Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Mavi Tilki Safrasındaki Tauroursodeoksikolik Asidin Farelerde Akut Alkolle İlişkili Karaciğer Hasarı Üzerine Etkisi ve Mekanizması

738 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68763

⸱

17 Ekim 2025

 ,  , 
1School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, mavi tilki safrasının farelerde alkole bağlı karaciğer hasarı üzerindeki hepatoprotektif etkilerini değerlendirdi. TUDCA, UDCA, bilirubin ve TCDCA içeren mavi tilki safrası, karaciğer hasarı belirteçlerini azalttı ve AGE-RAGE yolu, AKT1 ve PPARG yoluyla hareket ederek anti-inflamatuar ve antioksidan özellikler gösterdi.

Özet

Ayı safrası gibi hayvan safrası, terapötik faydaları nedeniyle geleneksel tıpta uzun süredir kullanılmaktadır. Ayı safrasına benzeyen mavi tilki safrasının, bazı geleneksel uygulamalarda hepatoprotektif özelliklere sahip olduğuna inanılmaktadır. Bu çalışma, mavi tilki safrasının farelerde alkole bağlı karaciğer hasarı üzerindeki bileşenlerini ve etkilerini inceledi. Safra, 30 mavi tilkiden toplandı ve kurutulmuş toz haline getirildi. Mavi tilki safrasının kimyasal bileşimi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak analiz edildi. Alkolle ilişkili karaciğer hasarıyla ilişkili potansiyel biyoaktif bileşikleri, hedefleri ve yolları belirlemek için ağ farmakolojisi kullanıldı. Düşük ve yüksek dozlarda mavi tilki safra tozu uygulanan Kunming fareleri kullanılarak alkolle ilişkili karaciğer hasarının bir fare modeli oluşturuldu. Serum alanin aminotransferaz, aspartat aminotransferaz ve total kolesterol düzeyleri ölçüldü. Karaciğer dokuları hematoksilen ve eozin boyama ve malondialdehit testi ile değerlendirildi. Aktif bileşikler ve çekirdek hedefler arasındaki bağlanma afinitesini tahmin etmek için moleküler yerleştirme yapıldı. Mavi tilki safrasının tauroursodeoksikolik asit (TUDCA), ursodeoksikolik asit, bilirubin ve taurokenodeoksikolik asit içerdiği bulundu. Histopatolojik analiz, mavi tilki safra tozunun oral yoldan uygulanmasını takiben ana organlarda önemli bir anormallik veya toksik etki ortaya çıkarmadı. Mavi tilki safrasının temel hedefleri arasında AKT1, PPARG, IGF1, MMP9 ve CASP3 proteini yer alıyordu. Mavi tilki safrası tedavisi, alkole bağlı karaciğer hasarı olan fare modellerinde serum ALT, AST, kolesterol ve MDA düzeylerini azalttı. Ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme, mavi tilki safrasının hepatoprotektif etkilerinin, ileri glikasyon son ürün sinyal yolu için ileri glikasyon son ürün reseptörü ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Genel olarak, ayı safrasına benzer TUDCA içeriğine sahip mavi tilki safrası, AKT1 ve PPARG gibi proteinleri hedef alarak alkolle ilişkili karaciğer hasarının tedavisinde potansiyel antiinflamatuar ve antioksidan etkiler göstermektedir.

Giriş

Alkolle ilişkili karaciğer hastalığı (ALD), asemptomatik laboratuvar anormalliklerinden sirozlu ilerlemiş karaciğer hastalığına ve en şiddetli formunda çoklu organ yetmezliğinin eşlik ettiği yaşamı tehdit eden son dönem karaciğer hastalığına kadar değişen bir karaciğer yaralanması spektrumunu kapsar1. Alkolle ilişkili yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere ALD prevalansı, ALD1'in nispeten hafif ve potansiyel olarak geri dönüşümlü bir formunu temsil eder. Alkolle ilişkili hepatit, asemptomatik steatohepatitten akut sarılık ile ortaya çıkan ve kısa süreli mortalitesi yüksek karaciğer yetmezliğine ilerleyebilen akut alkolik hepatite kadar değişen klinik tabloları olan inflamasyon ile karakterizedir1. Alkol ve metabolitleri, lipid metabolizmasını değiştirir ve mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyonunun inhibisyonu ve lipogenezin uyarılması dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar yoluyla lipid birikimini (yağlanma) teşvik eder2. Etanol, transferrin reseptörü 1'in ekspresyonunu yukarı regüle eder, böylece hepatik demir alımını2 arttırır. Hem alkol hem de asetaldehit, hepatositlere doğrudan zarar vererek oksidatif stresin artmasına, s-adenosilmetiyonin rejenerasyonunun inhibisyonuna, hasarla ilişkili moleküler modellerin (DAMPS) salınmasına, portal dolaşımda bakteriyel endotoksinlere maruz kalmaya ve protein eklentilerinin oluşumuna yol açabilir2. ALD'nin yönetimi, ilgili çok sayıda patojenik yol nedeniyle zor olmaya devam etmektedir3. Araştırılan gelecekteki stratejiler arasında ampirik probiyotikler, büyüme faktörleri, antioksidanlar, inflamasyonla ilişkili faktörleri hedef alan monoklonal antikorlar ve teknolojiyle geliştirilmiş davranışsal müdahaleler yer alıyor. Bununla birlikte, ek kapsamlı terapötik stratejiler keşfedilmeyi beklemektedir.

Ortaya çıkan kanıtlar, hayvan safrasının, anti-inflamatuar ve antioksidan özellikleri nedeniyle alkolle ilişkili karaciğer hastalığının (ALD) tedavisinde terapötik potansiyele sahip olabileceğini düşündürmektedir 4,5. Hayvan safrası, geleneksel Çin tıbbının (TCM) önemli bir bileşenidir6. TCM'de hayvan safrası, karaciğer ve safra kesesi fonksiyonunu güçlendirmek ve ağrı, ateş, öksürük ve iltihabı hafifletmek için kullanılır. Siroz da dahil olmak üzere karaciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılmıştır6. Hayvan safrası, anti-inflamatuar ve antioksidan özelliklere sahiptir6 ve inflamasyon ve oksidatif stres, ALD7'nin patogenezinde merkezi rol oynar. Safra asidi takviyesinin de hepatik steatozu iyileştirdiği bildirilmiştir8. Şu anda, ayı safrası, ana aktif bileşenleriolarak ursodeoksikolik asit (UDCA) ve taurokolik asit (TUDCA) ile en yaygın kullanılan safra türevi ilaçtır 6,9. Özellikle TUDCA, koyun,, tavuk ve yılan gibi diğer hayvanların safrasında bulunmaz6. TUDCA, akut karaciğer hasarının tedavisinde terapötik potansiyel göstermiştir10. Şu anda, TUDCA, ayı safrası drenajı (hayvan refahı endişelerini artıran), kimyasal sentez (maliyetlidir) veya tavuk safrası tozunun bir ayı safrası eşdeğerine (otantik ayı safrasına eşdeğer olmayan) biyotransformasyonu yoluyla elde edilmektedir11,12. Kutup tilkisi olarak da bilinen mavi tilki (Alopex lagopus), öncelikle kürkü için esaret altında yetiştirilir. Çin, dünyanın en büyük üç kürk giysi ihracatçısından biridir ve hasat edilen mavi tilkilerin iç organları tipik olarak atılır13. Bu, safra kesesini potansiyel bir tıbbi kaynak olarak değerlendirmek için bir fırsat sunar. Mavi tilkiler ve ayılar etoburdur, sindirim fizyolojisi, metabolizma ve beslenme açısından benzerlikler paylaşırlar, bu da safra bileşimlerinin ve etkilerinin de benzer olabileceğini düşündürür. Ancak bu olasılık henüz araştırılmamıştır.

Bu nedenle, bu çalışma mavi tilki safrasının farmakolojik etkilerini ve altta yatan mekanizmaları ALD modellerinde incelemeyi amaçlamıştır. Bulgular, ayı safrası ikamelerinin geliştirilmesi için yeni araştırma yolları sağlayabilir, mavi tilki safra kesesinin tıbbi bir kaynak olarak kullanılması için bilimsel bir temel oluşturabilir, endüstriyel atıkları değerli ürünlere dönüştürebilir ve gelecekteki terapötik gelişmelere bilgi sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma protokolü, Heilongjiang Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (onay #2023021101). Tüm hayvan deneyleri, ARRIVE yönergelerine (Hayvan Araştırmaları: İn Vivo Deneylerin Raporlanması) kılavuzlarına ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin ilgili ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma hayvan deneylerini içerdiğinden, bilgilendirilmiş onam geçerli değildi. Tüm hayvan yetiştirme ve kürk hasadı prosedürleri, Yabani Hayvan Yetiştiriciliğinin Yönetimine İlişkin Çin Teknik Yönetmeliklerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır. Çalışma, Çin'deki Heilongjiang Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylandı (onay #2023021101).

Mavi tilki safrası numune hazırlama
Mavi tilki safrasının kaynağı Malzeme Tablosunda verilmiştir. Toplam 30 mavi tilkiye (Vulpes lagopus) elektrik şoku ile ötenazi uygulandı, ardından kürk hasadı ve safra kesesi toplandı. Mavi tilki safra kesesi oval şekillidir, üst kısmı dar, alt kısmı şişmiştir. Dış yüzeyi görünür kıvrımlarla koyu kahverengidir ve kapsül zarı incedir. Safra, 1 mL'lik steril tek kullanımlık bir şırınga kullanılarak hemen aspire edildi ve koyu siyah veya koyu yeşil renkte göründü. Safra keseleri daha sonra kurutulmuş mavi tilki safrası tozu elde etmek için 37 °C'de 48 saat kurutuldu (Şekil 1). Elde edilen safra tozu, parlak, gevrek bir dokuya sahip sarı-kahverengi bir renk tonu sergiledi. Safra kesesi başına ortalama kurutulmuş safra tozu verimi yaklaşık 0.82 ± 0.30 g idi. Numune hazırlama için, mavi tilkiden (yukarıda tarif edildiği gibi) veya ayıdan ( Malzeme Tablosuna bakınız) elde edilen 250 mg kurutulmuş safra tozu, 1 mL %70 kromatografi dereceli metanol içinde çözüldü. Çözelti ultrasonik olarak sonikasyona tabi tutuldu (40 kHz, 300 W), 0.22 μm'lik bir zardan süzüldü, 50 mL'lik bir nihai hacme (yani 5 mg / mL'ye) seyreltildi ve sonraki analiz için 0.5 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltildi. Genel deneysel iş akışı Ek Şekil 1'de özetlenmiştir.

Bu çalışmada, hayvan deneyleri için kullanılan mavi tilki safrası tozunun dozaj aralığı, önceki toksisite değerlendirmelerine ve farmakolojik çalışmalara dayanarak 5-10 g/kg idi ve bu konsantrasyonlarda önemli bir yan etki gözlenmedi14,15. Safra tozu hazırlama sırasında safra keseleri 37 °C'de 48 saat kurutuldu; Ancak kuruma süresi yerel neme ve numune hacmine bağlı olarak değişebilir, bu nedenle tam dehidrasyonu sağlamak için nem içeriği kontrol edilmelidir. Çözünme için, kromatografi dereceli metanolde 5 mg/mL'lik bir konsantrasyon, HPLC ve UPLC-Q-TOF-MS analizleri için optimaldi; Eksik çözünme veya partikül kalıntısı, ek sonikasyon veya filtrasyon gerektiren analitik doğruluğu etkileyebilir. Bilinen bir sınırlama, mavi tilkiler arasındaki mevsimsel, diyetsel ve bireysel fizyolojik farklılıklar nedeniyle safra bileşimindeki değişkenliktir ve bu, TUDCA ve UDCA16 gibi aktif bileşiklerin nispi bolluğunu etkileyebilir. Bu nedenle, tutarlı bileşen profilleri sağlamak için farmakolojik kullanımdan önce kromatografik profilleme ile parti doğrulaması önerilir.

Ağ farmakolojik analizi
Mavi tilki safrasının kimyasal bileşimi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometrisi (UPLC-Q-TOF-MS) ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak analiz edildi. HPLC, faz A olarak 0.03 M sodyum dihidrojen fosfat (fosforik asit kullanılarak pH 4.4'e ayarlanmıştır) ve faz B olarak metanolden (bkz. Algılama dalga boyu, 1,0 mL/dak mobil faz akış hızıyla 210 nm'ye ayarlandı ve kolon sıcaklığı 40 °C idi. Enjeksiyon hacmi 10 μL idi. UPLC-Q-TOF/MS analizi, bir UPLCTM HSS T3 kolonu kullanılarak gerçekleştirildi (bkz. Mobil faz, asetonitril (A)-%0.1 formik asit sulu çözeltisinden oluşuyordu (B; Malzeme Tablosuna bakınız). Gradyan elüsyon programı şu şekildeydi: 4 mL/dk akış hızında 0-25.0 dk, %98-%2 A ve 25.0-28.0 dk, %2-%2 A. Kolon sıcaklığı 35 °C'de tutuldu. Kütle spektrometrisi, aşağıdaki parametrelere sahip bir elektrosprey iyonizasyon kaynağı (ESI) kaynağı kullanılarak gerçekleştirildi: 650 L/h solvent gazı akış hızı, 350 °C solvent gazı sıcaklığı, 50 L/h koni gazı akış hızı, 120 °C iyon kaynağı sıcaklığı, 2,8 kV (pozitif iyon modu) ve 2,0 kV (negatif iyon modu), 25 V koni voltajı ve 6 eV çarpışma enerjisi. Spektrumlar, 0.02 sn'lik aralıklarla her 0.2 s'de bir toplandı. Lösin-enkefalin (bkz. [M+H]+=556.2771), 40 fmol/μL konsantrasyonda ve 15 μL/dak akış hızında referans kalibrasyon çözeltisi olarak kullanıldı17.

Kimyasal bileşim analizi ve hedef tahmini
Mavi tilki safrasının aktif bileşenleri, dahili standartlar18 olarak aurokolik asit ve sodyum tauroursodeoksikolat (bkz. Tanımlanan bileşiklerin yapısal formülleri PubChem veri tabanından (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) alınmıştır. Potansiyel biyoaktif hedefleri araştırmak için, mavi tilki safrasının aktif bileşenleri, ilişkili gen hedeflerini belirlemek için PharmMapper veri tabanında (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/) sorgulandı.

Alkolik karaciğer hasarı ve alkole bağlı karaciğer hasarı anahtar kelime olarak kullanılarak, hastalıkla ilişkili genler GeneCards (https://www.genecards.org/) ve OMIM (https://omim.org/) veri tabanlarından elde edildi. GeneCards veri tabanında hedefler, ≥ 20 olarak belirlenen bir eşik ile alaka düzeyi puanına göre tarandı. Yaygın olarak kullanılan bu ampirik kesme, duyarlılık ve özgüllük arasında bir denge sağlar, zayıf ilişkili veya gürültülü genleri filtrelerken (yüksek hassasiyet) potansiyel olarak ilgili genlerin çoğunu korur (yüksek hatırlama). Buna karşılık, güçlü genetik kanıtlara sahip hedefleri yakaladığı ve böylece GeneCard'ların hesaplamalı uygunluk puanlarını tamamladığı için OMIM veritabanında ek bir filtreleme uygulanmadı. Elde edilen hedef veriler, ALD ile ilgili hedefleri belirlemek için birleştirildi ve çoğaltıldı. Aktif bileşen hedefleri ve hastalık hedefleri, görselleştirme için Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) kullanılarak karşılaştırıldı. Kavşaklar, ALD'ye karşı mavi tilki safrasının potansiyel hedefleri olarak belirlendi ve STRING veri tabanına (http://version10.string-db.org/) aktarıldı. STRING veritabanında, etkileşim ağı varsayılan parametrelerle (orta güven puanı ≥ 0,4) oluşturuldu ve görselleştirme netliğini artırmak için serbest düğümler gizlendi. Cytoscape yazılımı (sürüm 3.9.1) kullanılarak görselleştirilen protein-protein etkileşimi (PPI) ağ diyagramını oluşturmak için serbest düğümler gizlendi. Derece değerlerini hesaplamak için topolojik analiz yapıldı ve en yüksek derece değerlerine sahip altı hedef, p < 0.05 anlamlılık eşiği ile Ek Açıklama, Görselleştirme ve Entegre Keşif Veritabanı (DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) kullanılarak belirlendi. Yol zenginleştirme analizi için Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) veri tabanı kullanıldı.

Moleküler yerleştirme
Çekirdek hedef proteinler ile mavi tilki safrasının biyoaktif bileşenleri arasındaki etkileşimleri değerlendirmek için moleküler yerleştirme yapıldı. Çekirdek hedef proteinlerin üç boyutlu yapıları, Yapısal Biyoinformatik Araştırma İşbirliği (RCSB) Protein Veri Bankası'ndan (https://www.rcsb.org/) alındı ve safra bileşenlerinin yapıları PubChem veri tabanından (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) elde edildi. Yerleştirme simülasyonları, Moleküler İşletim Ortamı (MOE) yazılımı (sürüm 2022.02) kullanılarak gerçekleştirildi. AKT1 için kristal yapı (PDB ID: 4EKL) indirildi ve MOE'deki ön işleme, su moleküllerinin ve orijinal ligandların uzaklaştırılmasını, fizyolojik pH'ta (7.0) protonasyon ile hidrojen ilavesini ve enerji minimizasyonunu içeriyordu. Ligand yapıları (TUDCA, UDCA, TCDCA, TCA ve bilirubin) PubChem'den alındı ve kenetlenmeden önce enerji en aza indirildi. Yerleştirme işlemi sırasında, çoklu ligand konformasyonları üretildi ve her bir konformasyon, çeşitli uzamsal yönlerde reseptörün bağlanma cebine yerleştirildi. Yerleştirme, ilk yerleştirme için London dG ve puanlama işlevi olarak Affinity dG ile Induced Fit protokolü kullanılarak gerçekleştirildi. Her ligand için otuz konformasyon üretildi ve son pozlar kuvvet alanı optimizasyonu ile rafine edildi. Diğer tüm parametreler, daha fazla ince ayar yapılmadan MOE varsayılanlarına ayarlandı. Her ligand konformasyonu ile reseptör arasındaki afinite, yazılımın puanlama işlevi kullanılarak değerlendirildi. Yerleştirme sonuçları, temsili bağlanma modu olarak seçilen en büyük kümedeki en negatif enerji konformasyonu ile serbest enerji bağlanarak değerlendirildi. Görselleştirme için en güçlü afiniteye ve optimal konformasyona sahip bağlama modu seçildi. -4,25 kcal/mol'ün altındaki afinite değerleri ligand-hedef bağlanmasını, -5,0 kcal/mol'ün altındaki değerler orta derecede bağlanmayı ve -7,0 kcal/mol'ün altındaki değerler güçlü bağlanma afinitesini gösterir 19.

ALD'nin fare modelleri
Bu çalışma için 30 adet spesifik patojen içermeyen (SPF) Kunming faresi (18-22 g, 6-8 haftalık, 15 erkek, 15 dişi) satın alındı. Hayvanlar, 25 ± 2 °C'de, %60 ± %10 bağıl nemde, yiyecek ve suya ad libitum erişimle kontrollü koşullar altında barındırıldı. Deneyden önce fareler 1 hafta boyunca alıştırıldı.

ALD modeli aşağıdaki gibi oluşturulmuştur. Hacimsel bir şişeye 70.21 mL susuz etanol ölçülerek ve 100 mL'lik nihai hacme ultra saf su eklenerek %70 v/v etanol çözeltisi hazırlandı. Çözelti manyetik bir karıştırıcı ile 1 dakika karıştırıldı ve faz ayrımı gözlenene kadar 5 dakika bekletildi. Gavaj dozu, art arda 7 gün boyunca günde bir kez uygulanan 2 mL/kg vücut ağırlığı idi. 7. günün sabahı, son gavajdan 4 saat sonra, daha ileri analiz için kan örnekleri ve karaciğer dokuları toplandı. Model oluşturma, karaciğer hasarının tipik göstergeleri değerlendirilerek doğrulandı. Serum alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST), total kolesterol (T-CHO) ve malondialdehit (MDA) düzeyleri ölçüldü. Ek olarak, karaciğer dokuları, hepatosit morfolojisi, sitoplazmik vakuolizasyon, nekroz ve inflamatuar hücre infiltrasyonunu değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması kullanılarak histopatolojik incelemeye tabi tutuldu. Fareler rastgele beş gruba ayrıldı (grup başına n=6): Boş kontrol grubuna 2 mL/kg damıtılmış su verildi; model grubu tedavi edilmeden 2 mL/kg %70 etanol aldı; pozitif kontrol grubuna 0.4 g/kg hepatoprotektif tabletler uygulandı ( bkz yüksek doz mavi tilki safra tozu grubuna 10 g/kg mavi tilki safra tozu; Düşük doz mavi tilki safra tozu grubuna 5 g/kg mavi tilki safrası tozu uygulandı. Boş kontrol dışındaki tüm gruplara, alkolik karaciğer hasarını indüklemek için art arda 7 gün boyunca günde bir kez oral olarak %70 etanol (2 mL/kg) uygulandı. Etanol uygulamasından 4 saat sonra 7. günde, ilgili tedaviler (hepatoprotektif tabletler veya mavi tilki safra tozu) verildi ve sonraki deneyler yapıldı. Boş kontrol grubuna deney boyunca damıtılmış su verildi.

Serum transaminazlarının (ALT ve AST) ve total kolesterol kitinin (T-CHO) ölçümü
Kan örnekleri, serum elde etmek için 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edildi. Numuneler analize kadar -20 °C'de saklandı. Üreticinin talimatlarına göre ALT, AST ve T-CHO seviyelerini ölçmek için ticari kitler kullanıldı ( Malzeme Tablosuna bakınız).

Vücut ağırlığı izleme
Art arda 7 gün etanol uygulamasından sonra, tedaviler 7. günde verildi ve sabah dozundan 4 saat sonra deneyler yapıldı. Gözlem süresi boyunca vücut ağırlığı günde 2 kez kaydedildi. Aç olmayan vücut ağırlığı, uygulamadan sonraki 1, 2, 3, 5, 7, 10 ve 14. günlerde elektronik analitik terazi kullanılarak ölçüldü.

Doku örneği işleme
Uygulama sonrası 14. günde vücut ağırlığı ve kalan gıda alımı kaydedildi. Hayvanlar daha sonra öğleden sonra suya ücretsiz erişimle oruç tuttu. Ertesi gün (12-16 saatlik bir açlık döneminden sonra), servikal çıkık ile ötenaziden önce açlık vücut ağırlığı ölçüldü. Kalp, karaciğer, dalak, akciğerler, böbrekler, adrenal bezler, beyin, mide, bağırsaklar, testisler, prostat, yumurtalıklar ve uterus dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere ana organlardaki morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için makroskopik patolojik incelemeler yapıldı. Kalp, karaciğer, dalak, akciğerler, böbrekler, mide ve bağırsaklardan doku örnekleri, boş kontrol grubundan (CN) ve düşük doz mavi tilki safra grubundan (LH) rastgele toplandı, %4 paraformaldehit ile sabitlendi, parafine gömüldü, kesitlendi ve histopatolojik değerlendirme için hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı. Doku kesitleri mikroskop altında incelendi ve görüntülendi.

H&E boyama
Karaciğer örnekleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4 paraformaldehit ile sabitlendi, parafine gömüldü ve kesitlere ayrıldı. Kesitler ksilen I ve II içinde deparafinize edildi, azalan etanol konsantrasyonlarında (%100, %95, %85 ve %75) yeniden sulandırıldı ve su ile yıkandı, farklılaştırıldı, tekrar yıkandı ve mavileştirme çözeltisi kullanılarak mavileştirildi. Durulamadan sonra, kesitler her biri 5 dakika boyunca% 85 ve% 95 etanol içinde kurutuldu, 5 dakika boyunca eozin ile boyandı ve susuz etanol I, II ve III (her biri 5 dakika) içinde dehidre edildi. Son olarak, kesitler ksilen I ve II'de (her biri 5 dakika) temizlendi ve nötr sakızla monte edildi. Görüntüler ışık mikroskobu (100x) kullanılarak elde edildi.

Karaciğer dokularında malondialdehit (MDA) tayini
Karaciğer örnekleri, bir doku öğütücü kullanılarak 9 hacim fizyolojik salin içinde homojenize edildi. Homojenat, 4 °C'de 10 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjlendi. MDA testi, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak süpernatan üzerinde gerçekleştirildi.

İstatistiksel analiz
Veriler, standart sapmalar (SD'ler) ± ortalamalar olarak sunulur. Grup karşılaştırmaları, varyans analizi (ANOVA) ve ardından en az anlamlı fark (LSD) post hoc testi kullanılarak yapıldı. İki taraflı p değerleri <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mavi tilki safrasındaki aktif bileşiklerin tanımlanması
Mavi tilkiler ve ayılar, benzer sindirim fizyolojisini ve metabolizmayı paylaşan etoburlardır20. Bu nedenle, safraları karşılaştırılabilir bileşimlere sahip olabilir. Yukarıda açıklanan kromatografik koşullar kullanılarak, her bileşik iyi bir şekilde ayrıldı (Şekil 2). Bu deneyde, mavi tilki safrasında TUDCA'yı tanımlamak için TUDCA standardı21'in alıkonma süresi kullan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

2018 Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) Alkol ve Sağlık Küresel Durum Raporu'na göre, Çin'de kişi başına alkol tüketimi 2005'te 4,1 L'den 2016'da 7,2 L'ye yükseldi ve bu da %76'lık bir artışı temsil ediyor. Kronik alkol tüketiminin neden olduğu ALD, karaciğere bağlı morbidite ve mortalitenin önemli bir etiyolojisi olmaya devam etmektedir22. Bo ve ark. farelerde karbon tetraklorür (CCl4) ile indüklenen bir karaciğer hasarı modeli oluşturdu ve mavi tilki safra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Gençlik Bilim Vakfı Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NO.82204562) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.03M Sodyum dihidrojen fosfatYOKYOKHPLC mobil faz A
Suda %0,1 Formik asitFisher Scientific, ABDYOKUPLC için mobil faz
0.22 μ M Membran FiltreYOKYOKNumune filtrasyonu
%4 ParaformaldehitYOKYOKDoku fiksasyonu
Asetonitril, Kromatografi SınıfıFisher Scientific, ABDYOKUPLC için mobil faz
ALT, AST, T-CHO kitleriShanghai Yuanye Biyoteknoloji Co., Ltd., ÇinYOKSerum biyokimyasal analizi
Analitik teraziYOKYOKHayvan ağırlığı ölçümü
aurokolik asitÇin Gıda ve İlaç Kontrol EnstitüsüYOKHPLC/MS için dahili standart
Ayı safra tozuÇin Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüsü, PekinYOKReferans materyali
BilirubinBelirtilmemişYOKSafrada tanımlanmış aktif bileşik
Mavi tilkiSuihua Tilki Çiftliği, Heilongjiang, ÇinYOKSafra kaynağı
Mavi tilki safra tozuKurum içi hazırlıkYOKBileşen analizi için numune
C18 HPLC kolonuAgilent Technologies, ABDZORBAX SB-C18 (4.6&kez; 150 mm, 5 μ m)HPLC ayırma
Hücre manzarasıhttps://cytoscape.org/Sürüm 3.9.1Ağ görselleştirme ve topolojik analiz
DEMİRELNIHhttps://david.ncifcrf.gov/GO/KEGG zenginleştirme analizi
Gen KartlarıWeizmann Enstitüsühttps://www.genecards.org/Hastalıkla ilişkili gen alımı
Hematoksilen ve Eozin (H& E)YOKYOKHistolojik boyama
HPLC sistemiAgilent Technologies, ABD1200 SonsuzlukSafranın bileşim analizi
Kunming fareleri (SPF, 18– 22g)Liaoning Changsheng Biyoteknoloji Co., Ltd.SCXK (Liao) 2020-0010Alkolik karaciğer hasarı modeli
Lösin-enkefalinSigma, Amerika Birleşik DevletleriYOKMS kalibrasyon standardı (40 fmol/μ L)
MDA algılama kitiShanghai Yuanye Biyoteknoloji Co., Ltd., ÇinYOKKaraciğer oksidatif stres ölçümü
Metanol, Kromatografi SınıfıFisher Scientific, ABDYOKNumune hazırlama için çözücü
MOEKimyasal Hesaplama GrubuMOE 2022.02Moleküler yerleştirme analizi
OMİMNIHhttps://omim.org/Hastalıkla ilişkili gen alımı
Optik mikroskopYOKYOKHistolojik gözlem
Eczacılık EşleyiciECUSThttp://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/Aktif bileşik hedeflerinin tahmini
Fosforik asitYOKYOKMobil fazın pH ayarı
PubChemNCBIhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/Bileşik yapı alımı
RCSB Protein Veri Bankasıhttps://www.pdbus.org/YOKProtein 3D yapı kaynağı
Soğutmalı santrifüjYOKYOKSerum ve doku ayrımı
Sodyum tauroursodeoksikolat (TUDCA)Çin Gıda ve İlaç Kontrol EnstitüsüYOKHPLC/MS için dahili standart
DİZGİEMBLhttp://version10.string-db.org/Protein-protein etkileşim analizi
UniProtEMBL-EBIhttps://www.uniprot.org/Hedef standardizasyonu
UPLC-Q-TOF-MS sistemiSular, ABDUPLC HSS T3 (100&kez; 2.1 mm, 1.8 μ m)Bileşen tanımlama
VennyCSIChttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmlHedef kavşak görselleştirmesi

Kaynaklar

  1. Thursz, M., et al. EASL Clinical Practice Guidelines: Management of alcohol-related liver disease. J Hepatol. 69 (1), 154-181 (2018).
  2. Sugimoto, K., Takei, Y. Pathogenesis of alcoholic liver disease. Hepatol Res. 47 (1), 70-79 (2017).
  3. Adekunle, A. D., Adejumo, A., Singal, A. K. Therapeutic targets in alcohol-associated liver disease: progress and challenges. Therap Adv Gastroenterol. 16, 17562848231170946(2023).
  4. Wang, Y., et al. bile powder prevents drunkenness and alcohol-induced liver injury in mice via the gut microbiota and metabolic modulation. Chin Med. 19 (1), 39(2024).
  5. Li, L., Liu, C., Mao, W., Tumen, B., Li, P. Taurochenodeoxycholic Acid Inhibited AP-1 Activation via Stimulating Glucocorticoid Receptor. Molecules. 24 (24), 4513(2019).
  6. Wang, D. Q., Carey, M. C. Therapeutic uses of animal biles in traditional Chinese medicine: an ethnopharmacological, biophysical chemical and medicinal review. World J Gastroenterol. 20 (29), 9952-9975 (2014).
  7. Yang, Y. M., Cho, Y. E., Hwang, S. Crosstalk between Oxidative Stress and Inflammatory Liver Injury in the Pathogenesis of Alcoholic Liver Disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 774(2022).
  8. Quintero, P., et al. Bile acid supplementation improves established liver steatosis in obese mice independently of glucagon-like peptide-1 secretion. J Physiol Biochem. 70 (3), 667-674 (2014).
  9. Feng, Y., et al. Bear bile: dilemma of traditional medicinal use and animal protection. J Ethnobiol Ethnomed. 5, 2(2009).
  10. Song, G., et al. Potential therapeutic action of tauroursodeoxycholic acid against cholestatic liver injury via hepatic Fxr/Nrf2 and CHOP-DR5-caspase-8 pathway. Clin Sci (Lond). 137 (7), 561-577 (2023).
  11. Li, J., et al. Pharmacological studies on the comparison between the drainage and certified Fel Ursi. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 16 (12), 749-763 (1991).
  12. Allegri, F. Respect, Inherent Value, Subjects-of-a-Life Some. Reflections on the Key Concepts of Tom Regan's Animal Ethics. Relations Beyond Anthropocentrism. 7, 1-2 (2020).
  13. Underwood, L. S., Reynolds, P. Photoperiod and fur lengths in the arctic fox (Alopex lagopus L). Int J Biometeorol. 24 (1), 39-48 (1980).
  14. Wu, L., et al. Toxicological evaluation of porcine bile powder in Kunming mice and Sprague-Dawley rats. Front Pharmacol. 15, 1424940(2024).
  15. Chen, D. X., et al. Therapeutic Effects of Different Animal Bile Powders on Lipid Metabolism Disorders and Their Composition Analysis. Chin J Integr Med. 28 (10), 918-923 (2022).
  16. Liu, J., et al. Effect of Dietary Supplementation with Calcium, Phosphorus and Vitamin D(3) on Growth Performance, Nutrient Digestibility, and Serum Biochemical Parameters of Growing Blue Foxes. Animals (Basel). 12 (14), 1814(2022).
  17. Desiderio, D. M., Dass, C. The Measurement of Leucine Enkephalin at the Femtomole Level by Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry/Mass Spectrometry Methods. Anal Lett. 19 (19-20), 1963-1971 (1986).
  18. Li, S., et al. Substitutes for Bear Bile for the Treatment of Liver Diseases: Research Progress and Future Perspective. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 4305074(2016).
  19. Ji, L., et al. Identification of bioactive compounds and potential mechanisms of Scutellariae Radix-Coptidis Rhizoma in the treatment of atherosclerosis by integrating network pharmacology and experimental validation. Biomed Pharmacother. 165, 115210(2023).
  20. Shi, J., Zhou, B., Ding, C. Study on the Chemical Components of Blue Fox Gall Powder. J Trad Chinese Med Herald. 31 (03), 83-88 (2025).
  21. Gómez, C., Stücheli, S., Kratschmar, D. V., Bouitbir, J., Odermatt, A. Development and Validation of a Highly Sensitive LC-MS/MS Method for the Analysis of Bile Acids in Serum, Plasma, and Liver Tissue. Metabolites. 10 (7), 282(2020).
  22. Wu, M., et al. Estimated projection of incidence and mortality of alcohol-related liver disease in China from 2022 to 2040: a modeling study. BMC Med. 21 (1), 277(2023).
  23. Bo, Z., Rui, W., Jingbo, J. Arctic fox bile can alleviate carbon tetrachloride-induced acute liver injury. Intl J Clin Exp Med. 9 (2), 5050-5055 (2016).
  24. Zhou, C. F., Gao, G. J., Liu, Y. Advances in studies on bear bile powder. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40 (7), 1252-1258 (2015).
  25. Zhou, C. S., Yin, Z. Y., Zhao, W. X. Bear bile affects immunologic feature of hepatic stellate cells. J Hepatol Surg. 20 (3), 204-208 (2012).
  26. Wang, N., et al. A comparative study on the hepatoprotective action of bear bile and Coptidis Rhizoma aqueous extract on experimental liver fibrosis in rats. BMC Complement Altern Med. 12, 239(2012).
  27. Ratziu, V., et al. A randomized controlled trial of high-dose ursodesoxycholic acid for nonalcoholic steatohepatitis. J Hepatol. 54 (5), 1011-1019 (2011).
  28. Moorhouse, T. P., et al. Substitutes for wildlife-origin materials as described in China's "TCM" research literature. Global Ecol Conservation. 34 (April), e02042(2022).
  29. Steyn, W. J., Wand, S. J., Jacobs, G., Rosecrance, R. C., Roberts, S. C. Evidence for a photoprotective function of low-temperature-induced anthocyanin accumulation in apple and pear peel. Physiol Plant. 136 (4), 461-472 (2009).
  30. Intagliata, S., et al. Discovery of a Highly Selective Sigma-2 Receptor Ligand, 1-(4-(6,7-Dimethoxy-3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)butyl)-3-methyl-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-one (CM398), with Drug-Like Properties and Antinociceptive Effects In Vivo. AAPS J. 22 (5), 94(2020).
  31. Contreras-Zentella, M. L., Villalobos-Garcia, D., Hernandez-Munoz, R. Ethanol Metabolism in the Liver, the Induction of Oxidant Stress, and the Antioxidant Defense System. Antioxidants (Basel). 11 (7), 1258(2022).
  32. Lala, V., Zubair, M., Minter, D. A. Liver Function Tests. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  33. Seo, E., Kang, H., Choi, H., Choi, W., Jun, H. S. Reactive oxygen species-induced changes in glucose and lipid metabolism contribute to the accumulation of cholesterol in the liver during aging. Aging Cell. 18 (2), e12895(2019).
  34. Freitas, I. N., et al. Insights by which TUDCA is a potential therapy against adiposity. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1090039(2023).
  35. Lu, W., Xi, R., Huaiwu, H. Ursodeoxycholic acid (UDCA) reduces hepatocyte apoptosis by inhibiting farnesoid X receptor (FXR) in hemorrhagic shock (HS). Curr Mol Med. 23 (6), 550-558 (2022).
  36. Reyes-Gordillo, K., et al. Akt1 and Akt2 Isoforms Play Distinct Roles in Regulating the Development of Inflammation and Fibrosis Associated with Alcoholic Liver Disease. Cells. 8 (11), 1337(2019).
  37. Li, J., Guo, C., Wu, J. The Agonists of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma for Liver Fibrosis. Drug Des Devel Ther. 15, 2619-2628 (2021).
  38. Dichtel, L. E., Cordoba-Chacon, J., Kineman, R. D. Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor 1 Regulation of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. J Clin Endocrinol Metab. 107 (7), 1812-1824 (2022).
  39. Takahashi, Y. The Role of Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor-I in the Liver. Int J Mol Sci. 18 (7), 1447(2017).
  40. Feng, M., et al. Kupffer-derived matrix metalloproteinase-9 contributes to liver fibrosis resolution. Int J Biol Sci. 14 (9), 1033-1040 (2018).
  41. Ma, X. Y., et al. Ursolic acid reduces hepatocellular apoptosis and alleviates alcohol-induced liver injury via irreversible inhibition of CASP3 in vivo. Acta Pharmacol. 42 (7), 1101-1110 (2021).
  42. Taguchi, K., Fukami, K. RAGE signaling regulates the progression of diabetic complications. Front Pharmacol. 14, 1128872(2023).
  43. Lino Rodrigues, K., et al. Aerobic Exercise Training Improves Microvascular Function and Oxidative Stress Parameters in Diet-Induced Type 2 Diabetic Mice. Diabetes Metab Syndr Obes. 15, 2991-3005 (2022).
  44. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metab Dispos. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  45. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  46. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: an important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hepatoprotektif EtkilerA FarmakolojisiMolek ler KenetlenmeY ksek Performansl S v KromatografisiKaraci er HistopatolojisiAntioksidan Etkilernflamatuar Yolaklar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.