Yöntem makalesi

Kimerik Antijen Reseptörü-Hücre Dışı Veziküller (CAR-EV) Teknolojisinin Geliştirilmesi: Kanser Tedavisinin Geleceği

DOI:

10.3791/68726

⸱

19 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküllerin (EV'ler) terapötik uygulaması, kanser tedavisinde ve ilaç dağıtımında devrim yaratma potansiyeline sahiptir. İyon değişim kromatografisi kullanılarak izole edilen kimerik antijen reseptörü (CAR) hücresinden türetilen EV'ler (CAR-EV'ler), artan kargo kapasitesi sergileyerek fonksiyonel etkinliklerini önemli ölçüde artırır. Bu çalışma ayrıca biyolojik aktivitelerini ve terapötik potansiyellerini aydınlatmak için CAR-EV'leri karakterize etmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR hücre tedavileri, çeşitli hematolojik maligniteler için kişiselleştirilmiş tedaviyi önemli ölçüde geliştirmiştir. Şu anda, lenfoma, multipl miyelom ve kronik lenfositik lösemi tedavisi için Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından yedi CAR hücresi ürünü ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından altı ürün onaylanmıştır. Sitokin salınım sendromu (CRS) ve immün efektör hücreyle ilişkili nörotoksisite sendromu (ICANS) en önemlileri olmak üzere çeşitli zorluklar ve sınırlamalar devam etmektedir. CAR-EV'ler gibi hücresiz tedaviler, hücresel muadillerine göre önemli avantajlar sunar. Bunlar, gelişmiş tümör infiltrasyonunu ve CRS, ICANS ve diğer olumsuz yan etki risklerini en aza indirirken tekrar uygulama potansiyelini içerir. Ek olarak, CAR-EV'lerin gücü, sitotoksik ajanların ve fonksiyon değiştirici ribonükleik asitlerin (RNA'lar) dahil edilmesinin mühendisliğiyle ayarlanabilir. Burada, ayarlanabilir CAR-EV'ler üretmek için ölçeklenebilir bir CAR-EV platformunun geliştirilmesini rapor ediyoruz. Bu platform, EV üretici hücrelerinin (örneğin, CAR-T ve CAR-doğal öldürücü (CAR-NK) hücreleri) mühendisliğini ve ön koşullandırılmasını, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) dereceli iyon değişim kromatografisi (IEX) platformu kullanılarak CAR-EV'lerin izolasyonunu ve zenginleştirilmesini, tam otomatik yüksek verimli EV alt popülasyon analizini ve in vitro CAR-EV fonksiyonel sitotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi. Platform, hem hematolojik hem de katı tümör hücre dizileri için CAR-NK-EV'ler ve CAR-T-EV'ler kullanılarak doğrulanmıştır. CAR-EV platformu, CAR hücresi bazlı tedavilerle ilişkili olumsuz yan etkileri azaltma potansiyeline sahip, belirli hastalık endikasyonlarına göre uyarlanmış, kullanıma hazır terapötik CAR-EV'lerin hızlı gelişimi için umut verici bir yaklaşımı temsil ediyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR hücresi bazlı tedaviler hematolojik malignitelerin tedavisi için onaylanmıştır, ancak önemli zorluklar ve sınırlamalar devam etmektedir1. Özellikle, CRS ve ICANS'ın riskleri, hastanın CAR tedavisine uygunluğunu değerlendirirken kritik faktörler olmaya devam ediyor ve tedavi stratejilerinde sürekli ilerlemelere duyulan ihtiyacın altını çiziyor2.

CAR hücrelerinden (CAR-EV'ler) türetilen EV'ler, daha etkili ve potansiyel olarak daha güvenli bir allojenik terapötik seçenek olarak ortaya çıkmıştır. Bu tür EV'ler, azaltılmış immünojenisite, daha düşük CRS riski, gelişmiş tümör infiltrasyonu, tekrar dozlama için uygunluk, kombinasyon tedavileri potansiyeli ve ayrıca verimli üretim ve depolama süreçleri dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar3. Biyolojik olarak türetilmiş EV'ler, kanser hücreleri üzerindeki spesifik yüzey reseptörlerine yüksek afinite ile bağlanan kanseri hedefleyen molekülleri eksprese edecek şekilde tasarlanabilir. Bu tasarım EV'ler, değiştirildikten sonra, hedef dışı etkileri en aza indirme potansiyeline sahip, terapötik kargoyu seçici olarak teslim etmek için umut verici bir strateji sunuyor. CAR hücrelerinden türetilen bu silahlı EV'ler, daha hassas ve güçlü terapötik dağıtımı mümkün kılan gelişmiş fonksiyonel özellikler sergiliyor. Doğal özellikleri, toplu olarak tedavi etkinliğinin artmasına katkıda bulunan birçok avantaj sağlar.

Elektrikli araçların klinikte etkili bir şekilde kullanılmasının önündeki iki temel engel ölçek ve etkinliktir. Burada açıklanan metodolojiler, doğası gereği ölçeklenebilirlik sergiler ve geniş bir deneysel paradigma yelpazesine kolayca uyarlanabilir. EV üretimini klinik düzeyde üretime yükseltmek, aktif bir geliştirme alanıdır, ancak yeterli miktarda klinik düzeyde malzeme üretmek için daha fazla optimizasyon gerektirir4. Daha da önemlisi, son çalışmalar, ana hücrelerin interlökinlerle (örneğin, IL-7, IL-15, IL-21) ön koşullandırılması ve hipoksik (%1-2 O2) koşullar altında EV'lerin üretilmesi gibi EV etkinliğini iyileştirmeye yönelik umut verici yaklaşımlar göstermiştir 5,6,7.

Bu çalışmanın amacı, MCF-7 meme kanseri hücreleri ve K562 miyeloid lösemi hücreleri kullanılarak epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2'yi (HER2) hedefleyen CAR EV'lerinin in vitro terapötik potansiyelini araştırmaktı. EV'ler, IEX aracılığıyla CAR hücresi koşullandırılmış ortamdan (CM) izole edildi ve zenginleştirildi, nanopartikül izleme ve Western blot analizi kullanılarak karakterize edildi ve fonksiyonel analizlere tabi tutuldu. Endojen sitotoksik kargo içeren CAR EV'ler , in vitro hücre ölümünü etkili bir şekilde indükledi. Elde edilen veriler, terapötik uygulamalar için ölçeklenebilir hedefli EV üretiminin fizibilitesini ortaya koymaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm canlı hücreleri, uygun KKD (örn. eldivenler, laboratuvar önlükleri) kullanarak sertifikalı bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) kabini içinde tutun. Canlı hücreler içeren hücre peletleri gibi biyolojik tehlikeli malzemeler, son %10'luk sodyum hipoklorit (ağartıcı) çözeltisi kullanılarak dekontamine edilmelidir.

1. Hücre kültürü ve CM toplama

  1. CAR hücrelerinin kültürlenmesi
    NOT: Bu çalışmada kullanılan lentiviral transdüksiyonlu CAR hücreleri dışarıdan temin edilmiş olsa da, protokol, standart hücre mühendisliği teknikleri ile kurum içinde üretilen CAR-T/NK hücrelerine uygulanabilir olmaya devam etmektedir.
    1. CAR NK/T hücrelerini kseno içermeyen kültürde (100 IU/mL IL-2 ile desteklenmiş büyüme ortamı) 0,5-1 x 106/mL yoğunlukta, 37 °C'de (% 5 CO2 ,% 21 O2) nemlendirilmiş bir odada tutun. Her 2-3 günde bir izleyin ve geçiş kapasitesi kısıtlamaları nedeniyle hücre sayımlarını haftada 3 kez ile sınırlayın.
    2. Hücrelerin floresan olduğundan emin olarak (uygun şekilde etiketlenmişse) mikroskopi yoluyla CAR ekspresyonunu doğrulayın. Sağlıklı kümelerdeki hücreler, sağlam bir CAR hücre kültürünün göstergesidir.
  2. CM koleksiyonu
    1. Hücre kültürleri %80 birleşmeye ulaştığında, hücre canlılığını değerlendirin ve Tripan mavisi otomatik hücre sayım analizi ile canlı hücre yoğunluğunu belirleyin.
    2. Bir pelet oluşturmak için hücreleri 300 × g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin.
    3. Berraklaştırmak için süpernatanı dikkatlice toplayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin.
    4. Arıtılmış CM'yi EV zenginleştirmesi için hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

2. EV izolasyonu ve zenginleştirilmesi

NOT: Aşağıdaki yöntemler, hücre dışı vezikül (EV) zenginleştirmesi için iki yaklaşımı özetlemektedir: fonksiyonel in vitro analiz için EV izolasyonu için geliştirilen IEX yöntemi ve aşağı akış karakterizasyon çalışmaları için optimize edilmiş pan-eksozom yakalama yüksek verimli yöntem.

  1. IEX aracılığıyla işlevsel CAR EV'lerin zenginleştirilmesi
    NOT: Tüm hacimsel spesifikasyonlar, reaktif hacimleri ile kromatografik kolon içindeki reçine yatağı hacmi arasındaki orantılı ilişkiyi yansıtan Kolon Hacmi (CV) cinsinden ifade edilir.
    1. IEX kolonunu (kullanılan kolonun ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın) kullanmadan önce 15 dakika bekleterek oda sıcaklığına (RT) getirin. 10 CV rejenerasyon tamponu ekleyin, ardından 10 CV izotonik dengeleme tamponu (pH 7.4'te) kullanarak dengeleme yapın (tamponların ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Kolonun uzun süre kuru çalışmasına izin vermeyin. Kolonu daima dik tutun.
    2. CM'yi çözün ve 0,22 μm polietersülfon (PES) filtreden geçirin.
    3. Numuneyi dengelenmiş kolona (31,2 CV'ye kadar) ve ardından 10 CV izotonik yıkama tamponunu (pH 7,4'te) ekleyin. 2,5 CV hipertonik elüsyon tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve EV elüat numunesi olduğu için akışı toplayın.
    4. Ticari olarak temin edilebilen ultrafiltrasyon santrifüj filtreleri (30 kDa kesme) ve seyreltici olarak izotonik bir çözelti kullanarak EV elüatı üzerinde bir tampon değişimi gerçekleştirin ve minimum 100x seyreltme faktörü sağlayın. Tampon değişiminden sonra hedef hacim, kullanıcı tarafından deneysel parametrelerine uyacak şekilde belirlenebilir.
    5. İn vitro fonksiyonel testler için zenginleştirilmiş EV'leri sterilize etmek için 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak son bir filtrasyon adımı gerçekleştirin.
    6. Nanopartikül izleme analizi (NTA) 8,9 kullanarak CAR-EV boyut dağılımını, konsantrasyonunu ve verimini belirleyin.
  2. Sınırlı veya geniş bir numune dizisinin karakterizasyonu için yüksek verimli pan-eksozom EV izolasyonu (oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilen otomatik saflaştırma sistemi aracılığıyla)10,11.
    1. Kuyu başına 1 mL 1x PBS ile üç adet 96 derin kuyulu (DW) plaka hazırlayın.
    2. Her kuyucuğa 35 μL %1 sodyum dodesil sülfat (SDS) tamponu ekleyerek bir 'Elüsyon' plakası oluşturun.
    3. Kuyu başına 1 mL CM numunesi ve 30 μL EXO-NET pan-eksozom yakalama boncukları içeren bir 'Bağlama' plakası hazırlayın.
    4. Otomatik izolasyon sisteminde aşağıdaki ayarları yapın:
      1. Adım 1: İpucu Alın: İzolasyon protokolünün, izolasyon işlemi boyunca manyetik boncuk manipülasyonunu mümkün kılmak için cihazın 96 derin kuyulu uçlu bir tarağı devreye sokmasıyla başladığından emin olun.
      2. Adım 2: EV'lerin manyetik parçacıklar üzerinde verimli bir şekilde yakalanmasını sağlamak için CM numunesinin ve manyetik boncukların 30 dakika boyunca sürekli yavaş hız koşulları altında karıştırıldığından emin olun. Karıştırmadan sonra, manyetik boncukların yakalanmasını sağlamak için her biri 30 saniyelik 5 döngü dahil edilir.
      3. Adım 3: Üç yıkama adımının her birinin, bağlı EV'lerin bütünlüğünü korurken, özel olarak bağlanmamış kirleticileri gidermek için 30 saniyelik hafif bir yavaş hızlı karışım kullandığından emin olun. Daha önce olduğu gibi, adım, manyetik boncukları yakalamak için her biri 30 saniyelik 5 döngü ile tamamlanır.
      4. Adım 4: EV Protein Elüsyonu (Lizis): İki aşamalı bir işlemle protein geri kazanımı için bağlı EV'lerin parçalandığından emin olun. 30 saniyelik bir ilk karıştırma (alttan karıştırma), duraklanmış bir durumda 7 dakika ve 30 saniye inkübasyondan önce, uç konumu kuyunun üzerinde tutularak gerçekleştirilir. Süre geçtikten sonra, ikinci bir 30 sn karıştırma ve 7 dakika 30 saniye daha duraklama yapılır. Son olarak, her biri 30 saniyelik 5 döngü dahil edilmiştir.
      5. Adım 5: Bu noktada, protein içeriğinin tamponda olduğundan, boncukların uca bağlı olduğundan emin olun. Elüsyon adımının ardından, kullanılan uç tarağı atılır ve protokol tamamlanır.
        NOT: EXO-NET Pan-Exosome Capture boncukları %0,05 (a/a) koruyucu solüsyon içerir. Mesleki Güvenlik ve Sağlık İdaresi (OSHA) düzenlemeleri kapsamında tehlikeli olarak sınıflandırılmasa da, özellikle biyoakışkanlar bağlamında kullanım sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılmalıdır.

3. EV'lerin western blotlama yoluyla karakterizasyonu

NOT: CAR-EV'ler, kontrol olarak hücrelere kıyasla Western blot (Granzyme B ve Calnexin) ile karakterize edildi.

  1. 1 × 106 hücre başına 10 μL 1x radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu (proteaz inhibitörleri ile) ekleyerek hücre lizatlarını hazırlayın. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ardından hücre kalıntılarını gidermek için 15 dakika boyunca 14.000 × g'da (4°C) santrifüjleyin. EV'ler aynı tampon veya %1 SDS kullanılarak parçalanabilir.
  2. Bisinkoninik asit (BCA) testi (veya uygun bir nano spektrofotometre) kullanarak protein miktarını ölçün.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek %4-12'lik bir SDS-poliakrilamid jeli bir elektroforez aparatına monte edin. Laemmli tamponunu kullanarak protein lizatlarını hazırlayın.
    NOT: Jel sistemleri markaya göre değişiklik gösterebilir
  4. Her bir oyuğa 5 μg numune yükleyin ve jelleri 20 dakika boyunca 200 V'ta çalıştırın.
  5. Poliviniliden florür (PVDF) membranları kullanarak bir Western transferi gerçekleştirin, lekeleri %5 sığır serum albümini (BSA) ile 1x Tris tamponlu salin içinde bloke edin ve daha sonra %0.1 Tween 20 (1x TBST) ile bloke edin.
  6. Lekeleri birincil monoklonal antikorda (Granzyme B ve Calnexin, 1x TBST'de% 5 BSA çözeltisinde 500'de 1 seyreltme), durgun (çalkalanmayan) ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  7. Ertesi gün, ikincil antikorda inkübe etmeden önce lekeleri her biri 10-15 mL 1x TBST ile 5 dakika boyunca 3x yıkayın (türe bağlı, RT'de 1 saat boyunca 1x TBST'de %5 BSA çözeltisinde 1.000'de 1 seyreltme). Şarjlı bağlantılı cihaz (CCD) dijital kamera aracılığıyla yakalanan görüntülerle gelişmiş kemilüminesans (ECL) kullanarak bantları tespit edin.

4. Fonksiyonel tahlil (MTS aracılığıyla )

NOT: Sitotoksisite, in vitro MTS [(3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolium] testi ile değerlendirildi, burada hücreler tetrazolyum bileşiğini 490 nm absorbansta ölçülebilen çözünür renkli bir formazan ürününe indirger. MCF-7 meme kanseri ve K-562 kan kanseri hücreleri, artan konsantrasyonlarda (0-500.000 parçacık/hücre) CAR-EV ile üç bağımsız deneyde 3 güne kadar tedavi edildi.

  1. Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 5.000 alıcı hücre (50 μL/kuyu) tohumlayın. Boş ortam için bir sütun ayırın (MTS reaktifi arka plan çıkarma için). Kenar kuyularından kaçının ve bunları 200 μL steril suyla doldurun.
    NOT: Yapışık hücreler, tedaviden önce plaka yüzeyine hücresel yapışmayı sağlamak için bir gün önceden kaplanmalıdır.
  2. EV'leri artan miktarlarda ekleyin (örneğin, hücre başına 2,5 x 105 ve 4,5 x 105 veya 0,5, 0,75 ve 1 milyon EV). Kontrolleri dahil edin: 'EV yok', 1x PBS 'EV tamponu' ve pozitif hücre öldürme kontrolü (örneğin, hedefe özgü küçük molekül inhibitörü veya %0,1 TX-100).
  3. Hücreleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de (% 5 CO2 ,% 21 O2 ) 2-3 gün inkübe edin.
  4. Belirlenen tedavi zaman noktasında, hücreleri mikroskopi ile inceleyin. MTS reaktifini ekleyin (kuyu başına her 100 μL kültür için 20 μL). 1-4 saat arasında inkübe edin, saatte 490 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı ölçün.
  5. Veri analizi için boş ortam absorbans okumasını çıkarın. İki grup karşılaştırmaları için Öğrenci t-testini veya üç veya daha fazla grup için çoklu karşılaştırmalarla tek yönlü ANOVA'yı kullanarak istatistikleri hesaplayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T/NK hücre kültürünün tipik bir iş akışı, ardından EV izolasyonu, EV'lerin karakterizasyonu ve fonksiyonel bir tahlilde kullanımı Şekil 1'de gösterilmektedir. CAR T/NK hücrelerinin kültürlenmesinden elde edilen CM, EV zenginleştirmesi ve aşağı akış karakterizasyonundan (nanopartikül izleme analizi dahil) ve çok kuyulu bir plaka MTS testi ile değerlendirilen fonksiyonel aktiviteden önce toplanır (Şekil 1).

GFP etiketli CAR hücreleri, kültürde CAR yapısının ekspresyonunu doğrulamak için mikroskopi yoluyla görselleştirilebilir. Yeterli transdüksiyon verimliliğini sağlamak için mikroskopi, CM'nin toplanmasından önce ve sırasında rutin bir adım olarak yapılmalıdır. Verimliliği değerlendirirken potansiyel otofloresansı yakalamak için parlak alan ve GFP kanallarını üst üste bindirmek önemlidir. Dikkat çekici bir şekilde, T hücreleri doğal olarak kümelenme eğilimine sahiptir (NK hücrelerinde benzer şekilde gözlenir; veriler gösterilmemiştir) ve hücreler kümelenmiş bir fenotip sergilediğinde floresan açıkça gözlemlenebilir (Şekil 2).

EV zenginleştirmesinin ardından EV'ler, NTA ve western immünoblotlama yoluyla karakterize edilebilir. NTA kullanılarak, partikül veriminin analizi, CM'ye kıyasla izole edilmiş EV'lerde artan bir konsantrasyonu doğrulayabilir (Şekil 3A). Western blot verileri ayrıca CAR hücrelerinde ve EV'lerde sitolitik işaretleyici granzim B'nin ekspresyonunu ve ikincisinde preparatlarda hücresel materyalin bulunmadığını doğrulayan kalneksin yokluğunu doğrular. HEK293T hücreler CAR-negatif kontrol olarak dahil edilmiştir (Şekil 3B).

EV işlevselliğinin analizi, hücre canlılığını/proliferasyon kapasitesini belirlemek için MTS testi ile gerçekleştirildi. EGFR ve HER2'yi hedefleyen CAR-EV'lerin MCF-7 meme kanseri ve K562 kan kanseri hücre canlılığı ve büyümesi üzerindeki etkisi, kolorimetrik MTS reaktifinin 490 nm'lik bir absorbansta (arka plan sinyalinin kaldırılmasından sonra) ölçülmesiyle belirlenir. Bu örnekte, EGFR hedefleme CAR-EV'ler, MCF-7 ve K562 hücre canlılığını sırasıyla p ve @ oranında azalttı. CAR-EV'leri hedefleyen HER-2, MCF-7'yi ~ oranında azalttı (Student's t-testi ile belirlendiği gibi). Deneysel düzen göz önüne alındığında, parametrik olmayan bir testin (örneğin, Mann-Whitney U) kullanılması, sonraki çalışmalarda daha sağlam bilgiler sunabilir (Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: CAR-EV üretimi, zenginleştirmesi, EV karakterizasyonu ve işlevsel okuma. İşlevsellik analizinden önce EV üretimi, üretimi ve zenginleştirilmiş CAR-EV örneklerinin karakterizasyonunun tipik bir iş akışını gösteren şematik diyagram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: HER2'yi hedefleyen CAR-T hücrelerinde GFP ekspresyonunun doğrulanmasıyla temsili mikroskopi analizi. Görüntüler, 20x objektif kullanılarak floresan mikroskobu ile yakalandı. Beyaz ölçek çubuğu 50 μm'lik bir uzunluğu temsil eder. T hücreleri, tek hücrelere ayrılmadan önce kümeler halinde büyüme konusunda doğal bir eğilime sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: CAR hücrelerinin ve EV'lerin karakterizasyonu. (A) CAR-T CM ve zenginleştirilmiş EV'lerin nano izleme parçacık analizi. EV'lerin partikül konsantrasyonu, CM'ninkinden 1.6-2.1 kat daha fazlayken, protein konsantrasyonu %>80 oranında azaldı. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar tek yönlü ANOVA ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile test edildi; s≤ 0.001, **** s≤ 0.0001. (B) Transdüksiyona tabi tutulmuş T hücrelerinin ve zenginleştirilmiş CAR-EV'lerin Western blot analizi, hem CAR hücrelerinde hem de EV'lerde sitolitik granzim B'nin varlığını doğrularken, HEK293T CAR olmayan hücrelerde bir yokluk kaydedildi. CAR-EV'de kalneksin tespit edilmedi, bu da endoplazmik retikulum partikülleri tarafından düşük kontaminasyona işaret ediyor. Şerit başına protein yükü = 5 μg. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: CAR-EV'lerin hedef hücre canlılığı üzerindeki etkisi (MCF-7 meme kanseri hücreleri ve K562 kronik miyeloid lösemi hücre hattı). Hedef hücreler, 3 güne kadar tek doz 4.5 x 105 ve 2.5 x10 5 EV/hücre (sırasıyla EGFR veya HER2 CAR'lar) veya kontrol (EV tamponu) ile tedavi edildi. (A) EGFR'yi hedefleyen CAR-EV hücreleri. (B) HER2'yi hedefleyen CAR-EV'ler. Her iki hücre hattında da absorbans okumasında (tedavi etkinliğinin göstergesi) bir azalma gözlendi. Veriler, iki kuyruklu eşleştirilmemiş bir Öğrenci t-testi kullanılarak analiz edilen SD (n = 3) ± ortalama absorbansı temsil eder ve p değerleri istatistiksel anlamlılığı gösterir; ** s≤ 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR tedavisinin kanıtlanmış etkinliğini hücre dışı vezikül (EV) bazlı tedavinin umut verici avantajlarıyla birleştirmek, meme ve akciğer kanserlerini hedef alan çalışmalarda gösterildiği gibi kanser tedavilerinin etkinliğini artırabilir12,13. CAR-EV terapötik yaklaşımı, EV'lerin biyouyumluluk ve hedefleme yeteneklerinden yararlanırken, dağıtım zorlukları ve ilişkili toksisite gibi CAR tedavisinin mevcut sınırlamalarını ele alır. Bu yöntemlerin entegre edilmesi, kanser için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir ve elektrikli araçların klinik ortamda uygulanmasına yönelik fırsatları genişletebilir. Ek olarak, fonksiyonel EV'lerin mühendisliği ve zenginleştirilmesi, özellikle tümör çekirdeği, kemik iliği ve kan-beyin veya kan-testis bariyeri 14,15,16 gibi bariyerlerle korunan alanlara terapötik kargo iletmek için daha güvenli (sitolitik kargonun kapsüllenmesi yoluyla) ve daha kesin bir yöntem (yani, hedefleme alanlarının eklenmesi) sağlar. Ultrasantrifüjleme kullanılarak EV zenginleştirmenin köklü yöntemine rağmen, bazı sınırlamalar devam etmektedir. Dikkate değer kısıtlamalar şunları içerir: ölçeklenebilirlik, safsızlıkların birlikte izolasyonu ve sınırlı üretim sonrası verim17. Geniş ölçekte terapötik EV'ler üretmek için iyileştirilmiş süreçlere açık bir ihtiyaç vardır.

Bu kavram kanıtlama çalışması, IEX'in, girdi olarak CAR eksprese eden hücrelerden berraklaştırılmış CM kullanarak fonksiyonel CAR-EV'leri üretmek, izole etmek ve zenginleştirmek için ölçeklenebilir ve etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. IEX, yüksek verimli işleme sağlar ve hem araştırma hem de cGMP ölçekli üretimi destekleyerek, EV üretiminden nihai ilaç ürünü testine kadar iş akışı boyunca kalite kontrolüne olanak tanır18,19. EV karakterizasyonu, işlevi doğrulamak için gerekli olsa da, numune hacmi, giriş konsantrasyonu ve yüzey yükü ve bağlanma özellikleri gibi EV'ye özgü özelliklerdeki farklılıklar nedeniyle verim önemli ölçüde değişebilir. MCF-7 hücrelerini kullanan kurum içi veriler, ortalama 2.85 × 108 partikül/mL'lik bir ön saflaştırma verimi gösterir ve saflaştırma sonrası konsantrasyonlar tipik olarak 3 × 1011 ila 1 × 1012 partikül/mL arasında değişir. Bu seviyeler, tampon değişimi sırasında yeniden süspansiyon hacminin aşağı akış ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde değiştirilmesiyle ayarlanabilir. Bu değişkenlik göz önüne alındığında, kullanıcıların, tekrarlanabilir ve sağlam verimler sağlamak için deney düzenekleriyle ilgili olarak protokolü CM ile optimize etmeleri şiddetle tavsiye edilir.

Protokoldeki birkaç adım, özellikle numune yükleme ve elüsyon aşamalarına vurgu yaparak, CAR-EV'lerin başarılı bir şekilde üretilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu adımlar, kolon tarafından EV yakalama verimliliğini ve dolayısıyla genel verimi doğrudan etkiler. Fazla çözünen maddelerin eksik uzaklaştırılması EV stabilitesini tehlikeye atabileceğinden ve zamanla bozulmaya yol açabileceğinden, tampon değiştirme adımı çok önemlidir. EV'ler daha sonra NTA veya proteomik profilleme gibi yöntemler kullanılarak karakterize edilebilir. CAR-EV'ler hücresel alım çalışmaları veya terapötik müdahaleler gibi fonksiyonel analizler için tasarlanmışsa sterilite son derece önemlidir. Deneysel sonuçları karıştırabilecek veya biyogüvenlik riskleri oluşturabilecek mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için son bir 'terminal' (0,22 μm) sterilizasyon adımı gereklidir. Bu faktörler göz önüne alındığında, nihai EV hazırlığının tekrarlanabilirliğini ve işlevsel bütünlüğünü korumak için kullanıcıların bu adımlar sırasında özel dikkat göstermeleri şiddetle tavsiye edilir.

CAR-EV üretimi sırasında karşılaşılan yaygın sorunları çözmek için çeşitli protokol değişiklikleri gerekli olabilir. Düşük verim en yaygın olarak, kolonun bağlama kapasitesini aşan veya yetersiz kalan CM'nin optimal olmayan yüklenmesinden kaynaklanır. Optimum girdi hacmini belirlemek için, maksimum EV geri kazanım noktasını belirlemek üzere yükü kademeli olarak artıran bir CM titrasyon çalışması yapılması tavsiye edilir. Tipik olarak son steril filtreleme adımı sırasında gözlemlenen filtre tıkanması, genellikle EV agregasyonunu destekleyebilen aşırı numune konsantrasyonu ve viskoziteden kaynaklanır. Bu gibi durumlarda, nihai EV preparatının seyreltilmesi önerilir. Seyreltme mümkün değilse, tampon değişiminden önce steril filtrasyon yapılabilir; Ancak bu yaklaşım, steriliteyi korumak için sonraki tüm adımların katı aseptik koşullar altında yürütülmesini gerektirir.

EV'lerin kanser terapötikleri olarak geliştirilmesi, tekrarlanabilir üretim süreçlerini ve hedef kanser hücre dizilerine karşı etkinliklerinin sağlam bir şekilde doğrulanmasını gerektirir. EV zenginleştirmede IEX'in yaygın bir sınırlaması, EV olmayan parçacıkların birlikte izolasyonudur - EV'ye özgü belirteçlerin aşağı akış analizi yoluyla tanımlanabilen ve daha fazla CM optimizasyonu ile azaltılabilen bir zorluk. EV'lerin kontrol salınımı karakterizasyonu şunları içermelidir: Partikül sayısını ve boyutunu belirlemek için NTA ve zenginleştirme sonrası EV konsantrasyonu; CAR yapı ifadesinin genetik ve transkript analizi; CAR'ın hücresel ve EV protein ekspresyonunun, kanonik EV biyobelirteçlerinin ve sitolitik belirteçlerin (örneğin, granzim B ve perforin) belirlenmesi; ve hedef içi ve hedef dışı etkiler. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gibi ek tekniklerin dahil edilmesi, boyuta dayalı karakterizasyonu tamamlayacak morfolojik doğrulama sağlayarak daha kapsamlı bir analizi destekleyecektir. Kalite kontrolünü sürdürmek için EV ürünleri, steriliteyi ve klinik üretime uygunluğu doğrulamak amacıyla mikoplazma ve endotoksin kontaminasyon testlerine tabi tutulmalıdır. Fonksiyonel CAR-EV'lerin uzun süreli depolanması için uygun formülasyonların kullanılması, kalite, miktar ve terapötik etkinliğin korunması da dahil olmak üzere stabilitelerini artırma fırsatları sunabilir. Ürün bütünlüğünü sağlamak için işlevsel performansın tutarlı bir şekilde değerlendirilmesi önemlidir. Özellikle, bu çalışmada kullanılan MTS testi, metabolik aktivitenin ölçümü yoluyla sitotoksisitenin dolaylı bir değerlendirmesini sunar. Gelecekteki çalışmalar, sitotoksik etkileri daha doğru bir şekilde tanımlamak için laktat dehidrojenaz (LDH) salınımı, Ek V/PI boyama veya kaspaz aktivasyon profili oluşturma gibi standartlaştırılmış sitotoksisite testlerinin entegre edilmesinden fayda sağlayacaktır. Ayrıca, CAR hücre karşılaştırıcılarının (kaynak sınırlamaları nedeniyle mevcut çalışmaya dahil edilmemiştir) tek başına veya CAR-EV'lerle kombinasyon halinde dahil edilmesi ve kanser dışı kontrol hücre dizilerinin paralel tedavisinin dahil edilmesi, bulguların yorumlayıcı değerini derinleştirebilir.

Bu çalışma, EGFR/HER2 CAR EV'lerin belirli kanserler için geçerli bir terapötik strateji olarak potansiyel kullanımını vurgulamaktadır. CAR EV'lerin etkinliğinin arttırılması, sitotoksisiteyi arttırmak için ana T hücrelerinin çoklu dozlanması veya ön aktivasyonu yoluyla sağlanabilir. Ayrıca, siRNA kargoları gibi yeni ortaya çıkan yaklaşımlardaki ilerlemeler ve EGFR/HER2 bağlanma kapasitesindeki gelişmeler, bu terapötik platformların tasarımını iyileştirmek için fırsatlar sunmaktadır20,21. Hücre terapisinde ikili kimerik antijen reseptörlerinin (dual-CAR'lar) umut verici uygulaması, ilerleme için ek bir fırsat sunmaktadır. Terapötiklerde EV muadillerinin kullanılmasıyla ikili CAR'ların kullanımının genişletilmesi, terapötik kapsamlarını genişletmede ve tedavi yöntemlerini geliştirmede çok önemli bir adım olabilir22,23. CAR EV kaynaklı kanser hücresi sitotoksisitesinin (örneğin, kaspaz 3/7 aktivasyonu, empedans okuması) gerçek zamanlı izlenmesi, optimal dozaj rejimlerinin belirlenmesi için değerli bilgiler sağlayarak gelecekteki in vivo uygulamalara kolaylaştırılmış çeviriyi kolaylaştırır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L ve Rice G, INOVIQ LTD.'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, laboratuvara katkılarından dolayı Siena Barton, Hiba Rashid, Sara Nikseresht, Shayalini Wignarajah ve Abel Sujeev'e teşekkür eder. Yazarlar, INOVIQ Ltd. tarafından desteklenen ve finanse edilen bu çalışma ile tüm iç ve dış işbirlikçileri kabul eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemeler
1x fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7,4Gibco10010049EV zenginleştirme
%1 sodyum dodesil sülfat (SDS)SigmaL3771-100G1 g SDS tozunu 10 mL ultra saf suda çözün
1x tris tamponlu salin, Tween-20 (TBST) ileThermo Scientific KimyasallarJ77500. K21x çözelti yapmak için ultra saf suyla seyreltin (alternatif olarak, 1x tris tamponlu salin içinde %0,1 polisorbat-20/Tween-20 çözeltisi hazırlayın)
96 oyuklu şeffaf düz tabanlı polistiren TC ile işlenmiş mikroplaka, sterilCorning3595İn vitro fonksiyonel test
Bolt Bis-Tris Plus Mini Protein Jelleri, %4-12, 1,0 mm, WedgeWell formatıDavetliHücre/EV karakterizasyonu
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA9647-100GHücre/EV karakterizasyonu
Kalneksin antikoruHücre Sinyali2433'LERHücre/EV karakterizasyonu
CAR-NK/T hücreleriProMab BiyoteknolojileriDeğişirCAR hücre dışı ligand bağlama alanı, alıcı hücrelerde tercih edilen hedefe bağlıdır
CellTiter 96 AQueous One Solüsyon Hücre Proliferasyon Testi (MTS)PromegaG3580 Serisiİn vitro fonksiyonel test
cOmplete, Mini, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitör KokteyliRoche11836170001Hücre lizizi
ECL Western blot tespit reaktifiAmershamRPN2232Hücre/EV karakterizasyonu
Elüsyon tamponuUYARIEV zenginleştirme/izolasyon
Dengeleme tamponuUYARIEV zenginleştirme/izolasyon
EXO-ACE IEX sütunuUYARIAşağı akış fonksiyonel tahlili
için EV zenginleştirme/izolasyon Patent Kimliği AU2024901931
EXO-NET pan-eksozom yakalama boncuklarıUYARIAşağı akış karakterizasyonu için EV izolasyonu
Patent Kimliği WO/2014/011673
Granzim B antikoruHücre Sinyali4275Hücre/EV karakterizasyonu
İnsan IL-2 IS, birinci sınıfMiltenyi Biotec130-097-744T/NK hücrelerinin kseno içermeyen kültürü
iBlot 2 Transfer Yığınları, PVDFDavetliHücre/EV karakterizasyonu
İmmünoKült-XF (cGMP)Kök Hücre Teknolojileri100-0956T/NK hücrelerinin kseno içermeyen kültürü
K-562 SerisiATCCCCL-243 Serisiİn vitro fonksiyonel test
MCF-7 SerisiATCCHTB-22İn vitro fonksiyonel test
Millex-GP şırınga filtre ünitesi, 0.22 µ mMerck MilliporeSLGPR33RSTerminal filtrasyonu
Yenileme tamponuUYARIEV zenginleştirme/izolasyon
RIPA arabelleği (10X)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi9806Hücre lizizi
Tripan mavisi çözeltisi, %0,4Gibco15250061Hücre canlılığı ve yoğunluğunun değerlendirilmesi
Yıkama tamponuUYARIEV zenginleştirme/izolasyon
Ekipman
Otomatik hücre sayacıDavetliKontes II FLHücre canlılığı ve yoğunluğunun değerlendirilmesi
Tezgah üstü otomatik ekstraksiyon cihazıDavetliKingFisher Apex SistemiYüksek verimli otomatik arıtma sistemi
Protokol ayrıntıları için bağlantıya bakın: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Floresan mikroskobuZeissAxio Gözlemci 7Hücre kültürü
Nanopartikül izleme analizi (NTA)Parçacık Metrix GmbHZetaview PMX-130Partikül analizi
Plaka okuyucuBMG Laboratuvar TeknolojisiSPECTROstar Nanoİn vitro fonksiyonel test
Soğutmalı tezgah üstü santrifüjBeckman CoulterAvanti J-15RHücre kültürü ve EV zenginleştirme işlemi
SDS-PAGE mini jel tankıDavetliA25977 SerisiHücre/EV karakterizasyonu
Western blot transfer sistemiDavetliiBlot 2Hücre/EV karakterizasyonu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date. Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).
  2. Jain, M. D., Smith, M., Shah, N. N. How I treat refractory CRS and ICANS following CAR T-cell therapy. Blood. 141 (20), 2430-2442 (2023).
  3. Tang, X. J., et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: A cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget. 6 (42), 44179-44190 (2015).
  4. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. JEV. 12 (12), e12387(2023).
  5. Jiang, Y., et al. Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells. Ann Transl Med. 9 (6), 473-473 (2021).
  6. Decot, V., et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy:comparison of three cytokines IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol. 38 (5), 351-362 (2010).
  7. Kim, I. Y., et al. Functional enhancement of exosomes derived from NK cells by IL-15 and IL-21 synergy against hepatocellular carcinoma cells: The cytotoxicity and apoptosis in vitro study. Heliyon. 9 (6), e16962-e16962 (2023).
  8. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. J Vis Exp. (95), e50974(2015).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. JEV. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Khanabdali, R., et al. High throughput surface epitope immunoaffinity isolation of extracellular vesicles and downstream analysis. Biol Methods Protoc. 9 (1), bpae032(2024).
  11. Salomon, C., et al. Early detection of ovarian cancer: An accurate high-throughput extracellular vesicle test. J Clin Oncol. 43 (16_suppl), 5582-5582 (2025).
  12. Fu, W., et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 10 (1), 1-12 (2019).
  13. Zheng, W., et al. Inhalable CAR-T cell-derived exosomes as paclitaxel carriers for treating lung cancer. J Transl Med. 21 (1), 383(2023).
  14. Tian, J., et al. Engineered exosome for drug delivery: Recent development and clinical applications. Int J Nanomed. 18, 7923-7940 (2023).
  15. Chen, Z., et al. Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review. J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).
  16. Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer. Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).
  17. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  18. Zhang, W., et al. Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography. Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).
  19. Fernandes, R. P., et al. Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography. Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).
  20. Jiang, J., et al. Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases. JNB. 22 (1), 159(2024).
  21. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728-100728 (2024).
  22. Shi, M., et al. Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial. Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).
  23. Roddie, G., Amrolia, P. J. Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CAR H cre D Vezik lleriEkzozom zolasyonuyon De i im KromatografisiNanopar ac k zlemeGMP Uyumlu zolasyonRNA Terap tikleri letimiY ksek Kapasiteli EV AnaliziEGFR CAR Vezik lleriHER2 CAR Vezik lleri

İlgili makaleler