Yöntem makalesi

Orta Kızılötesi Mikroskop Kılavuzlu Kütle Spektrometresi Görüntüleme ile Çok Modlu Uzamsal Metabolomik

DOI:

10.3791/68709

⸱

25 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Shanghai Xuhui Central Hospital, Zhongshan-Xuhui Hospital, 3Children's Hospital of Fudan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzamsal olarak çözülmüş metabolik ve biyokimyasal analiz için kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) ve orta kızılötesi (MIR) görüntülemeyi aynı doku kesitinde entegre eden çok modlu bir uzamsal metabolomik iş akışı sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekansal metabolomik, dokular, organlar ve hatta tek hücreler içindeki metabolitlerin dağılımını haritalamak için hızla gelişen bir alandır. Bu yaklaşım, biyolojik sistemlerin biyokimyasal heterojenliğini anlamak için kritik olan bağlamsal metabolik bilgi sağlar. Orta kızılötesi (MIR) görüntüleme ve kütle spektrometresi görüntüleme (MSI), uzamsal metabolomikler için her biri benzersiz ve tamamlayıcı avantajlar sunan güçlü yaklaşımlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, aynı doku kesiti üzerinde MIR görüntüleme ve matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon MSI (MALDI-MSI) gerçekleştirmek için deneysel prosedürler, görüntüleme ortak kaydı, veri entegrasyonu ve biyoinformatik analizi kapsayan bir iş akışı sunuyoruz. MIR görüntüleme, dokuların tahribatsız biyokimyasal analizine izin veren yukarı akış modalitesi olarak kullanılır. Daha sonra, MIR görüntülemeden elde edilen uzamsal bilgiler tarafından yönlendirilen MALDI-MSI için dokuda bir matris biriktirilir. Görüntüler, Seurat gibi gelişmiş biyoinformatik araçları kullanarak çok modlu uzamsal metabolomik analize olanak tanıyan ortak kaydın ardından entegre edilir. MIR görüntüleme ve MSI'nin entegrasyonu, mekansal metabolomikte dönüştürücü bir ilerlemeyi temsil eder ve hem sağlık hem de hastalıkta metabolik süreçlerin mekansal ve kimyasal karmaşıklığını keşfetmek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Bu çok modlu yaklaşım, biyobelirteç keşfi, hastalık teşhisi ve terapötik geliştirmede yenilikleri yönlendirmek için önemli bir potansiyele sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekansal metabolomik, kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) veya diğer uzamsal olarak çözülmüş teknikleri metabolik analizle entegre ederek metabolitlerin doğal doku bağlamları içinde haritalanmasını içerir ve alt doku, hücresel veya hücre altı çözünürlükte metabolizma hakkında bilgi sunar 1,2,3,4,5,6,7,8 . Bu görüntüleme modaliteleri arasında, orta kızılötesi (MIR) mikroskobu, moleküler titreşim kontrastına dayalı olarak biyomolekülleri kimyasal olarak haritalama yeteneği nedeniyle artan ilgi görmektedir 4,7,9,10,11,12. Tahribatsız, etiketsiz, yüksek hızlı ve uygun maliyetli doğası 4,7,9,10,11,12, MIR görüntülemeyi MSI ile entegrasyon için özellikle uygun hale getirir ve kapsamlı uzamsal analiz için umut verici bir çok modlu yaklaşım oluşturur.

Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu MSI (MALDI-MSI), uzamsal metabolomikte en yaygın kullanılan tekniklerden biridir (Şekil 1A)13. Lipitler, amino asitler, şekerler, nükleotidler ve ikincil metabolitler dahil olmak üzere çok çeşitli metabolitlerin yüksek hassasiyetle tespit edilmesini sağlar1. Matris seçimindeki ilerlemeler (örneğin, 2,5-dihidroksibenzoik asit [DHB], 9-aminoakridin [9AA] veya N- (1-naftil) etilendiamin dihidroklorür [NEDC]) ve iyonizasyon teknikleri (örneğin, iyonizasyon sonrası yöntemler), özellikle düşük bolluklu ve zayıf iyonlaşabilen türler için algılama kapsamını daha da genişletmiştir14. Modern MALDI-MSI sistemleri, uzamsal çözünürlüğe ve kullanılan kütle analizörünün türüne bağlı olarak tipik olarak saniyede 5 ila 50 piksel arasında değişen görüntüleme hızlarını destekler (örneğin, uçuş süresi [TOF], Orbitrap veya Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonansı [FT-IRC]). Özellikle, yüksek hızlı MALDI-TOF cihazları saniyede 100 pikseli aşan hızlara ulaşarak birkaç saat içinde geniş alanlı görüntülemeyi mümkün kılmıştır15. MALDI-MSI'nin uzamsal çözünürlüğü genellikle 5 ila 50 μm arasındadır, bu da hücresel ve hatta hücre altı yapıları çözmek için yeterlidir16,17. Bununla birlikte, daha yüksek uzamsal çözünürlük tipik olarak daha uzun çekim süreleri, azaltılmış sinyal-gürültü oranı ve veri işleme sırasında daha fazla hesaplama talebi pahasına gelir.

MSI'dan farklı olarak, MIR görüntüleme geniş alanlı bir optik yaklaşımdır4, bu da onu doğası gereği tahribatsız ve yüksek verimli hale getirir. Yüksek güçlü kuantum kaskad lazerlerdeki (QCL'ler) son gelişmeler, görüntüleme hızını video hızına kadar önemli ölçüde artıran ayrık frekanslı kızılötesi (DFIR) görüntüleme olarak bilinen yeni bir çerçeveyi mümkün kılar (Şekil 1B)12,18. Ek olarak, QCL kaynakları, soğutulmamış mikrobolometre dedektörlerini MIR görüntüleme için uygun hale getirerek daha büyük odak düzlemi dizisi (FPA) dedektörlerininkullanılmasını sağlamıştır 12. Sonuç olarak, 1cm2'lik bir alan üzerinde tek frekanslı bir MIR görüntüsü, sadece birkaç saniye içinde hücresel çözünürlükle (~ 5 μm) elde edilebilir. MIR görüntüleme hem etiketsiz hem de etiketli modlarda çalışabilir. Önceki çalışmalarda 4,19,20, çeşitli metabolik aktivitelerin kinetiğini yerinde izlemek için küçük IR aktif titreşim probları tanıtılmıştır. Bu problar, benzersiz MIR spektral bantları4 aracılığıyla küresel kimyasal dönüşümleri raporlayarak metabolik yolların gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Böylece MIR görüntüleme, yüksek uzamsal çözünürlük ve hızlı alım hızı ile hem statik biyokimyasal profilleme hem de dinamik metabolik izleme sağlar.

Bu yazıda, MIR kılavuzluğunda MALDI-MSI mekansal metabolomiklerini gerçekleştirmek için kapsamlı bir iş akışı sunuyoruz ve bu da aynı örnekten her iki modaliteyi elde etmenin fizibilitesini gösteriyor (Şekil 2, Şekil 3). MIR görüntülemeyi MSI ile entegre ederek, her tekniğin tamamlayıcı güçlü yönlerinden yararlanan çok modlu bir yaklaşım oluşturuyoruz. MIR görüntüleme, tüm slaytın hücresel çözünürlükte hızlı, etiketsiz biyokimyasal haritalandırılmasını sağlar ve sonraki MSI alımında ilgi bölgesi (ROI) seçimi için değerli bir kılavuz görevi görür. Bu strateji, daha hedefli ve verimli bir MSI iş akışı sağlayarak edinim süresini ve maliyetini azaltırken mekansal metabolomik verilerin yorumlanabilirliğini ve biyolojik uygunluğunu artırır. Buna karşılık, MSI, MIR hiperspektral görüntülerinin son derece ayrıntılı moleküler açıklamalarını sağlayarak doku biyokimyasının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Genel olarak, bu entegre yaklaşım, biyobelirteç keşfini, hastalık teşhisini ve terapötik geliştirmeyi ilerletmek için büyük bir potansiyele sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Fudan Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan deney protokolüne (DSF-2024-004) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Bu çalışma, aynı doku kesitinde MIR görüntüleme ve MALDI-MSI gerçekleştirmek için bir iş akışı sağlar. Bu entegre yaklaşım, deneysel prosedürleri, görüntü ortak kaydını, veri füzyonunu ve aşağı akış biyoinformatik analizini kapsar (Şekil 1C). MIR görüntüleme, dokunun tahribatsız, etiketsiz biyokimyasal haritalanmasını sağlayan yukarı akış modalitesi olarak kullanılır. MIR görüntülemeden elde edilen uzamsal bilgilerin rehberliğinde, daha sonra MALDI-MSI edinimi için bir matris uygulanır. Kesin ortak kaydın ardından, veri kümeleri çok değişkenli ortak analiz için entegre edilir (Şekil 4), gelişmiş hesaplama araçları aracılığıyla kapsamlı uzamsal metabolomiklere olanak tanır.

1. Numune hazırlama

  1. Doku örneği hazırlama
    1. Fare dokusu toplama
      1. Ev C57BL / 6J fareleri (20 haftalık, 40 g) belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde tutulur ve deneyden önce optimal sağlığı sağlamak için yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlanır.
      2. Derin anesteziyi sağlamak için fareyi vücut ağırlığının 50 mg / kg'lık bir dozunda intraperitoneal pentobarbital sodyum enjeksiyonu ile uyuşturun. Hayvanı izleyin ve perfüzyona devam etmeden önce pedal ve kornea reflekslerinin olmadığını onaylayın.
      3. Heparin (5 IU / mL) içeren yaklaşık 20-30 mL soğuk PBS'yi sol ventrikülden 150 mmHg'lik kontrollü bir basınçta 6 dakika boyunca kanı boşaltmak ve çıkarmadan önce kan kaybını sağlamak için perfüze edin.
      4. Toplanan tüm dokuları hemen sıvı nitrojen ile söndürün ve daha fazla analiz için -80 °C'de saklayın.
        NOT: Doku morfolojisini bozabilen buz kristali oluşumunu önlemek için hızlı dondurma şarttır.
    2. Doku gömme ve kriyo-kesit alma
      1. Mikrotomu -20 °C'ye ayarlayın ve artık gömme ortamını ortadan kaldırmak için hazneyi ve bıçağı etanol (EtOH) ile dekontamine edin. CaF2 slaytlarının, slayt postasının, numune tutucunun ve doku numunesinin kriyostat içinde dengelenmesine izin verin.
      2. Dokuyu yaklaşık 5 mm × 5 mm × 3 mm olacak şekilde kesin. -20 °C'de standart bir kriyomold içinde% 10 jelatin içine gömün ve kesit için uygun yönlendirmeyi sağlayın. Gömülü numuneyi kuru buz üzerinde dondurun ve kriyoseksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
      3. Dokuyu kalıbından çıkarın, kesiti optimize etmek için fazla malzemeyi kesin ve stabil yapışmayı sağlamak için ultra saf su kullanarak numune tutucuya yapıştırın.
      4. 10 μm kalınlığında kesitler kesin ve kesitleri önceden kaplanmış CaF2 alt tabakalara hareketsiz hale getirin ve -80 °C'de saklayın.
      5. Monte edilmiş doku bölümlerini, orta kızılötesi görüntülemeden önce vakumlu dondurarak kurutucuya yerleştirin. Oda basıncını 0,1 mPa'ya ve sıcaklığı -100 °C'ye ayarlayın. Numuneleri 30 dakika kurutun.
  2. Hücre numunesi hazırlama
    1. 1.25 × 105 HeLa hücrelerini, standart kültür plakalarına yerleştirilmiş 13 mm çapında dairesel CaF2 substratları üzerine tohumlayın. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) kullanın. Hücreleri standart kültür koşullarında (37 °C,% 5 CO2) 24 saat inkübe edin.
    2. 24 saat sonra, ortamı dikkatlice çıkarın ve hücreleri, oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca PBS tamponunda çözülmüş% 4 paraformaldehit (PFA) içinde inkübe ederek sabitleyin.
    3. Sabit hücreleri HBSS tamponu ile üç kez durulayın, ardından ddH2O ile üç kez daha yıkayın.
    4. MIR görüntülemeye devam etmeden önce CaF2 alt tabakalarını RT'de tamamen havayla kurutun.

2. Çok modlu görüntü elde etme

  1. Kuantum kaskad lazer (QCL) MIR görüntü alımı
    1. N olmayan2 sıvı soğutmalı mikrobolometre, 520 × 480 odak düzlemi dizisi (FPA) dedektörü ve uzamsal tutarlılık azaltma teknolojisi ile donatılmış bir QCL-MIR mikroskobu kullanarak QCL MIR görüntüleme mikroskobu gerçekleştirin.
    2. 950 cm-1 ila 1800 cm-1 arasında spektral aralığı seçin.
    3. 0,6 sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip 4,25 μm'lik bir nominal piksel boyutu elde eden 4,25 ×'lik bir objektif kullanın.
    4. Temiz bir CaF2 alt tabakası üzerinde 4 cm-1 spektral çözünürlükte bir arka plan spektrumu toplayın.
    5. Doku morfolojisine dayalı olarak toplama alanını seçin ve 4 cm-1 spektral çözünürlükte spektral verileri toplayın. Bu spektral çözünürlükte, görüntü elde etme hızı yaklaşık 0,3 mm2/s'dir.
      NOT: Tüm ölçümler, manuel odak ayarı ile CaF2 kızakları kullanılarak iletim modunda gerçekleştirilir.
  2. Kütle spektrometresi görüntü alımı
    1. Matris uygulaması
      1. MALDI-MSI için MIR sonrası doku kesitlerini kullanın, bir Tippex kalemi kullanarak dokunun etrafına referans işaretleyiciler uygulayın ve görüntü kaydı için düz yataklı bir tarayıcı ile MSI öncesi optik görüntü yakalayın.
      2. NEDC matrisini metanol/asetonitril/deiyonize suda (V/V/V=75:25:5) 7 mg/mL'de hazırlayın, ardından partikülleri gidermek için 0,2 μm'lik bir membrandan süzün.
      3. İşaretli doku slaytlarını otomatik bir matris püskürtücüye yükleyin. NEDC matrisini numuneye dağıtınampönceden tanımlanmış parametreleri kullanarak.
    2. MALDI-MSI ölçümü
      1. Harici bir kütle kalibrasyon standardı olarak hizmet etmek için CaF0.2 sürgüsüne 2 μL kırmızı fosfor süspansiyonu bırakın.
      2. Matris kaplı sürgüyü sürgü adaptörüne sabitleyin ve tutucu ile optimum elektrik teması sağlayın. Plakayı bir MALDI-MSI sistemine yükleyin.
      3. Referans işaretleyicileri kullanarak slaydın optik görüntüsünü MALDI aşamasının XY motor koordinatlarıyla hizalayın. Doku analizi için ROI'leri tanımlayın ve negatif kontrol olarak "yalnızca matris" bir alanı dahil edin.
      4. Cihazı, 50-1000 m/z aralığını kapsayan 20 × 20 μm2 piksel boyutuyla negatif iyon modunda yapılandırın. Veri toplamaya başlamadan önce kırmızı fosfor noktasını kullanarak kütle kalibrasyonu yapın. Ticari bir veri analizi platformu kullanarak veri toplama işlemi gerçekleştirin.

3. Görüntü verilerinin ön işleme ve analizi

NOT: MATLAB özel kodları Ek Dosya 1 olarak yüklenir.

  1. QCL-MIR veri ön işleme ve analizi
    1. Veri ön işleme
      1. Daha fazla analiz için hiperspektral verileri uygun bir formatta dışa aktarın.
      2. Aşağıdaki adımları izleyerek CytoSpec ve MATLAB kullanarak veri ön işleme gerçekleştirin 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Ön işleme için MIR spektral verilerini CytoSpec v2.00.07'ye aktarın.
      4. CytoSpec'teki yerleşik kalite testleri modülünü kullanarak spektral kaliteyi değerlendirin. Numune tutarlılığını değerlendirmek için kriter 2'yi (numune kalınlığı) seçin. Spektral entegrasyon aralığını 950-1800 cm-1 olarak ayarlayın. Aşırı ince veya kalın bölgelerden spektrumları dışlamak için 50 ile 1000 birim arasındaki absorbans eşiklerini tanımlayın.
      5. CytoSpec'te PCA tabanlı filtrelemeyi kullanarak gürültüyü azaltın. Temel biyokimyasal varyansı korurken yüksek frekanslı gürültüyü ortadan kaldırmak için ilk 10 ana bileşeni (PC'ler) koruyun.
      6. MATLAB'da daha fazla analiz için önceden işlenmiş spektral verileri CytoSpec'ten .mat formatında dışa aktarın.
      7. Temel kaymayı ortadan kaldırmak ve spektral doğruluğu artırmak için 950-1800 cm-1 spektral aralığı boyunca bir lastik bant düzeltme algoritması kullanarak MATLAB'da temel düzeltme gerçekleştirin.
      8. Tüm spektrumlardaki yoğunlukları standartlaştırmak ve veri kümesi boyunca karşılaştırılabilirliği sağlamak için aynı spektral aralıkta min-maks ölçeklendirme kullanarak spektral normalleştirme uygulayın.
    2. Veri analizi
      1. Sırasıyla amid II ve amid I bantlarına karşılık gelen 1.550 cm-1 ve 1.650 cm-1'de proteinle ilişkili özellikleri tanımlayın. Ester C=O germe titreşimini temsil eden 1.740 cm-1'de lipid ile ilişkili özellikleri tanımlayın.
      2. Amid I bandının (1650 cm-1) ester C=O gerginliğine (1740 cm-1) yoğunluk oranını hesaplayın ve uzamsal lipit-protein dağılımını görselleştirmek için oran haritaları oluşturun.
      3. Denetimsiz küme analizi: Bölgeleri spektral benzerliğe göre sınıflandırmak için Öklid mesafesini ve Ward'ın bağlantısını kullanarak hiperspektral veriler üzerinde hiyerarşik kümeleme analizi (HCA) gerçekleştirin. Biyokimyasal olarak farklı bölgeleri tanımlamak ve yapısal veya patolojik farklılıkları ortaya çıkarmak için küme haritaları oluşturun.
  2. MSI veri ön işleme ve analizi
    1. Ham MSI verilerini ticari bir veri analizi platformuna aktarın.
    2. %0,01'> bağıl yoğunlukta tepe toplama gerçekleştirin.
    3. Matristen türetilen tepe noktalarını, yalnızca matris kontrol bölgesinden elde edilen spektrumla karşılaştırarak deneysel tepe listesinden çıkarın. Kontrol spektrumunda görünen ve sinyal-gürültü oranı (SNR) 3'ten az olan tüm tepe noktalarını çıkarın.
    4. Pikseller ve örnekler arasında iyon sinyali yoğunluğundaki değişkenliği hesaba katmak için veri kümesini Ortalama Kök Kare (RMS) olarak normalleştirin.
    5. Doku dağılımlarına göre özellikleri filtreleyerek metabolit tanımlamasını iyileştirin, İnsan Metabolom Veritabanındaki (HMDB) girişlerle eşleştirin ve teorik m / z değerleriyle anlaşın.
    6. Deneysel hedeflere ve doku bağlamına göre ilgili metabolitleri seçin.
    7. Tüm pikseller için seçilen unsurların yoğunluklarını CSV dosyası olarak dışa aktarın.
    8. Veri karmaşıklığını azaltmak ve Seurat ve Banksy gibi biyoinformatik araçları kullanarak benzer metabolik imzalara sahip piksel kümelerini belirlemek için boyutsallık azaltma tekniklerini (örneğin, PCA, t-SNE veya UMAP) uygulayın ve mekansal metabolik heterojenliğin görselleştirilmesini kolaylaştırın.

4. Çok modlu görüntü ortak kaydı ve ortak analizi

  1. Ortak kayıt için uzamsal referans olarak 1650 cm-1'de elde edilen MIR görüntüsünü seçin. Bu spesifik dalga numarası, güçlü doku kontrastı sunan amid I protein bandını vurgular.
  2. Görsel karşılaştırılabilirliği artırmak için hem MIR hem de MSI görüntülerinin yoğunluk değerlerini normalleştirin. Görüntü yoğunluklarını yeniden dağıtmak ve yer işareti seçimi için kritik olan yapısal özelliklerin görünürlüğünü artırmak için MATLAB'deki histeq işlevini kullanarak histogram eşitleme gibi kontrast geliştirme tekniklerini uygulayın.
  3. Görüntü İşleme Araç Kutusu'ndaki cpselect işlevini kullanarak hem MIR hem de MSI görüntülerini MATLAB'a yükleyin. Bu işlev, yer işareti seçimi için etkileşimli bir arabirim açar.
  4. cpselect işlevini kullanarak hem MIR hem de MSI görüntülerinde anatomik olarak ilgili ve iyi dağıtılmış beş ila on kontrol noktasına manuel olarak açıklama ekleyin. Bu yer işaretleri, doku sınırları gibi farklı morfolojik özelliklere karşılık gelmelidir.
    NOT: Yerelleştirilmiş bozulmayı en aza indirmek için kontrol noktalarını görüntü alanı boyunca eşit olarak dağıtın.
  5. Her iki görüntüden açıklamalı kontrol noktalarının koordinatlarını dışa aktarın ve kaydedin. Bunları dönüştürme hesaplaması için eşleşen iki dizi olarak saklayın (örneğin, movingPoints ve fixedPoints).
  6. Afin modunda MATLAB fonksiyonu fitgeotrans kullanarak bir afin dönüşüm matrisi hesaplayın. Bu dönüştürme ölçeklendirme, döndürme, çevirme ve yamultmayı hesaba katar.
  7. MATLAB'daki imwarp işlevini kullanarak hesaplanan dönüştürmeyi MSI görüntüsüne uygulayın. Bu adım, MIR referans çerçevesine geometrik olarak hizalanmış, uzamsal olarak kaydedilmiş bir MSI görüntüsü oluşturur.
  8. MSI ve MIR görüntülerini üst üste bindirmek ve yapısal özelliklerin doğru şekilde kaydedildiğini onaylamak için karışım modunda imshowpair işlevini kullanarak hizalamayı görsel olarak inceleyin.
  9. MATLAB'da imbinarize işlevini kullanarak hem kayıtlı MSI görüntüsünü hem de referans MIR görüntüsünü ikili maskelere dönüştürün.
  10. İki ikili maske arasındaki uzamsal örtüşmeyi ölçmek için Zar Benzerlik Katsayısı'nı (DSC) hesaplayın. DSC şu şekilde tanımlanır: DSC = 2 × (Örtüşme Alanı)/(Her İki Maskenin Toplam Alanı). 1.0'a yaklaşan bir DSC değeri, yüksek uzamsal örtüşme ve kayıt doğruluğunu gösterir.
    NOT: Gerekirse, kontrol noktalarının sayısını veya yerleşimini ayarlayarak ve dönüştürme işlemini tekrarlayarak kaydı iyileştirin. Yerel yanlış hizalamalar devam ederse katı olmayan kayıt yöntemlerini göz önünde bulundurun.
  11. Biyokimyasal ve yapısal özelliklerin uzamsal korelasyonu gibi aşağı akış çok modlu görüntü analizi için kayıtlı görüntüyü, dönüştürme parametrelerini ve yer işareti koordinatlarını kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan çok modlu mekansal metabolomik stratejiyi doğrulamak için, bunu bir fare kanser modelinde uyguladık. Tümör hücreleri, yeşil floresan proteini (GFP) eksprese etmek için genetik olarak modifiye edildi ve floresan görüntüleme yoluyla tümör bölgesinin hassas lokalizasyonunu sağladı. Şekil 2A, "parmak izi bölgesi" olarak bilinen 950-1800 cm-1 spektral kapsama alanına sahip etiketsiz QCL-MIR görüntüleme sonuçlarını göstermektedir. P=O gerilmesi (1240 cm-1, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, aynı numuneler üzerinde yüksek verimli, moleküler olarak spesifik metabolik profilleme sağlamak için MSI ve MIR görüntülemeyi entegre eden çok modlu bir mekansal metabolomik strateji sunuyoruz. MIR görüntüleme, moleküler titreşimlere dayalı etiketsiz, tahribatsız kimyasal haritalama sağlayarak ayrıntılı yapısal ve işlevsel grup bilgileri sağlar. Buna karşılık, MSI, metabolit tanımlaması ve miktar tayini için yüksek hassasiyet ve özgüllük sağlar ve onu metabolomik araştırmaların t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Westlake Üniversitesi'nden Dr. Yilong Zou'ya MALDI2-MSI görüntüleme konusundaki destekleri için ve Bruker Scientific Technology Co., Ltd. Şanghay ofisine QCL tabanlı MIR görüntüleme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Dr. Shuguo Sun'a KrasLSL-G12D/+ Tp53fl/fl Rb1fl/fl ZsgreenLSL fareleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Bulaşıcı Olmayan Kronik Hastalıklar-Ulusal Bilim ve Teknoloji Ana Programı (2023ZD0500400'den L.S., G.W. ve D.Y.'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 22377016'dan L.S.'ye) ve Fudan Üniversitesi ve Cao'ejiang Temel Araştırma Fonu'ndan (No. 24FCA08'den L.S.'ye) alınan hibelerle desteklenmektedir. Ayrıca Fudan Üniversitesi, Şanghay Tıp Koleji'nin Çekirdek Tesisine de teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 4 Paraformaldehit, doku fiksasyon solüsyonuSangon Biotech 
Sığır serum albüminiSigma Aldrich126615
C57BL/6JNifdc farelerCharles Nehri219
CaF2 slaytlarCrystranCAFP25-1
Kriyostat mikrotomuDakewe BiotechCT520
CytospecPeter LaschSürüm 2.10.01Temel düzeltme, normalleştirme, görüntü oluşturma ve hiperspektral analiz dahil olmak üzere MIR veri analizi için yazılım.
DPBS tamponFisher Scientific 14-190-250
Fetal sığır serumuGibco10270106
Dondurarak kurutucularLABCONCOFreeZone
Jelatin Sigma-AldrichG1890Tip A, domuz derisinden
HBSS tamponuSangon Biotech 
Yüksek Glikozlu DMEMThermoFisher Scientific 
MatlabMathWorksMatlab R2024aTemel düzeltme, normalleştirme, görüntü oluşturma ve hiperspektral analiz dahil olmak üzere MIR veri analizi için yazılım.
Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon kütle spektrometresi görüntüleme (MALDI-MSI) sistemiBruker Daltonics GmbH MALDI-2
MetanolSinopharm Kimyasal10014108
aktifi Ham MSI verilerini ön işleme için SCILS Lab'e aktarın.  mMass'ta %0,01'> bağıl yoğunlukta tepe toplama gerçekleştirin.
N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorür (NEDC) matrisi Sigma Aldrich222488
Penisilin-streptomisinThermoFisher Scientific 
Kuantum Kaskad Lazer  Orta Kızılötesi (QCL-MIR) mikroskobu  Bruker Optics GmbHLUMOS II ILIM
Kırmızı fosforSigma-Aldrich8.0727
SCiLS LabBruker DaltonicsSCiLS Lab 2024bMSI veri analizi için yazılımlar. Ham MSI verilerini ön işleme için SCILS Lab'e aktarın.  mMass'ta %0,01'> bağıl yoğunlukta tepe toplama gerçekleştirin.
PüskürtücüHTX TechnologiesTM
Tripsin, %0,25 EDTAThermoFisher Scientific 
E672002A00321010564011mMass Entomoloji Enstitüsü, Çek Bilimler Akademisi Biyoloji Merkezi, Çek Cumhuriyeti Sürüm 5.5.0 MSI veri analizi için yazılımlar, mMass Entomoloji Enstitüsü, Biyoloji Merkezi, mMass Re 15140122C25200072

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandrov, T. Spatial metabolomics: From a niche field towards a driver of innovation. Nat Metab. 5 (9), 1443-1445 (2023).
  2. Gilmore, I. S., Heiles, S., Pieterse, C. L. Metabolic imaging at the single-cell scale: Recent advances in mass spectrometry imaging. Annu Rev Anal Chem. 12 (1), 201-224 (2019).
  3. Chadha, R. S., Guerrero, J. A., Wei, L., Sanchez, L. M. Seeing is believing: Developing multi-modal metabolic insights at the molecular level. ACS Central Science. 10 (4), 758-774 (2024).
  4. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  5. Steinhauser, M. L., et al. Multi-isotope imaging mass spectrometry quantifies stem cell division and metabolism. Nature. 481 (7382), 516-519 (2012).
  6. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  7. Qian, N., et al. Illuminating life processes by vibrational probes. Nat Methods. 22 (5), 928-944 (2025).
  8. Kim, M. M., Parolia, A., Dunphy, M. P., Venneti, S. Non-invasive metabolic imaging of brain tumours in the era of precision medicine. Nat Rev Clin Oncol. 13 (12), 725-739 (2016).
  9. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9 (8), 1771-1791 (2014).
  10. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23 (4), 469-474 (2005).
  11. Schnell, M., et al. All-digital histopathology by infrared-optical hybrid microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3388-3396 (2020).
  12. Yeh, K., Kenkel, S., Liu, J. N., Bhargava, R. Fast infrared chemical imaging with a quantum cascade laser. Anal Chem. 87 (1), 485-493 (2015).
  13. Ma, S., et al. High spatial resolution mass spectrometry imaging for spatial metabolomics: Advances, challenges, and future perspectives. TrAC Trends Anal Chem. 159, 116902(2023).
  14. Mckinnon, J. C., et al. Enhancing metabolite coverage in MALDI-MSI using laser post-ionisation (MALDI-2). Anal Methods. 15 (34), 4311-4320 (2023).
  15. Bednařík, A., et al. MALDI MS imaging at acquisition rates exceeding 100 pixels per second. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (2), 289-298 (2019).
  16. He, M. J., et al. Comparing DESI-MSI and MALDI-MSI mediated spatial metabolomics and their applications in cancer studies. Front Oncol. 12, 2022(2022).
  17. Wang, G., et al. Analyzing cell-type-specific dynamics of metabolism in kidney repair. Nature Metab. 4 (9), 1109-1118 (2022).
  18. Haase, K., Kröger-Lui, N., Pucci, A., Schönhals, A., Petrich, W. Real-time mid-infrared imaging of living microorganisms. J Biophotonics. 9 (1-2), 61-66 (2016).
  19. Liu, X., et al. Towards mapping mouse metabolic tissue atlas by mid-infrared imaging with heavy water labeling. Adv Sci. 9 (15), e2105437(2022).
  20. Liu, X., Shi, L., Zhao, Z., Shu, J., Min, W. Vibrant: Spectral profiling for single-cell drug responses. Nat Methods. 21 (3), 501-511 (2024).
  21. Gruber, L., et al. Deep MALDI-MS spatial omics guided by quantum cascade laser mid-infrared imaging microscopy. Nat Commun. 16 (1), 4759(2025).
  22. Heijs, B., et al. Histology-guided high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 87 (24), 11978-11983 (2015).
  23. Rabe, J. H., et al. Fourier transform infrared microscopy enables guidance of automated mass spectrometry imaging to predefined tissue morphologies. Sci Rep. 8 (1), 313(2018).
  24. Wang, G., et al. Spatial quantitative metabolomics enables identification of remote and sustained ipsilateral cortical metabolic reprogramming after stroke. bioRxiv. , (2024).
  25. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  26. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (d2o) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Analytica Chimica Acta. 1242, 340722(2023).
  27. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Commun. 9 (1), 2995(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Spatial MetabolomicsMass Spectrometry ImagingMid Infrared ImagingMALDI MSIImaging Co RegistrationBioinformatics AnalysisTissue Metabolite MappingMulti Modal ImagingMetabolic HeterogeneityBiomarker Discovery
Video yakında

İlgili makaleler