Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Özet

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Özet

Kanser immünoterapisinin etkinliği, tip 1 konvansiyonel dendritik hücreler (cDC1'ler) tarafından katı tümörlere karşı sitotoksik T hücresi yanıtlarının toplanmasına ve aktivasyonuna dayanır. Bununla birlikte, kanser immünoterapisi için cDC1'lerin üretilmesi, zayıf hücre verimi, fonksiyonel heterojenlik ve tümör mikroçevresinde (TME) immünosupresyona duyarlılık dahil olmak üzere önemli sınırlamalarla karşı karşıyadır. Yakın zamanda, kanser hücrelerinin immünojenik cDC1 benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasına dayanan bir immünoterapi modalitesi geliştirdik, bu da kanser hücrelerinin tümör antijenlerini cDC1'ler olarak sunmasını sağladı ve poliklonal sitotoksik T hücresi yanıtları ve dayanıklı sistemik anti-tümör bağışıklığı ortaya çıkardı. Burada, kanser hücrelerinde minimal cDC1'e özgü gen düzenleyici ağı (PU.1, IRF8 ve BATF3 (topluca PIB olarak anılır) aşırı eksprese ederek TME içinde cDC1 benzeri hücreler oluşturmak için izlenebilir bir protokolü açıklıyoruz, ardından transdüksiyonlu ve ebeveyn hücrelerin bir karışımının deri altı implantasyonu. PIB aşırı ekspresyonu, hematopoietik belirteç CD45'in ve tümör hücreleri üzerinde profesyonel antijen sunum kompleksi MHC sınıf II'nin kademeli olarak edinilmesini sağlar ve in vivo cDC1 yeniden programlaması için hücre yüzeyi okumaları olarak hizmet eder. İn vitro yeniden programlama işlemiyle karşılaştırıldığında, YUMM1.7 fare melanom modelinin in vivo olarak yeniden programlanması daha hızlı kinetik ve daha yüksek verimlilik gösterdi. cDC1 benzeri hücreler, ilk 3 gün içinde konakçı bağışıklık hücrelerini işe alarak ve 9. günde üçüncül lenfoid yapının oluşumuna yol açarak TME'nin hızlı bir şekilde yeniden şekillenmesine neden oldu. Yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreler tümörlerde en az 9 gün kaldı, ancak 15. günde tespit edilmedi. Burada açıklanan in vivo cDC1 yeniden programlama protokolü, "bağışıklık-soğuk" tümörleri etkili bir şekilde "bağışıklık-sıcak"a dönüştürmek için izlenebilir ve sağlam bir yöntem sağlar. Genel olarak, cDC1 aracılı anti-tümör bağışıklığının altında yatan mekanizmaları incelemek ve diğer kanser immünoterapi modaliteleri ile sinerjik kombinasyonları ortaya çıkarmak için güçlü bir platform sunar.

Giriş

İmmün kontrol noktası blokajı (ICB), evlat edinen hücre tedavisi (ACT) ve aşılar dahil olmak üzere kanser immünoterapi modalitelerindeki son gelişmeler, kanser tedavisinin manzarasını değiştirmiştir¹. Melanomda, programlanmış hücre ölümü proteini 1 (PD-1) ve sitotoksik T lenfosit ile ilişkili protein 4 (CTLA-4) inhibisyonuna yanıt oranları %60'a kadar ^ulaşabilir2. Bununla birlikte, melanom hastalarının %40'ından fazlası ICB'ye yanıt verememekte ve meme kanseri, mikrosatellit stabil kolorektal kanser ve glioblastoma gibi daha az immünojenik kanserlerde yanıt oranları %5'in altında kalmaktadır^ve bu da klinik boşlukları vurgulamaktadır ^3,4,5. Geniş klinik başarının önündeki en önemli engel, tümör mikroçevresi (TME) içinde etkili antijen sunumuna bağlı olan sitotoksik T hücresi yanıtlarının zayıf ^{aktivasyonudur6}.

Konvansiyonel tip 1 dendritik hücreler (cDC1'ler) nadirdir, ancak tümöre özgü bağışıklığın başlatılması için vazgeçilmezdir ve T hücresi yanıtlarını hazırlamak için üç anahtar sinyal sunar: (1) majör histouyumluluk kompleksleri (MHC) sınıf I ve II üzerinde antijenlerin profesyonel işlenmesi ve sunumu, (2) CD80 ve CD86 yoluyla ko-stimülasyon ve (3) IL-12 ^7,8 dahil pro-inflamatuar sitokin sinyali. Dendritik hücre (DC) alt kümeleri arasında, cDC1'ler, naif bellek CD8 ⁺ T hücrelerini hazırlamak veya yeniden aktive etmek veya CD4 ⁺ T hücresi farklılaşmasını tip 1 T yardımcı (T_H1) hücrelerine yönlendirmek için tümör hücresi ile ilişkili antijenleri çapraz sunmada mükemmeldir⁹. Ek olarak, cDC1'ler, tümör dokusuna T hücresi alımına aracılık eden kemokinlerin, CXC motifli kemokin ligandları 9 ve 10'un (CXCL9/10) ana üreticileridir^10,11,12,13. Son birkaç yılda, çok sayıda çalışma, tümör reddinin ve ICB veya ACT'ye etkili yanıtların intratümöral cDC1'lerin varlığı ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu vurgulamıştır^12,13. Bu nedenle, cDC1'ler kanser immünoterapisi için çekici bir hedef olarak gelişmiştir ve benzersiz özelliklerinden başarılı bir şekilde yararlanmak, önemli bir translasyon potansiyeline sahip olabilir.

cDC1'leri oluşturmak için mevcut yöntemler, CD34⁺ progenitörlerinden veya pluripotent kök hücrelerden kan izolasyonuna veya farklılaşmasına dayanmaktadır 14,15,16. Baskın klinik stratejiler, otolog DC alt kümelerinin bir karışımının kandan izole edilmesine ve reinfüzyondan önce olgun, immünojenik bir programı indüklemek için bunları toll benzeri reseptör agonistleri veya proinflamatuar sitokinlerle ex vivo olarak uyarmaya^{dayanır 16}. Bununla birlikte, bu stratejiler, zayıf hücre olgunlaşması, TME'deki immünosüpresif bariyerler ve cDC1'lerin sadece küçük bir kısmının mevcut olduğu infüze edilmiş DC karışımındaki alt küme heterojenliği ile sınırlıdır⁷. Ayrıca, kanser immünoterapisi veya aşılama için sadece cDC1'leri izole etmek, periferik kandaki son derece düşük bollukları (%<0.3)¹⁶ nedeniyle zordur. Ek olarak, cDC1'ler, sitokinler ve NOTCH sinyali kullanılarak CD34⁺ progenitör hücrelerden veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden üretilebilir. Bununla birlikte, bu yöntemler karmaşık ve uzun protokoller gerektirir ve DC alt kümelerinin düşük sayıları ve heterojen popülasyonları^verir 17,18,19.

Bu sınırlamaları ele almak için, in vivo yeniden programlama, cDC1s^20'nin fenotipik, transkripsiyonel ve fonksiyonel özelliklerine benzeyen cDC1 benzeri hücreler oluşturmak için kanser immünoterapisi için uygun bir strateji sağlar. cDC1'e özgü minimal gen düzenleyici ağının aşırı ekspresyonu yoluyla - PU.1, IRF8 ve BATF3 (topluca PIB olarak anılır) - fibroblastlar, stromal hücreler ve kanser hücreleri, tümör antijeninin işlenmesini ve MHC sınıf I ve II'de sunumunu, CD80 ve CD86 yoluyla ko-stimülatör sinyallemeyi ve CXCL9 / 10 ve IL-12²⁰ dahil olmak üzere sitokin / kemokin sekresyonunu sağlayan cDC1 benzeri hücrelere kademeli olarak yeniden programlanmıştır^. 21,22,23. cDC1 yeniden programlaması, insan ksenogreftleri arasında in vivo ve immünosupresyondan bağımsız olarak daha hızlı ve daha verimli bir şekilde ilerledi ve olgun bir immünojenik imzaya sahip cDC1 benzeri hücreler²⁰ üretti. Sinjeneik melanom tümörlerinde, cDC1 benzeri hücrelerin TME'lerini yeniden şekillendirdiğini, üçüncül lenfoid yapının (TLS) oluşumunu indüklediğini ve poliklonal T_H1 ve sitotoksik bellek T hücrelerini işe alıp genişleterek uzun süreli sistemik bağışıklığa yol açtığını gözlemledik²⁰. Son olarak, adenoviral vektörlerin²⁰ intratümöral enjeksiyonu ile kanser hücrelerinin cDC1 benzeri hücrelere yerinde yeniden programlanmasına dayanan yeni bir kanser immünoterapi modalitesi geliştirdik. Bu bulgular, cDC1'lerin fonksiyonel özelliklerinden yararlanabilen yeni bir kanser immünoterapi modalitesi olarak cDC1'in yeniden programlanmasının klinik çevirisinin yolunu açmaktadır.

Burada, in vivo cDC1 yeniden programlamaya dayalı olarak TME içinde cDC1 benzeri hücreler oluşturmak için izlenebilir bir protokol sunuyoruz. PIB'nin kanser hücrelerine lentiviral olarak verilmesi ve ardından transdüksiyona uğramış ebeveyn kanser hücreleri ile transdüksiyona uğramış kanser hücrelerinin tanımlanmış bir karışımı olarak implantasyon, TME içindeki kanser hücrelerinin kontrollü bir fraksiyonunun in vivo olarak yeniden programlanmasına izin verir. Ek olarak, bu yöntem viral vektörlerin²⁰ yerinde dağıtım verimliliği ile sınırlı değildir. Örnek olarak sinjeneik melanom modeli YUMM1.7'yi kullanarak verimli lentiviral vektör üretimi, fonksiyonel titrasyon ve in vivo cDC1 yeniden programlama adımlarını özetliyoruz. Tümör ayrışmasından sonra akış sitometrisi ile in vivo yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreleri analiz etmek için deney kurulumunu ve geçit stratejisini detaylandırıyoruz. Ayrıca, tümör bölümlerinin kriyoprezervasyonu, kesiti ve immünofloresan boyaması ve ardından konfokal mikroskopi yaparak TME'deki değişiklikleri değerlendirmek için adımlar sağlıyoruz. Son olarak, tümör büyümesini ve sağkalımını ölçerek cDC1 ile indüklenen bağışıklığın nasıl izleneceğini ele alıyoruz. Bu izlenebilir ve ölçeklenebilir yaklaşım, araştırmacılara in vivo cDC1 yeniden programlama ile kombinatoryal tedavi stratejilerini değerlendirmek, kanser modellerinde TME ve TLS neogenezindeki değişiklikleri karakterize etmek veya antijen sunumu veya sitokin / kemokin sekresyonu gibi çeşitli bağışıklık yollarının ekspresyonunu değiştiren büyük ekranlar gerçekleştirmek ve bunların antitümör bağışıklığı üzerindeki etkilerini çözmek için değerli bir araç sunar.

Protokol

Hayvan deney prosedürleri, İsveç Tarım Kurulu'ndan onay alındıktan sonra İsveç yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Reaktif hazırlama

1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) tam ortamını hazırlamak için,% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat, 100 U / mL penisilin (Kalem), 2 mM glutamin ikamesi ve 100 mg / mL streptomisin (Strep).
2. RPMI 1640 tam ortamı hazırlamak için %10 (h/h) FBS, 2 mM glutamin ikamesi, 1 mM sodyum piruvat, 50 mM 2-merkaptoetanol, 100 U/mL Kalem ve 100 mg/mL Strep ekleyin.
3. DMEM / F12 tam besiyerini hazırlamak için,% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler ve 100 U / mL Pen ve 100 mg / mL Strep ekleyin.
4. 1 mg / mL Polietilenimin (PEI) hazırlamak için, 100 mg PEI tozunu 100 mL steril deiyonize su içinde bir cam beher veya konik tüpte çözün. Beheri manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin ve tamamen eriyene kadar bir girdap oluşturmak için oda sıcaklığında (RT) karıştırın. Damla damla hidroklorik asit (HCl)/sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH'ı 6.9-7.1'e ayarlayın ve çözeltiyi 0.22 μm PES membran filtreden süzün.
5. 1 mM Sodyum Butirat hazırlamak için 1.10 mg'ı 10 mL steril deiyonize suda çözün.
6. 8 mg / mL Polibren hazırlamak için, 80 mg Polibren tozunu 10 mL steril deiyonize suda çözün.
7. FACS tamponunu hazırlamak için, fosfat tamponlu saline (PBS) %2 FBS ve 1 mM EDTA ekleyin.

2. Lentivirus üretimi

1. HEK 293T hücrelerini, 9 mL önceden ısıtılmış DMEM tam ortamına 1 mL hücre ekleyerek çözün ve hücreleri 350 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini 20 mL DMEM tam ortamında ve kültür hücrelerinde 150 mm'lik bir plakada 37 ° C'de% 5 CO₂ ile yeniden süspanse edin.
2. HEK 293T hücrelerini% 80-90 birleşmeye ulaştıklarında genişletin ve bölün. Hücreleri bölmek için, PBS ile bir kez yıkayın, plakadan ayırmak için 5 mL tripsin ekleyin ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
3. 5 mL DMEM tam ortamlı hücreleri toplayın, 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüjleyin ve transfeksiyondan 48 saat önce 1: 6 oranında yeni 150 mm'lik plakalara bölün.
   NOT: Lentivirüs üreten hücre hattının kalitesi, yüksek titreler üretmek için çok önemlidir. Hücrelerin %95 birleşme oranını aşmasına izin vermeyin ve bunları %<30 birleşme noktasında tohumlamaktan kaçının.
4. 48 saat sonra veya hücreler% 70-80 birleşmeye ulaştığında, transfeksiyon karışımını 50 mL'lik konik bir tüpte hazırlayın. Aşağıdaki transfer plazmidini kullanın: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-PU.1, IRF8, BATF3 transkripsiyon faktörlerini, dahili bir ribozomal giriş bölgesini (IRES) ve floresan transdüksiyon raportörü olarak gelişmiş bir yeşil floresan proteini (eGFP) içeren bir polisistronik lentiviral vektör; veya 2) SFFV-eGFP, çoklu klonlama bölgesi ve eGFP'ye sahip bir kontrol lentiviral vektörü; veya 3) mCherry'yi ifade eden bir lentiviral vektör olan SFFV-mCherry. 10 μg transfer plazmidi, 7.5 μg ambalaj plazmidi psPAX2 ve 2.5 μg zarf plazmidi pMD2.G ekleyin. Toplam 2 mL hacme ulaşmak için tüpü Opti-MEM ile doldurun. Son olarak, transfeksiyon karışımına 60 μL transfeksiyon reaktifi PEI (1 mg / mL stoktan) ekleyin.
   NOT: Lentiviral vektör SFFV-eGFP, lentiviral aracılı immünojenisiteyi hesaba katmak için deneylerin yeniden programlanması için bir transdüksiyon kontrolü olarak kullanılırken, SFFV-mCherry, floresan etiketli kanser hücre hatları oluşturmak için kullanılır.
5. Transfeksiyonu girdapla 1 dakika boyunca iyice karıştırın ve DNA-lipit komplekslerinin oluşumuna izin vermek için RT'de 15 dakika inkübe edin.
   NOT: İzdiham, viral titreleri önemli ölçüde etkiler. Hücrelerin %70'ten daha az birleşmede transfekte edilmesi, plazmitleri alan daha az hücre nedeniyle daha düşük viral titrelere neden olacaktır.
6. HEK 293T hücrelerinin besiyerini aspire edin ve Kalem / Adım olmadan ve% 10 steril filtreli FBS ile 10 mL DMEM ekleyin.
7. Transfeksiyon karışımını 150 mm'lik plakalara damla damla ekleyin ve %5 CO₂ ile 37 ° C'de 16 saat inkübe edin.
8. Transfeksiyondan sonra, ortamı 1 mM Sodyum Butirat ile takviye edilmiş 20 mL DMEM tam ortam ile değiştirin ve hücreleri% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
   NOT: Sodyum bütirat, sınıf 1 histon deasetilaz (HDAC) inhibitörüdür ve kromatin yapısını açan ve viral paketleme ve transfer plazmitlerinin transkripsiyonunu kolaylaştıran histon hiperasetilasyonunu indükleyerek HEK 293T hücrelerinde gen ekspresyonunu artırabilir. Transfeksiyon verimliliği, bir floresan mikroskobu kullanılarak eGFP ekspresyonu kontrol edilerek değerlendirilebilir.
9. Lentivirüs içeren süpernatanı, transfeksiyondan 48 saat ve 60 saat sonra 50 mL konik tüplere toplayın. İlk koleksiyondan sonra, ikinci koleksiyon için 150 mm'lik plaka başına 12 mL önceden ısıtılmış DMEM tam ortamı ekleyin. Koleksiyonları 4 °C'de saklayın, 0,45 μm düşük protein bağlayıcı PES filtresinden süzün ve birleştirin.
10. Virüsü konsantre etmek için, 37 g lentivirüs içeren ortamı 38,5 mL Üstü Açık İnce Duvar Polipropilen Tüplere pipetleyin. Bir tezgah üstü terazi kullanarak tüplerin ağırlığını ölçün.
    NOT: Ağırlık dengeleme için daha fazla hassasiyet sağladığından, lentivirüs içeren ortamın hacminden ziyade ağırlığını ölçün. Ultrasantrifüje zarar vermemek için tüplerin ağırlığı iyi dengelenmelidir.
11. Tüpleri ultrasantrifüj kovalarına yerleştirin, kapakları kapatın ve kovaları bir Sallanan kova rotoruna yerleştirin. 25.000 × g'da 4 °C'de 90 dakika santrifüjleyin.
12. Santrifüjlemeden sonra, tüpleri kovalardan çıkarın ve süpernatanı aspire edin.
    NOT: Aynı tüpler tekrar tekrar doldurulabilir ve tüp başına daha büyük bir lentivirüs peleti üretmek için toplam üç santrifüj turu için kullanılabilir.
13. Üstü Açık İnce Duvar Polipropilen Tüpleri, fazla sıvının peleti boşaltmasını ve kurumasını sağlamak için bir laboratuvar mendili veya benzeri emici malzeme üzerine 5 dakika boyunca baş aşağı yerleştirin.
14. Her pelete HEPES veya PBS ile takviye edilmiş 200 μL buz gibi soğuk DMEM ekleyin. Mikrosantrifüj tüplerini 50 mL'lik konik tüplere yerleştirin ve steriliteyi korumak için kapağı kapatın.
15. Yeniden süspansiyona izin vermek için peleti gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
16. Yeniden askıya alınmış peletleri birleştirin, alikot ve bir yıla kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Tekrarlanan dondurarak çözme turlarından kaynaklanan titre kaybını önlemek için daha küçük alikot hacimleri kullanın (örn., 50-200 μL).

3. Fonksiyonel virüs titrasyonu

NOT: Bu adım, transdüksiyonlu (eGFP ⁺) ve transdüksiyonsuz (eGFP^-) hücrelerin 1: 1 oranını elde etmek için gereken optimal viral dozu belirlemek için her lentivirüs partisi için tekrarlanmalıdır.

1. Kanser hücrelerini uygun kültür ortamında çözün ve genişletin (ör., DMEM / F12 tam ortamındaki YUMM1.7 murin melanom hücre hattı).
   NOT: Hücreler, bir yeniden programlama deneyinden önce en az bir tur bölünmeye tabi tutulmalıdır. Hücrelerin geçişleri deneyler arasında benzer olmalıdır.
2. Tümör oluşumundan bir gün önce, kültür ortamlarını aspire ederek, PBS ile bir kez yıkayarak ve 100 mm plaka veya 150 mm plaka başına 2 mL veya 5 mL tripsin ekleyerek kanser hücrelerini yükseltin. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 5-10 dakika inkübe edin ve 50 mL konik tüplere sırasıyla 100 mm veya 150 mm plaka başına 8 mL veya 5 mL tam ortam ekleyerek hücreleri toplayın.
3. Tripsini çıkarmak ve tam ortamda yeniden süspanse etmek için hücreleri 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüjleyin.
4. 10 μL'lik bir hücre alikotu alın, 10 μL Tripan Mavisi ekleyin ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
5. 6 × 10⁵ hücreyi 12 mL tam ortam içeren yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın ve 8 μg/mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için hücre süspansiyonuna 12 μL 8 mg / mL polibren ekleyin.
6. 2 oyuklu bir doku kültürü plakası üzerindeki her bir oyuğa 6 mL hücre süspansiyonu pipetleyin.
   NOT: Gerekirse, hücre sayılarını 6 oyuklu plaka başına 1.2-1.8 x 10^6'ya yükseltin.
7. Aktarılan (eGFP ⁺) ila dönüştürülmeyen (eGFP^-) hücrelerin 1: 1 oranını elde etmek için gereken optimal hacmi belirlemek için her bir oyuğa artan hacimlerde lentivirüs ekleyin.
   NOT: Önerilen 1, 2, 4, 8, 16 ve 32 μL'lik lentivirüs hacimlerini üç kopya halinde ekleyin. Boş kontrol lentiviral vektörü SFFV-eGFP ve SFFV-mCherry için fonksiyonel titrasyonu gerçekleştirin.
8. Hücreleri 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile inkübe edin.
9. 0. günde, lentivirüs içeren ortamı çıkarın, taze ortamla değiştirin ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 72 saat inkübe edin.
10. 3. günde, floresan mikroskobu altında hücreleri eGFP ekspresyonu açısından kontrol edin.
    NOT: Bu adım, hücre transdüksiyonunun hızlı bir şekilde doğrulanmasını sağlar, ancak eGFP⁺'nın eGFP- hücrelerine tam oranını belirlemek için adım 3.14'te akış sitometrisi ile gerçekleştirilen analizin yerini almaz.
    Bazı kanser hücrelerinde (örneğin, B16 fare melanom hücreleri) eGFP sinyali düşük olabilir ve bir floresan mikroskobu kullanılarak tespit edilmesi zor olabilir. Doğrudan akış sitometrisine devam etmeniz önerilir.
11. Ortamı aspire edin, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve kuyucuk başına 500 μL tripsin ekleyin. % 5 CO₂ ile 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
12. Her bir oyuktaki hücreleri 1.5 mL FACS tamponu ile yükseltin ve hücre süspansiyonunu 5 mL polistiren tüplere pipetleyin. Bir alikot alın ve bir hemositometre ve Tripan mavisi boyama kullanarak canlı hücreleri sayın.
13. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüjleyin, peleti 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi analizine devam edin.
14. Akış sitometrisi ile transdüksiyonlu (eGFP⁺) ve transdüksiyonsuz (eGFP^-) hücrelerin kesin oranını ölçün. In vivo test için, 1:1 oranına en yakın verim veren lentivirüs hacmini kullanın.
    NOT: eGFP ⁺ 'nın eGFP hücrelerine oranını doğru bir şekilde belirlemek için, geçit için negatif kontroller olarak transdüksiyon yapılmamış kanser hücrelerini dahil edin.

4. İn vivo yeniden programlama için deri altı tümör oluşumu

1. Kanser hücrelerini, mCherry eksprese eden hücreler oluşturmak için uygun kültür ortamlarında çözün ve genişletin.
   NOT: mCherry ekspresyonu, akış sitometrisi analizi sırasında kanser hücrelerinin tümördeki diğer popülasyonlardan, örneğin endojen stromal ve immün hücrelerden ayırt edilmesini kolaylaştırır.
2. Adım 3.2-3.4'ü uygulayın ve hücreleri mL başına 10⁵ hücre konsantrasyonunda tam ortamda yeniden süspanse edin.
3. % >90 iletim verimliliğine ulaşmak için hücre süspansiyonuna 8 μg / mL polibren ve belirlenen hacimde SFFV-mCherry lentivirus ekleyin.
   NOT: Alternatif olarak, %>90 transdüksiyon elde etmek hücre canlılığını tehlikeye atıyorsa, mCherry ⁺ hücrelerini transdüksiyondan 72 saat sonra floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) ile sıralayın ve sıralanan hücreleri kültürde genişletin.
4. 100 mm'lik plaka başına 5 mL hücre süspansiyonu (5 × 10,⁵ hücre içeren) plakalayın ve hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.
5. 24 saat sonra, ortamı 10 mL tam ortamla değiştirin ve yeniden programlama deneylerine başlamadan önce hücreleri en az 7 gün boyunca% 5 CO₂ ile% 37 ° C'de kültürleyerek genişletin.
6. Genişlemeden sonra, hücre süspansiyonlarını önceden belirlenmiş SFFV-PIB-IRES-eGFP hacmi ile sonraki transdüksiyon için hazırlamak için 3.2-3.4 adımlarını izleyin, bu da 3. günde transdüksiyon (eGFP ⁺) ile transdüksiyon yapılmamış (eGFP^-) hücrelerin en yakın 1: 1 oranıyla sonuçlanır.
7. Hücre süspansiyonuna 8 μg/mL polibren ekleyin, daha önce belirlenen lentivirüs hacmi ile birlikte 50 mL konik tüplerde hücre süspansiyonuna ekleyin. Kabarcık oluşturmadan iyice karıştırın.
8. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına 2 mL hücre süspansiyonu (10⁵ hücre içeren) pipetleyin ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 24 saat inkübe edin.
   NOT: Alternatif olarak, hücreleri 100 mm'lik doku kültürü plakalarında 5 mL transdüksiyon ortamında kaplayın. Bununla birlikte, transdüksiyon verimliliğinin daha büyük hacimlerde azaltılabileceğini ve adım 3.1-3.13'te açıklandığı gibi ampirik olarak belirlenmesi gerektiğini unutmayın.
   Transdüksiyon işlemi sırasında potansiyel hücre kaybını telafi etmek ve tümör oluşumu sırasında pipetleme veya enjeksiyon için yeterli hacmi sağlamak için en az %10 daha fazla hücre transdüksiyonu önerilir.
9. 24 saat sonra, lentivirüs içeren ortamı çıkarın, PBS ile iki kez yıkayın, her oyuğa 500 μL tripsin ekleyin ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
10. Hücrelerin plakalardan tamamen ayrılıp ayrılmadığını ışık mikroskobu altında kontrol edin ve daha sonra bunları tam ortamla birlikte 50 mL konik tüplere toplayın.
11. Hücreleri 350 × g'da 5 dakika santrifüj ederek peletleyin, peleti PBS ile yıkayın ve 350 × g'da 5 dakika tekrar santrifüjleyin. Bir alikot alın ve bir hemositometre ve Tripan mavisi boyama kullanarak canlı hücreleri sayın.
12. Tümör başına 50 μL enjeksiyon hacminde 1-2 × 10⁶ hücreye karşılık gelen mL başına 2-4 × 10⁷ hücre konsantrasyonuna ulaşmak için peleti buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin.
    NOT: Daha da önemlisi, bu sayılar, akış sitometrisi analizi için in vivo yeniden programlanmış cDC1.7 benzeri hücreleri izole etmek için YUMM1 melanom tümörleri için doğrulanmıştır. Diğer hücre dizileri ve tümör büyümesi ve hayatta kalma deneyleri gibi diğer deneysel okumalar için sayıların ampirik olarak test edilmesi gerekir. Tümör büyümesi ve sağkalım deneyleri için, tümör başına 100.000 ila 250.000 hücre arasında değişen daha düşük hücre sayıları önerilir.
13. Hayvan deneylerinin yapıldığı çalışma alanına yerleşin ve hücreleri buz üzerinde tutun.
    NOT: Hücre hazırlığından sonra, hücre canlılığı zamanla azaldığı için hücre enjeksiyonlarını mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
14. Fare başına 3 μL Ksilazin (20 mg / mL), 27 μL Ketamin (100 mg / mL) ve 30 μL PBS içeren anestezi solüsyonunu hazırlayın.
15. CD45.1 fareleri intraperitoneal olarak 60 μL anestezik enjekte ederek uyuşturun. Fareleri rastgele hale getirin ve vücut ısısında bir düşüşü önlemek için onları bir ısıtma pedi üzerinde tutun. Anestezi sırasında oküler dehidrasyonu önlemek için gözlerine göz kremi sürün.
    NOT: Yabani tip CD45.1 alelini eksprese eden in vivo yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreler ile endojen bağışıklık hücreleri arasında ayrım yapmak için CD45.2 farelerinin kullanılması çok önemlidir. Hücre hattı CD45.1 ise, C57BL / 6 fareler (CD45.2) alıcı olarak kullanılabilir. Fareler, deney grupları arasında cinsiyet ve yaş açısından eşleşmeli ve tümör oluşturulmadan önce randomize edilmelidir.
16. Tüm fareler tamamen uyuşturulana kadar 5-10 dakika bekleyin.
17. Bir tıraş bıçağı kullanarak farelerin sağ tarafını tıraş edin; İsteğe bağlı olarak, bir kulak kesme makinesi kullanarak işaretleyin. Alanı dezenfekte edin ve kalan saçları %70 etanol ile kaydırın.
18. Bir P1000 pipeti kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek kanser hücrelerini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 0,5 mL 30 G'lik bir şırıngaya yükleyin.
19. İki parmağınızı kullanarak farenin traşlı yan tarafının derisini nazikçe kaldırın ve iğnenin ucunu cildin bir kırışıklık oluşturduğu yere sokun.
    NOT: İğne ile parmaklarınızı delmemek için dikkatli olun.
20. Cildi serbest bırakın, şırıngayı bir elinizle yerinde tutun ve farenin cildini germek için diğer elinizin iki parmağını kullanın.
21. Enjeksiyon bölgesinde oval bir çıkıntı (deri altı şişmesi) oluşturmak için 50 μL kanser hücresi süspansiyonunu yavaşça enjekte edin.
    NOT: Bir çıkıntı oluşmazsa, süspansiyon çevredeki deri altı dokuya sızmış olabilir ve bu da tutarsız veya başarısız tümör oluşumuna yol açabilir.
22. İşlem sonrası, anesteziden sonra hayatta kalmayı sağlamak için tüm farelerin uyanmasını izleyin.
23. Fareleri 23 ± 2 °C ve sabit 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya serbest erişim ile kontrollü bir sıcaklık ortamında tutun.
    NOT: Tümör büyümesini izlemek istiyorsanız, 4.24-4.26 adımlarıyla ilerleyin. Aksi takdirde, bu adımları atlayın ve doğrudan sonraki bölümlere geçin.
24. Tümör büyümesini izlemek için, fareyi bir elinizle nazikçe kısıtlayın ve tümörün net bir şekilde görüntülenmesini sağlayın.
25. Elektronik bir kumpas kullanarak tümörün uzunluğunu (l), genişliğini (w) ve yüksekliğini (h) ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak tümör hacmini (V) hesaplayın: V = (l x w x h) / 2.
26. Tümör boyutlarını her iki ila üç günde bir ölçün. Tümör, insancıl son nokta kriterini karşılayan bir hacme ulaştığında (ör., 1.500 mm³), hayvanı etik ve kurumsal yönergelere uygun olarak ötenazi yapın.

5. Akış sitometrisi analizi için tümör izolasyonu

1. Tümör örneklerinin toplanması için makas, forseps, FACS tamponu ve buz gibi soğuk RPMI tam besiyeri ile 12 oyuklu doku dışı kültür plakaları hazırlayın.
2. Tümör başına 3 μL 100 mg / mL kollajenaz D ve 3 μL 10 mg / mL DNAse I'i tümör başına 3 mL RPMI tam ortamda karıştırarak tümör sindirim çözeltisini hazırlayın (1 mg / mL kollajenaz D ve 10 μg / mL DNAse I çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için).
   NOT: Sindirim verimliliği yetersiz ise, kollajenaz aktivitesini desteklemek için 2-5 mM_CaCl2 ekleyin.
3. İzolasyon gününde servikal çıkık veya CO₂ boğulması ile farelere ötenazi yapın.
4. Deri altı tümörleri makas ve forseps ile eksize edin ve her tümörü buz gibi soğuk RPMI ile 12 oyuklu doku dışı kültür plakasının bir kuyusuna yerleştirin. Tümör olmayan dokunun eksizyonunu en aza indirmeye çalışın.
5. Tümör örneklerini makas kullanarak 1-2 mm³ parçaya kesin, parçaları 3 mL sindirim solüsyonu içeren 50 mL konik tüplere toplayın ve 200-250 rpm'de 30-45 dakika çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
   NOT: Sindirim sürecini kolaylaştırmak için her 15 dakikada bir vorteks veya pipet yapın.
6. Sindirimi takiben, karışımı 5 mL serolojik pipet kullanarak 1 dakika kuvvetlice pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün.
7. Sindirilmemiş parçaları 70 μm hücre süzgecine karşı parçalamak için 10 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın ve süzgeci 10 mL RPMI tam ortam ile durulayın.
8. Hücre süspansiyonunu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve canlı hücreleri sayın.
9. Hücre süspansiyonunu 5 mL polistiren tüplere, 5 dakika boyunca 350 × g'da pelet hücrelerine aktarın ve 100 μL FACS tamponu başına 10⁶ canlı hücreyi yeniden süspanse edin.
10. Tek renk (SC) ve FMO kontrolleri için ayrı hücreleri, ayrı polistiren tüplere ayırın.
11. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için sıçan serumu (1:100) içeren bir antikor boyama ana karışımı hazırlayın; analizdeki ölü hücreleri dışlamak için sabitlenebilir bir canlılık boyası (1:100); ve floresan etiketli antikorlar anti-CD45.1, anti-CD45.2 ve anti-MHC-II'yi optimal konsantrasyonlarında. Her numuneye 100 μL ana karışım ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
12. Numuneleri 2 mL FACS tamponu ile 2 kez yıkayın ve akış sitometrisi analizine devam edin.
13. CD45.2 ve/veya MHC-II'yi eksprese eden cDC1 benzeri hücrelerin yüzdelerini, transdüksiyonlu (eGFP ⁺) kanser hücrelerinde (CD45.1-mCherry ⁺) geçit yaparak ölçün.
    NOT: Bu protokol, boyama panelini endojen lenfoid ve/veya miyeloid immün hücre popülasyonlarına karşı antikorlarla tamamlayarak in vivo cDC1 yeniden programlamasından sonra tümörlerin immünofenotiplemesini gerçekleştirmek için kullanılabilir.

6. Konfokal mikroskopi analizi için tümör dondurma ve kesit alma

1. Adım 5.1 ve 5.3'ü izleyerek tümör izolasyonu için hazırlanın. Deri altı tümörleri makas ve forseps ile eksize edin.
2. Tümörleri PBS'de taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA) içinde 4 ° C'de hafifçe çalkalayarak sabitleyin. Fiksasyon süresini, kılavuz olarak mm³ doku başına 1 saat kullanarak tümör boyutuna göre ayarlayın.
3. Tümörleri PBS'de% 15 sükroza aktarın ve dokuları tüpün dibine batana kadar hafifçe sallarken 4 ° C'de inkübe edin. Ardından, aynı koşullar altında PBS'de% 20 sakaroz'a taşıyın.
4. Tümörler tüpün dibine yerleştikten sonra, PBS ve OCT bileşiğinde 1: 1 oranında sükroz ve OCT bileşiğinde 4 ° C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.
5. Karışımı çıkarın, dokuları %100 OCT ile bir kriyokalıba gömün ve sıvı nitrojen kullanarak dondurun.
   NOT: Soğuk yanıklarını veya hızlı buhar genleşmesinden kaynaklanan yaralanmaları önlemek için her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (kriyoeldiven, yüz siperi ve laboratuvar önlüğü) kullanın. Boğulma riskini önlemek için iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
   1. Dehidrasyonu önlemek için blokları -80 °C'de kapalı kaplarda saklayın.

7. Tümör bölümlerinin immünofloresan boyaması

1. Bir kriyostat kullanarak, tümörleri yaklaşık 8 μm kalınlığında bölümler halinde kesin ve mikroskop cam slaytlarına monte edin. Gerekirse slaytları -80 °C'de saklayın.
   NOT: Doku bütünlüğünü korumak için, kriyostata ve kriyostattan taşıma sırasında blokları ve kızakları monte edilmiş tümör kesikleri ile kuru buz üzerinde tutun. Kesit alma sırasında kriyostatın -20 °C'de tutulduğundan emin olun.
2. Slaytları PBS'de 5 dakika çözün ve RT'de 4 dakika boyunca% 10 PFA çözeltisinde sabitleyin.
3. Sabitlemeyi takiben, slaytları PBS'de 5 dakika yıkayın.
   NOT: Dokuların nemli kaldığından emin olun; Sonraki tüm boyama adımları boyunca bunları daima sıvı içinde tutun. Deneyin duraklatılması gerekiyorsa, slaytlar RT'de PBS'de 3 saate kadar saklanabilir. Slaytları gece boyunca PBS'de saklamaktan kaçının.
4. Antijen alımı için, bir buharlı pişiriciyi suyla doldurun ve açın. Buharlı pişiriciye deiyonize su içeren bir kavanoz ve 10 mM Sodyum Sitrat (pH 6) içeren bir kavanoz yerleştirin ve açıklığı alüminyum folyo ile kapatın. Kapağı çıkarmadan, buharlı pişirici kapağının havalandırma deliklerinden bir termometre yerleştirin, alüminyum folyoyu delin ve çözeltilerin ~99 °C'ye ulaştığından emin olarak sıcaklığı izleyin.
5. Tamponlar ~ 99 ° C'ye ulaştığında, slaytları 10 saniye boyunca deiyonize suya batırın ve ardından bunları hızlı bir şekilde antijen alma çözeltisine aktarın.
6. Slaytları ~ 99 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
7. Slaytları 1x PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
8. Her doku bölümünü tanımlamak için bir Hidrofobik Bariyer Pap Kalem kullanın ve dokulara eklenen herhangi bir sıvının sızmasını önleyen hidrofobik bir çevre oluşturun.
   NOT: Sonraki PBS yıkamaları, dokuları çevreleyen hidrofobik çevreyi bozabilir ve yenilenmesi gerekebilir. Gerektiği kadar tekrar çizin.
9. RT'de 60 dakika boyunca 150 μL bloke edici tampon (1x PBS'de% 5 serum ve% 0.5 Triton X-100) ile dokuları bloke edin ve geçirgenleştirin. Tüm boyama adımları için, ikincil antikorun konakçısı ile aynı türden serum kullanın.
10. Slaytları 1x PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
11. Dokuları 20 μg / mL primer anti-CD45 antikoru ile bloke edici tamponda (% 5 serum ve% 0.5 Triton X-100 1X PBS'de) gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Diğer antikorları kullanmak için, antikor konsantrasyonunu ampirik olarak doğrulayın.
12. Slaytları 1x PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
13. Doku bölümlerini, RT'de karanlıkta 2 saat boyunca bloke edici tamponda (% 5 serum) 1:250 seyreltmede AlexaFluor-647 ile konjuge edilmiş keçi anti-sıçan ikincil antikoru ile inkübe edin.
    NOT: İkincil antikoru ekledikten sonra, floroforların foto-ağartılmasını önlemek için sonraki tüm adımları karanlıkta gerçekleştirin.
14. Slaytları 1x PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
15. Dokuları 1 μg / mL DAPI ve 20 μg / mL AlexaFluor-594 konjuge antikorları ile RT'de karanlıkta 1 saat boyunca bloke edici tamponda (% 5 serum) inkübe edin.
16. Slaytları 1x PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
17. Her tümör bölümüne bir damla montaj solüsyonu ekleyin, ardından lamel üzerine birkaç damla montaj ortamı uygulayın. Lameli monte etmek ve tümörlerin yakınında kabarcık olmadığından emin olmak için lamel üzerine hızlı bir şekilde ters çevirin.
18. Slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin ve konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.

Sonuçlar

İzlenebilir in vivo yeniden programlama protokolünün şematik bir genel bakışı Şekil 1'de sunulmuştur. İlk olarak, cDC1 talimatlı yeniden programlama faktörleri PU.1, IRF8, BATF3'ü kodlayan polisistronik lentiviral vektör SFFV-PIB-IRES-eGFP'yi (PIB-eGFP) ürettik, ardından HEK 293T paketleme hücresi hattında dahili bir ribozomal giriş bölgesi (IRES) ve gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) izledik. Lentivirüs aracılı immünojenisiteyi kontrol etmek için, çoklu klonlama bölgesi (MCS) ve IRES-eGFP içeren, ancak yeniden programlama faktörlerini hariç tutan boş bir SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vektörü ürettik. Viral üretimin ardından, lentivirüs içeren süpernatanı hasat ettik ve ultrasantrifüjleme ile konsantre ettik. Transdüksiyondan sonraki 3. günde değerlendirdiğimiz, transdüksiyondan sonraki 3. günde değerlendirdiğimiz, transdüksiyon (eGFP⁺) ve transdüksiyon yapılmamış (eGFP^-) hücrelerin 1:1 oranını elde etmek için gereken miktarı belirlemek için virüsü işlevsel olarak titre ettik. Daha sonra, elde edilen virüs miktarını, seçilen kanser hücre hattını -1. günde dönüştürmek için kullandık. 24 saat sonra hücreleri topladık ve tümörleri oluşturmak için deri altına implante ettik. Bu strateji, transdüksiyonlu hücrelerin TME içinde in vivo olarak cDC1 benzeri hücrelere yeniden programlanmasını sağlamıştır. Aşılama sonrası belirtilen zaman noktalarında, TME'deki değişiklikleri karakterize etmek için in vivo yeniden programlama verimliliğini veya dondurularak saklanmış tümör bölümlerinin immünofloresan boyamasını ölçmek için ayrışmış tümör hücrelerinin akış sitometrisi dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için tümörleri eksize ettik ve işledik.

İlk olarak, yüksek lentiviral titrelerin üretimini sağlamak için, transfeksiyondan önce HEK 293T hücrelerini izledik,% 70-80 birleşmeye ulaşmayı hedefledik ve 24 saat sonra, floresan mikroskobu ile eGFP ekspresyonu yoluyla transfeksiyon verimliliğini değerlendirdik (Şekil 2A). Daha sonra, transfeksiyondan 48 saat ve 60 saat sonra virüs içeren ortamı topladık, ultrasantrifüjledik ve -80 ° C'de alikotlarda sakladık (Şekil 2B). Daha sonra, YUMM1.7 melanom ^{hücrelerinde} eGFP + / eGFP ^{hücrelerinin} 1: 1 oranını elde etmek için gereken optimal viral miktarı belirledik. 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 10⁵ YUMM1.7 hücresi ektik, hücreleri artan hacimlerde lentivirüs ile dönüştürdük ve virüs içeren süpernatanı 24 saat sonra taze DMEM / F12 tam ortamı ile değiştirdik (Şekil 2C). 3. günde, eGFP ⁺ hücrelerinin kesin yüzdelerini akış sitometrisi ile ölçmeye devam etmeden önce floresan mikroskobu ile eGFP ekspresyonunu değerlendirdik (Şekil 2C). eGFP + 'nın eGFP ^hücrelerine oranını ölçmek için, ölü hücreleri ve çiftleri dışlamak için canlı, tek hücrelere geçit yaptık (Şekil 2D). Üretilen lentivirüs partisinin optimal hacmi hem PIB-eGFP hem de kontrol eGFP virüsü için 10⁵ YUMM1.7 hücre başına 2 μL olarak belirlendi, bu da sırasıyla P.0 ± %0.3 ve c.0 ± %0.9 eGFP⁺ hücresi ile sonuçlandı (Şekil 2E).

Daha sonra, in vivo yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için, floresan etiketli (mCherry ⁺) bir kanser hücre hattı (YUMM1.7-mCherry) oluşturduk. Bu, akış sitometrisi analizinde canlı mCherry ⁺ hücrelerinde geçit yaparak kanser hücreleri ile stromal veya immün hücreler arasında ayrım yapabilmemizi sağladı (Şekil 3A, B). Daha sonra YUMM1.7-mCherry hücrelerini 2 μL PIB-eGFP ile transdüksiyon yaptık veya 1: 1^{eGFP +} - eGFP oranı elde etmek için 10 5 hücre başına eGFP virüsünü kontrol ettik. CD45.1 farelerde tümör başına 1.6 × 10⁶ hücreyi deri altına implante ettik ve karşılaştırma için in vitro kültüre bir dizi hücre tuttuk. Akış sitometrisi ile yeniden programlama verimliliğini değerlendirdik, eGFP veya mCherry'yi yutmuş konakçı bağışıklık hücrelerini dışlamak için canlı mCherry ⁺ eGFP ⁺ ve CD45.1^- hücrelerini geçit ettik (Şekil 3B). 1. günden 9. güne kadar, kısmen yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreleri (CD45.2 ^{+ MHC-II} - veya CD45.2^- MHC-II ⁺) ve tamamen yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreleri (CD45 ⁺ MHC-II ⁺) işaretleyerek CD45.2 ve / veya MHC-II ekspresyonunun kademeli olarak edinildiğini gözlemledik (Şekil 3C). Fare kanseri hücrelerinin in vivo olarak yeniden programlanmasının, in vitro koşullara kıyasla 9. günde daha yüksek yüzdelerde cDC1 benzeri hücrelerle sonuçlandığını doğruladık (9.54 ± %1.54 CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vivo vs. 4.72 ± %1.1 CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vitro, P = 0.018). 4. gün gibi erken bir tarihte daha yüksek bir cDC1 benzeri hücre yüzdesi gözlemlediğimiz için yeniden programlama kinetiği de hızlandı (8.7 ± %3.3 CD45⁺ MHC-II⁺'ya karşı in vivo vs. 0.3 ± %0.1 CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vitro, P = 0.05), çevresel ipuçlarının varlığının cDC1 benzeri hücrelere doğru daha hızlı ve daha verimli yeniden programlamayı teşvik ettiğini gösterir¹⁹. İn vitro olarak yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreler 15. güne kadar mevcutken, in vivo cDC1 benzeri hücreler 9 gün boyunca devam etti, ancak 15. güne kadar tespit edilmedi, bu da konakçı bağışıklık sistemi tarafından TME'den tükenmeyi düşündürdü. 

Son olarak, ilk 9 gün içinde in vivo cDC1 yeniden programlamasının bir sonucu olarak TME'deki erken değişiklikleri karakterize etmeyi amaçladık. Pan-hematopoietik belirteç CD45 ile işaretlenen immün hücrelerin infiltrasyonuna odaklanarak, 3 ve 9 günlük in vivo yeniden programlamadan sonra hem eGFP hem de PIB-eGFP tümörlerinden kriyoprezervasyonlu ve kesitli tümör dokularının immünofloresan boyamasını gerçekleştirdik. Özellikle, cDC1 benzeri hücreler, eGFP tümörlerine kıyasla 3. günde TME'ye kolayca önemli ölçüde daha fazla CD45 hücresi aldı (49.6 ± 17.0'a karşı 8.0 ± 5.8 eGFP, tümör alanı başına CD45 boyamanın ortalama floresan yoğunluğu; Şekil 4A,B). İlginç bir şekilde, 9 günlük in vivo yeniden programlamadan sonra tümörlerin TME'sinde TLS tespit ettik. Bu, cDC1 benzeri hücrelerin TME'yi 3 gün içinde "bağışıklık-soğuk"tan "bağışıklık-sıcak" ortama hızla yeniden şekillendirebileceğini ve bunun daha sonra 9. günde TLS oluşumuna yol açtığını göstermektedir.

Şekil 1: Kanser hücrelerinin in vivo olarak yeniden programlanmasıyla cDC1 benzeri hücreler oluşturmak için protokole genel bakış. Dalak odak oluşturan virüs promotörü (SFFV) ve eGFP'nin kontrolü altında bir polisistronik kasette PU.1, IRF8 ve BATF3 kodlayan lentiviral vektörler SFFV-PIB-IRES-eGFP, dahili bir ribozom giriş bölgesinden sonra (IRES) akış sitometrisi ve floresan mikroskobu ile transdüksiyonlu hücreleri izlemek için HEK 293T paketleme hücre hattında üretilmektedir. Daha sonra, lentiviral vektörler ultrasantrifüjlenir ve kanser hücrelerinin transdüksiyonu için gereken virüs miktarını 1: 1 transdüksiyonlu eGFP ⁺ / transdüksiyonsuz ^{eGFP hücreleri} oranında belirlemek için fonksiyonel olarak titre edilir. İn vivo yeniden programlama deneyleri için, kanser hücreleri -1. günde en uygun miktarda lentivirüs ile kaplanır. Ertesi gün, transdüksiyonlu GFP ⁺ ve transdüksiyonsuz ^{GFP hücrelerinin} bu 1: 1 karışımı yıkanır ve farelerde deri altı tümör oluşumu için toplanır. Paralel in vitro kültürler, akış sitometrisi ile 3. günde transdüksiyonu doğrulamak için korunur. Hayvanlar, tümör büyümesi ve sağkalımı için her 2-3 günde bir izlenir. Tümörler tanımlanmış zaman noktalarında toplanır, ayrışır ve akış sitometrisi analizi için yüzey belirteç ekspresyonu için boyanır. Alternatif olarak, tüm dokular sabitlenir, kriyoprezervasyon yapılır ve immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi analizi için bölümlere ayrılır. İn vivo yeniden programlama etkinliği akış sitometri analizi ile değerlendirilirken, tümör mikroçevresindeki değişiklikler konfokal görüntüleme ile karakterize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İn vivo cDC1 yeniden programlama için lentivirüsün üretimi ve fonksiyonel titrasyonu.(A) HEK 293T hücreleri ~% 70-80 birleşmeye ulaştığında, 7.5 μg psPAX2 ve 2.5 μg mPD2.G ve 60 μL 1 mg / mL PEI ile birlikte SFFV-eGFP (PIB-eGFP) veya boş lentiviral vektör kontrolü SFFV-eGFP (eGFP) ile birlikte 10 μg transfer plazmidi içeren bir karışım ile transfekte edilir. Transfeksiyondan 24 saat sonra eGFP ekspresyonunu gösteren HEK 293T hücrelerinin parlak alan ve floresan mikroskopi görüntüleri, başarılı plazmit iletimini gösterir. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) Lentivirüsü konsantre etmek için ultrasantrifüj iş akışının şematik gösterimi. HEK 293T hücrelerinin lentivirüs içeren süpernatanı, transfeksiyondan 48 saat ve 60 saat sonra toplanır, 0.45 μm düşük proteinli bağlayıcı PES filtresinden süzülür ve 37 g, bir tezgah üstü terazi kullanılarak Üstü Açık İnce Duvar Polipropilen Tüplerde tartılır. Tüpler bir Sallanan Kova Rotorunda ultrasantrifüjlenir, süpernatan aspire edilir ve pelet 5 dakika boyunca kurutulur. Peletler daha sonra HEPES içeren buz gibi soğuk DMEM'de yeniden süspanse edilir ve -80 ° C'de saklanmadan ve saklanmadan önce gece boyunca inkübe edilir. (C) GFP + / GFP hücrelerinin 1: 1 oranını elde etmek için optimal viral dozu belirlemek için fonksiyonel titrasyonun deneysel stratejisi. Transdüksiyondan 72 saat sonra YUMM1.7 melanom hücrelerinde eGFP ekspresyonunu gösteren parlak alan ve floresan mikroskobu görüntüleri, yeniden programlama faktörlerinin ve eGFP'nin başarılı bir şekilde verildiğini gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm. (D) eGFP ⁺ hücrelerinin oranını ölçmek için geçit stratejisini gösteren temsili akış sitometrisi grafikleri. Canlı hücreler, canlılık boya negatif popülasyonu (DAPI) ve ardından çift dışlama için kapılandı. (E) 1: 1 GFP ⁺ / GFP^- hücreleri elde etmek için en uygun hacmi belirlemek için artan viral dozlarla transdüksiyon verimliliğinin akış sitometrisi miktarı. Hem PIB-eGFP hem de eGFP lentivirüs için, 10⁵ hücre başına 2 μL hacim istenen orana ulaştı. Kısaltmalar: cDC1s = tip 1 konvansiyonel dendritik hücreler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PIB = PU.1, IRF8 ve BATF3; PEI = polietilenimin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İn vivo cDC1 yeniden programlama verimliliğinin değerlendirilmesi. (A) in vivo cDC1 yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için deneysel iş akışının şematik gösterimi. Kanser hücreleri başlangıçta floresan etiketli bir hücre hattı (YUMM1.7-mCherry) oluşturmak için mCherry eksprese eden bir lentivirüs ile transdüksiyon yapılır, ardından -1. günde optimize edilmiş PIB-eGFP lentivirus dozu ile transdüksiyon yapılır. Hücreler daha sonra, CD45.1 farelerinde tümörler oluşturmak ve PIB ile transdüksiyonlu hücrelerin TME içinde cDC1 benzeri hücrelere yeniden programlanmasına izin vermek için 0. günde 1: 1 oranında eGFP ⁺ / eGFP^- hücreleri ile deri altına enjekte edilir. Tümörler daha sonra belirtilen zaman noktalarında izole edilir, ayrıştırılır ve akış sitometrisi kullanılarak CD45.1, CD45.2 ve MHC-II için boyanır. Bu, CD45.2 ve MHC-II'nin ekspresyonu ile in vivo cDC1 yeniden programlama verimliliğini ölçmek için CD45.1 konakçı bağışıklık hücrelerinin dışlanmasına izin verir. Paralel in vitro kültürler, in vivo yeniden programlamaya kıyasla zaman noktaları boyunca tutulur. (B) 9. gündeki geçit stratejisini gösteren temsili akış sitometrisi grafikleri. Hücreler, başarılı bir şekilde transdüksiyon yapılan kanser hücrelerini tanımlamak için mCherry ⁺ ve GFP ⁺ üzerinde kapılandı. Konak immün hücreleri, CD45.1⁺ hücreleri dışarı atılarak dışlandı. (C) YUMM1.7-mCherry hücrelerinin in vivo yeniden programlama verimliliğinin (solda) CD45⁺ MHC-II⁺ hücrelerinin (tamamen yeniden programlanmış) ve CD45.2⁺ HLA-DR^- veya CD45.2^- HLA-DR⁺ cDC1 benzeri hücrelerin (kısmen yeniden programlanmış) yüzdesi olarak akış sitometrisi ile ölçülmesi eGFP ⁺ mCherry ⁺ içinde kapılı Hücre. Belirtilen zaman noktaları boyunca PIB-eGFP ile transdüksiyonlu YUMM1.7-mCherry hücrelerinde CD45.2 ve MHC-II ekspresyonunun kademeli olarak edinilmesini gösteren temsili akış sitometrisi grafikleri (sağda). kontrol olarak eGFP ile transdüksiyonlu YUMM1.7-mCherry hücreleri kullanıldı ve karşılaştırma için in vitro yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücreler kullanıldı. (C)'deki veriler, 3-5 biyolojik kopya deneyin ortalama ± SD'sini göstermektedir. (C)'de istatistiksel analiz CD45⁺ MHC-II⁺ hücreleri için Mann-Whitney testi kullanılarak yapıldı. *P < 0.05. Kısaltmalar: cDC1s = tip 1 konvansiyonel dendritik hücreler; PIB = PU.1, IRF8 ve BATF3; TME = tümör mikroçevresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İn vivo cDC1 yeniden programlamasını takiben tümör mikroçevresindeki immün infiltrasyonun analizi. (A) PIB-eGFP- veya kontrol eGFP ile transdüksiyonlu hücrelerin (transdüksiyonun ebeveyn hücrelerine oranı) 3. ve 9. günlerde deri altı implantasyonundan sonra YUMM1.7 tümörlerinde CD45⁺ hücrelerini gösteren temsili konfokal görüntüler. Ölçek çubukları = 500 μm. (B) PIB ile tedavi edilen ve 3. ve 9. günlerde eGFP ile transdüke edilen YUMM1.7 tümörlerini kontrol eden CD45 boyaması için MFI'nin miktarının belirlenmesi. (B)'deki veriler, 3-6 biyolojik kopya deneyin ortalama ± SD'sini göstermektedir. (B)'deki istatistiksel analiz Mann-Whitney testi kullanılarak yapıldı. *P < 0.05 ve ***P < 0.001. Kısaltmalar: cDC1s = tip 1 konvansiyonel dendritik hücreler; PIB = PU.1, IRF8 ve BATF3; MFI = ortalama floresan yoğunluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolde, katı tümörlerden kanser hücrelerinin in vivo olarak yeniden programlanmasına dayalı olarak cDC1 benzeri hücreler oluşturmak için izlenebilir bir yöntem tarif ediyoruz. Sonuçlarımız, PU.1, IRF8 ve BATF3'ün aşırı ekspresyonunun, TME'de 9. güne kadar bir cDC1 fenotipinin kademeli olarak edinilmesini sağladığını ve ardından cDC1 benzeri hücrelerin tümörlerden tükendiğini göstermektedir. Sonuç olarak, bu, CD45 hücrelerinin 3. güne kadar TME'ye sızmasında bir artışa yol açar ve "bağışık-soğuk" bir TME'nin yeniden şekillenmesinin "bağışıklık-sıcak" hale gelmesine neden olur.

cDC1 oluşturmak için mevcut protokoller arasında periferik kandan otolog DC'lerin zenginleştirilmesi, CD34 ⁺ hematopoietik progenitör hücrelerden farklılaşma veya pluripotent kök hücrelerden^{farklılaşma} 14,15,16,17,18,19 yer alır. Bununla birlikte, bu yöntemler sınırlayıcı faktörler sunar: yetersiz olgunlaşma, azalmış antijen sunumu ve in vivo sitokin / kemokin üretim kapasitesi, immünosupresyona duyarlılık, yüksek DC heterojenliği ve düşük sayıda^{üretilen hücre 7}. Burada, fonksiyonel ve mekanik çalışmalar için in vivo olarak cDC1 benzeri hücrelerin ölçeklenebilir üretimine izin veren bir protokol sunuyoruz.

Bu yöntemle, transkripsiyon faktörü kombinasyonu PU.1, IRF8 ve BATF3'ün ekspresyonunun in vivo yeniden programlamayı sürdürmek için yeterli olup olmadığını test ettik. Bu protokol, implante edilen genetik olarak değiştirilmiş hücrelerin dozunun değiştirilmesi tedavi etkinliğini doğrudan etkilediğinden, dağıtım verimliliği üzerinde hassas kontrol sağlar. Daha önce% 0.15 CD45 ⁺ ve MHC-II ⁺ cDC1 benzeri hücrelere karşılık gelen% 2'lik transdüksiyon hücrelerinin, anti-tümör bağışıklığını ortaya çıkarmak için yeterli olduğunu göstermiştik²⁰. Ayrıca, 3. günde gözlenen hızlı bağışıklık infiltrasyonu, kısmen yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücrelerin işlevsel olarak aktif olduğunu düşündürmektedir in vivo, çünkü bu zaman noktasında tamamen yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücrelerde önemli bir artış yoktur. Gelecekte, tanımlanmış zaman noktalarında seçilen hücre popülasyonlarında hücre ölümünü indüklemek için bir intihar geni içeren modifiye vektörler kullanarak, anti-tümör etkinliğinde kısmen ve tamamen yeniden programlanmış cDC1 benzeri hücrelerin işlevsel rolünü çözmek ilginç olacaktır²⁴. Bu protokol ayrıca, yeniden programlama verimliliğini artırabilen epigenetik adjuvanlarla kombinasyonu araştırmak için de kullanılabilir²⁵. Son olarak, bu yöntem aynı zamanda in vivo olarak diğer DC alt tiplerini oluşturmak için de uyarlanabilir ve örneğin anti-viral veya tolerojenik yanıtlar gibi farklı tipte bağışıklık tepkileri başlatabilir¹⁴. Ek olarak, çeşitli bağışıklık hücresi tipleri oluşturmak için transkripsiyon faktörü kombinasyonları için barkodlu ekranlar gerçekleştirmek için bir platform olarak in vivo yeniden programlamadan yararlanabiliriz. Bu olasılık, spesifik bağışıklık alt kümelerinin çeşitli fonksiyonel özelliklerinden yararlanarak tedavilerin esnekliğini artırabilir.

Önceki çalışmamızda, immünosupresif in vivo ortamın insan kanser hücrelerinin immünojenik cDC1s^20'ye yeniden programlanmasını engellemediğini gösterdik. Bu makalede, farelerde yeniden programlamanın in vivo olarak in vitro olarak daha hızlı ve verimli olduğunu gösteriyoruz, bu da in vivo olarak gözlemlenen gelişmiş yeniden programlamanın her iki türde de korunmuş bir fenomen olduğunu gösteriyor. Bununla birlikte, bu yöntemin sınırlamalarından biri, ilk vektör iletimi sırasında in vivo ortamın olmamasıdır; bu nedenle, çevresel ipuçlarının in vivo teslimat verimliliğini etkileyip etkilemediğini ayırt edemez. Bu, farklı kısımlar karşılaştırılarak yerinde belirlenmelidir. İn situ dağıtım için lentiviral vektörlerden daha verimli olduğunu belirlediğimiz adenoviral vektörler²⁰ , doğrusal, dairesel ve kendi kendini çoğaltan RNA'lar veya küçük moleküllü kokteyller gibi viral olmayan kısımlarla^{karşılaştırılabilir 2 6,27}.

Daha önce, cDC1'in yeniden programlanmasının kanser hücrelerine proinflamatuar sitokin ve lenfosit toplayan kemokin salgılanması ve melanom modellerinde MHC-I ve MHC-II üzerinde profesyonel antijen işleme ve sunumu sağladığını göstermiştik^23,28. Bu, sitotoksik efektör T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve B hücrelerinin infiltrasyonunu artıran ve düzenleyici ve tükenmiş T hücreleri gibi immünosüpresif popülasyonları azaltan TLS oluşumunu indükleyerek TME'nin "bağışıklık-soğuk"tan "bağışıklık-sıcak" duruma yeniden modellenmesiyle sonuçlanır²⁰. Hastalarda, immünoterapiye pozitif yanıtlar, tümör antijenlerine karşı sürekli T ve B hücresi hazırlamanın tümöre özgü antikor yanıtları oluşturduğu tümörler içinde TLS'nin varlığı ile ilişkilendirilmiştir^29,30. Gelecekte, farklı kanser türlerinde indüklenmiş TLS neogenezi, TME yeniden şekillenmesi ve anti-tümör bağışıklığı mekanizmalarını çözmek ve tümöre özgü antikorların üretiminin uyarılıp uyarılmadığını karakterize etmek için bu izlenebilir in vivo cDC1 yeniden programlama protokolünü kullanmayı öngörüyoruz.

Daha önce in vivo cDC1 yeniden programlama ile anti-PD-1 veya anti-CTLA-4²⁰ ile ICB arasında sinerji gözlemlemiştik. Bu, cDC1'in yeniden programlanmasıyla oluşturulan "bağışıklık-sıcak" TME'nin, T hücresi reseptörü (TCR)-T hücreleri, kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücreleri veya tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) dahil olmak üzere ACT gibi diğer immünoterapilerle olası kombinasyonlar için uygun bir ortam sağlayabileceğini düşündürmektedir. Bu yöntemin bir başka avantajı, immünolojik reseptörlerin, sitokinlerin, kemokinlerin veya lenfotoksinlerin dirençli tümör tiplerinde cDC1 benzeri hücrelerde aşırı eksprese edilebildiği veya tükenebildiği büyük tarafsız kombinatoryal veya CRISPR ekranları gerçekleştirme olasılığıdır, böylece cDC1 aracılı bağışıklığın arttırılmasında farklı yolların rolünü ortaya çıkarır. Sonuç olarak, mevcut protokol geniş bir bilimsel topluluk için değerli bir kaynak sağlar, çünkü in vivo cDC1 yeniden programlama, kanser immünoterapisinde mekanik çalışmalar ve terapötik yenilikler için esnek ve güçlü bir platformdur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.45 μ m düşük proteinli bağlayıcı filtre, 150 mL Şişe Üstü Vakum Filtresi	Fisher bilimsel	15983297
2-Merkaptoetanol 50 mM	ThermoFisher Bilimsel	31350010
Anti-fare CD45 Monoklonal Antikor (klon: 30-F11), Sıçan IgG2b, κ	ThermoFisher Bilimsel	14-0451-82
B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)	Jackson Laboratuvarı	002014
BD Micro-Fine U-100 İnsülin Şırıngaları (0,5 mL)	Fisher Bilimsel	11395751
C57BL/6J fareler	Jackson Laboratuvarı	000664
Kollajenaz D	Sigma Aldrich	11088882001
Corning Falcon Hücre Süzgeci 50ml Konik Tüplerle Kullanım İçin	Sigma Aldrich	CLS352340
Corning kapak camları 24 x 50 mm	Sigma Aldrich	CLS2975245
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür)	ThermoFisher Bilimsel	D1306 Serisi
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
eBioscience Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 450	Davetli	65-0863-14
eBioscience IHC Antijen Alma Solüsyonu - Düşük pH (10x)	ThermoFisher Bilimsel	00-4955-58
Fetal Sığır Serumu (FBS)	ThermoFisher Bilimsel	A5256701
Floromount-G Montaj Ortamı	ThermoFisher Bilimsel	00-4958-02
GFP Antikoru [Alexa Fluor 594]	Novus Biyolojik Ürünler	NB600-308AF594 Serisi
Gibco DMEM/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Bilimsel	31331028
Gibco MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (100x)	ThermoFisher Bilimsel	11140035
Gibco Opti-MEM I	ThermoFisher Bilimsel	11058021
Gibco Roswell Park Anıt Enstitüsü (RPMI) 1640 Orta	ThermoFisher Bilimsel	52400025
Gibco Sodyum Piruvat (100 mM)	ThermoFisher Bilimsel	11360070
Gibco Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4	ThermoFisher Bilimsel	15250061
GlutaMAX Takviyesi	ThermoFisher Bilimsel	35050061
Keçi anti-sıçan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Poliklonal, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Bilimsel	A-11006
HEK 293T hücreleri	ATTC	CRL-11268
Heksadimmetrin bromür (Polibren)	Sigma Aldrich	H9268
HyClone Dulbecco'nun yüksek glikozlu Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
HyClone Penisilin Streptomisin 100x Solüsyon (Kalem/Strep)	Cytiva	SV30010
HyClone Fosfat Tamponlu Salin çözeltisi (PBS)	Cytiva	SH30028.02
Ketaminol veterineri. Enjeksiyon çözeltisi 100 mg/mL	MSD Hayvan Sağlığı İsveç	QN01AX03
Mikrotom Bıçağı - C35	PFM Medikal	207500005
Fare anti-CD45.2 (104), Yüzey, APC, Monoklonal	Biyolojik Efsane	109814
Fare anti-MHCII (M5/114.15.2), Yüzey, PE-Cy7, Monoklonal	Biyolojik Efsane	107630
Normal Keçi Serumu	Abcam	AB7481
Normal Sıçan Serumu (steril)	Abcam	AB7488
Üstü Açık İnce Duvarlı Polipropilen Borular	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	326823
Paraformaldehit, %16 w/v aq. soln., metanol içermez	ThermoFisher Bilimsel	043368,9 milyon
pFUW-tetO-Batf3, fare Batf3'ü kodlayan bir monosistronik kaset	Addgene	139837
pFUW-tetO-Irf8, fare Irf8'i kodlayan bir monosistronik kaset	Addgene	139838
pFUW-tetO-Pu.1, fare Pu.1'i kodlayan bir monosistronik kaset	Addgene	139839
Plazmit pMD2.G	Addgene	12259
Plazmit psPAX2	Addgene	12260
Plazmit SFFV-eGFP (eGFP)	Evde klonlama	-
Plazmit SFFV-mKiraz (mKiraz)	Evde klonlama	-
Plazmid SFFV-PIB-eGFP,  fare PU.1, IRF8 ve BATF3 (PIB)	Evde klonlama	-	Yeniden programlama için kullanılan yapılar ve vektörler, şirketle yapılan bir malzeme transfer anlaşması kapsamında Asgard Therapeutics'ten temin edilebilir
Polietilenimin (PEI), Doğrusal, MW 25000, Transfeksiyon Sınıfı	Polibilimler	23966
ReadyProbes Hidrofobik Bariyer Pap Kalem	ThermoFisher Bilimsel	R3777 Serisi
Sodyum Butirat	Sigma Aldrich	303410
Sakaroz	Sigma-Aldrich	S7903 Serisi
SuperFrost Plus Yapışma Mikroskobu Slaytları	Epredia	J1800AMNZ
Tissue-Tek O.C.T. Bileşiği	Sakura Finetek	4583
TrypLE Express Enzim (1x) fenol kırmızısı içermez	ThermoFisher Bilimsel	12604021
TT Cryomold Intermediate, kare (15 x 15 x 5 mm)	Sakura Finetek	4566
Ultra Saf 0,5 M EDTA, pH 8,0	Davetli	15575020
Xysol veterineri. Enjeksiyon çözeltisi 20 mg/mL	VM İlaç	QN05CM92
YUMM1.7 hücreleri	Antineo