Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Beyaz ve Kahverengi Yağ Greftleri: Siyah ve Ten Rengi Brachyury (BTBR) Obez Farelerde Üreme, Metabolik ve Böbrek Eksikliklerini Düzeltmeye Yönelik Bir Yaklaşım

1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68759

⸱

9 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, diyabetik ve obez BTBR farelerinde böbrek fonksiyonlarını iyileştirirken kısırlığı, obeziteyi ve hiperglisemiyi tersine çevirmek için umut verici bir strateji sunan beyaz ve kahverengi bir yağ dokusu nakli protokolü sunuyoruz.

Özet

Beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT) transplantasyonu, eksojen ajanların sürekli uygulanmasına gerek kalmadan metabolik bozuklukları tersine çevirmek için umut verici bir terapötik strateji olarak ortaya çıkmıştır. WAT, enerji homeostazında yer alan önemli bir endokrin organ olarak işlev görürken, BAT termoregülasyon için kritik olan termojenik bir dokudur. Siyah ve Ten Rengi Brachyuric (BTBR) obez fare modeli, hiperglisemi, insülin direnci, hipometabolizma ve kısırlık dahil olmak üzere obezite, tip 2 diabetes mellitus (T2DM) ve diyabetik böbrek hastalığının (DKD) temel özelliklerini yakından taklit eder.

Aşağıda sunulan protokolü kullanarak, BTBR vahşi tip ve heterozigot donörlerden türetilen WAT ve BAT'ın BTBR obez alıcılara kombine transplantasyonu, kısırlığın tersine çevrilmesi, kilo alımının zayıflaması, glisemik kontrolün normalleşmesi ve böbrek parametrelerinin iyileşmesi ile sonuçlandı. Özellikle, böbrek hipertrofisi ve apoptoz azalırken, podosit sayıları korundu. Bu bulgular, kombine WAT ve BAT transplantasyonunun, DKD ve obeziteyi azaltmada eşzamanlı faydaları olan T2DM tedavisi için alternatif bir terapötik stratejiyi temsil edebileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, bu yaklaşım, vivaryum kolonileri içindeki canlı BTBR obez farelerin sayısını artırmaya yardımcı olabilir. Altta yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması, bu müdahalenin klinik çevirisini kolaylaştırabilir.

Giriş

Diyabetik böbrek hastalığı (DKD), tip 2 diabetes mellitus (T2DM) ve obezite, önemli ve büyüyen küresel sağlık sorunları oluşturan birbiriyle ilişkili, çok faktörlü durumları temsil eder. Böbrek hasarının tanımlanabilir diğer nedenlerinin yokluğunda diabetes mellitus (DM) ve kronik böbrek hastalığının bir arada bulunması olarak tanımlanan DKD, DM 1,2'li bireylerin yaklaşık %20-40'ını etkilemektedir. T2DM, kronik hiperglisemi ve glukoz, lipid ve insülin homeostazında bozulmalar ile karakterize sistemik bir metabolik hastalıktır. Dünya çapında önde gelen on ölüm nedeni arasında yer alıyor ve şu anda 500 milyondan fazla kişiyi etkiliyor3. Enerji alımı ve harcaması arasındaki kronik dengesizlikten kaynaklanan obezite, şu anda dünya çapında her sekiz kişiden birini etkilemekte ve hem morbidite hem de mortaliteye önemli bir katkıda bulunmaktadır4. Bu üç koşul birbiriyle sıkı sıkıya bağlantılıdır: obezite, T2DM gelişme riskini önemli ölçüde artırır ve bu da DKD 1,4 riskini önemli ölçüde artırır. Obezite, T2DM ve DKD'nin artan küresel prevalansı, bunların patofizyolojik mekanizmalarının daha derinlemesine anlaşılmasına ve etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine olan acil ihtiyacın altını çizmektedir.

BAT transplantasyonu, obezite ve T2DM ile mücadelede umut verici bir terapötik strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bu müdahale, vücut ağırlığında azalma, insülin direncinde ve hepatik steatozda iyileşmeler ve dolaşımdaki adiponektin, β3-adrenerjik reseptör ekspresyonu ve yağ asidi oksidasyonunda yer alan genlerde artışlarla ilişkilendirilmiştir5. Not etmek gerekirse, memeli yağ dokusu renge göre üç ana tipte sınıflandırılabilir: beyaz, kahverengi ve bej6. WAT doğumdan kısa bir süre sonra genişlemeye başlar ve vücutta yaygın olarak dağılır. Dolaşımdaki glikoz ve serbest yağ asitlerini tutarak fazla enerjiyi trigliserit formunda depolayan önemli bir endokrin organ olarak işlev görür6. Buna karşılık BAT, enerjiyi ATP6 olarak depolamak yerine titremeyen termojenez yoluyla ısı olarak dağıtarak termoregülasyonda kritik bir rol oynar. BAT aktivitesi yaş, obezite ve DM ile azalır. Yetişkinlerde BAT, toplam yağ dokusunun küçük bir kısmını oluşturur ve insanlarda esas olarak supraklaviküler ve servikal bölgelerde bulunurken, farelerde ağırlıklı olarak interskapular bölgedebulunur 6. Mitokondri açısından zengin olan BAT, önemli miktarda glikoz ve yağ asidi tüketir ve kilo alımına karşı dirençle ilişkilidir7. Ortaya çıkan kanıtlar, BAT'ın daha yalın ve metabolik olarak daha uygun bir fenotipi teşvik etmedeki rolünü desteklemekte ve transplantasyon yoluyla terapötik kullanımına artan bir ilgi yaratmaktadır.

Öncelikle WAT tarafından salgılanan bir hormon olan leptin, enerji dengesinin, metabolizmanın ve doğurganlığın düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar8. Hipotalamusta gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) salgılanmasını uyarmak için merkezi sinir sistemine etki eder, bu da daha sonra ön hipofizden luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) salınımını teşvik eder9. Leptin ayrıca foliküler gelişimi desteklemek için doğrudan yumurtalık teka ve granüloza hücrelerine etki eder9.

Genetik olarak BTBR olarak adlandırılan BTBRob/ob (BTBR obez) fare modeli. Cg-Lep ob/WiscJ (siyah ve ten rengi, obez, püsküllü; Malzeme Tablosuna bakınız), leptin geninde (Lep) spontan fonksiyon kaybı için homozigottur ve hiperglisemi, glukoz intoleransı, hiperinsülinemi, hipertrigliseridemi, bozulmuş yara iyileşmesi, hipometabolizma, hipotermi ve hipogonadotropik hipogonadizme bağlı kısırlık dahil olmak üzere bir dizi metabolik ve üreme anormalliği gösterir. Erkekler tipik olarak altı haftalıkken T2DM geliştirirken, dişiler bunu sekiz haftalıkken10. Hiperglisemi şiddetli ve ilerleyicidir, açlık kan şekeri seviyeleri on haftaya kadar 400 mg/dL'yi aşar. Ek olarak, BTBR obez erkekler sekizinci haftaya kadar zamana bağlı albüminüri sergiler ve mezanjiyal genişleme ve podositüri dahil olmak üzere histolojik olarak belirgin DKD'ye ilerler. Bu özellikler, BTBR obez fareleri, insan DKD10'u yakından özetleyen sağlam bir klinik öncesi model olarak ortaya koymaktadır.

Leptin eksikliğinin derin metabolik sonuçları göz önüne alındığında, ob /ob fenotipini tersine çevirmek için leptin replasman tedavisi ve yağ dokusu nakli dahil olmak üzere çeşitli stratejiler araştırılmıştır. Çoğu çalışma, C57BL/6 arka planında ob/ob fareleri kullanmış olsa da, nispeten azı metabolik olarak daha tehlikeye atılmış BTBR suşunda bu müdahaleleri araştırmıştır. C57BL / 6 ob / ob farelerinde, WAT transplantasyonunun insülin seviyelerini normalleştirdiği, insülin duyarlılığını iyileştirdiği ve doğurganlığı geri kazandırdığı gösterilmiştir8. Ayrıca, yağsız C57BL/6 farelerine BAT transplantasyonunun, özellikle yüksek yağlı diyete bağlı obezite bağlamında insülin direncini azaltırken vücut ağırlığı artışını önlediği, glikoz toleransını ve insülin duyarlılığını iyileştirdiği gösterilmiştir11. Ek olarak, BAT transplantasyonunun kardiyak hemodinamiği ve metabolik sağlığı iyileştirdiği gösterilmiştir12. Cesaret verici sonuçlara rağmen, bu çalışmalar birkaç önemli sınırlama sunmaktadır. Araştırmaların çoğu, daha ciddi şekilde etkilenen BTBR ob /ob suşuna kıyasla nispeten hafif bir metabolik fenotip sergileyen C57BL/6 ob/ob farelerinde yapılmıştır. Sonuç olarak, bu bulguların daha belirgin insülin direnci, hiperglisemi, obezite ve böbrek hastalığı olan modellere genellenebilirliği sınırlıdır. Ayrıca, leptin replasmanı ve yağ dokusu transplantasyonunun etkileri, literatürde kritik bir boşluğu temsil eden BTBR arka planında yeterince çalışılmamıştır. Bu müdahalelerin çoğu, insan metabolik hastalığının karmaşıklığını ve kronik doğasını yeterince yakalayamayabilecek zayıf hayvanlarda veya kısa süreler boyunca da değerlendirilmiştir. İnsülin duyarlılığı, glukoz toleransı ve doğurganlıkta iyileşmeler bildirilmiş olmasına rağmen, altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve bu bulguların klinik ortamlarla translasyonel ilişkisi hala belirsizdir. Özellikle, BTBR ob/ob farelerinde beyaz ve kahverengi yağ dokusu transplantasyonunun kombine metabolik etkileri büyük ölçüde keşfedilmemiştir.

Bu çalışmanın amacı, BTBR obez farelerde kombine WAT ve BAT transplantasyonu için bir protokolü standartlaştırmak ve doğurganlık restorasyonu, böbrek fonksiyonu ve histolojik değişiklikler üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. İkincil bir amaç, vivaryumdaki heterozigot (BTBR ob/+) ve vahşi tip (BTBR +/+) farelerin kaybını azaltırken BTBR obez kolonisinin genişlemesini kolaylaştırmaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler, Israelita Albert Einstein Hastanesi'nin (HIAE) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı ve Yahudi Araştırma ve Eğitim Enstitüsü, São Paulo, SP, Brezilya'ya (N°. 3309-18 ve N°. 4900-21) kaydedildi. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

NOT: BTBR obez fareler (leptin gen nakavt, homozigot, ob/ob) T2DM, DKD ve obezite için bir model olarak kullanıldı. 4-5 haftalık dişi BTBR obez fareler, yağ dokusu nakli için alıcı olarak görev yaptı. Donör hayvanlar dişi BTBR ob/+ (heterozigot) veya +/+ (vahşi tip) farelerdi (genotip doğrulanmadı, ancak fenotipik olarak zayıf). Nakil sırasında, alıcı farelerin ortalama vücut ağırlığı 25 ila 32 g arasında değişiyordu. Tüm hayvanlar, standart koşullar altında, yiyecek ve suya ad libitum erişim, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ve ortam sıcaklığı kontrolü ile ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde barındırıldı. Kafes başına en fazla beş hayvan barındırıldı.

1. Cerrahi prosedür

  1. Donör farelere% 100 v / v izofluran doz aşımı (% 2.5-5) ve ardından servikal çıkık kullanarak ötenazi yapın (Şekil 1A).
  2. Hayvanı sırt yasağına (göbek yukarı) yerleştirin ve alt karnını %0,5 alkollü klorheksidin diglukonat ile dezenfekte edin. Kasık WAT'ı çıkarmak için 2-3 cm'lik orta hat karın kesisi yapın (Şekil 1B). Eksize edilen dokuyu buz üzerinde 3 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Hayvanı ventral yaslanmada (göbek aşağı) yeniden konumlandırın ve interskapular BAT'ı hasat etmek için kürek kemikleri arasında 1-2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın (Şekil 1C). 10-14 donörden alınan yağ dokusunu havuzlayın. Toplam WAT + BAT'ın alıcının vücut ağırlığının %10-15'ine eşit olduğundan emin olun.
  4. WAT ve BAT'ı 16 G'lik bir iğne ve 3 mL'lik bir şırınga kullanarak ayrı ayrı homojenize edin (Şekil 1D).
  5. Analitik bir terazi kullanarak nihai yağ ağırlığını ölçün (Şekil 1E) ve numuneleri transplantasyona kadar buz üzerinde tutun.
  6. Alıcı BTBR obez fareleri %100 v/v izofluran odasında (%2.5-5 indüksiyon) uyuşturun ve yüz maskesi (%1.5-2.5) ile anesteziyi sürdürün. Solunum her 3 saniyede bir ≤1 nefese düştüğünde, hayvanı ventral yaslanmaya yerleştirin (Şekil 1F).
  7. Sırt bölgesini% 2.0 alkolsüz klorheksidin diglukonat kullanarak dezenfekte edin (Şekil 1G).
  8. Sırt yüzeyindeki 6-26 bölgeye 16 G'lik bir iğne kullanarak bölge başına 100-200 μL homojenize yağ enjekte edin. Dağıtıma yardımcı olması için forseps kullanın. Transplantasyon sonrası her enjeksiyon bölgesine% 0.5 klorheksidin çözeltisi uygulayın (Şekil 1H).
  9. İyileşme sırasında yaralanmayı önlemek için analjezi ve ev hayvanları için ayrı ayrı kas içi tramadol dozu (40 mg / kg; 50 mg / mL çözelti) uygulayın.
  10. Ertesi gün, enjeksiyon bölgelerini% 0.5 klorheksidin çözeltisi ile temizleyin ve ikinci bir tramadol dozu uygulayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Yağ nakli prosedürünün şeması. (A) Kapalı bir kutuda izofluran kullanılarak donör ötenazisi. (B) Kasık WAT'ının toplanması. (C) İnterskapular BAT'ın hasadı. (D) Yağ homojenizasyonu. (E) Yağ tartım. (F) Alıcı anestezisi. (G) Sırt asepsisi. (H) Forseps yardımlı teknikle yağ enjeksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Nakil sonrası çiftleşme

  1. Transplantasyondan iki hafta sonra, çiftleşme için dişi BTBR obez fareleri erkek BTBR ob/+ (heterozigot) farelerle birlikte barındırın.

3. İşlevsel değerlendirmeler

  1. Analitik bir terazi kullanarak vücut ağırlığını haftalık olarak ölçün.
  2. Açlık kan şekerini beş zaman noktasında bir şeker ölçer kullanarak değerlendirin: 4-7, 8-10, 14-16, 18-20 ve 24-26. haftalar.
  3. İdrar örneği almak için hayvanı 6 saat boyunca suya erişimi olan metabolik bir kafese koyun.
  4. İdrar albümin düzeylerini ELISA yöntemini kullanarak ölçün ve 6-8 haftada kolorimetrik pikrik asit yöntemini kullanarak idrar kreatinin düzeylerini belirleyin. Albümin konsantrasyonunu (μg) kreatinin konsantrasyonuna (mg) bölerek idrar albümin-kreatinin oranını (uACR) hesaplayın.

4. Morfolojik analiz

  1. Alıcı farelere 24 haftalıkken %100 v/v izofluran doz aşımı (%2,5-5) uygulayarak ötenazi uygulayın ve ardından ölümü sağlamak için servikal çıkık uygulayın.
  2. Yumurtalıkları, böbrekleri ve pankreası 24 haftalıkken toplayın.
  3. Hasat edilen organları %10 nötr tamponlu formaline yerleştirin ve oda sıcaklığında 24-48 saat sabitleyin.
  4. Fiksasyonun ardından, suyu çıkarmak için otomatik bir doku işlemcisi kullanarak dokuları işleyin ve histolojik analiz için parafine gömün.
    1. Dokuları sırayla her biri 1 saat boyunca aşağıdaki etanol çözeltilerine daldırın:% 70,% 85,% 95 (2x) ve% 100 (2x).
    2. Mendilleri 1 saat boyunca taze ksilene aktarın, ardından 1 saat daha ikinci bir ksilen banyosu yapın.
    3. Mendilleri 6 °C'de 1 saat erimiş parafin mumuna batırın, ardından 1 saat daha taze parafine aktarın.
    4. Dokuları erimiş parafinle doldurulmuş ısıtılmış bir kalıba yönlendirin ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
    5. Bir mikrotom kullanarak her bloktan ardışık olmayan dört adet 3,5 μm kalınlığında kesit kesin. Şeritleri düzleştirmek için 4 °C'lik bir su banyosunda yüzdürün, ardından ayrı bölümleri pozitif yüklü cam slaytlara monte edin. Fazla suyu boşaltın ve slaytları 60 dakika boyunca 3 °C'lik bir ısıtma plakasına yerleştirin.
  5. Hematoxylin ve Eosin (H&E) boyama kullanarak yumurtalıklardaki folikül sayısını ve pankreas adacık boyutunu değerlendirin.
    1. Parafine gömülü doku slaytlarını 6 °C'de bir fırında 1 saat inkübe edin. Slaytları taze ksilen içeren bir kaba aktarın ve parafini çözmek için 30 dakika inkübe edin, 15 dakika sonra ksileni taze bir çözelti ile değiştirin.
    2. Slaytları sırayla 30 saniye boyunca ksilen:etanol karışımına,% 100 etanol,% 85 etanol ve% 70 etanole daldırın.
    3. Musluk suyunda durulayın (10 s), Harris hematoksilin ile boyayın (30 s) ve %95 etanole (3 s) batırın.
    4. Slaytları sırayla her biri 30 saniye boyunca %70, %85, %100 etanol ve ksilen:etanol karışımına batırın.
    5. Slaytları 5 dakika taze ksilene batırın, ardından lekenin sabitlenmesini sağlamak için 5 dakika daha ikinci bir ksilen banyosu yapın.
    6. Bir montaj ortamı kullanarak lameller ile kızakları monte edin.
  6. Böbrek bölümlerinin Periyodik Asit-Schiff (PAS) boyamasını kullanarak glomerüler boyutu ve mezanjiyal matris genişlemesini değerlendirin.
    1. Slaytları 6 °C'de 1 saat inkübe edin ve doku bölümlerini deparafinize etmek için 5 dakika taze ksilene daldırın.
    2. Slaytları her biri 30 saniye boyunca sırayla %99, %95 ve %70 etanole daldırın.
    3. Musluk suyunda 10 saniye durulayın.
    4. 10 damla periyodik asit uygulayın ve 10 dakika inkübe edin.
    5. Akan suda 3 dakika durulayın ve kurulayın.
    6. 10 damla Schiff reaktifi ekleyin ve karanlık bir odada 15 dakika inkübe edin.
    7. Akan suda 3 dakika durulayın ve kurulayın.
    8. Karşı boyamaya 10 damla Harris hematoksilen ekleyin ve 3 dakika inkübe edin.
    9. Slaytları akan suda 3 dakika durulayın ve kurulayın.
    10. Slaytları her biri 30 saniye boyunca sırayla% 70,% 85,% 100 etanol ve ksilen:etanol karışımına daldırın.
    11. Slaytları 5 dakika taze ksilene batırın, ardından lekeyi düzeltmek için 5 dakika daha ikinci bir ksilen banyosu yapın.
    12. Bir montaj ortamı kullanarak lameller ile kızakları monte edin.
  7. Yumurtalıklarda ve böbreklerde foliküler apoptozu (bölünmüş kaspaz-3) ve böbreklerde podosit sayısını (WT-1+ hücreleri) İmmünohistokimya (IHC) ile değerlendirin.
    1. Slaytları 6 °C'de 1 saat inkübe edin, ardından 30 dakika ksilen tedavisi uygulayın (15 dakika sonra ksileni değiştirin).
    2. Slaytları sırayla %100, %90 ve %70 etanol ve suya (her biri 30 s) daldırın.
    3. Antijen bölgelerinin maskesini düşürmek için bir mikrodalga kullanarak slaytları sitrat tamponunda (pH 6.0) 95 °C'de 12 dakika ısıtarak antijen alımını gerçekleştirin.
    4. 1x yıkama tamponunda 15 dakika durulayın, tamponu her 5 dakikada bir değiştirin.
    5. Arka plan lekelenmesini önlemek ve sığır serum albümini (BSA) kullanarak spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için endojen peroksidazı hidrojen peroksit ile bloke edin.
      NOT: Bölünmüş kaspaz-3 boyaması için, endojen peroksidaz aktivitesini 7 dakika 30 saniye boyunca bloke edin; WT-1 boyama için 5 dakika bloke edin.
    6. Yıkamayı 4.7.4'teki gibi tekrarlayın.
    7. Bölünmüş kaspaz-3 (apoptoz) ve WT-1'e (podositler) karşı 10 μL birincil antikor uygulayın. Karanlık, nemlendirilmiş bir odada gece boyunca °C'de inkübe edin.
    8. Yıkamayı 4.7.4'teki gibi tekrarlayın.
    9. Karanlıkta oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca 10 μL Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikor uygulayın.
    10. Yıkamayı 4.7.4'teki gibi tekrarlayın.
    11. HRP aktivitesini görselleştirmek için kromojen olarak 10 μL DAB (3,3'-Diaminobenzidin) uygulayın ve kahverengi bir çökelti oluşturun.
      NOT: Bölünmüş kaspaz-3 boyaması için, DAB ile 1 dakika 30 saniye inkübe edin; WT-1 boyama için 45 saniye inkübe edin.
    12. Yıkamayı 4.7.4'teki gibi tekrarlayın.
    13. İstenilen yoğunluğa bağlı olarak 30 saniye ila 1 dakika boyunca Harris hematoksilen ile karşı boya bölümleri.
    14. Musluk suyunda 1-2 dakika veya su berraklaşana kadar durulayın.
    15. Slaytları sırayla %70, %85, %95 ve %100 etanol (her biri 30 s) ve ksilen:etanol karışımına (30 s) daldırın.
    16. Slaytları 5 dakika taze ksilen çözeltisine yerleştirin ve 5 dakika daha ikinci bir ksilen banyosuna aktarın.
    17. Bir montaj ortamı kullanarak lameller ile kızakları monte edin.
  8. 40x büyütmede ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak lekeli kesitleri analiz edin. Her organ için ilgi alanlarını (ROI'ler) seçmek için otomatik görüntü analiz yazılımı kullanın.
    1. Yumurtalıklar (H&E): Bölüm başına folikül tiplerini sayın ve sınıflandırın.
    2. Pankreas (H&E): Her pankreas adacığının ana hatlarını manuel olarak izlemek için ROI aracını kullanarak adacıkları seçin. ROI tanımlandıktan sonra, yazılım alanı otomatik olarak mikrometre kare (μm2) cinsinden hesaplayacaktır.
    3. Böbrek (H&E): Her glomerüler tutamın dış kenarını manuel olarak izlemek için ROI aracını seçerek glomerüler alanı ölçün. Alanını μm2 cinsinden elde etmek için Alanı Ölç işlevini kullanın. İzlemeden sonra, yazılım alanı μm2 cinsinden otomatik olarak hesaplayacaktır.
    4. Böbrekler (PAS)
      1. Mezanjiyal matrisi ölçmek için, glomerulus içindeki PAS pozitif (macenta/pembe) bölgeleri tanımlamak ve seçmek için Eşik aracını kullanın. Seçimi iyileştirmek için önizleme penceresini kullanarak PAS lekeli alanları doğru bir şekilde seçmek için renk ve yoğunluk eşiklerini gerektiği gibi ayarlayın. Seçili PAS bölgesini ROI olarak tanımlayın. İzlemeden sonra, yazılım alanı μm2 cinsinden otomatik olarak hesaplayacaktır.
      2. Toplam glomerüler alana göre PAS pozitif alan yüzdesini hesaplayarak mezanjiyal matriks genişlemesini normalleştirin.
    5. Yumurtalıklar ve böbrekler (bölünmüş kaspaz-3 için IHC)
      1. Foliküler veya glomerüler yapılara karşılık gelen ROI'leri seçin. Ton, doygunluk ve yoğunluk eşiklerini ayarlayarak DAB pozitif (kahverengi) lekelenmeyi tanımlamak için bir renk maskesi uygulayın. DAB sinyalinin doğru seçilmesini sağlamak için önizleme işlevini kullanın ve hematoksilen (mavi) karşı boyamayı ve spesifik olmayan arka planı hariç tutmak için eşik ayarlarını iyileştirin.
      2. İstenen eşik tanımlandıktan sonra, seçimi bir ROI olarak ayarlayın ve DAB pozitif alanı (μm2) ölçün. DAB pozitif alanı toplam ROI alanına bölerek ve 100 ile çarparak lekeli alan yüzdesini hesaplayın.
    6. Böbrekler (WT-1+ için IHC): Podosit sayısını tahmin etmek için glomerül başına kahverengi lekeli çekirdekleri sayın.
      NOT: Bölüm başına folikül sayıları (ortalama ± SD): BTBR obez (7.7 ± 3.11), Nakledilen (5.8 ± 3.24), BTBR yağsız (4.6 ± 5.62). Bölüm başına adacık sayıları (ortalama ± SD): BTBR obez (18.3 ± 8.42), Transplante (9.7 ± 5.45), BTBR zayıf (6.8 ± 1.72). Glomerüler alan ve mezanjiyal matriks genişleme ölçümü için hayvan başına 30 glomerül değerlendirin. Veriler, uygun olduğu şekilde ortalama ± standart sapma (SD) veya ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edildi. Normallik Shapiro-Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. Normal dağılım gösteren gruplar arasında karşılaştırma yapmak için Tukey'in post hoc testi ile tek yönlü ANOVA uygulandı. Tekrarlanan ölçümler, gerektiğinde Geisser-Greenhouse düzeltmesi ile iki yönlü ANOVA veya karışık etki modelleri kullanılarak analiz edildi. Normal dağılım göstermeyen veriler için Sidak'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanıldı. Tüm analizleri, istatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak ayarlanmış uygun bir istatistiksel yazılım kullanarak gerçekleştirin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nakledilen yağ miktarı ve protokol etkinliği
Protokol standardizasyonundan sonra, iki yağ nakli hacmi (donörün vücut ağırlığına göre %5-9,9 ve %10-15) etkinlik açısından değerlendirildi ve en az bir hamileliğin yaşayabilir yavrularla sonuçlanması olarak tanımlandı. %5-9,9'luk grup %23,8'lik bir başarı oranı sergilerken, %10-15'lik grup %52,2'lik bir başarı oranı elde ederek protokol etkinliğinde 2,2 kat artışa karşılık geldi (Şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, kombine WAT ve BAT transplantasyonunun, klinik öncesi bir T2DM, DKD ve obezite modelinde hiperglisemiyi kontrol etmek, vücut ağırlığı artışını ve adacık hücresi hipertrofisini önlemek, kadın subfertilitesini geri kazanmak ve apoptozu azaltarak ve podosit sayılarını koruyarak böbrek fonksiyonunu iyileştirmek için etkili bir terapötik yaklaşım olduğunu göstermektedir.

Önceki çalışmalar, glikoz homeostazını ve insülin duyarlılığını11...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Deneysel ve Cerrahi Eğitim Merkezi (CETEC) ve Yahudi Araştırma ve Eğitim Enstitüsü'nün (IIEP) teknik ekiplerine destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CAPES'ten (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Yüksek Öğrenim Personelinin İyileştirilmesi için Koordinasyon) S.B'ye bir yüksek lisans araştırma bursu hibesi, CAPES'ten (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Yüksek Öğrenim Personelinin İyileştirilmesi için Koordinasyon) MLF'ye Doğrudan Doktora araştırma bursu hibesi ile desteklenmiştir. FAPESP'den (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Araştırma Vakfı; no. 2024/08173-6) M.O.M.'a yüksek lisans araştırma bursu hibesi ve FAPESP'den (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Araştırma Vakfı; no. 2019/12636-3) M.T.A.B-R.'ye bilimsel başlangıç bursu hibesi. Bu çalışma aynı zamanda FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Araştırma Vakfı; no. 2017/23195-2 ve no. 2021/02216-7) ve EFSD'den (Avrupa Diyabet Araştırmaları Vakfı) É.B.R.'ye verilen hibelerle de desteklenmiştir. Yazarlar, bu makalede Yapay Zeka (AI) tarafından üretilen çalışmaları kullanmadıklarını beyan ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,5 alkollü klorheksidin diglukonat çözeltisiRioquí MikaSKU 1068253
16 kalibre iğneBecton DickinsonSKU 305198
%2,0 alkolsüz klorheksidin diglyukonat çözeltisiRioquí MikaSKU 1113045
3 mL şırıngaBecton DickinsonSKU 309657
Accu-Check şeritleri & ndash; PerformaRocheEAN 4015630981960
Alcian Mavi PAS KitiEasyPathSKU EP-11-20019
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA4612
CellSens yazılımıOlympusCELLENS
Sitrat Tamponu pH 6.0: Sitrik asit monohidrat + Sodyum hidroksitSigma-AldrichC1909 + 28-3010
Kesilmiş Kaspaz-3 antikorHücre Sinyal Teknolojisi9661
Cobas C 111 analizörüRoche4528778001
Kreatinin KLabtest96-300
EnVision FLEX DAB+ ChromogenAgilent-DakoK3468
EnVision FLEX / HRP algılama reaktifiAgilent-DakoSM802
Envision FLEX Peroksidaz Bloke ReaktifiAgilent-DakoSM801
EnVision FLEX Substrat TamponuAgilent-DakoSM803
EnVision FLEX 20 kez buffer olduAgilent-DakoK800721-2
EosinAgilent-DakoCS701
GloMax Discover Microplate ReaderPromegaGM3000
Glukometre Accu-Check - PerformaRocheEAN 4015630980512
GraphPad Prism 8 yazılımı (istatistiksel yazılım)Dotmatics tarafından GraphPad-
%100 V/V İzoforin (İzofluran)Cristá lia-
HematoksilinAgilent-DakoCS700
IX51 ışık mikroskobuOlympusIX51
Tek fare için metabolik kafesTecniplast3600M021
Montaj ortamı - EntellanSigma-Aldrich100869
Fare Albümini ELISA KitiAbcamAb207620
Fare süzü: BTBR. Cg-Lepob/WiscJJAX Laboratuvarları4824
Periyodik Asit Schiff (PAS) KitiEasyPathEP-11-20014
RM255 MikrotomLeica Biosystems14050237960
TP1020 Doku işlemciLeica BiosystemsTP-1020
Tramadol 50 mg/mLGrü Nenthal4022444
WT-1 antikoruSanta CruzSC-192

Kaynaklar

  1. Zhao, M., Cao, Y., Ma, L. New insights in the treatment of DKD: recent advances and future prospects. BMC Nephrol. 26 (1), 72(2025).
  2. van Raalte, D. H., et al. Combination therapy for kidney disease in people with diabetes mellitus. Nat Rev Nephrol. 20 (7), 433-446 (2024).
  3. Xu, M., et al. Trends and future predictions of chronic kidney disease due to diabetes mellitus type 2 attributable to dietary risks: insights based on GBD 2021 data. Front Nutr. 11, 1494383(2024).
  4. GBD 2021 Adult BMI Collaborators. Adult BMI Collaborators. Global, regional, and national prevalence of adult overweight and obesity, 1990-2021, with forecasts to 2050: a forecasting study for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 405 (10481), 813-838 (2025).
  5. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  6. Ghesmati, Z., et al. An update on the secretory functions of brown, white, and beige adipose tissue: Towards therapeutic applications. Rev Endocr Metab Disord. 25 (2), 279-308 (2024).
  7. Dewal, R. S., et al. Transplantation of committed pre-adipocytes from brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis. iScience. 27 (2), 108927(2024).
  8. Klebanov, S., Astle, C. M., DeSimone, O., Ablamunits, V., Harrison, D. E. Adipose tissue transplantation protects ob/ob mice from obesity, normalizes insulin sensitivity and restores fertility. J Endocrinol. 186 (1), 203-211 (2005).
  9. Childs, G. V., Odle, A. K., MacNicol, M. C., MacNicol, A. M. The importance of leptin to reproduction. Endocrinology. 162 (2), 1-18 (2021).
  10. Hudkins, K. L., et al. BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 21 (9), 1533-1542 (2010).
  11. Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123 (1), 215-223 (2013).
  12. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released Lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  13. Valgas da Silva, P. C., et al. Brown adipose tissue prevents glucose intolerance and cardiac remodeling in high-fat-fed mice after a mild myocardial infarction. Int J Obes (Lond). 46 (2), 350-358 (2022).
  14. Zhang, Y., et al. Brown adipose tissue transplantation ameliorates diabetic nephropathy through the miR-30b pathway by targeting Runx1. Metabolism. 125, 154916(2021).
  15. Clee, S. M., Nadler, S. T., Attie, A. D. Genetic and genomic studies of the BTBR ob/ob mouse model of type 2 diabetes. Am J Ther. 12 (6), 491-498 (2005).
  16. Stoehr, J. P., et al. Identification of major quantitative trait loci controlling body weight variation in ob/ob mice. Diabetes. 53 (1), 245-249 (2004).
  17. Liu, X., Zhang, Z., Song, Y., Xie, H., Dong, M. An update on brown adipose tissue and obesity intervention: Function, regulation and therapeutic implications. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1065263(2022).
  18. Mollah, M. L., Yang, H. S., Jeon, S., Kim, K., Cheon, Y. P. Overaccumulation of fat caused rapid reproductive senescence but not loss of ovarian reserve in ob/ob mice. J Endocr Soc. 5 (1), bvaa168(2021).
  19. Serke, H., et al. Leptin-deficient (ob/ob) mouse ovaries show fatty degeneration, enhanced apoptosis and decreased expression of steroidogenic acute regulatory enzyme. Int J Obes (Lond). 36 (8), 1047-1053 (2012).
  20. Diamanti-Kandarakis, E., Dunaif, A. Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited: an update on mechanisms and implications. Endocr Rev. 33 (6), 981-1030 (2012).
  21. Chang, A. S., Dale, A. N., Moley, K. H. Maternal diabetes adversely affects preovulatory oocyte maturation, development, and granulosa cell apoptosis. Endocrinology. 146 (5), 2445-2453 (2005).
  22. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  23. Beyerstedt, S., et al. Combining sodium-glucose co-transporter-2 inhibitor with mesenchymal stem cells and brown adipose tissue (BAT) and white adipose tissue (WAT) transplantation to mitigate the progression of diabetic kidney disease: a pre-clinical approach. Stem Cell Res Ther. 16 (254), 1-15 (2025).
  24. Sávio-Silva, C., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells in a pre-clinical model of diabetic kidney disease and obesity. Int J Mol Sci. 22 (4), 1546(2021).
  25. Takemura, S., Shimizu, T., Oka, M., Sekiya, S., Babazono, T. Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cell sheets directly into the kidney suppresses the progression of renal injury in a diabetic nephropathy rat model. J Diabetes Investig. 11 (3), 545-553 (2020).
  26. Pichaiwong, W., et al. Reversibility of structural and functional damage in a model of advanced diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 24 (7), 1088-1102 (2013).
  27. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  28. O'Brien, P. D., et al. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analysis. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  29. Sávio-Silva, C., et al. Mesenchymal stem cell therapy for diabetic kidney disease: A review of the studies using syngeneic, autologous, allogenic, and xenogenic cells. Stem Cells Int. 2020, 8833725(2020).
  30. Morsy, M. A., et al. Leptin gene therapy and daily protein administration: a comparative study in the ob/ob mouse. Gene Ther. 5 (1), 8-18 (1998).
  31. Wang, Y., Asakawa, A., Inui, A., Kosai, K. Leptin gene therapy in the fight against diabetes. Expert Opin Biol Ther. 10 (10), 1405-1414 (2010).
  32. Blüher, S., Shah, S., Mantzoros, C. S. Leptin deficiency: clinical implications and opportunities for therapeutic interventions. J Investig Med. 57 (7), 784-788 (2009).
  33. Paz-Filho, G., Mastronardi, C. A., Licinio, J. Leptin treatment: facts and expectations. Metabolism. 64 (1), 146-156 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Adipoz Doku TransplantasyonuKahverengi Adipoz DokuBeyaz Adipoz DokuMetabolik DisfonksiyonReprodüktif EksikliklerRenal DisfonksiyonAçlık Kan ŞekeriOvaryan ApoptozFoliküler Genesis
Beyaz ve Kahverengi Yağ Greftleri: Siyah ve Ten Rengi Brachyury (BTBR) Obez Farelerde Üreme, Metabolik ve Böbrek Eksikliklerini Düzeltmeye Yönelik Bir Yaklaşım
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.