Yöntem makalesi

Yüksek Dereceli Seröz Over Karsinomu Modellemesi için Fallop Tüpü Epitel Hücrelerinden Fare Kaynaklı Organoid Hatların Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/68753

⸱

6 Ağustos 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, in vitro ve in vivo olarak yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu (HGSOC) fare modellerinin geliştirilmesini detaylandırır. Murin fallop tüpü organoidlerinin türetilmesinden, insan HGSOC genetiğini özetlemek için genetik modifikasyonlarından ve in vivo tümörlerin gelişimi için sinjeneik farelerin yumurtalık bursasına sokulmasından.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastalıkların gerçekçi ortamlarda etkili bir şekilde modellenmesi, çeşitli patolojileri anlamamızı geliştirmek için çok önemlidir. Bu açıdan organoidler, in vitro klasik iki boyutlu muadillerine göre daha sadık bir ortam sunar. Benzer şekilde, sinjeneik murin modelleri, araştırmacıların in vivo olarak bağışıklık sistemi gibi daha eksiksiz tümör-konak etkileşimlerini araştırmalarına da olanak tanır. Burada, yüksek dereceli seröz over karsinomlarının (HGSOC) orijin hücresi olan fallop tüpü epitel hücrelerinin bir fareden çıkarılması ve bunların birincil organoid kültürler olarak türetilmesinin yanı sıra in vitro kültürleri ve bakımları hakkında eksiksiz bir protokol sunuyoruz. Daha sonra, bu hatları değiştirmek ve bunları kanser öncesi tümöroidlere dönüştürmek için lentiviral veya retroviral gen aşırı ekspresyonu ve CRISPR-Cas9 gen delesyonu gibi genetik mühendisliği tekniklerinin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Ayrıca, genetik materyallerin ekstraksiyonu ve immünofloresan boyama yoluyla in vitro doğrulama için bunların nasıl kullanılacağını da rapor ediyoruz. Son olarak, bu tümöroidlerin, tümör başlangıcı için HGSOC'un otokton bölgesi olan yumurtalık bursasına nasıl etkili bir şekilde enjekte edileceğini gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek dereceli seröz over karsinomu (HGSOC) tam olarak anlaşılamamış ve oldukça ölümcül bir hastalıktır. Tarihsel olarak, HGSOC biyolojisini ve tedavi yanıtını temsil eden in vitro ve in vivo modellerin sadık olmaması, ilerlemenin önünde önemli bir engel olmuştur. Örneğin, çok sayıda (çoğu olmasa da) çalışma, HGSOC'un temel genomik / genetik özelliklerini paylaşmayan hücre dizilerini kullanmış ve bulgularının alaka düzeyini sorgulanabilir hale getirmiştir 1,2,3,4. Örneğin, yaygın ID8 sinjeneik fare modeli, yumurtalık yüzey epitelinden (OSE) türetilmiştir ve Trp53-vahşi tip5'tir. Buna karşılık, HGSOC'nin tümü olmasa da çoğu fallop tüpü epitelinde (FTE)6 ortaya çıkar ve HGSOC neredeyse evrensel olarak TP53 mutantı veya susturucudur7. Araştırmacılar o zamandan beri Trp53 mutasyonlarını5'e entegre ederek bu çizgiyi düzeltmeye çalıştılar, ancak Trp53 mutasyonu HGSOC patogenezinde erken bir olay olduğundan, bu modifikasyon bu hücre hattının dönüşümünde muhtemelen çok geç gelir ve muhtemelen normal HGSOC gelişimini temsil etmez.

Son on yılda, daha gerçekçi HGSOC modelleri üreterek bu durumu düzeltmek için girişimlerde bulunulmuştur. Örneğin, patogenezi kontrol etmek için genellikle bir Cre-rekombinaz sistemi altında, Müllerian sistem soy hücreleri üzerinde ilgili mutasyonları barındıran genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), araştırmacıların hastalığı in vivoolarak daha iyi taklit etmelerine olanak tanır 8,9,10. Ne yazık ki, bu modellerin üretilmesi genellikle karmaşıktır ve Cre sızıntısı, Cre etkisi veya "alan etkileri" gibi başka sorunları olabilir11,12,13. Bu bağlamda, sinjeneik organoid modelleri, hastalığı hem in vitro hem de in vivo olarak daha iyi taklit etmek isteyen araştırmacılar için sağlam bir uzlaşma gibi görünmektedir 14,15,16,17,18,19. Gerçekten de, şu anda mevcut olan ve kullanılan çoğu HGSOC modeli iki boyutlu modeller olsa da, ne yazık ki hücre biyolojisini etkileyen çok önemli bir unsur olan hücre dışı matrisin (ECM) karmaşıklığını düzgün bir şekilde simüle edemezler. Organoidler, genellikle kök hücrelerden üretilen, Petri kabındaki bir organın erken yapısal ve işlevsel karmaşıklığını yeniden yaratabilen, kendi kendini organize eden3D dokulardır 20. Üretimleri tipik olarak, Matrigel21 gibi bir bazal membran matrisinde (BMM) pluripotent olan tek hücreleri askıya alarak çalışır. İn vitro, bu modeller in vivo koşullarda 2D modellere göre nispeten daha doğrudur. Benzer şekilde, sinjeneik yapıları nedeniyle, bu modeller tam işlevli bir bağışıklık sistemine sahip bir fareye nakledilebilir ve bu da patogenez ve gelişimin daha sadık bir şekilde yeniden yapılandırılmasına olanak tanır14,15. Bu, en gerçekçi tümör genetiğine sahip olmasına rağmen, bağışıklığı baskılanmış fare modellerinde aşılama gerektiren hasta kaynaklı ksenogreftlere göre açık bir avantajdır.

Bu protokolde, sinjeneik HGSOC organoid modellerinin nasıl geliştirileceğini açıklıyoruz. Bir fareden ekstrakte edilen orijinal vahşi tip FTE organoid kültürünün oluşturulmasından, hastalık bilgili genotipler oluşturmak için genetik mühendisliğinden, son olarak tam gelişmiş tümörler oluşturmak için yumurtalık bursasına geri nakledilmesine kadar. Ayrıca, in vitro organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması ve enjeksiyonlar gibi büyük ölçekli hücre üretimi için hücre hatlarının 2D dönüşümü gibi yaygın deneylere yardımcı olmak için birkaç ek protokol ekledik. Bu protokol, HGSOC biyolojisini daha gerçekçi in vitro koşullarda ve ayrıca tümör mikroçevresinde in vivo olarak mevcut olan etkileşimleri incelemek amacıyla, genetik yapıları üzerinde kontrol sahibi olan HGSOC'un organoid sinjeneik modellerini geliştirmek isteyen araştırmacılara yöneliktir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan dokusu toplama ve prosedürleri, İskenderiye Yaşam Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve NYU Langone Health, New York, New York'taki Perlmutter Kanser Merkezi'nin onayı altında etik olarak gerçekleştirildi.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Murin organoid media (MOM) hazırlığı
    1. Tablo 1'deki öğeleri birleştirerek bazal ortamı hazırlayın.
      NOT: Ortam 4 °C'de bir aya kadar stabildir.
  2. 2D medya hazırlama
    1. Rekombinant murin EGF 50 ng / mL, İnsülin-Transferrin-Selenyum (son konsantrasyonlar 10 mg / L İnsülin, 5.5 mg / L Transferin, 6.7 μg / L),% 3 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve Penisilin-Streptomisin (100 U / mL), DMEM'de (piruvat ve yüksek glikoz ile).
  3. Sindirim karışımı hazırlama
    1. Kollajenaz / Hyaluronidaz (3000 U / mL Kollajenaz, 1000 U / mL Hyaluronidaz) ile DMEM (piruvat ve yüksek glikoz ile) 1: 10 oranında birleştirin. 1.5 mL mikrotüplerde 1 mL alikotlar hazırlayın. Alikotları -20 °C'de saklayın ve buz üzerinde çözdürün.
    2. DNAse I (10.000 U / mL) ve Dispase'ın (5 U / mL) tek kullanımlık alikotlarını hazırlayın.
    3. DMEM'deki bir Kollajenaz / Hyaluronidaz alikotu çözüldükten sonra, DNAseI (10 μL, 100 birim) ekleyin ve Dispase (25 μL, 0.1 birim) ekleyin.
      NOT: Bu sindirim çözeltisi aynı zamanda 0,5 g'a kadar tümörü sindirmek için de yararlıdır.
  4. BMM işleme
    1. BMM'yi -80 °C'de uzun süre saklayın. BMM'nin donarak çözülmesini önlemek için, 1,5 mL'lik tüplerde 1 mL'lik alikotlar hazırlayın. Bir alikotu 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de buzun üzerine koyarak çözdürün.
      NOT: BMM, oda sıcaklığında (RT) katılaşacaktır. Bu nedenle, BMM tüpünü her zaman buz üzerinde veya soğuk bir tüp rafında tutmanız önerilir. -20 °C'lik bir dondurucuda en az 2 saat önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın.

2. Fare FTE'den hücrelerin izolasyonu

  1. Bir BMM alikotunu, önceden ısıtılmış TrypLE Express Enzimini ve 24 oyuklu bir plakayı 37 ° C'de çözün (en iyi sonuçlar için plakayı inkübatörde 24 saat saklayın). Ardından, çalışma alanını hazırlayın: diseksiyon mikroskobunda diseksiyon ve doku temizleme aletleri, soğuk PBS + P / S'li plaka ve ılık sindirim karışımı.
  2. Dişi C57BL / 6J farelerini karbondioksit boğulması ile ötenazi yapın. IACUC'un gerektirdiği şekilde ikincil ötenazi yöntemini (servikal çıkık) gerçekleştirin.
  3. Yumurtalık ve fallop tüpünü inceleyin ve çıkarın ve bunları 4 ° C'de DMEM + PS içeren steril bir Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, ince bir forseps ve makas seti, yumurtalıktan kalan yağ miktarını çıkarır ve fallop tüpünü (infundibulum ve distal ampulla'nın bir kısmı) yumurtalık ve uterustan izole eder.
    NOT: Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için farenin cildine veya saçına aletlerle dokunmaktan kaçınmaya dikkat edin.
  4. Dokuyu tam sindirim karışımını içeren tüpe aktarın ve fallop tüpünü küçük parçalara (<0,5 mm) doğramak için ince makas kullanın. 37 °C'de 40-50 dakika inkübe edin.
  5. Ayrışmadan sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 500 μL önceden ısıtılmış TrypLE Express ekleyin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  6. DMEM'de (2D ortam) 500 μL% 3 FBS ile tripsinizasyonu söndürün. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir mikrotüpe süzün. 350 g'da 5 dakika döndürün ve süpernatanı atın.
  7. Hücre peletini 12.5 μL organoid murin ortamında (kullanılan FT sayısına bağlı olarak zar zor görünür) yeniden süspanse edin ve kısa bir süre buz üzerinde inkübe edin. 37,5 μL buz gibi soğuk BMM ile karıştırın ve tüm hacmi (50 μL) önceden ısıtılmış 24 oyuklu bir plakanın kuyusunun dibine tohumlayın.
  8. BMM'yi ayarlamak için plakayı en az 37 dakika, ancak en fazla 20 saat boyunca 48 °C'ye yerleştirin. Plakayı inkübatöre aktarırken kubbeleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
  9. Her bir kuyucuğa 500 μL önceden ısıtılmış MOM ekleyin, ortamı kuyunun kenarından nazikçe pipetleyin. Hasara veya ayrılmaya neden olabileceğinden, asla doğrudan kubbeye ortam eklemeyin. Kapağı kültür plakasına yerleştirin ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.

3. Murin FTE'den türetilmiş organoidlerin bakımı

  1. Medyayı değiştirme
    1. Filtresiz, steril 10 μL'lik bir uç kullanarak, plaka 45°'lik bir eğimde tutulurken ortamı kuyunun dibinden aspire edin. Kubbe plakadan ayrılırsa, ayrılmış kubbe alttayken ortamı kuyunun üstünden dikkatlice aspire edin.
    2. 37 °C'de önceden ısıtılmış 750 μL MOM'u, ucu kuyunun yan duvarına bastırarak yavaşça ekleyin.
    3. Ortamı her 2 ila 3 günde bir veya ortamın rengi pembeden sarıya dönene kadar değiştirin. Ortam değiştirildikten sonra 24 saatten daha kısa bir süre içinde sararırsa, organoidler geçişe hazırdır.
  2. Geçen organoidler
    1. Ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu 500 μL soğuk (4 °C) PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 500 μL soğuk (4 °C) Hücre Geri Kazanım Solüsyonunu çözmek için doğrudan BMM kubbesine ekleyin. BMM tamamen eriyene kadar pipetlemeye devam edin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    2. Tüpü 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve plakayı sıcak kalması için inkübatöre geri koyun. Yeni bir plaka kullanıyorsanız, 24 saat boyunca 37 °C'de önceden ısıtıldığından emin olun.
      NOT: Aşağıda özetlenen genişletmeler sırasında olduğu gibi 2x 50 μL'den fazla kubbe geçiriliyorsa, en iyi sonuçlar için buz üzerinde inkübasyonun 30 dakikadan daha uzun süre uzatılması gerekebilir.
    3. 350 g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peleti aspire etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 500 μL soğuk PBS ile yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
      NOT: Soğuk bir santrifüj mevcut değilse, tüpü buz veya soğuk bir raf üzerine yerleştirerek yıkamalar arasında soğumasını bekleyin.
    4. Son yıkamadan sonra, 350 g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 500 μL önceden ısıtılmış (37 °C) TrypLE Express Enzimi ekleyin. Pipetleme nedeniyle hücre kaybını önlemek için, hücreleri homojenize etmek için tüpü doku kültürü başlığındaki havalandırma ızgarasına doğru sürükleyin.
    5. Tüpü 37 ° C'de 30 ila 60 dakika inkübe edin.
      NOT: Zaman, organoid genotipine ve geçiş süresine bağlı olarak uyarlanabilir, çünkü bazıları tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için daha uzun tripsinasyon gerektirebilir.
    6. 500 μL DMEM +% 3 HI FBS ekleyerek hücre ayrışma işlemini durdurun ve çözelti homojen hale gelene kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    7. 350 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı ~ 20 μL hacim kalana kadar aspire edin. Kalan süpernatanı bir vakum aspiratörü yerine bir P20 pipeti ile manuel olarak çıkarın, çünkü bu adımda peleti aspire etmek yaygındır.
    8. Hücreleri 100 μL soğuk (4 °C) MOM'da yeniden süspanse edin ve hücre konsantrasyonunu ölçün. Hücre seyreltmelerini istediğiniz gibi hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Ardından, daha önce -20 °C'de saklanmış pipet uçlarını kullanarak buz gibi BMM ile karıştırın.
      NOT: MOM'un BMM'ye oranının 1:4 olduğu 2 × 105 hücre/mL'de iki adet 50 μL'lik kubbe hazırlanması önerilir. Bu nedenle; MOM'da 8 × 105 hücre/mL'de 25 μL hücre ve toplam 100 μL için 75 μL BMM, 2 kubbeye bölünmüştür. Bunun gibi, kubbe başına 1 × 104 hücreyi etkili bir şekilde tohumlayacaktır.
    9. Önceden ısıtılmış 24 oyuklu bir plakanın kuyusunun ortasındaki her 50 μL'lik kubbeyi tohumlayın. BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı en az 30 dakika boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin. Daha önce adım 3.1.2'de gösterildiği gibi 37 °C'de 500 μL MOM ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.
  3. Genleşme
    1. Organoid hücre kültürünü (önceden ısıtılmış) 6 oyuklu bir plakaya genişletmek için, 8 × 10 5 hücre / mL'de beşadet 50 μL'lik kubbe hazırlayın. Hücreleri toplam 62.5 μL MOM içinde yeniden süspanse edin ve 187.5 μL buz gibi soğuk BMM ile karıştırın ve 5 kubbeyi aynı kuyucuğa tohumlayın.
    2. BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı 30 dakika boyunca inkübatöre taşıyın. Daha önce adım 3.1.2'de gösterildiği gibi 37 °C'de 2 mL MOM ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Hücreler birleşene kadar ortamı gerektiği gibi değiştirin.
      NOT: Hücreleri paslama için toplamak için, 500 μL yerine 1 mL Hücre Geri Kazanım Çözeltisi kullanın ve 30 dakika yerine 45 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  4. Kriyoprezervasyon
    1. Organoidlerin uzun süreli depolanması için, 3.2.1-3.2.7 adımlarında açıklandığı gibi geçiş. Daha sonra, 250 μL organoid dondurma ortamında (%80 MOM, %10 FBS ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO)) yeniden süspanse edin ve bir kriyotüpe aktarın. Kriyovial başına 1 × 105 hücreyi dondurun.
    2. Tüpü kriyojenik bir şişe dondurma kabında (örneğin, Mr. Frosty) saklayın ve -80 ° C'lik bir dondurucuda soğumaya bırakın. Uzun süreli saklama için hücreleri sıvı nitrojen deposunda veya -150 °C dondurucuda saklayın.

4. Yeni hücre hatları geliştirmek için murin FTE'den türetilmiş organoidlerin genetik modifikasyonu

  1. Spinokülasyon ile transdüksiyon (lentiviral veya retroviral)
    1. 25 μL MOM ve 75 μL BMM'den oluşan bir karışım hazırlayın ve bunu bir kuyucuklu soğuk (4 °C, BMM'nin kuyuyu tamamen "ıslatmasına" izin verir) 48 oyuklu bir plakaya ekleyin. Hücreleri tohumlamadan önce BMM'nin katılaşmasına izin vermek için 37 ° C'de 30 ila 60 dakika inkübe edin.
    2. Organoidlerden türetilen tek hücreleri elde edin (adım 3.2.5) ve BMM'nin üzerine yaklaşık 2 × 104 tohumlayın. 200 μL ılık (37 °C) MOM ekleyin ve 37 °C ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
    3. Virüsü istenen konsantrasyonda ekleyin. MOI'yi deneysel olarak belirleyin; yaklaşık% 30'un altında bir MOI önerilmektedir.
      NOT: Organoidlerin enfekte edilmesi, 2D hücre hatlarına kıyasla özellikle zordur ve yüksek virüs titrelerinde bile düşük MOI'ler bekler. Hücreleri 32 ° C'de 60 dakika boyunca 600 × g'da santrifüjleyin. Spinokülasyon bittikten sonra plakayı inkübatöre geri koyun.
    4. 8 saat sonra, ortamı çıkarın ve hücrelerin üzerine 25 μL MOM ve 75 μL BMM karışımı ekleyerek onları BMM'de "sandviç" haline getirin ve organoidlerin 3 boyutta doğal olarak büyümesine izin verin. Plakayı 30-60 dakika inkübatöre yerleştirerek BMM'nin katılaşmasına izin verin. Ardından 250 μL ılık (37 °C) MOM ekleyin.
    5. Hücreler birleştikten sonra, tüm hücre hacmini 24 oyuklu bir plakada 2 kubbeye genişleterek adım 3.2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi onları geçmeye devam edin.
      NOT: Bir antibiyotik seçimi kullanılıyorsa, seçimin ilk spinokülasyondan 48 saat sonra başlayarak doğrudan 48 kuyucuğunda yapılması önerilir. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) yapılıyorsa, yeterli hücre elde etmek için yukarıda belirtildiği gibi 6 oyuklu bir plaka üzerinde daha fazla genişletmeniz önerilir. Numuneleri akış için filtrelemeden önce tek hücrelerin emin olmak için daha uzun (1 saat) tripsinizasyon süreleri de önerilir.
  2. Elektroporasyon tabanlı CRISPR-Cas9 ile dönüşüm
    NOT: Ribonükleoprotein (RNP) kompleks konsantrasyonları ve hazırlığı için IDT Homolojiye Yönelik Onarım Kılavuzuna (sayfa 9-11)22 bakın. Bununla birlikte, yalnızca homolog rekombinasyon gerektiren genom düzenleme için önerildiğinden, nakavtlar için HDR Enhancer V2'yi atlayın.
    1. Organoidlerden türetilen tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın (adım 3.2.7). PBS ile yıkayın ve hücre konsantrasyonunu ölçün. 104 büyüklük sırası (1 × 104 ila 9 × 104 hücre) içinde bir miktar içeren bir hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    2. 350 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 10 μL genom düzenleme tamponunda yeniden süspanse edin. Elektroporasyon için >1 × 104 hücre gerekiyorsa, her 10 μL'nin 1 × 104 ila 9 × 104 hücre içerdiğinden emin olarak seri elektroporasyonlar için yeterli bir hacim hazırlayın.
    3. Bir elektroporasyon pipet sistemi kullanarak, 10 μL hücre süspansiyonunu toplayın ve kabarcık oluşmadığından emin olun. Aşağıdaki koşullar altında elektropozit: 1200 V voltaj, 20 ms darbe süresi, toplam 4 darbe. Hücreleri soğuk MOM ile bir tüpe yerleştirin.
    4. Hücreler elektroporasyona tabi tutulduktan sonra, tüm süspansiyonu 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüjleyin. Peletleri buz gibi soğuk MOM ve BMM'de (1:4 oranında) yeniden süspanse edin, elektroporasyon turu başına bir kubbe tohumlamaya yetecek kadar hazırlayın (1 104 hücre başına 1 kubbe).
    5. BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı en az 30 dakika boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin. Daha önce adım 3.1.2'de gösterildiği gibi 37 °C'de 500 μL MOM ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.
  3. Tek klonların seçilmesi
    1. Tek bir hücreden gelen bir klon elde etmek için, hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi geçirin, ancak kubbe başına 50 ila 100 hücre tohumlayın (BMM ile karıştırmadan önce hücre süspansiyonunda 4 ×10 3 ila 8 × 103 hücre / mL).
    2. MOM'u her 3 günde bir değiştirin. Organoidlerin uygun şekilde büyüdüğünü kontrol edin ve hangilerinin diğerlerinden iyi ayrıldığını not edin.
    3. Organoidler fark edilebilir bir boyuta (yaklaşık 500 μm) ulaştığında, yeterince ayrılmış 4-5 büyük organoidi tanımlamak için bir ışık mikroskobu kullanın.
      NOT: Çıplak gözle görülebilmelidirler, ancak plakanın organoidin bulunduğu alanın etrafına bir daire çizerek plakanın altını ince uçlu bir işaretleyici ile işaretlemek yararlı olacaktır.
    4. Steril başlıkta 20 μL'lik bir pipet kullanarak, ucu nazikçe BMM'ye yerleştirin ve tek organoidi aspire edin (yaklaşık 12,5 μL'lik bir hacmi aspire edin). Organoidi 500 μL MOM içeren 1.5 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin.
    5. 350 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 500 μL TrypLE Express Enzimi içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    6. DMEM'de (2D ortam) 500 μL% 3 FBS ile hücre ayrışma reaksiyonunu söndürün ve 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çok dikkatli bir şekilde çıkarın, 12.5 μL soğuk MOM'da yeniden süspanse edin, 37.5 μL buz gibi soğuk BMM ile karıştırın ve tüm süspansiyonu yukarıda tarif edildiği gibi 24 oyuklu bir plakada tek bir 50 μL kubbe olarak tohumlayın.
    7. BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı en az 30 dakika boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin. Daha önce adım 3.1.2'de gösterildiği gibi 37 °C'de 500 μL MOM ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.
    8. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin ve kubbe birleştiğinde geçiş yapın.

5. Organoidlerden 2D hücre hattı türetme

  1. Geçiş hücre kültürü
    1. Organoidleri geçtikten sonra olduğu gibi tek hücreli bir süspansiyondan başlayın.
    2. 6 oyuklu bir plakayı tohumlamak için yaptığınız gibi ilerleyin (adım 3.3), ancak bunun yerine önceden soğutulmuş (24 saat boyunca 4 ° C) kullanın. Kubbeleri gece boyunca 4 °C'de saklanan 6 oyuklu bir plaka üzerine dikin ve plakayı inkübatöre koymadan önce steril davlumbazda 5-10 dakika dinlendirin.
      NOT: Bu adım, hücrelerin, BMM'nin ECM bileşenlerine erişmeye devam ederken, 2D büyüme koşuluna uyum sağlamak için plakanın dibine nazikçe yerleşmesine izin verecektir.
    3. Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin, ardından 37 ° C'de 2 mL MOM ekleyin. Medyayı gerektiği gibi değiştirin.
    4. Organoidler birleştiğinde, 3.2.1-3.2.7 adımlarında açıklandığı gibi geçiş. Kalan BMM'yi çıkarmak için kuyunun son PBS yıkamasından sonra, kuyuya 2 mL önceden ısıtılmış 2D ortam ekleyin.
      NOT: BMM'nin çıkarılması, kuyuya bağlı hücreleri çıkarmayacaktır ve bunlar artık 2B koşullara/ortama uyum sağlarken kuyunun geri kalanını serbestçe istila edebilir.
    5. BMM'de kalan hücrelerle tek bir hücre süspansiyonuna ulaşıldığında, hücre hacminin yarısını tohumlayın ve adım 5.1.2'yi tekrarlayın. Orijinal kuyucuğun diğer yarısını ekleyin, daha fazla hücrenin tohumlanmasına izin verin, bu da birleşmeyi hızlandıracaktır.
    6. Bağlı olmayan hücreleri çıkarmak için 2D medyayı 24 saat sonra değiştirin.
      NOT: BMM'de yetiştirilen hücreler plastik substratlara alışkın olmadığından ve kolayca yapışmayacağından, birçok bağlanmamış hücre olmalıdır.
    7. Adım 5.1.4'ü tekrarlayın. Daha sonra, tüm hücre hacmini 4 mL 2D ortamda yeniden süspanse edin ve daha önce kullanılan oyukların her birinde 2 mL tohum ekin. 2D medyayı her 3-4 günde bir değiştirin.
  2. Genişletme için 2D hücre kültürü
    1. Hücreler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, ilk geçişe devam edin.
    2. Geçmek için, ortamı aspire etmek için, 1 mL PBS ile bir kez yıkayın ve 1 mL% 0.25 Tripsin ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin.
      NOT: Farklı hücre hatları, tripsinizasyon süresinin değişmesine neden olan farklı yapışma özelliklerine sahip olabilir. Bir sonraki adıma geçmeden önce hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını mikroskop altında kontrol edin. Hücre kültürü plakasına elle hafifçe vurmak, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olabilir.
    3. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, ayrışmayı DMEM +% 10 FBS ile söndürün ve 350 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    4. İlk genişleme için (%80-100 birleştiğinde), 1:1 bölme oranında yeniden tohumlayın. Adım 5.1.6'yı tekrarlayın ve 2D medyayı her 2-3 günde bir değiştirin.
    5. İkinci genişlemede (% 80-100 birleşme), hücreleri 37 ° C'de 10 mL 2D ortamda yeniden süspanse ederek tüm hücreleri 100 mm'lik bir tabağa tohumlayın. Adım 5.1.6'yı tekrarlayın ve medyayı 2-3 günde bir değiştirin.
      NOT: Bu işlem zaman alıcıdır ve tam bir aya kadar sürebilir. Proteinin aşırı ekspresyonu için viral olarak entegre genlere sahip hücre dizileri ile çalışılıyorsa, seçim antibiyotiklerinin büyüme ortamında bulunması önerilir. İşaretleyici bir floresan proteinse, floresanla aktive edilen hücre sıralamasını mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirin (yani, 100 mm'lik çanak genişlemesinin sonu).
  3. Kriyoprezervasyon
    1. Bu hücrelerin saklanması için, 5.2.1-5.2.3 adımlarında açıklandığı gibi geçiş. Ardından, %80 2D ortam, %10 FBS ve %10 DMSO'dan oluşan 1 mL 2D dondurma ortamında ~ 1 × 106 hücreyi yeniden süspanse edin ve bir kriyotüpe aktarın. Adım 3.5.2'yi izleyerek hücreleri saklayın.

6. Organoid hatların doğrulanması

  1. Organoidlerden genetik materyalin izole edilmesi
    1. Tek hücreli bir süspansiyondan başlayarak, normal hücre yoğunluğunun iki katı (1 × 106 hücre / mL) iki kubbe tohumlayın. MOM'u 3. günde değiştirin.
    2. 5. günde, ortamı çıkarın, PBS ile bir kez yıkayın ve 350 μL tercih edilen lizis tamponunu doğrudan kubbelerin üzerine ekleyin. RT'de 5 dakikalık inkübasyondan sonra veya BMM çözülene kadar lizatı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    3. Uzun süreli kullanım için lizatı -80 °C'de saklayın. Aksi takdirde, tercih edilen ekstraksiyon tekniğini veya ticari bir kiti kullanarak DNA ve/veya RNA ekstraksiyonu protokolüne devam edin.
  2. İmmünofloresan (IF) boyama
    1. Hücreleri hazırlamak için, 3.2.1-3.2.5 adımlarında açıklandığı gibi geçiş. 37,5 μL MOM ve 112,5 μL buz gibi soğuk BMM karışımında (biyolojik kopya görevi görecek üç adet 50 μL'lik kubbe için yeterli) yeniden süspanse edin. Adım 3.2.6'yı izleyin ve 3. ve 5. günlerde medyayı değiştirin.
    2. 7. günde, MOM'u aspire edin ve hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın. PBS'de 500 μL önceden ısıtılmış (37 °C) %4 paraformaldehit (PFA) solüsyonunu doğrudan kubbeye ekleyerek her kubbeyi ayrı ayrı sabitleyin. BMM eriyene kadar 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
    3. Geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanarak (mevcut değilse, ince uçtan yaklaşık 0,5 cm uzakta normal bir P1000 ucunu kesin), organoidleri %4 PFA'da toplayın ve hacmi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: Standart bir pipet ucu kullanmak organoidlerin kırılmasına neden olur.
    4. Organoidlerin tüpün dibine batması için 2 ila 3 dakika bekleyin. % 4 PFA'yı aspire edin (organoidleri aspire etmemek için güvenli bir hacim bırakırken) ve organoidleri yıkamak için 500 μL PBS ekleyin. Toplam 3 yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
      NOT: Organoid şeklini korumak için organoidlerin dibe çökmesini beklemek, santrifüjlemeden daha çok tercih edilir.
    5. Uzun süreli depolama için (4-6 hafta), organoidleri PBS'de 4 ° C'de tutun. Boyamaya devam etmek için, RT'de 30 dakika boyunca PBS +% 1 Triton-X ile geçirgenleştirin. PBS ile bir kez yıkayın.
    6. RT'de 60 dakika boyunca PBS +% 0.2 Triton-X +% 4 FBS +% 1 fare serumu ile bloklayın. PBS ile bir kez yıkayın ve tüpte 100 μL hacim bırakın.
    7. Antikor boyaması için çalışma tamponunu hazırlayın: PBS +% 0.2 Triton-X,% 0.4 FBS,% 0.1 sıçan serumu. Bu tampon hem birincil hem de ikincil antikorlar için çalışacaktır.
    8. Birincil antikor boyasını hazırlamak için, seyreltmeyi gereken gerçek seyreltmenin iki katı kadar konsantre olacak şekilde hesaplayın. Her tüpte kalan 100 μL PBS'ye 100 μL antikor eklemek için yeterli çözelti hazırlayın. Örneğin, 1:1000'lik orijinal bir seyreltme için 100 μL 1:500'lük çözelti hazırlayın.
    9. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Daha sonra 500 μL PBS ile üç kez yıkayın.
    10. İkincil antikor boyasını adım 6.2.8'de açıklandığı gibi hazırlayın. RT'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Bu adımdan itibaren, floresan antikorların fotoağartılmasını önlemek için çalışma alanını alüminyum folyo / tercih edilen koyu kutu ile kapladığınızdan emin olun.
    11. İkincil lekelenme bittikten sonra 500 μL PBS ile üç kez yıkayın. Numuneyi montaja hazırlamak için son yıkamadan sonra tüpten mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın. Organoidlerin aspire edilmesini önlemek için 20 μL'lik bir pipet kullanın.
    12. Geniş delikli veya kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, tercih ettiğiniz 20 μL montaj ortamını ekleyin ve kabarcıklardan kaçınarak çözeltiyi iyice homojenize edin.
    13. Dikdörtgen bir kapak kızağı üzerine montaj çözeltisine bir damla organoid yerleştirin. Forseps kullanarak, kabarcıklardan kaçınarak damlanın üzerine dairesel bir lamel yerleştirin ve gece boyunca RT'de karanlıkta kurumaya bırakın. Slayt başına birden fazla örnek yerleştirilecekse, bu adımı aynı slaytta tekrarlayın.
    14. 20 μL daha fazla montaj ortamını doğrudan dairesel kapak kızağının üzerine ekleyin. Şimdi, dikdörtgen lamel 180° çevirerek ve mikroskop lamının üzerine yerleştirerek bir montaj "sandviçi" oluşturun. RT'de karanlıkta en az 8 saat kurumaya bırakın.
      NOT: Slayt aşağıdan yukarıya doğru şu sırada olmalıdır: mikroskop lam, dairesel kapak kayması, organoidler, dikdörtgen kapak lam. Bu, optimum görüntüleme koşullarını yaratır.

7. Farelerde tümör modellerinin geliştirilmesi

  1. Hücrelerin hazırlanması
    1. Tercih ettiğiniz 2B hücrelerden oluşan bir şişeyi 2B ortamda çözün. Bu hücrelerin büyümesine ve 150 mm'lik bir plakaya genişlemesine izin verin. Hücrelerin antibiyotik seçim belirteçleri varsa, istenen hücrelerin saf bir popülasyonunu sağlamak için enjeksiyondan önce hücreleri seçin.
    2. 5 fare enjeksiyonu için, hücreleri iki adet 150 mm'lik plakaya genişletin. Plakalar %80 birleştiğinde, 5.2.2-5.2.3 adımlarını izleyerek hücreleri hasat edin. Hücreleri 1 mL Opti-MEM I Azaltılmış Serum ortamında yeniden süspanse edin ve hücre konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Her enjeksiyon 4 × 106 hücre içerir; Bununla birlikte, şırıngaların ölü hacmini hesaba katmak için ek bir enjeksiyon için hazırlık yapılması önerilir. Bu durumda, 20 × 106 hücre yerine 24 × 106 hücre hazırlayın.
    3. Tüm enjeksiyonlar için tüm hücre hacmini 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Takviyesiz Opti-MEM I'de 1 kısım hücre ve 1 kısım buz gibi soğuk BMM'den oluşan enjeksiyon başına toplam 44 μL hazırlayın. Örneğin, 24 × 106 hücre (6 enjeksiyon) için, 132 μL Opti-MEM I ve 132 μL BMM'de yeniden süspansiyon haline getirin.
    4. Hücreleri iyice karıştırın ve enjeksiyonu gerçekleştirene kadar buz üzerinde tutun.
  2. Prosedür için hazırlanıyor
    1. Soğuk PBS ile şırınganın ölü hacminden (U-100 insülin 28 G) hava kabarcıklarını dışarı atın.
    2. 1.5 mL'lik tüpteki hücreleri kullanarak, iğne içindeki kesme kuvvetleri nedeniyle hücrelerin parçalanmasını önlemek için şırıngayı yavaşça yükleyerek beş adet 40 μL'lik enjeksiyon hazırlayın. Fareler sakinleşene kadar buz üzerinde tutun.
    3. Enjeksiyonlar için her şey hazırlandıktan sonra, şırıngaları ısıtma lambasının yanına yerleştirin, böylece BMM ısınabilir ve viskoz hale gelebilir, bu da enjeksiyon ve aşılamayı kolaylaştırır. Bunları doğrudan ısıtma lambasının altına yerleştirmeyin, çünkü aşırı katılaşmış BMM şırıngadan uygun şekilde geçmeyecektir. Genel olarak, bunun olmasını önlemek için hızlı çalışın.
  3. Yumurtalık içine intrabursal enjeksiyon (IBI)
    1. Ketamin (100 mg / mL) kullanarak bir C57BL / 6J fareyi uyuşturun. İntraperitoneal enjeksiyon ile 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL uygulayın.
      NOT: Genç dişi fareler genellikle sadece 0.2 mL enjeksiyon gerektirir, ancak daha yaşlıysa daha fazlasına ihtiyaç duyabilir. Bu, 20-40 dakika süreyle anestezi sağlayacaktır, ancak herhangi bir analjezi sağlamayacaktır.
    2. Fareyi, ısıtma lambası tarafından ısıtılan bir kafese yerleştirin.
      NOT: Fareleri doğrudan ısıtma lambasının altına koymayın, çünkü bu, ölümcül olabilen kuyruk nekrozuna ve hipertermiye neden olabilir.
    3. İlk fare tamamen uyuşturulduktan sonra, aseptik teknik kullanılarak, karın bölgesinde ve uyluğun üzerinde bir C57BL/6J farenin yan tarafı boyunca <1 cm'lik bir kesi kesin. Bursa bölgesine ulaşmadan önce epidermis ve hipodermisten geçtiğinizden emin olun.
    4. Yumurtalığı dikkatlice dışarı çekin (üzerine bağlı yağ yastığı ile kolayca bulunur). Hazırlanan şırıngalardan birini alın ve hücreleri yumurtalığın hemen arkasındaki yağ yastığından, yumurtalığın içinden yavaşça yumurta kanalı torbasına enjekte edin.
      NOT: Başarılı bir enjeksiyon, BMM ile yumurta kanalı çuval balonunu görecektir. Karışım muhtemelen yağ yastığının her yerine sızacaktır, bu normaldir.
    5. Yumurtalığı dikkatlice bursaya geri koyun ve kesiyi cerrahi zımba kullanarak veya dikerek kapatın.
    6. Fareyi tekrar kafese yerleştirin. Fareleri ameliyat sonrası yarı bilinçli olana kadar (>15 dakika) iyileşirken sıcak tutmak için bir ısıtma lambası kullanın. Ertesi gün, gece boyunca sepsis oluşmadığını doğrulamak için fareyi kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HGSOC yumurtalık kanseri oluşturmak ve doğrulamak için iş akışını özetleyen bir şema Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu işlem, dişi bir C57BL/6J vahşi tip fareden fallop tüpü dokusunun çıkarılmasıyla başlar (Şekil 2A). Düzgün bir toplama sağlamak için cömert bir doku parçasıyla başlamanız önerilir. Bir diseksiyon mikroskobu kullanmak, yağ ve yumurtalık gibi çevre dokuları çıkarırken distal fallop tüpünün hassas bir şekilde izole ed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onkoloji araştırmalarındaki önemli gelişmelere rağmen, HGSOC tüm yumurtalık kanserleri arasında en agresif jinekolojik malignite türü ve önde gelen mortalite nedeni olmaya devam etmektedir23,24. Jinekolojik onkoloji araştırmaları geliştikçe, içinde kullanılan modeller de gelişmelidir. Gerçekten de, birçok tarihsel yumurtalık kanseri model hücre hattının, genomik alaka düzeyi, köken hücresi tutarsızlıkları veya in vivo ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R01 (CA257507) ödül numarası altında desteklenmiştir. Şekillerin şemaları BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Bu proje boyunca verdiği destek için Dr. Benjamin Neel'e, orijinal protokolün geliştirilmesi için Dr. Shuang Zhang'a ve optimize etmedeki yardımı için Dr. Kiyomi Araki'ye teşekkür etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HBSS'de kalsiyum, magnezyum ve sodyum bikarbonat olmadan %0,25 tripsin, %0,1 EDTACorning25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
İleri DMEM/F12Gibco12-634-028
C57BL/6J yaşında (kadın)Jackson Laboratuvarı000664
AllPrep DNA/RNA Mini KitiQIAGEN80204DNA/RNA çıkarımı için
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Entegre DNA Teknolojileri10008100
Anti-Ki67 antikorAbcamAB15580
AutoClip SistemiGüzel Bilim Araçları12020-00IBI sonrası yara kapanması için
B-27 Takviyesi (50x), serumsuzGibco17-504-001
Blastisidin HCl (10 mg/mL) 50 mgInvivoGenant-bl-05
Sığır Serum AlbüminiSigma AldrichA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393DNA/RNA ekstraksiyonundan önce hücreleri lizlemek için
Hücre Kurtarma ÇözümüCorning354253
Kollajenaz/HialuronidazaSTEMCELL Teknolojileri07912
CoraLite 594-Phalloidin (kırmızı)ProteintechPF00003
Kapak camı 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
Kapak camı 24 mm ve keskin; 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) N-2 TakviyesiGibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
Deoksiribonukleaz I (DNA I) sığır pankreasındanSigma AldrichD5025
Difco Yağsız SütBecton Dickinson232100
DağıtmakSTEMCELL Teknolojileri07913
DMEM, L-Glutamin, 4.5 g/L Glikoz ve Sodyum Piruvat ileCorning10013CV
DNase I rekombinant, RNase-freeRoche04716728001
Dulbecco'nun Fosfat-Tamponlu ÇözeltisiSigma AldrichD8537
Dumont #5 - Seramik Kaplamalı PensapGüzel Bilim Araçları11252-50Fallop tüpü diseksiyon için
Fetal Sığır SerumuCorning35-010-CV56 derece ve derecede ısı-inaktive et; C 60 dakika boyunca.
İnce Makas - ToughCutGüzel Bilim Araçları14058-09Fallop tüpü toplama ve IBI kesisi için
Geneticin Seçici Antiseptik (G418 Sülfat) (50 mg/mL)Gibco10131027
GlutaMAX Takviyesi (100 kat)Gibco35-050-061
Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Siyanin3InvitrogenA10520
Graefe pensepsiGüzel Bilim Araçları11053-10Doku işleme için
HEPES tamponuCorning25060CI
İnsan R-Spondin 1 Rekombinant ProteiniPeproTech120-38
İnsülin Şırıngası, U-100 0.5 mL 0.36 mm (28 G)x 12.7 mm (1/2")BDBD329461
İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25-030-081
Matrigel GFR Bazal Membran MatrisiCorning356231BMM
Fare EGF Rekombinant ProteiniPeproTech315-09
Fare FGF-bazlı Rekombinant ProteinPeproTech450-33
Fare Noggin Rekombinant ProteiniPeproTech250-38
Fare Wnt-3a Rekombinant ProteiniPeproTech315-20
N2 EkiGibco17502048
N-asetilsistein amidiSigma AldrichA0737
Neon NxT Elektroporasyon SistemiInvitrogenNEON1SCRISPR-Cas9 elektroporasyonu için
Neon NxT Elektroporasyon Sistemi 10-μ 1 Kanallı Tüplü L KitInvitrogenN1025Genom düzenleme tamponu dahil elektroporasyon için tüketim malzemeleri
NikotinamidSigma AldrichN3376
Normal Fare SerumuInvitrogen10410
Normal Fare SerumuSTEMCELL Teknolojileri13551
Opti-MEM I İngenezilmiş Serum OrtamıGibco31985070
PAX8 Poliklonal antikorProteintech10336-1-AP
Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15-140-122
PuromysinSigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm ve akut; 75 mm ve akut; 1.0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Fisher BiyoreagentleriBP151
TrypLE Ekspres Enzimi (1x), fenol kırmızı içermeyenGibco12-604-013
Vannas Yay Makası - 4 mm Kesici KenarGüzel Bilim Araçları15019-10Fallop tüpü diseksiyon için
Y27632STEMCELL Teknolojileri72304Rho-kinaz (KAYA) Inhibitörü 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 4, 2126(2013).
  3. Anglesio, M. S., et al. Type-specific cell line models for type-specific ovarian cancer research. PLoS One. 8 (9), e72162(2013).
  4. Beaufort, C. M., et al. Ovarian cancer cell line panel (OCCP): Clinical importance of in vitro morphological subtypes. PLoS One. 9 (9), e103988(2014).
  5. Walton, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma. Cancer Res. 76 (20), 6118-6129 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nat. Commun. 8 (1), 1093(2017).
  7. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
  8. Kim, J., Coffey, D. M., Creighton, C. J., Yu, Z., Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  9. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. J Pathol. 233 (3), 228-237 (2014).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Vooijs, M., Berns, J. A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2 (4), 293-297 (2001).
  12. Semprini, S., et al. Cryptic loxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35 (5), 1402-1410 (2007).
  13. Loonstra, A., et al. Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9209-9214 (2001).
  14. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  15. Yver, S., et al. Genetically defined syngeneic mouse models of ovarian cancer as tools for the discovery of combination immunotherapy. Cancer Discov. 11 (2), 384-407 (2021).
  16. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. Commun. 11 (1), 2660(2020).
  17. Maniati, E., et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment. Cell Reports. 30 (2), 525-540.e7 (2020).
  18. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protoc. 3 (1), 101164(2022).
  19. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32, 51-60 (2018).
  20. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).
  21. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med. 145 (1), 204-220 (1977).
  22. Homology-directed repair using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and HDR Donor Oligos. , Integrated DNA Technologies (IDT). https://idtsfprod.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/protocol/homology-directed-repair-using-the-alt-r-crispr-cas9-system-and-hdr-donor-oligos.pdf?sfvrsn=47121607_6 (2022).
  23. Santoro, A., et al. The multiple facets of ovarian high grade serous carcinoma: A review on morphological, immunohistochemical and molecular features. Crit Rev Oncol Hematol. 208, 104603(2025).
  24. Lisio, M. -A., Fu, L., Goyeneche, A., Gao, Z., Telleria, C. High-grade serous ovarian cancer: Basic sciences, clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci. 20 (4), 952(2019).
  25. Silva-Pedrosa, R., Salgado, A. J., Ferreira, P. E. Revolutionizing disease modeling: The emergence of organoids in cellular systems. Cells. 12 (6), 930(2023).
  26. Claassen, D. A., Desler, M. M., Rizzino, A. ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 76 (8), 722-732 (2009).
  27. Leibowitz, M., et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet. 53 (6), 895-905 (2021).
  28. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  29. Kossaï, M., Leary, A., Scoazec, J. -Y., Genestie, C. Ovarian cancer: A heterogeneous disease. Pathobiology. 85 (1-2), 41-49 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fallop T p OrganoidleriFare T m r ModeliOrganoid K lt rGenetik M hendisli iCRISPR Cas9 DelesyonuLentiviral A r EkspresyonBa kl k Sistemi Etkile imiOvarian Bursa Enjeksiyonu

İlgili makaleler