Xenotransplantasyonda akut hücresel ve antikor aracılı reddi incelemek için üç kişilik iş akışına sahip standartlaştırılmış bir fare modeli

Özet

Bu çalışma, akut hücresel reddi ve akut antikor aracılı reddi için iki standart fare ksenotransplantasyon modeli oluşturmaktadır. Bu modeller, ksenograft immün reddetme mekanizmalarının araştırılması, immünosupresif stratejilerin değerlendirilmesi ve preklinik ksenotransplantasyon araştırmalarının ilerletilmesi için güvenilir bir platform olarak hizmet vermektedir.

Özet

Ksenotransplantasyondaki son gelişmelere rağmen, akut reddetme klinik uygulamasının önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Akut hücresel reddetme (ACR) ve akut antikor aracılı reddetme (AMR), ksenograft alıcılarında erken greft başarısızlığına yol açan birincil bağışıklık yanıtlarıdır. İnsan olmayan primatlar ve genetik olarak değiştirilmiş domuzlar gibi büyük hayvan modelleri değerli bilgiler sağlamış olsa da, kullanımları yüksek maliyetler, etik kısıtlamalar ve önemli deneysel değişkenlik nedeniyle sınırlıdır. Küçük hayvan modelleri, bağışıklık reddetme üzerine mekanik çalışmalar için pratik ve tekrarlanabilir bir alternatif sunar. Bu çalışmada, özellikle ACR ve AMR taklit etmek için iki standart fare ksenotransplantasyon modeli geliştirildi. Tekrarlanabilirliği sağlamak ve operatörle ilgili değişkenliği en aza indirmek için, montaj hattı iş akışına sahip yapılandırılmış üç kişilik cerrahi protokol uygulandı; bu protokol, yüksek verimlilik ve kaliteyle tutarlı model üretimini mümkün kıldı. Ortaya çıkan modeller, klinik ksenograft reddinin temel immünopatik özelliklerini çoğaltmakla kalmıyor, aynı zamanda bağışıklık mekanizmalarını araştırmak ve hedefe yönelik immünosupresif stratejileri değerlendirmek için sağlam bir platform sunuyor. Bu modeller, ksenotransplantasyon tedavilerinin preklinik gelişimini hızlandırmaya yardımcı olacaktır.

Giriş

Ksenotransplantasyon, nakil için donör organ eksikliğini gidermek için en umut vadeden stratejilerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Son yıllarda, genetik düzenleme teknolojileri, bağışıklık düzenleme stratejileri ve biyomedikal mühendislikteki hızlı gelişmeler bu alanda önemli ilerlemelere yol^{açmıştır 1}. Son üç yılda, dünya çapında birçok araştırma ekibi insanlarda xenotransplantasyonla ilgili klinik denemeler yürütmüştür; bunlar arasında Maryland Üniversitesi'nde genetik olarak değiştirilmiş domuz kalbi nakli vakası, Massachusetts General Hospital'da domuz böbreği nakli denemesi ve New York^{Üniversitesi'nde} 2,3,4,5 timoböbrek nakli denemesi bulunmaktadır . Bu eşi benzeri görülmemiş gelişmelere rağmen, bağışıklık reddedilme ksenotransplantasyonun klinik uygulamasını sınırlayan birincil zorluk olmaya devam etmektedir. Yüksek optimize edilmiş genetik olarak modifiye donör organlar ve birleşik immünosupresif rejimler olsa bile, reddetme büyük bir engel olmaya devam ediyor. Mevcut çalışmalar, akut reddetmenin ksenotransplantasyonda kritik bir engel olduğunu ve öncelikle akut hücresel reddetme (ACR) ve akut antikor aracılı reddetme (AMR) olarak sınıflandırıldığını göstermektedir. ACR öncelikle T hücreleri tarafından aracılık edilir ve grefte yoğun T hücresi sızmasıyla karakterize edilir; bu da doku hasarına ve fonksiyonel bozulmaya yol açar. Altta yatan mekanizmaları arasında ksenojenik antijen sunumu, T-hücre aktivasyonu ve inflamatuar^{sitokinlerin salınımı yer alır 6,7}. Buna karşılık, AMR önceden oluşturulmuş veya yeni üretilen donör-spesifik antikorlarla yönlendirilir. Bu antikorlar greft içindeki endotel hücrelerine bağlanır, komplement aktivasyonunu ve güçlü bir bağışıklık yanıtını tetikler; bu da nihayetinde mikrovasküler hasar, tromboz ve greft yetmezliğine^{yol açar 8,9,10}. Bu nedenle, bu reddetme mekanizmalarının daha derinlemesine anlaşılması ve daha hassas immünoregülasyon stratejilerinin geliştirilmesi, ksenotransplantasyonun preklinik araştırmalardan uzun vadeli klinik uygulamaya ilerlemesi için gereklidir.

Ksenotransplantasyonda akut reddetme sorununu ele almak için, temel araştırmalara ve preklinik çalışmalara geri dönmek ve altta yatan immünolojik mekanizmaları aydınlatmak gereklidir. Büyük hayvan modelleri, özellikle insan dışı primatlar (NHP) ve genetik olarak değiştirilmiş domuzlar, insanlara yakın anatomik ve fizyolojik benzerlikleri nedeniyle xenotransplantasyon araştırmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bu modeller, bağışıklık reddetme mekanizmaları ve immünomodülatör stratejiler hakkında kritik içgörüler sağlar. Ancak, uygulamaları yüksek maliyetler, etik kaygılar ve uzun vadeli ameliyat sonrası bakımın karmaşıklığı nedeniyle önemli ölçüde kısıtlanmaktadır. Ayrıca, bireysel NHP'ler arasındaki bağışıklık yanıtlarındaki önemli değişkenlik, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğini^etkiler 11,12,13. Büyük hayvan modelleri klinik çeviri için vazgeçilmez olsa da, deneysel fizibilite ve tutarlılıktaki sınırlamaları, daha maliyet etkin, ölçeklenebilir ve mekanik olarak uygun küçük hayvan modellerine acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır.

Bu zorluklar göz önüne alındığında, küçük hayvan modelleri düşük maliyetleri, kısa deneysel döngüleri ve büyük ölçekli uygulama kolaylığı nedeniyle xenotransplantasyon araştırmalarında giderek daha fazla önem kazanmıştır. Bu modeller, bağışıklık reddetme mekanizmalarını araştırmak için temel bir platform sağlamakla kalmaz, aynı zamanda in vitro çalışmalar ile büyük hayvan deneyleri arasında kritik bir köprü rolünü de sunarak, immünoregulasyon stratejilerinin daha hassas bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır. Bu çalışmada, özellikle ACR ve AMR'yi taklit eden iki standart fare ksenotransplantasyon modeli oluşturuldu. Tekrarlanabilirlik ve tutarlılığı sağlamak için, standart üç kişilik cerrahi protokol ve model üretiminde sade, montaj hattı yaklaşımı uygulandı. Bu standartlaştırılmış iş akışı, operatöre bağlı değişkenliği en aza indirir ve son derece uniform kalp nakli modelleri ortaya çıkarır. Bu iyileştirmeler, mekanik araştırmalar ve yeni immünosupresif stratejilerin değerlendirilmesi için güvenilir bir platform sağlar. Bu protokol, özellikle ksenotransplantasyon bağışıklık mekanizmaları ve immünosupresif stratejilerin değerlendirilmesi üzerine küçük hayvan çalışmaları yapan araştırmacılar için uygundur. Düşük maliyet, yüksek tekrarlanabilirlik ve standart bir iş akışı gibi avantajlar sunar; böylece sonraki büyük hayvan ve preklinik çalışmalar için güvenilir bir deneysel temel sağlar.

Protokol

Bu protokol, her üye sırasıyla donör kalp toplama, alıcı hazırlığı ve donör kalp anastomozundan sorumlu olmak üzere üç kişilik bir ekip tarafından gerçekleştirilebilir. Tüm işlem 10 dakika içinde tamamlanır ve hızlı, yüksek verimlilikli ve standart bir model üretimi mümkün olur.

Bu çalışmadaki hayvan deneyleri, Çin Tıp Bilimleri Akademisi Fuwai Hastanesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (Onay No. 0108-1-70-ZX(X)-41). Tüm işlemler, ilgili standartlara uyum sağlamak için hayvan refahı yönetmelikleri ve etik yönergelere sıkı şekilde uyarak gerçekleştirilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Manşet hazırlığı
   1. Nakil ameliyatı için manşetleri yapmak için poliimid tüpleri kullanın. Arteriyel manşet için, iç çapı 0,3–0,5 mm olan poliimid boru seçin ve stereomikroskop altında (10×–20× büyütme ile 2 mm segmentlere bölünür.
   2. Her segmentin kelepçe kesitini çevresinden kısmen ikiye keserek sap benzeri bir uzantı oluşturun. Venöz manşet için, iç çapı 0,4–0,7 mm olan poliimid boru seçin ve 3 mm segmentlere kesin. Benzer şekilde, kelepçe kesitini kısmen çevresinden ikiye bölüp sap benzeri bir uzantı oluşturun.
      NOT: Manşetleri %75 etanolde 30 dakika bekletin, ardından normal salinle iyice durulayın.
2. Fare hazırlığı: 10–12 günlük yenidoğan Sprague-Dawley (SD) farelerini donör olarak kullanarak, alıcı olarak 7–8 haftalık C57BL/6 veya Balb/c farelerini kullanın. Doğru bakımı sağlamak ve stresi en aza indirmek için, anne sıçanla birlikte yenidoğan donör fareleri taşın. Tüm hayvanları belirli bir patojensiz (SPF) ortamda barındırın.

2. Donör kalp hasadı

1. Fiksasyon ve anestezi
   1. Neonatal sıçanları intraperitoneal 30 μL/g tribromoetanol enjeksiyonu ile anestezi yapın (Jitianbio, JT0781) (kurumsal onaylı protokollere göre).
   2. Tamamen anestezi edildikten sonra, fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve stereomikroskop altında sabitleyin. Torakoabdominal bölgeyi povidon-iyotla ıslatılmış pamuk toplarıyla dezenfekte edin.
      NOT: Tribromoetanolu havalandırmalı bir alanda eldiven ve göz koruyucu ile kullanın; Cilt temasından ve solumaktan kaçının.
2. Heparinizasyon
   1. Torakoabdominal bölgeyi povidon-iyotla ıslatılmış pamuk toplarıyla dezenfekte edin. Bağırsakları hafifçe kenara çekerek alt vena cava'yı ortaya çıkarmak için pamuk çubuğu kullanın.
   2. İnsülin şırıngası kullanarak inferior vena kavaya hepparinli tuzlu su (0,2–0,5 mL) enjekte edin, ardından kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesini pamuk topuyla nazikçe sıkıştırın.
      NOT: Heparinli salin hazırlanırken veya enjekte edilirken eldiven ve göz koruyucu takın; Şırıngaları keskin atık olarak at. Heparinizlenmiş salin hazırlanarak 100 mL normal salin içinde bir şişe tıbbi derecede sodyum heparin (125 mg) eritilebilir.
3. Kalp krizi
   1. Diyaframı kesin, göğüs duvarını iki taraflı kesin ve kalbi tamamen açığa çıkarmak için geri çekin. Timusu çıkarın. Basıncı azaltmak için superior vena kava kesilir ve Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonundan 1 mL perfüze ederek kalp durmasını tetikler.
   2. Perfüzyona devam edin, kalp kırmızıdan solguna dönene kadar. Aynı zamanda, kalbin üzerine buz gibi tuzlu suyla ıslatılmış bir gazlı bez döşeği yerleştirerek sıcaklığını düşürür ve susuzluğu önler.
      NOT: Steril gazlı bezi 1 cm × 1 cm ölçülerinde parçalara kesin ve kullanmadan önce buz gibi tuzlu suda önceden islatın.
4. Donör kalbinin hasadı
   1. Üst ve alt vena kava 8–0 ipek dikişle bağlanır, ardından kesin. Aort kemperinde aort kesin ve ikiye bölünen akciğer arterini kesin.
   2. Son olarak, tüm akciğer damarları 8-0 ile bağlanın donör kalbi ipek dikiş ve çıkar. Toplanan kalbi geçici olarak buz gibi tuzlu suda saklayıp koruma için.

3. Alıcı hazırlığı

1. Anestezi
   1. Alıcı fareyi aynı yöntemle anestezi yapın ve stabilizasyon için sırtüstü pozisyona yerleştirin.
2. Dezenfeksiyon
   1. Boyun bölgesindeki tüyleri depilasyon kremi ile çıkarın, ardından povidon-iyot ile cilt dezenfeksiyonu alın.
3. Deri kesisi
   1. Boynun orta hattının yaklaşık 1 cm sağında oftalmik makasla 2 cm boyuna bir kesi yapın. Deri altı yağ ve kas katmanlarını kademeli olarak çıkarmak için küt diseksiyon yapın ve submandibular bezi çıkarın.
      NOT: Submandibular bez çıkarılırken, bazal kan damarları 8–0 ipek dikiş ile bağlanmalı veya kanamayı önlemek için elektrokoter kalem ile yakılmalıdır.
4. Dış juguler ven hazırlığı
   1. Dış juguler ven açığa çıktıktan sonra, dalları düşük pıhtılaşma moduna (5–10 W) ayarlanmış elektrokooter kalemi ile tek tek koterize edin. İkinci sıra, 8-0 ligasyon için damarın distal ucuna yakın ipek dikişler.
   2. Dış juguler veni iki ligatür arasında kesmek için mikrocerrahi makas kullanın. Dış juguler ven manşetinden girin, manşeti damarın tabanına itin ve damar kelepçesiyle sabitleyin.
   3. Bağları mikrocerrahi makasla çıkarın ve hepparinizlenmiş salin kullanarak damar içindeki kalıntı kanı boşaltın. Dış juguler ven manşetin üzerine mikrocerrahi forseps ile geçirildi ve 8-0 ile düzeltildi. İpek dikiş.
      NOT: Elektrokoter kalemini dikkatlice kullanın ve yanıklardan kaçınmaya özen gösterin. Dış juguler venin birden fazla kolu vardır ve bunlar kanama en aza indirilmesi için dikkatlice izole edilip kapatılmalıdır.
5. Karotis arter hazırlığı
   1. Karotis kılıfı bulmak için sternokleidomastoid kasın arkasından küt diseksiyon yapın. Karotis kılıfını açın ve ortak karotis arteri iç juguler ven ve vagus sinirinden dikkatlice ayırın.
   2. Arteri damar gibi bağlayın ve kesin. Kesilmiş arterin alt ucunu arteriyal manşetten geçirin, gerin ve yerinde sabitleyin.
      NOT: Karotis arteri, iç juguler ven ve vagus siniri karotis kılıfının içinde kapalıdır. Kılıfı açarken, vagus sinirine zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Karotis arteri, dış juguler venden daha küçük çapa sahiptir ancak daha elastiktir, bu da dönmeyi venin vermesine göre daha zorlaştırır.

4. Donör kalp anastomozu

1. Aorta-karotis arter anastomozu
   1. Donör kalbi kesildikten sonra, hemen alıcı farenin boynuna yerleştirin. 8-0 kullanın Donor aortanın etrafında bir halka oluşturmak için gevşek bir düğümlü ipek dikiş.
   2. Donör aortayı, alıcının karotis arterindeki arterial manşetin üzerinden geçirin ve 8-0 ile sabitleyin. ipek bağlayıcı.
      NOT: Aortayı sabitlerken, ligasyon bölgesi ile alıcının kanı arasında doğrudan temas oluşmasını önlemek için dikiş karotis arter ligasyon hattının üstüne bağlanmalıdır.
2. Pulmoner arterden dış juguler ven anastomozu
   1. 8-0 kullanın donor akciğer arterinin etrafında bir halka oluşturmak için gevşek bir düğümlü ipek dikiş. Akciğer arteri, alıcının dış juguler venindeki venöz manşetin üzerine geçirin ve 8-0 ile sabitleyin ipek bağlayıcı.
3. Kardiyak yeniden başlama
   1. Alıcının karotis arteri ve dış juguller ven üzerindeki damar kelepçelerini serbest bırakarak kan akışını yeniden sağlayabilirsiniz. Donör kalbin güçlü kasılmalara devam ettiğini ve 10 saniye içinde hızla kırmızıya döndüğünü gözlemleyin.
4. Kesiyin kapanması
   1. Donör kalp stabil bir ritme geldiğinde, pozisyonunu ayarlayın ve alıcının boynundaki deri kesisini 4-0 dikişle kapatın. Cerrahi bölgeyi povidon-iyot ile dezenfekte edin.

5. Ameliyat sonrası bakım

1. Postoperatif analjezi
   1. Cilt kapanışını tamamladıktan sonra ağrı gidermek için lokal olarak lidokain jeli uygulayın. Farede belirgin ağrı belirtileri varsa , intraperitoneal enjeksiyon yoluyla meloksikam (2 mg/kg) uygulanır.
      NOT: Meloksikam, %10 DMSO ve %90 mısır yağında çözünür ve enjeksiyon hacmi gerekli doza göre hesaplanır.
2. İyileşme
   1. Fareyi vücut sıcaklığını korumak için 37–38 °C sıcaklıkta tutulan sıcak yumuşak bir pedin üzerine koyun ve bilinç kazanana kadar izleyin. Tamamen uyandığında, fareyi yeterli yiyecek ve suya erişimi olan bir kafese tek tek yerleştirin.
3. İzleme
   1. Nakil edilen kalbi her gün görsel inceleme ve palpasyon ile izleyerek atışını ve genel greft canlılığını değerlendirin.
      NOT: Tüm işlemleri uygun PPE ile gerçekleştirin ve kurumsal biyogüvenlik ile hayvan bakım düzenlemelerine uyun. Deney sırasında oluşan tüm kimyasal kalıntılar, perfüzasyonlar ve hayvan dokuları kurumsal düzenlemelere uygun olarak toplanıp bertaraf edilmelidir. Tribromoetanol veya heparin içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak muamele edilmeli, hayvan dokuları ve kan kaynaklı malzemeler ise biyolojik atık olarak ele alınmalı, otoklavlama ile sterilize edilmeli veya sertifikalı tesislerde bertaraf edilmelidir.

Sonuçlar

Şekil 1, fare ksenotransplantasyon modeli oluşturmak için standartlaştırılmış üç kişilik iş akışını göstermektedir. Bu sistemde, üç operatör paralel olarak çalışır ve her biri belirlenmiş bir görevi defalarca yerine getirir: alıcı hazırlığı, donör kalp alımı veya donör kalp anastomozu. Bu iş bölümü, her 10 dakikada bir tam bir nakil modelinin tamamlanmasına olanak tanır. Tek bir operatör bir modeli yaklaşık 30 dakikada tamamlayabilirken, üç kişilik iş akışı ...

Tartışma

Mouse xenotransplantasyonu, operatörden yüksek düzeyde teknik yeterlilik ve tutarlılık gerektiren son derece invaziv bir prosedürdür. Model kurulumunda, operatör deneysel sonuçlar üzerinde önemli bir etkiye^{sahiptir 14,15}. Tek kişilik iş akışında, prosedürün karmaşıklığı ve uzunluğu modelin yaklaşık 30 dakikalık çalışma süresine yol açar ve bu da düşük verimlilik sağlar. Ayrıca, anatomik diseksiyon, damar kullanımı ve anastomotik ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-CD3 antikoru	Abcam	ab16669
Anti-CD68 antikoru	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Epilasyon kremi	Veet	-
Elektrokoter kalemi	Yuyan Instrument	-
Floresan ikincil antikorlar	Thermofisher	A-11008
HE boyama kiti	Beyotime	C0105S
Buz yapıcı	Shjingmi	IMS-20
Insülin şırıngaları	KDL	U-40
Lidocain jel	Tide Pharm
Meloksikam	Sigma-Aldrich	444800
Mikrocerrahi forseps	ZHENHAO	FS217
Mikrocerrahi iğne tutucu	BIOFIVEN	HH01231
Mikrocerrahi makas	ZHENHAO	FS237
Normal salin	Kelun Pharmaceutical	-
Poliimid boru	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	İç çap: 0.3-0.5 mm
Poliimid boru	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	İç çap: 0.4-0.7 mm
Povidon-iyot çözeltisi	INOHV	-
Sodyum hepar	Qianhong bio-pharma	-
Stereomikroskop	Murzider	MSD204
Cerrahi sütürler	Jinhuan Medical	8-0 ve 4-0 ipek sütürler
Cerrahi ısıtma pedi	Hani Pet	-
Tribromoetanol	Jitianbio	JT0781
Wisconsin Üniversitesi çözeltisi	Belzer	-
Vasküler klempler	RWD Life	R31005-10