Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Karaciğer Hücrelerinde İlaca Bağlı Yaşlanma, M2 Makrofaj Polarizasyonunu Teşvik Eder: Tirozin Kinaz İnhibitörü ile İlişkili Hepatotoksisite İçin Çıkarımlar

898 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68725

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

Bu makalede

Özet

Burada, geleneksel toksisite testlerinin ötesinde daha derin bir mekanik anlayış sunan SASP güdümlü makrofaj polarizasyonu yoluyla lapatinib ve neratinib'in neden olduğu hepatotoksisiteyi inceliyoruz. Bu yaklaşım, yaşlanan hepatositlerin bağışıklık tepkilerini nasıl etkilediğini göstermektedir. Bu, özellikle uzun vadeli ilaç etkilerini değerlendirmek ve ilaca bağlı hepatotoksisiteyi yönetmek için yeni terapötik hedefler keşfetmek için değerlidir.

Özet

Lapatinib ve neratinib, HER2 pozitif metastatik meme kanserini tedavi etmek için onaylanmış tirozin kinaz inhibitörleridir (TKI'ler), ancak klinik kullanımları hepatotoksisite ile sınırlıdır. Hepatositler içinde, sitokrom P450 enzimleri bu ilaçların reaktif metabolitlerini üreterek DNA hasarına, mitokondriyal disfonksiyona ve oksidatif strese neden olur ve bu da hepatosit hasarına yol açar. Bu hücresel stres, yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) adı verilen proinflamatuar ve doku yeniden şekillenme faktörlerinin salgılanmasının eşlik ettiği bir büyüme durması durumu olan hepatosit yaşlanmasını tetikler. SASP, karaciğer mikroçevresini önemli ölçüde değiştirir, bağışıklık hücresi davranışını etkiler ve doku hasarını kötüleştirir. Lapatinib ve neratinib'in HepG2 karaciğer hücre hattında yaşlanmayı ve SASP'yi indüklediğini gösterdik. Ek olarak, bu yaşlanan hücrelerden gelen SASP, RAW264.7 makrofajlarının M2 benzeri polarizasyonunu destekler. M2 makrofajları, anti-inflamatuar yanıtlar ve doku onarımı ile ilişkili olmasına rağmen, aşırı veya uzun süreli aktiviteleri doku hasarına ve fibrozise yol açabilir. Bulgularımız, TKI ile indüklenen hepatosit yaşlanması ve SASP'nin immün yanıtı modüle ettiği ve meme kanseri hastalarında karaciğer toksisitesine katkıda bulunabileceği bir mekanizmayı vurgulamaktadır. Bu, karaciğer toksisitesini azaltmak ve tedavi sonuçlarını iyileştirmek için yaşlanan hücreleri veya SASP faktörlerini hedeflemenin önemini vurgulamakta ve etkili senoterapötiklerin tanımlanmasını hayati bir araştırma odağı haline getirmektedir. TKİ ile indüklenen karaciğer hücresi sekretomunun makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkisini gösteren herhangi bir literatür raporu bulunmamaktadır.

Giriş

Her ikisi de küçük moleküllü tirozin kinaz inhibitörleri (TKI) olan lapatinib ve neratinib, metastatik meme kanserinin tedavisi için 2007 ve 2017 yıllarında FDA onayı aldı1. Bu ilaçların, bazı meme kanserlerinde aşırı eksprese edilen bir reseptör tirozin kinaz olan insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2, HER22'yi inhibe ettiği bilinmektedir3. Klinik başarılarına rağmen, lapatinib ve neratinib de yan etkilerle, özellikle hepatotoksisite 4,5 ile ilişkilidir. Yüksek aminotransferaz seviyeleri ile kendini gösteren akut karaciğer hasarı, lapatinib veya neratinib6 ile tedavi gören hastaların yaklaşık% 14'ünde görülür. Hepatotoksisite büyük ölçüde, ağırlıklı olarak CYP3A4/5 7,8 olmak üzere sitokrom P450 (CYP) enzimlerini içeren bu ilaçların hepatik metabolizmasına atfedilir. Bu enzimler, elektrofilik ve oldukça reaktif olan kinon-imin ara maddelerinin oluşumunu katalize eder 9,10. O-dealkillenmiş lapatinib, N-dealkillenmiş lapatinib ve N-hidroksi lapatinib, O-dealkillenmiş neratinib ve N-demetillenmiş neratinib dahil olmak üzere bu reaktif metabolitler, hücresel makromoleküller ile kovalent eklentiler oluşturabilir, böylece normal hücresel fonksiyonları bozabilir ve sonuçta karaciğer hasarına neden olabilir11.

Lapatinib ve neratinib'in reaktif metabolitleri, hücresel yaşlanmanın önemli bir tetikleyicisi olan oksidatif stresi de indükleyebilir12. Hücresel yaşlanma, çeşitli proinflamatuar sitokinlerin, büyüme faktörlerinin ve proteazların salgılanmasıyla karakterize, büyümenin durduğu ancak metabolik olarak aktif bir durumdur. Bu salgı fenotipi, yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) 13,14,15 olarak bilinir. SASP, çevredeki mikro çevreyi derinden etkileyebilir ve sıklıkla inflamasyonu ve doku yeniden şekillenmesini teşvik edebilir. Kanser tedavisi bağlamında, SASP kanser kök hücre popülasyonunu zenginleştirebilir ve tümörün sağkalımını desteklemek için bağışıklık tepkisini değiştirebilir16. Ek olarak, enflamatuar sitokinler doku hasarını şiddetlendirebilir. Lapatinib ve neratinib ile tedavi edilen hastalarda, karaciğer hasarına kısmen TKI kaynaklı yaşlanma ve proinflamatuar SASP üretiminin katkıda bulunduğunu tahmin ettik.

Deneylerimiz, lapatinib ve neratinib'in hepatik hücrelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini indüklediğini, DNA hasarına ve mitokondriyal fonksiyon bozukluğuna yol açtığını ve bunun da hücresel yaşlanmayı tetiklediğini gösterdi. Bu yaşlanma, makrofaj polarizasyonunu etkileyebilen SASP faktörlerini serbest bırakarak lapatinib/neratinib kaynaklı hepatotoksisiteye katkıda bulunabilir.

Makrofajlar, bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynar ve fonksiyonel fenotipleri, çeşitli uyaranlara yanıt olarak değişebilir17,18. Klasik M1 makrofaj fenotipi tipik olarak TNF-α ve IL-1β gibi sitokinlerin üretimi de dahil olmak üzere proinflamatuar yanıtlarla ilişkilidir ve genellikle akut inflamasyonun bir belirteci olarak kabul edilir19,20. Buna karşılık, M2 makrofaj fenotipi fibroz, doku onarımı21, immünosupresyon ve kronik inflamasyona yanıt22,23 ile ilişkilidir. SASP'deki inflamatuar sitokinler, makrofaj polarizasyonunu etkileyerek M1 makrofajlarının M2 benzeri bir fenotip23'e dönüşümünü teşvik edebilir. Polarizasyondaki bu değişimin, bağışıklık mikro çevresi üzerinde önemli etkileri olabilir ve potansiyel olarak bağışıklık sisteminin baskılanmasına, tümörün ilerlemesine ve doku mimarisinin yeniden şekillenmesine yol açabilir.

Lapatinib ve neratinib tarafından indüklenen makrofaj polarizartionunu araştırmak için, immünolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan murin makrofaj benzeri bir hücre hattıolan RAW264.7 hücre hattını kullandık 24,25. RAW264.7 hücreleri, BALB/c farelerinden türetilir ve inflamasyon, fagositoz ve bağışıklık tepkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılır25. Lipopolisakkaritler (LPS) dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt verirler ve makrofaj fonksiyonu, sitokin üretimi ve kanser biyolojisi26'yı incelemek için özellikle değerlidirler. Bu çalışmada, bir insan hepatom hücre dizisi olan HepG2, hastalarda gözlenen hepatotoksik etkileri taklit etmek için lapatinib ve neratinib ile tedavi edildi. HepG2 hücre hattı, insan kökenli ve hepatoselüler karsinom soyu27 nedeniyle sıklıkla bir ilaç metabolizması ve hepatotoksisite çalışma modeli olarak kullanılır. HepG2 hücreleri TKI'lerle muamele edildikten sonra, şartlandırılmış ortam toplandı ve RAW264.7 hücrelerine eklendi. Sonraki makrofaj fenotipik değişiklikleri, tedavinin proinflamatuar M1 fenotipinden immünosupresif M2 fenotipine bir geçişe neden olup olmadığına odaklanılarak izlendi.

İlaca bağlı hepatotoksisite genellikle sitotoksisite deneyleri, inflamatuar belirteçlerin değerlendirilmesi ve hayvan modellerinin kullanımı yoluyla incelenir. Bunlarla karşılaştırıldığında, yaşlanmayla ilişkili sekretuar fenotip (SASP) faktörleri ve bunların makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkileri yoluyla TKI lapatinib ve neratinib kaynaklı hepatotoksisiteyi inceleme yöntemimizin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, yöntemimiz ilaca bağlı yaşlanan karaciğer hücreleri tarafından üretilen SASP faktörleri ile doku yeniden şekillenmesi, kronik inflamasyon ve karsinojenez 28,29,30,31 ile daha fazla bağlantılı olabilen doğuştan gelen bağışıklık arasında bir bağlantı kurar. Geleneksel toksisite taramaları, karaciğer ve bağışıklık hücreleri arasındaki kısa vadeli etkileşimleri yakalamamıza yardımcı olamaz ve özellikle kronik ilaca maruz kalma bağlamında TKI'lerin karaciğer iltihabı ve fibroz üzerindeki uzun vadeli etkisini ortaya çıkaramaz. SASP bileşenlerini tanımlamak için uygun bir proteomik yaklaşımla birleştirildiğinde, bu teknik, TKI ile indüklenen hepatotoksisitenin öngörücü biyobelirteçlerini tanımlamaya yardımcı olabilir ve bunu hafifletmek için terapötik müdahalelerin tasarımını bilgilendirebilir 29,30,31.

Uygulama için araştırmacılar, tarif edildiği gibi hepatik ve immün hücre dizileri ile ko-kültür veya şartlandırılmış ortam sistemlerini kullanmalı ve yaşlanmanın biyobelirteçlerinin yanı sıra M1 ve M2 makrofajlarını değerlendirmelidir. Bu yöntem, ilaca bağlı akut veya kronik karaciğer hasarının değerlendirilmesinde veya kanser tedavilerinin hedef dışı etkilerini en aza indirmeye yönelik stratejilerin araştırılmasında en etkilidir 29,30,31.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre kültürü

  1. Kültür HepG2 hücreleri Modifiye Eagle Medium (MEM) %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile yüksek glikoz ve Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) RAW264.7 hücreleri %10 FBS ile 37 °C'de %5 CO ile 2 ve her 3 günde bir yenilenir.
    NOT: Herhangi bir mantar veya bakteri kontaminasyonu olmadıkça antibiyotik kullanımı önerilmez. RAW264.7 hücreleri çok hızlı büyür ve 2 gün sonra geçilmelidir.

2. MTT testi

  1. Hücre sayımı ve hücre kaplama
    1. HepG2 hücrelerini, tam büyüme ortamında (MEM +% 10 FBS) bir hücre kültürü inkübatöründe 60 mm'lik bir kültür kabında büyütün.
    2. Hücreler yaklaşık %80 birleştiğinde, büyüme ortamını çıkarın, 1 mL 1x PBS ile hızlı bir yıkama yapın ve 600 μL 0.5x Tripsin ekleyin. 5-6 dakika inkübe edin.
      NOT: Tüm adımlar bir BSL 2 hücre kültürü kabininde gerçekleştirilmelidir.
    3. BSL 2'nin içine 1,2 mL tam büyüme ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
      NOT: Aşırı tripsinizasyonu önlemek için, eklenen tripsin hacminin iki katı olan tam ortam eklenmelidir.
    4. Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne (MCT) alın ve oda sıcaklığında (RT) 3-4 dakika boyunca 180 g'da (1000 rpm) santrifüjleyerek peletleyin.
    5. Süpernatanı atın, hücre peletini 1 mL ortamda yeniden süspanse edin, tek hücre süspansiyonu olarak karıştırmak için pipetleyin ve mikroskop altında bir hemositometre kullanarak sayın.
    6. Daha sonra, HepG2 hücrelerini 96 oyuklu bir plakaya, kuyucuk başına 5000-7000 hücrede, tam büyüme ortamında, her ilaç dozu için üç kopya halinde plakalayın ve inkübatörde 12-16 saat tutun.
      NOT: İlaç tedavisi için hücre akıcılığı %50-60 olmalıdır ve bu adım başlık içinde yapılmalıdır.
  2. İlaç tedavisi
    1. Davlumbaz içindeki stok konsantrasyonundan (sırasıyla 30 mM ve 3,5 mM) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde kademeli olarak artan lapatinib ve neratinib çalışma konsantrasyonları hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar, büyüme ortamında (MEM + %5 FBS) lapatinib için 1, 2.5, 5, 10, 15, 25, 50 μM ve neratinib için 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM'dir. Her iki ilaç için de tedavisiz bir kontrol tutun.
    2. Hücreleri içeren 96 oyuklu plakadan önceki ortamı atın ve ilaçla birlikte 100 μL ortam ekleyin ve inkübatörün içinde 48 saat inkübe edin.
  3. Boyama ve miktar belirleme
    1. 48 saat sonra, 10 μL 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür boyası (MTT; 5 mg/mL) ekleyin, her bir kuyucukta 1x fosfat tampon salin (PBS) içinde çözün ve mor renkli kristaller görünene kadar inkübatörün içinde en az 2 saat inkübe edin.
      NOT: Boyayı doğrudan ilaç içeren ortama ekleyin ve hücreleri boya ile 4 saatten fazla inkübe etmeyin.
    2. İnkübasyondan sonra boyayı çıkarın, kristalleri her bir oyukta 100 μL DMSO içinde çözün ve 15 dakika inkübe edin, ardından optik yoğunluğu (OD) 595 nm'de alın.
      NOT: Bu adım kaputun dışında gerçekleştirilebilir.

3. SA-β galaktosidaz testi

  1. İlaç tedavisi
    1. HepG2 hücrelerini 35 mm'lik kaplarda 40 x 10 yoğunlukta plaka başına 4 hücre, biri lapatinib için, biri neratinib için ve biri işlenmemiş kontrol için olmak üzere üç set halinde plaka başına4 hücre.
      NOT: Hücre sayımı ve kaplama adımları adım 2.1'de açıklandığı gibidir.
    2. 2.5 μM (öldürücü olmayan doz) lapatinib ve neratinib nihai konsantrasyonunu elde etmek için 2 mL ortama 5 mM çalışma stoğundan 1 μL lapatinib ve 3.5 mM ana stoktan 1.43 μL neratinib ekleyin.
      NOT: Ölümcül olmayan ilaç dozu, MTT testinde hücre sağkalım grafiğine göre seçilir.
    3. Önceki ortamı bulaşıklardan çıkarın ve bir kez 500 μL 1x PBS ile yıkayın ve ilaç içeren ortamı (davlumbazın içinde) ekleyin ve inkübatörde 48 saat bekletin.
  2. Sabitleme ve boyama
    1. 48 saat sonra ilacı çıkarın, bir kez 500 μL 1x PBS ile hızlı bir yıkama yapın ve RT'de 10 dakika boyunca 1x PBS'de 1.5 mL %2 formaldehit ve %0.2 glutaraldehit ile sabitleyin.
    2. Fiksasyonun ardından plakları 1 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın ve fiksatif solüsyonun doğru şekilde çıkarıldığından emin olun. 1.5 mL boyama çözeltisi (40 mM sitrik asit / Na-fosfat tamponu, 5 mM K4 [Fe (CN) 6], 5 mM K3 [Fe (CN) 6], 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 mg / mL X-gal otoklavlanmış suda) ekleyin ve CO2 olmadan 37 ° C'de 8 saat inkübe edin.
      NOT: İnkübasyon süresi hücre tipine göre değişebilir; HepG2 için kuluçka süresi 8 saati geçmemelidir.
    3. Boyamanın ardından, plakaları 1 mL 1x PBS'de iki kez hızlı bir şekilde yıkayın ve bir epi-floresan mikroskobu ile 20x ve 40x büyütmede parlak alan görüntüleri yakalayın. Her tedavi grubu için en az dört ila beş alan yakalayın.
      NOT: Fiksatif ve boyama solüsyonunun hacmi plaka boyutuna göre değişecektir ve tüm adımlar kaputun dışında gerçekleştirilebilir.
  3. Görüntü ölçümü
    1. Bir alandan resim çekin, toplam hücre sayısını ve mavi sinyal gösteren hücreleri sayın. Mavi sinyalli hücrelerin yüzdesini manuel olarak hesaplayın. En az dört görüntü hesaplayın, ortalamayı alın, bir elektronik tablo grafiğinde çizin ve bir t-testi yapın.

4. ROS tespiti

  1. Hücre kaplama ve ilaç tedavisi
    1. Plaka HepG2 hücreleri, 35 x 40 yoğunlukta cam tabanlı kaplarda 10 Üç set halinde plaka başına4 hücre: biri lapatinib için, biri neratinib için ve biri işlenmemiş kontrol.
      NOT: Hücre sayımı ve kaplama adımları adım 2.1'de açıklandığı gibidir.
    2. Adım 3.1'de açıklanan tedavi stratejisinin aynısını izleyin.
  2. Boyama ve görüntüleme
    1. 48 saatlik tedaviden sonra, 30 dakika boyunca 2 μM hücre ROX koyu kırmızı reaktif (5 mM stok), 1 μM Mito Tracker Green (1 mM stok) ekleyin ve 500 nM nükleer boyama boyası Hoechst (500 μM stok) ile karşı boyama yapın.
      NOT: Davlumbazın içine boya eklenmeli ve doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçınılmalıdır. Karşı boyama, diğer boyaların uygulanması sırasında nükleer boyama boyası Hoechst eklenerek yapılır.
    2. 30 dakika sonra boyayı çıkarın ve fazla boyayı çıkarmak için 1x PBS ile yıkayın ve 100x büyütmede (sırasıyla yağ çıkarma, 640 nm, 488 nm ve 405 nm uyarma dalga boyu) konfokal mikroskopla görüntüyü çıkarın.
  3. Görüntü ölçümü
    1. Fiji ImageJ yazılımını kullanarak hücre ROX kırmızısının sinyalini ölçün ve bunu işlenmemiş kontrolün sinyaliyle karşılaştırın. Sinyalin mitokondriden kaynaklandığını belirtmek için MitoTracker yeşilini kullanın. Çubuk grafikleri ortalama değerlerle çizdikten sonra bir t-testi yapın.

5. Koşullandırılmış ortam (CM) toplama

  1. HepG2 hücrelerini 48 saat boyunca 2,5 μM lapatinib veya neratinib ile tedavi edin (bu deney dışında adım 3.1'e benzer tedavi stratejisi, 60 mm'lik bir kapta 70 x104 hücre plakalayın).
  2. 48 saat sonra ilacı çıkarın ve bir kez 500 μL 1x PBS ile yıkayın.
  3. Maksimum yaşlanma gününde (48 saatlik ilaç tedavisinden sonra), ilaçla tedavi edilen hücrelere ve 48 saat boyunca tedavi edilmemiş kontrole 4 mL serumsuz MEM ortamı (FBS veya başka herhangi bir takviye olmadan) ekleyin.
    NOT: Serumsuz ortamın hacmi plaka boyutuna bağlı olacaktır.
  4. Daha sonra, şartlandırılmış ortam olarak adlandırılan tüm sekretomu içeren serumsuz ortamı toplayın ve ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
    NOT: CM toplandıktan sonra, ölü hücreleri ve diğer hücresel kalıntıları gidermek için 2800 g'da (4000 rpm) 5 dakika santrifüjlenmelidir. RAW264.7 hücreleri tipik olarak DMEM'de kültürlenir, ancak CM, HepG2 kültür koşullarına göre MEM'de toplanır. Uyumluluğu korumak için, şartlandırılmış ortam, RAW264.7 inkübasyonundan önce 1:1 oranında serumsuz DMEM ile karıştırılmalıdır.

6. RAW264.7'de M1/M2 polarizasyonu

  1. Hücre kaplama
    1. Tripsinizasyon adımı hariç, adım 2.1'de açıklandığı gibi hücre sayımı ve hücre kaplamasını izleyin. RAW264.7 hücrelerini tripsinize ederken, 600-700 μL 0.5x tripsin ekleyin, inkübatörde 15-20 dakika inkübe edin ve tripsini nötralize etmek için 2 mL büyüme ortamı (DMEM +% 10 FBS) ekleyin ve 70 x104 hücreyi 60 mm'lik bir kaba üç set halinde yerleştirin: lapatinib, neratinib ve bir işlenmemiş kontrol.
  2. RAW264.7 indüksiyon
    1. Normal büyüme ortamını çıkarın, 1 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve karşılık gelen CM'yi 48 saat boyunca ekleyin.
      NOT: CM'yi eklemeden önce, RAW264.7 hücreleri DMEM'de büyüdüğünden, 1:1 oranında serumsuz DMEM ile koşullandırdığınızdan emin olun, bu nedenle hücreleri MEM'de tutmak strese neden olur ve bu da sonucu engelleyebilir. RAW264.7'nin CM'de (serumsuz ortam) 48 saat boyunca kültürlenmesi de strese neden olabilir; Bu durumda veriler toplanmadan önce 24-30 saat inkübasyon yapılabilir.
    2. İnkübasyondan sonra, CM'yi atın, 1 mL 1x PBS ile yıkayın, her plakaya 600 μL tripsin ekleyin, 10 dakika inkübe edin ve ardından RT'de 3 dakika boyunca 180 g'da (1000 rpm) pelet haline getirin. Peleti protein saflaştırması için kullanın veya ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
      NOT: Tripsinizasyon süresi hücre tipine göre değişir ve 180 g'ın üzerinde santrifüjleme önerilmez.
  3. Protein izolasyonu ve western blotlama
    1. Radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ve proteaz inhibitör kokteylini 100:1 oranında karıştırarak lizis tamponunu hazırlayın. Lizis tamponunu hücre peletine ekleyin, yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Lizis tamponunun hacmi hücre paletinin boyutuna göre değişecektir ve lizis kaputun dışında yapılabilir. Pelet -80 °C'de saklanırsa, önce peleti buz üzerinde çözdürün, kısa bir dönüş yapın ve kalan ortamı çıkarın.
    2. İnkübasyondan sonra, hücre lizatını 20.000 g'da 4 °C'de 30 dakika döndürün. Süpernatanı toplayın ve western blot için devam edin veya ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
    3. 35-40 μg protein alarak protein numunesi hazırlayın, 1x yükleme boyası ekleyin, 95 °C'de 5-6 dakika ısıtın, SDS-PAGE'i (%10 ve %12 akrilamid jel) 90 V'ta çalıştırın ve nitroselüloz membrana aktarın.
    4. NOT: Western blot ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Joubert ve ark.32'ye bakınız.
    5. Anti-NOS2 ve anti-ARG1 antikorları kullanarak sırasıyla bir yaban turpu peroksidaz (HRP) geliştiricisi, iNOS (M1) ve arginaz1 (M2) kullanarak lekeyi geliştirerek M1 ve M1 polarizasyon belirteçlerinin ekspresyonunu kontrol edin.
      NOT: Hem birincil antikorlar, anti-NOS2 hem de anti-ARG1 için konsantrasyon 1:1000'dir ve ikincil anti-tavşan antikoru 1:10.000'dir.
  4. LPS ve IFN-γ kullanılarak makrofaj polarizasyonu
    1. Plaka 70 x 104 RAW264.7 hücre, iki adet 60 mm'lik çanakta.
      NOT: Kaplama prosedürü adım 6.1'e benzer.
    2. 12-16 saat sonra, 4 μL 1 μg/mL lipopolisakkarit (LPS, stok konsantrasyonu 1 mg/mL'dir) ve 1,33 μL 33 ng/mL interferon-γ (IFN-γ, stok konsantrasyonu 100 μg/mL'dir) 4 mL büyüme ortamında (DMEM + %10 FBS) karıştırın ve önceden kaplanmış RAW264.7'ye ekleyin, indüklenmemiş bir kontrol sağlayın.
    3. 48 saat sonra, tripsinizasyon yoluyla hücre peletini toplayın, proteini izole edin, bir western blot çalıştırın ve anti-iNOS ve anti-ARG1 antikorlarını kullanarak sırasıyla iNOS (M1) ve ARG1 (M2) ekspresyonunu kontrol edin.
      NOT: Tüm hücre kültürü atıkları ve biyokimyasal atıklar biyolojik tehlike kutusuna atılmalı, uygun şekilde otoklavlanmalı ve ardından atılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

TKI lapatinib ve neratinib'in hepatoselüler karsinom (HepG2) hücreleri üzerindeki etkisini ve bunların makrofajlar üzerindeki aşağı akış parakrin etkilerini değerlendirmek için bir dizi test yapıldı. HepG2 hücreleri, değişen konsantrasyonlarda lapatinib veya neratinib ile muamele edildi ve hücre canlılığı, MTT testi kullanılarak 48 saatte ölçüldü (Şekil 1A,B). Hayatta kalma eğrilerine dayanarak, daha ileri deneyler için 2...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, TKI ile tedavi edilen HepG2 karaciğer hücrelerinden toplanan şartlandırılmış ortam yoluyla lapatinib veya neratinib tedavisinin makrofaj polarizasyonu üzerindeki dolaylı etkilerini araştırmaktadır. RAW264.7 makrofajlarını kullanarak, ARG1'in yukarı regülasyonu ile gösterildiği gibi, koşullandırılmış ortama maruz kaldığında bir M2 fenotipi gözlemliyoruz. Morfolojik olarak, tedavi edilen makrofajlar, M2 benzeri bir durumun indüklenmesini daha da destekleyen karakteristik genişl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, altyapı desteği için Shiv Nadar Üstünlük Enstitüsü'ne teşekkür eder. Bu çalışma, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı hibesi CRG/2022/003242 tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HepG2 hücre hattıNCCSYapışkan hücre hattı
RAW264.7 hücre hattıNCCSYapışkan hücre hattı
DMEM (Dulbacco'nun Modifiye Kartal Ortamı)HimediaAT066Yüksek glikoz, toz
MEM (Modifiye Kartal Orta AracıGibco611100-053Toz
PBS (Fosfat Tamponu Salin)HimediaTS1101Toz
Tripsin-EDTA ÇözümüHimediaTCL007Çözüm
FBS (Fetal Sığır Serumu)HimediaRM1112Sıvı
MTT BoyasıHimediaTC191Toz
LapatinibSelleckchemS2111Toz
NeratinibCayman Kimya Şirketi18404Toz
DMSO (Dimetil Sülfoksit) & nbsp;HimediaTC185Çözüm
Formaldehit & nbsp;RankemF0080Çözüm
GlutaraldehitSigma-aldrich340855Çözüm
Limon Asit monohidrat, SafHimediaGRM229Toz
Sodyum fosfat dibazik ansusuz  HimediaMB024Toz
Potasyum ferrosiyanür, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-236-500
Potasyum ferrrisiyanüd, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-232-500
NaClSRL41721Toz
MgCl2 heksahidratHimediaGRM-1068Toz
X-GalSRL45904Toz
LipopolisakkaritSigma-aldrichL6529
İnsan Rekombinant Interferon-γHimediaCF040-20MCG
Hücre ROX derin kırmızı reaktifTermo Fisher ScientificC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Toz
MitoTRACKER YeşilInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Toz
Anti-ARG1 antikorİlgiDF6657Çözüm, MW-35kDa hesaplandı, gözlemlenen MW - 65kDa
Anti-NOS2 antikorCloudo Clone Corp.PAA837Hu01Çözüm, MW-130kDa hesaplandı, gözlemlenen MW - 65kDa
Anti-iNOS antikoruİlgiÇözüm, MW- 130kDa hesaplandı, gözlemlenen MW - 120kDa
Anti-GAPDH antikorBiobharati Yaşam Bilimleri Pvt.LtdBB-AB0060Çözüm
Anti-Tavşan AntikoruCayman Kimya Şirketi10004301Çözüm
Nitroselüloz zarı Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Ürün numarası)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
60mm AntenlarNUCK150462
96 kuyu plakası,  NUCK165306
Hücre Kültürü Kuluçka Makinesi Thermo Fisher Scientific371
Microscope 1. LEICA Ters Mikroskobu    2. Nikon Konfokal Mikroskobu 1. DMIL LED        2. Ti2E, A1R  İkisi de model numarası
iBright Görüntüleme SistemiInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (model numarası)
Plaka okuyucuBio-RADiMark Mikroplaka Okuyucu
Santrifüj Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (model numarası)

Kaynaklar

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Karaciğer Hücresi YaşlanmasıTirozin Kinaz İnhibitörleriHepatotoksisite MekanizmalarıYaşlanma ile İlişkili Salgılayıcı FenotipHepG2 HücreleriKondisyonlu OrtamReaktif Oksijen TürleriWestern Blotlama
Karaciğer Hücrelerinde İlaca Bağlı Yaşlanma, M2 Makrofaj Polarizasyonunu Teşvik Eder: Tirozin Kinaz İnhibitörü ile İlişkili Hepatotoksisite İçin Çıkarımlar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.