (IF) mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak ko-kültürlerin.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak mukozal mimarisini in vitro olarak yeniden oluşturmak için, bağırsak bakterilerinin tabakalı katmanlarını, mukus üreten kolon epitel hücrelerini ve makrofajları içeren basit bir ortak kültür sistemi tasarladık. Bu çoklu ko-kültür sistemi, bakteriyel sekretom, bağırsak epiteli ve makrofajlar arasındaki karışmanın immünojenik yeniden programlama ve mukozal savunma mekanizmalarını indükleme üzerindeki etkilerini incelememize izin verdi.

3D Flipw.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Yazarlar, yasaların izin verdiği en geniş ölçüde, açık veya zımni tüm garantileri reddeder. Yazarlar hiçbir koşulda, herhangi bir tüzük, sözleşme, haksız fiil veya başka herhangi bir yasal teori kapsamında, Flipwell'lerin yapımında aletlerin kullanımından, BSL reaktiflerinin, hücre hatlarının, bakteri kültürlerinin kullanımından, Flipwell sisteminin anaerobik bir odada anaerobik ortamda kullanılmasından kaynaklanan veya bunlarla ilgili herhangi bir özel, arızi, dolaylı, cezai, çoklu veya sonuç olarak ortaya çıkan zararlardan sorumlu tutulamaz. Bu sorumluluk sınırlaması, burada açıkça açıklanmayan, belirtilmemiş herhangi bir Flipwell kullanım şeklini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil yazar, mükemmel mentorluk becerileri, uzun mesafelerde sürekli rehberlik ve destek ve harika öğrenme fırsatlarını teşvik eden becerikli ve sürekli proje tasarımı için Dr. Saori Furuta'ya içten şükranlarını sunar. Yazarlar ayrıca mikrobiyoloji uzmanlığı ve rehberliği için Dr. Vandana Sharma'ya ve THP-1 makrofajlarının hazırlanması için Dr. Veani R. Fernando'ya teşekkür eder. Ek olarak, yazarlar Dr. Elektron Mikroskobu Tesisi'nden Andrew Kleinhenz ve William T. Gunning'e ve EM görüntüleme için yapıcı öneriler için Toledo Üniversitesi Enstrümantasyon Merkezi'nden Cassandra Zamora ve Kristin Kirschbaum'a teşekkür eder. Bu çalışm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
%0,4 PFA (tarife bakınız: Reagents and Solutions)	Metinde anlatılır
10 ml'lik serolojik pipet	Corning	4488
12 kuyulu TC Plakası, Yardımcı Oyuncu	Corning	3513
15 ml'lik konik tüpler, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 µ l ipuçları	USA Scientific	1111-1700
24 kuyuklu insertler - 24 kuyu plakalar için kültür insertleri, PET 0.4 ve mikro; m	BrandTech Scientific	782710
3D Flipwell'ler hazır yapılmış, UV ile sterilize edilmiş ve nbsp;	Laboratuvarda yap
%4 PFA (tarife bakınız: Reagents and Solutions)	Metinde anlatılır
50 mM Sepiapterin stoku (SEP, Reaktifler ve Çözelti içindeki tarife bakınız)	Kariyer Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
50 ml'lik konik tüpler	Greiner Bio-One	227261
5 ml'lik serolojik pipet	Corning	4487
%70-95 etanol (etil alkol)	Decon Labs	04-355-151
Alüminyum folyo	Fisher Scientific	01-213-100
Hayvan Besleme İğneleri, 20 kalibre 1.5" uzunluk, tek kullanım	Fisher Scientific	01-208-87
Antikor Sulandırma Tamponu (Reaktif ve Çözeltiler içindeki tarife bakınız)	Metinde anlatılır
Attofluor Hücre Odası	ThermoFisher Scientific	A7816
Otoklav bant	Fisher Scientific	15-901-111
Bacillus subtilis wt (3A1T) gliserol stokunda suşları ()	Bacillus Genetik Stok Merkezi (https:// bgsc. org/
BioGrip Pembe Nitril pudrasız lateks serbest eldiven	En Kaliteli Üretim	P2810
Bloklama Tamponu (Reagentler ve Çözeltiler - PBS'de %10 Normal Keçi Serumu içindeki tarife bakınız)	Metinde anlatılır
Bloklama Tamponu (Reaktifler ve Çözümler bölümünde tarife bakınız)	Metinde anlatılır
Brightfield mikroskobu (Nikon veya eşdeğeri) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Caco-2 hücreleri	ATCC	HTB-37
Hücre kültürü kuluçka makinesi, 37 derece ve derece; C, %5 CO2 (Eppendorf CellXpert)	Eppendorf	6734010015
Santrifüj (Eppendorf, Santrifüj 5804/5804 R veya eşdeğeri	Eppendorf	22622501
Santrifüj tüpleri 50 ml SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
12 kuyruklu plaka, PET, 0.4 ve mikro için kültür insertleri; m, steril	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT	782730
DAPI VectaShield montaj ortamı	Vektör Laboratuvarları	H-1000
Derin Petri kabı tabanları, 100 x 25 mm Derin Polistiren Üst Üstlenebilir Petri Kabı, steril ve nbsp;	USA Scientific	8609-0625
Drummond Pipet Yardım XP	Drummond	4-000-101
Eppendorf 5804 50 ml konik tüpler için salıncak kovalı rotorlu santrifüj	Eppendorf	22622501
Forseps, paslanmaz çelik, steril otoklavlı, 2x set	VWR	82027-438
Penset, paslanmaz çelik, steril otoklav, 2x set, Numune Pensetler	VWR	82027-438
Cam şişe 500 ml	Corning	4980-500
Hemacytometer (Kapak kaymaları olan Neubauer)	Thermo Fisher Scientific	50-312-90
HT-29-MTX-E12 hücreleri	Millipore Sigma	12040401
ImmunoPen (isteğe bağlı)	Fisher Scientific	4021761EA
Kevlar bazlı veya diğer kesilmeye dayanıklı eldivenler (isteğe bağlı)	Donanım mağazası veya Amazon
Laboratuvar bandı veya nakliye bandı	Fisher Scientific	159015R
Laminar Akış Başlığı 1300 Seri A2 BSC Sınıf II	ThermoFisher Scientific	1375
UV ışığı ile Laminar akış başlığı SterilGARD	Baker Şirketi	SG403A-HE
İşatörler çözücü geçirme	VWR	52877-310 veya 95042-566
Caco-2 hücreleri için ortam (DMEM Yüksek Glukoz bazlı, tarife Reagentler ve Çözeltiler bölümünde bakınız)	'de tanımlanmıştır; Metin
HT-29 hücreleri için ortam (DMEM Yüksek Glukoz, tarife Reaktifler ve Çözeltiler bölümünde bakınız)	Metinde anlatılır
THP-1 hücreleri için ortam (RPMI, tarife bakınız: Reaktifler ve Çözümler)	Metinde anlatılır
Mikrosantrifüj tüpü, 1.7 ml, steril & nbsp;	Alkali Scientific	C3017-ST
Mikrosantrifüj tüpleri	Thermo Fisher	3451
Miller LB medyası (Reagents and Solutions'daki tarife bakınız)	Sigma-Aldrich	L3522
İğneli burun penseleri, 2x set	Donanım mağazası veya Amazon
Nitril tozsuz lateks serbest eldiven Aurelia Muhteşem	MidSci	92885
Petri kabı kapakları, steril Falcon Petri Dish steril 100x15 mm tarzı	Corning Inc	351029
Phorbol miristat asetat (PMA) (100 ng/μ l, Reagents and Solutions'da tarife bakınız)	InvivoGen	Kısa Kısaca-pma
Pipet uçları (10 & mikro; L, 200 &Micro; L, 1000 &Micro; l) PurePoint veya eşdeğeri	Alkali Scientific	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Plastik sargı	Bakkal
Purecol çalışan kollagenaz çözeltisi (100 µ g/mL)	Gelişmiş BioMatrix	5005-100ML
Yuvarlak kapak kağıtları #1 1 oz (Corning Float Cam veya Fisherbrand)	Corning veya Fisherbrand	50143822 veya 12-546-2 25CIR-2
Skalpel bıçakları, steril, tek kullanımlık	Mopec veya Tüy #10	AJ136 veya 2975#10
Sepiapterin (SEP, 100 & micro; M, Reaktifler ve Çözelti bölümünde tarife bakınız)	Kariyer Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
220 rpm, 37° için sarsıntı kuluçka makinesi; C	Eppendorf New Brunswick Scientific	M12990080
Silikon Yapıştırıcı Loctite Şeffaf Silikon IDH veya 3M Deniz Sınıfı Silikon Sızdırmazlık Maddesi Burun ucu ile şeffaf	Loctite veya 3M	1745658 ya da PN08019
Tek kanallı pipet Eppendorf Research Plus, 200 µ l	Eppendorf
Tek kanallı pipetler (10 & mikro; L, 200 &Micro; L, 1000 &Micro; l)	Eppendorf	2231001122
Spektrofotometre NanoDropOneC	Thermo Fisher Scientific	13-400-519
Steril deionize su
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen steril fosfat tamponlu serin (PBS)	Fisher Scientific	BSS-PBS-1X6
Luer-Lok Ucu ile 3 ml veya 5 ml şırınga	BD	309585 ya da 309603
THP-1 hücreleri	ATCC	TIB-202
Transfer pipetleri, steril	Fisherbrand	13-711-20
Triton X-100	Millipore Sigma	X100
Tripan mavi çözeltisi	VWR	97063-702
Tripsin-EDTA %0,25	Thermo Fisher Scientific	25200-056
Kimwipes Professional LintGuard Anti-Stat Polyshield ile Wipes	Kimberly-Clark	34120
Birincil Antikorlar:
Anti-insan CD163	Abcam	156769
İnsan karşıtı CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0.1 mg
Anti-insan CD80, E3Q9V	Hücre Sinyal Teknolojileri	15416
İnsan karşıtı CK20	Yaşam Teknolojileri	PA5-82875
İnsan karşıtı MUC2 (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
ikincil antikorlar:
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG (CD80 ve CK20 için)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Keçi Fare Karşıtı IgG (MUC2 ve CD68 veya CD163 için)	ThermoFisher	A11005
Reaktifler ve Çözümler:
Caco-2 Orta:
yüksek glikozlu DMEM (4.5g/L) ve %1 (v:v) GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS %10 (v:v) ısıyla inaktif edilmiş	Sigma	F2242-500ML
Caco-2 ortamı için temel olmayan amino asitler %1	Thermo Fisher Scientific	11140076
Pen Streptokok %1 (v:v)	Sigma	F2242-500ML
HT-29-MTX Orta
yüksek glikozlu DMEM (4.5g/L) ve %1 (v:v) GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS %10 (v:v) ısıyla inaktif edilmiş	Sigma	F2242-500ML
HEPES (10 mM nihai konsantrasyon)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Pen Streptokok %1 (v:v)	Sigma	F2242-500ML
THP-1 Orta:
FBS (%10 v:v) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu	Sigma	F2242-500ML
Glikoz (4.5 g/L nihai konsantrasyon)	Thermo Fisher Scientific	A249001
GlutaMax %1 (v:v) 2 mM son konsantrasyon	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES (10 mM nihai konsantrasyon)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Pen Streptokok %1 (v:v)	Sigma	F2242-500ML
Roswell Park Anıt Enstitüsü (RPMI)-1640 orta	Thermo Fisher Scientific	11875119
Sodyum Piruvat (1 mM nihai konsantrasyon)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Purecol çalışan kollajenaz çözeltisi (1:30 100 ve mikro dereceye seyreltme; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30'dan 100'e kadar ve mikro; g/ml	Gelişmiş BioMatrix	5005-100ML
steril deiyonize su
L-Sepiapterin stok çözeltisi (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)	Kariyer Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Phorbol miristat asetat stok çözeltisi (PMA, 5 mg/mL)	InvivoGen	Kısa Kısaca-pma
BSA %1 sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	5470
DMSO	Sigma	D2650
Miller LB	Sigma-Aldrich	L3522
İkincil antikorla aynı türden normal serum	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles