Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aşamalı Mezoderm İndüksiyonu ve 3D Kendi Kendine Organizasyon Yoluyla Embriyonik Kök Hücrelerden İnsan Kardiyak Organoidlerinin Üretilmesi

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68738

⸱

7 Ekim 2025

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan embriyonik kök hücrelerinden (hESC'ler) fonksiyonel insan kardiyak organoidleri üretmek için adım adım bir yöntemi açıklamaktadır. Hücre çözülmesi, farklılaşması ve olgunlaşma adımlarını içerir ve kardiyak gelişim ve hastalık modellemesi için sağlam bir platform sağlar.

Özet

İnsan embriyonik kök hücresinden (hESC) türetilen kardiyak organoidler, erken insan kalp gelişimi ve işlevinin temel yönlerini özetleyen çok hücreli üç boyutlu (3D) yapılardır. Bu kendi kendini organize eden organoidler, spontan kontraktilite, kardiyomiyosit belirteç ekspresyonu ve doğal miyokardiyumu anımsatan doku benzeri mimari sergiler. Burada, kademeli soy farklılaşması yoluyla H9 hESC hattından kardiyak organoidler üretmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Mezoderm indüksiyonu, sferoidlerin 36-40 saat boyunca Activin A (50 ng/mL), kemik morfogenetik proteini 4 (BMP4, 10 ng/mL), fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2, 30 ng/mL), laduviglusib (CHIR99021, 3 μM) ve bir fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K) inhibitörü (LY294002, 5 μM) ile muamele edilmesiyle başlatılır. Kardiyak soy spesifikasyonu daha sonra dört gün boyunca BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), bir Wnt yolu inhibitörü (XAV-939, 5 μM) ve retinoik aside (0.5 μM) günlük maruz kalma ile yönlendirilir. Kardiyomiyosit farklılaşması ve olgunlaşması, BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL) ve insülin (10 μg/mL) kullanılarak 5.5. günden itibaren daha da desteklenir. Fonksiyonel doğrulama, hızlandırılmış görüntüleme ve immünofloresan analizi yoluyla elde edilir ve kardiyak troponin T (cTnT) ekspresyonu ile işaretlenmiş kasılma kardiyomiyositlerinin oluşumunu doğrular. Ek olarak, 3D immün boyama, düz kas ve endotel benzeri hücre popülasyonlarının ortaya çıktığını gösteren α-SMA ve CDH5'in varlığını ortaya çıkarır. Bu kardiyak organoidler sürekli olarak ritmik kasılmalar gösterir; ancak, elektromekanik kuplajın doğrudan elektrofizyolojik doğrulaması yapılmadı. Bilinen sınırlamalar arasında organoidlerin geçememesi ve genişletilmiş kültürler sırasında potansiyel merkezi nekroz yer alır. Özetle, bu model insan kardiyogenezi, ilaç yanıtları ve konjenital kalp hastalıklarını incelemek için ölçeklenebilir ve fizyolojik olarak uygun bir platform sağlar.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedeni olmaya devam etmekte olup, insan kardiyak gelişimini ve fonksiyonunu özetleyen güvenilir in vitro modellere olan acil ihtiyacın altını çizmektedir 1,2. Kardiyomiyositlerin geleneksel iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültürleri, değerli olmakla birlikte, doğal insan kalbinin uzamsal karmaşıklığını, çok hücreli etkileşimlerini ve elektromekanik entegrasyonunu yeniden üretmekte başarısız olur 3,4. Pluripotent kök hücrelerden türetilen 3D kardiyak organoidler, bu sınırlamaları ele alan, erken kardiyak morfogenezi ve in vitrofonksiyonel olgunlaşmayı taklit eden kendi kendini organize eden, çok hücreli yapılar sağlayan güçlü platformlar olarak ortaya çıkmıştır 5.

H9 çizgisi gibi hESC'ler, kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve kardiyak fibroblastlar6 dahil olmak üzere tüm somatik hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptir. Kontrollü kültür koşulları altında, hESC'ler mezoderm indüksiyonu, kardiyak mezoderm spesifikasyonu ve kardiyomiyosit farklılaşmasınınsıralı aşamaları boyunca yönlendirilebilir 5,7. Bu aşamalı süreç, Activin A, BMP4, FGF2, PI3K inhibitörleri, CHIR99021, Wnt inhibitörleri ve retinoik asit 5,8 dahil olmak üzere spesifik sinyal molekülleri ve inhibitörleri kullanılarak düzenlenebilir. Embriyonik kardiyak gelişimin in vivo sinyal ortamını yakından taklit ederek, bu ipuçları in vitro 5,7'de verimli ve tekrarlanabilir kardiyogenezi teşvik eder.

Matrigel gibi hücre dışı matris (ECM) bileşenlerine gömülmeyi gerektiren birçok organoid sistemin aksine, kardiyak organoidler, matris desteği olmadan düşük yapışma koşullarında kendi kendine bir araya gelebilir 5,9. Süspansiyonda farklılaşan hESC'lerin toplanması, farklılaşmanın10. haftasında kendiliğinden dayak sergileyen küresel 3D yapılar verir. Bu organoidler, işlevsel olarak ilgili kalp hücresi popülasyonlarını içerir ve sarkomerik organizasyon, kalsiyum geçişleri ve ritmik kasılmalar11,12 gibi karakteristik özellikler gösterir ve erken insan kalp dokusunun fizyolojik olarak ilgili bir modelini sunar.

hESC'den türetilen kardiyak organoidler üretme yeteneği, gelişimsel biyoloji, hastalık modelleme, ilaç taraması ve kardiyotoksisite testi13,14 için heyecan verici fırsatlar sunar. Ayrıca, genom düzenleme teknolojileri ve hastaya özel indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) ile entegrasyon, kalıtsal kalp bozuklukları için kişiselleştirilmiş hastalık modellemesine ve terapötik araştırmaya olanak tanır.

Bu makalede, insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak organoidlerin üretilmesi için farklılaşmanın temel aşamalarını, kültür koşullarını ve doğrulama tekniklerini vurgulayan ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu platform, insanın kardiyak gelişimini özetlemek ve gelecekteki çeviri araştırmaları için bir temel oluşturmak için sağlam, ölçeklenebilir bir sistem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan embriyonik kök hücrelerini (H9) içeren tüm prosedürler kurumsal yönergelere uygun olarak yürütüldü ve Southwest Medical Üniversitesi Biyomedikal Etik Komitesi tarafından 20241023-031 onayı ile onaylandı. Aşağıda ayrıntıları verilen tüm doku kültürü çalışmaları Sınıf II laminer akış başlığında yapılmalıdır. Kullanmadan önce daima ortam ve reaktiflerin oda sıcaklığında olduğundan ve doğal olarak dengelendiğinden emin olun. Ortamı ısıtmak için su banyosu kullanmayın.

1. HESC'lerin çözülmesi ve rutin kültürü (H9)

  1. Kültür plakalarının vitronektin kaplaması
    1. Vitronektin stoğunu buz üzerinde çözdürün ve soğuk E8 ortamı kullanarak 10 μg/mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
    2. Seyreltilmiş Vitronectin çözeltisinin kuyucuğu başına 1 mL'yi 6 oyuklu bir plakaya ekleyin. Plakayı kullanmadan önce 37 °C,% 5 CO2 inkübatöründe 1-4 saat inkübe edin.
    3. Hücreleri tohumlamadan önce, fazla Vitronectin'i aspire edin ve durulamayın.
      NOT: Hücre kültürü inkübatöründe inkübasyon, kaplama homojenliğini iyileştirir ve özellikle hassas hESC'ler için önemli olan hücre bağlanmasını artırır. Kaplama solüsyonunun kurumasına izin vermeyin. Bu protokol, tanımlanmış, yüzeye bağlı bir ECM ikamesi sağlamak için yalnızca hESC çözülme ve genişletme aşamaları sırasında vitronektin kaplı plakalar kullanır. Kardiyak organoidler daha sonra ECM'ye ihtiyaç duymadan düşük adezyonlu süspansiyon koşullarında kendi kendine agregasyon yoluyla oluşturulur.
  2. Dondurularak saklanan HESC'lerin (H9) çözülmesi
    1. En az 30-60 dakika önceden, gerekli tüm ortam ve reaktiflerin (örneğin, E8 ortamı, E8 + ROCK inhibitörü, PBS) doğal olarak oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
    2. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak sıvı nitrojen deposundan bir H9 insan embriyonik kök hücresi dondurarak yudumlayın. Kriyovial'i hemen 37 °C'lik bir su banyosuna daldırın. Şişeyi yavaşça döndürün ve yakından izleyin.
    3. Küçük bir buz kristali kaldığında (~%90 çözülmüş, ~1-2 dakika), şişeyi derhal bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Açmadan önce kriyoviyalin dışını %75 etanol ile dezenfekte edin.
    4. Kriyoviyal içeriğini, 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş 5 mL oda sıcaklığında E8 ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yavaşça damla damla aktarın. Geniş delikli pipet ucuyla yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 2 mL E8 + Y-27632 ortamında yeniden süspanse edin.
    6. Hücreleri, istenen tohumlama yoğunluğunda (tipik olarak 150.000-200.000 hücre/kuyu) Vitronectin kaplı 6 oyuklu bir plaka (önceden hazırlanmış) üzerine plakalayın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve 37 °C,% 5 CO2 inkübatörüne aktarın.
      NOT: ROCK inhibitörünün (Y-27632) kullanımı, anoikisi önlemek ve sağkalımı desteklemek için çözülmeden sonraki ilk 24 saat boyunca kritik öneme sahiptir.
  3. Rutin bakım ve geçiş
    1. Kuyu başına 2 mL taze E8 ortamı kullanarak ortamı günlük olarak değiştirin.
    2. Faz kontrast mikroskobu altında günlük olarak izleyin; geçiş hücreleri ~%70-80 birleşmeye ulaştıklarında, tipik olarak her 3-4 günde bir.
      1. Geçiş için: Ortamı aspire edin ve 1 mL DPBS ile hafifçe durulayın.
      2. 0,5 mL kök hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin. Kolonileri yerinden çıkarmak için plakaya hafifçe vurun.
      3. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 10 μM Y-27632 içeren E8 ortamında taze Vitronektin kaplı kuyucuklara 1:3-1:4 bölünmüş oranda yeniden plakalayın. 24 saat sonra ortamı ROCKi içermeyen E8 ile değiştirin.
        NOT: Optimal iyileşme ve müteakip farklılaşma verimliliği için, HESC'ler 2-10 hücreden oluşan küçük kümeler olarak geçirilmelidir.
        Kayma gerilimini en aza indirmek için geniş çaplı uçların kullanılması önerilir. Karıştırma için 5 mL'lik bir pipet ucu veya 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanılabilir.

2. HESC'lerin (H9) kardiyak soya farklılaşması

  1. Mezodermal farklılaşmanın indüksiyonu (0-1.5.
    NOT: Yeni çözülmüş HESC'leri (H9) doğrudan kardiyak organoidlere ayırmaktan kaçının. Optimum hücre canlılığını ve sağlıklı farklılaşmayı sağlamak için farklılaşmaya başlamadan önce hücrelerin ilk önce geçişinin yapılması ve en az bir geçiş boyunca muhafaza edilmesi çok önemlidir. Çözüldükten hemen sonra hücrelerin farklılaşması, hücre sağlığının bozulması nedeniyle kötü sonuçlara neden olabilir.
    1. İndüksiyon öncesi tohumlama: hPSC'ler yaklaşık %70 birleşmeye ulaştığında, uygun bir ayrışma reaktifi kullanarak hücreleri yavaşça küçük kümelere ayırın. Kümeleri, 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL E8 ortamında yeniden süspanse edin.
    2. Toplama: 200 μL hücre süspansiyonunu (tipik olarak 12.000-15.000 hücre) 96 oyuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir oyuğuna tohumlayın ve daha sonra her bir kuyucuğun dibinde hücre kümelenmesini kolaylaştırmak için plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin.
    3. İnkübasyon: Kompakt ve düzgün embriyoid cisimlerin (EB'ler) oluşumuna izin vermek için plakayı 37 °C, %5 CO2 inkübatörüne yerleştirin ve 24 saat boyunca kültürleyin.
    4. % 50 IMDM,% 50 F12 besin karışımı, 15 μg / mL İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS-G), 450 μM monotiyogliserol ve 5 mg / mL sığır serum albümin fraksiyonu V'yi birleştirerek Bazal Kültür Ortamı (BC-M) hazırlayın.
    5. BC-M'yi Activin A (50 ng/mL), BMP4 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), FGF2 (30 ng/mL) ve LY294002 (5 μM) ile destekleyerek MD-M'yi hazırlayın.
    6. Mezodermal İndüksiyon: 24 saatlik agregasyondan sonra, MD-M ile 36 saat boyunca EB'leri indükleyin.
      NOT: Kardiyak organoidlerin indüksiyon verimliliğini ve tutarlılığını sağlamak için, H9 hESC'lerin kullanımını çözüldükten sonra üç pasajla kesinlikle sınırladık. Bu strateji, yüksek farklılaşma verimliliğini ve genel deneysel güvenilirliği korumak için kritik öneme sahiptir.
      Orta değişim sırasında nazik kullanım, oluşan agregaların bütünlüğünü korumak için kritik öneme sahiptir. EB'lerin küresel morfolojisini bozmaktan kaçının.
  2. Kardiyak mezodermal diferansiyasyonun indüksiyonu (1.5-5.5 Günler)
    NOT: Wnt sinyal inhibitörü (XAV-939), posterior mezodermal sinyalleri baskılamak ve kardiyak soy spesifikasyonunu desteklemek için kritik öneme sahiptir. Retinoik asit, ön-arka desenlemede doza duyarlı bir rol oynar; aşırı RA, ön bağırsak spesifikasyonuna yol açabilir.
    1. Kardiyak Mezodermal Farklılaşma Ortamı (CMD-M) hazırlamak için BC-M'yi (Adım 2.1'de ayrıntılı olarak açıklanan bileşim) BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), Retinoik Asit (0.5 μM) ve XAV-939 (5 μM) ile destekleyin.
    2. 36-40 saatlik mezodermal indüksiyondan sonra, MD-M'yi dikkatlice aspire edin ve her gün orta düzeyde değişiklikle 4 gün boyunca CMD-M ile değiştirin.
      NOT: Mekanik bozulmayı veya stres kaynaklı apoptozu önlemek için ortam değişiklikleri sırasında agregaları nazikçe tutun.
      Bu dönemde sferoidler daha kompakt ve düzenli hale gelir. Kardiyak soy bağlılığının erken belirtileri, 5. günde parlak alan mikroskobu altında gözlemlenebilir.
  3. Kardiyak organoid spesifikasyonu (5.5-7.5 Günler)
    1. Kardiyak organoid spesifikasyon ortamını (COS-M) hazırlamak için BC-M'yi (Adım 2.1'de ayrıntılı olarak açıklanan bileşim) BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL) ve insülin (10 mg/mL) ile destekleyin.
    2. 5.5. Günde, CMD-M'yi nazikçe aspire edin ve her gün orta düzeyde değişiklikle 2 gün boyunca COS-M ile değiştirin.
      NOT: BMP4 ve FGF2 sinerjik olarak kardiyak progenitör genişlemesini teşvik eder ve bu aşamada kardiyak olmayan kaderleri bastırır. İnsülin, farklılaşan kardiyomiyositlerin metabolik aktivitesini ve yapısal gelişimini destekler.
  4. Kardiyak organoid olgunlaşma
    NOT: Transfer sırasında sferoidlerin tamamen ayrışmasını veya pipetlenmesini önleyin. Kardiyomiyositler, kesme stresine karşı oldukça hassastır.
    1. Kardiyak Organoid Olgunlaşma Ortamını (COM-M) hazırlamak için BC-M'yi (Adım 2.1'de ayrıntılı olarak açıklanan bileşim) insülin (10 mg/mL) ile destekleyin.
    2. 7.5. Günden itibaren COM-M'ye geçiş. Stresi en aza indirirken besin seviyelerini korumak ve metabolik atıkları ortadan kaldırmak için günlük olarak orta değişiklikler yapın.
    3. 8. Günden 12. Güne kadar, tipik olarak ışık mikroskobu altında belirgin hale gelen kardiyak organoidlerin kendiliğinden atımını arayın.
    4. 12+ Günde, kasılma ritminin düzenli ve sürekli olduğunu onaylayın.
      NOT: Vuruş hızı ve morfolojisi, hızlandırılmış mikroskopi ve görüntü analiz araçları kullanılarak ölçülebilir.
      Fonksiyonel olgunluğu değerlendirmek için elektrofizyolojik analiz (örneğin, kalsiyum görüntüleme veya MEA) 12. günden itibaren yapılabilir.

3. Kriyoprezervasyon için hazırlık

  1. Mekanik stresi önlemek için geniş çaplı bir pipet kullanarak kardiyak organoidleri kültür plakasından dikkatlice aktarın. Bunları 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve organoidlerin santrifüjleme olmadan 3-5 dakika yerçekimi ile doğal olarak yerleşmesine izin verin.
  2. Kriyoprezervasyon Ortamını (Cryo-CM) aşağıdaki bileşenlerle (nihai konsantrasyonlar) hazırlayın: %80 CM-M, %10 FBS, %10 DMSO.
  3. Kardiyak organoidleri kriyoviyal başına 500 μL Cryo-CM içinde nazikçe yeniden süspanse edin.
  4. Dondurularak saklanan şişeleri izopropanol bazlı bir dondurma kabına yerleştirin. ~1 °C/dk'da kademeli soğutma sağlamak için -80 °C'de 12-24 saat saklayın.
  5. Gece boyunca dondurulduktan sonra, uzun süreli koruma için şişeleri sıvı nitrojen deposuna aktarın.
    NOT: Kardiyak organoidleri, 1 mL kriyoprezervasyon ortamında süspanse edilmiş, kriyovyal başına yaklaşık 20-30 olgun organoid yoğunluğunda dondurarak sakladık.

4. Kardiyak organoid iyileşme ve çözülme

  1. Organoidleri geri kazanmak için, şişeleri bir su banyosunda hızlıca çözün, kardiyak organoidleri CM-M ortamına aktarın, DMSO'yu çıkarmak için nazikçe santrifüjleyin ve organoidleri taze CM-M'de yeniden süspanse edin..
    NOT: Çözülme sonrası dövme, organoidlerin olgunluğuna ve kullanım kalitesine bağlı olarak tipik olarak 24-48 saat içinde devam eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

H9 hESC'lerin kardiyak organoidlere başarılı bir şekilde farklılaşması, pluripotent kök hücrelerin güçlü bir şekilde canlandırılması ve sürdürülmesi ile başlar. Çözüldükten sonra, hESC'ler, bir ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E8 ortamında vitronektin kaplı plakalar üzerine kaplandığında yüksek canlılık ve aderans gösterir. 24-48 saat içinde, tipik farklılaşmamış morfolojinin geri kazanıldığını gösteren, tanımlanmış kenarlara ve yüksek çekirdek-sitoplazma oranlarına sahip kompakt koloniler gözlemlenebilir (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

H9 hESC'lerden kardiyak organoidlerin başarılı bir şekilde üretilmesi, erken kardiyak gelişimi taklit etmek için anahtar sinyal yollarının hassas zamansal ve uzamsal düzenlenmesine dayanır. Bu protokol, mezoderm indüksiyonunun, kardiyak soy spesifikasyonunun ve kimyasal olarak tanımlanmış bir sistemde 3D kasılma yapılarında kendi kendine organizasyonun kritik aşamalarını özetlemektedir. Yöntem, insan kalp gelişimini, konjenital kalp hastalığını ve kardiyotoksisite taramasını modellemek i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Junfeng Ji'ye (Temel Tıp Bilimleri Okulu, Zhejiang Üniversitesi, Çin) ve Tao Luo'ya (Temel Tıp Bilimleri Okulu, Zhejiang Üniversitesi, Çin) hESC'leri (H9) sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (C.Z.'ye Hibe No. U23A20398), Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (C.Z.'ye Hibe No. 2022YFS0578 ve 2022YFS0614), Southwest Tıp Üniversitesi Araştırma Start-up Vakfı (C.Z.'ye Hibe No. 00040155), Southwest Tıp Üniversitesi Araştırma Start-up Vakfı (B.W.'ye Hibe No. 00170071), Luzhou Belediye Halk Hükümeti ve Güneybatı Tıp Üniversitesi'nin Bilim ve Teknoloji Stratejik İşbirliği Programları (Hibe No. 2024LZXNYDJ088 BW'ye), Güneybatı Tıp Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Stratejik İşbirliği Projesi (Hibe No. 2024PZXNYD01'den BW'ye) ve Güneybatı Tıp Üniversitesi Vakfı (Hibe No. 2024ZKZ014'ten BW'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,02 EDTABeyotimeC0198 (İngilizce)
6 kuyu  tabakCORNİNG3516
%7,5 sığır serum albüminiACMECAC11954
96 oyuklu ultra alçak bağlantı plakasıCORNİNG7007
Alexa Fluor 488 Eşek anti-Fare IgGEvet34106ES60
Alexa Fluor 555 Keçi anti-tavşanDavetliA-21428
CHIR-99021 monohidroklorürEvet52965ES10
DMSO Güneş EnerjisiD8370 Serisi
Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS)Evet60152ES76
FBS'ninGibco10099141C
FGF2 Proteini, İnsan, RekombinantHedef MolTMPY-00749-50 μ g 
Jambon'un F-12 Besin KarışımıYaşam Teknolojileri11765054
hPSC-CDM (Temel 8 ortam)Karnabahar hücresi400105
İnsan BMP-4 Rekombinant ProteiniGibcoPHC9534
IMDM, GlutaMAX TakviyesiYaşam Teknolojileri31980030
İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS -G)Gibco41400045
LY294002SelleckS1105-50mg
MonotiyogliserolSigma-AldrichM6145 Serisi
Fare anti-&alfa;SMAAbmartMN50104
DAPI'li ProLong Diamond Antifade MountantDavetliP36966
Tavşan anti-CDH5AbmartTA6265 Serisi
Tavşan anti-cTNTDavetli701620
Rekombinant İnsan BMP-4 ProteiniEvet92053ES20
Rekombinant İnsan İnsülin Evet40112ES25
Rekombinant İnsan/Fare/Sıçan Aktivin Bir ProteinEvet91702ES10
ReLeSRKök hücre100-0483
Retinoik asitSigma-AldrichR2625 Serisi
VitronektinGibcoA14700 Serisi
XAV-939 SerisiSelleckS1180 Serisi
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitörü)SelleckS1049 Serisi

Kaynaklar

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game-changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Ni, B., Ye, L., Zhang, Y., Hu, S., Lei, W. Advances in humanoid organoid-based research on inter-organ communications during cardiac organogenesis and cardiovascular diseases. J Transl Med. 23 (1), 380(2025).
  3. Mohr, E., Thum, T., Bär, C. Accelerating cardiovascular research: Recent advances in translational 2D and 3D heart models. Eur J Heart Fail. 24 (10), 1778-1791 (2022).
  4. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  5. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  6. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: A methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  7. Yang, N., et al. Human cardiac organoid model reveals antibacterial triclocarban promotes myocardial hypertrophy by interfering with endothelial cell metabolism. Sci Bull. 70 (3), 342-346 (2025).
  8. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  9. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  10. Liu, C., Feng, X., Li, G., Gokulnath, P., Xiao, J. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76 (1), 103813(2022).
  11. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nat Commun. 11 (1), 4283(2020).
  12. Yang, J., et al. Generation of human vascularized and chambered cardiac organoids for cardiac disease modelling and drug evaluation. Cell Prolif. 57 (8), e13631(2024).
  13. Kim, H., Kamm, R. D., Vunjak-Novakovic, G., Wu, J. C. Progress in multicellular human cardiac organoids for clinical applications. Cell Stem Cell. 29 (4), 503-514 (2022).
  14. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 39 (6), 737-746 (2021).
  15. Klimanskaya, I., McMahon, J. Approaches for derivation and maintenance of human embryonic stem cells. Handb Stem Cells. , 1st ed, Elsevier Academic Press. (2004).
  16. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799(2022).
  17. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3D bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri3B Öz-OrganizasyonKardiyomiyosit DiferansiyasyonuSoy Belirlemeİmmünofloresan AnalizTime-Lapse GörüntülemeKardiyak Troponin TDüz Kas Hücreleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.