Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bu çalışma, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD) farelerinden primer hepatositleri izole etmek için standart bir protokol oluşturarak, yapay lipid yüklemesi olmadan steatoz ve metabolik disfonksiyonun hastalıkla ilgili araştırmalarını mümkün kılmaktadır. Yöntem, mekanik ve terapötik çalışmalar için uygun, yüksek verimli ve yüksek canlılığa sahip hepatositler verir.
Hepatositler içinde patolojik lipid birikimi (steatoz) ile karakterize metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), önemli ve büyüyen bir küresel sağlık yükünü temsil eder. Primer fare hepatosit kültürleri, MASLD patogenezini ve terapötik müdahaleleri aydınlatmak için vazgeçilmez ex vivo modeller olarak hizmet eder. Bununla birlikte, yüksek kaliteli hepatositlerin steatotik karaciğerlerden güvenilir bir şekilde izole edilmesi teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak MASLD farelerinden primer hepatositlerin etkili izolasyonu için basit bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, palmitat ve oleik asit takviyesi yoluyla yapay indüksiyon gerektirmeden doğal steatoz sergileyen hepatositler üretir ve böylece fizyolojik olarak daha ilgili bir fenotipi korur. Protokol, yüksek derecede canlı ve yüksek saflıkta hepatositler verir ve MASLD farelerinden yüksek miktarlarda hepatositleri izole etmek için evrensel olarak uygulanabilir. Ayrıca, farmakolojik değerlendirme veya genetik müdahale çalışmaları için uygundur. Özetle, MASLD için yeni terapötik hedeflerin ve ilaçların keşfini kolaylaştırmak için alt hücre biyolojik çalışmaları için yüksek verimli, yüksek saflıkta ve yüksek derecede canlı hepatositleri izole etmek için tekrarlanabilir bir protokol sağlıyoruz.
Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), hepatositlerde patolojik lipid birikimi ile karakterizedir ve dünya çapında en yaygın kronik karaciğer bozukluğunu temsil eder1. MASLD'nin dünyadaki yetişkin nüfusun %38'ini etkilediği tahmin edilmektedir ve insan sağlığı için önemli bir tehdit haline gelmiştir2. MASLD'nin mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır ve tedavi seçenekleri oldukça sınırlıdır. MASLD için yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesi ve hedefe yönelik ajanların geliştirilmesi kritik bir klinik ihtiyaç haline gelmiştir. Karaciğeri oluşturan ba....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm deneysel adımlar, Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Erkek C57BL / 6J fareleri, bu çalışmada 12 haftadan fazla bir süre boyunca yüksek yağlı bir diyetle (HFD, # 12492, Araştırma Diyeti) beslendi.
1. Kollajen kaplı bir kültür plakasının veya tabağının hazırlanması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Mevcut protokol, 12 haftadan uzun süredir HFD ile beslenen erkek C57BL / 6J farelerine uygulandı. İzole edilen primer hepatositler morfoloji ve fonksiyon açısından incelendi. Yaklaşık 40 g fare karaciğerinden izolasyon başına ortalama 2 × 107
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Canlı fare hepatositlerinin izolasyonu, kan bileşenlerini uzaklaştırmak için izotonik çözelti kullanılarak kapsamlı vasküler perfüzyon ile başlayan ve ardından aktif kollajenazçözeltisi 9,10 ile kontrollü enzimatik sindirim ile başlayan kritik iki aşamalı bir prosedürü içerir. Başarılı izolasyon, proses boyunca optimal fizyolojik koşulların, özellikle perfüzyon çözeltilerinin stabil sıcaklığının (37 °C) ve pH'ının (7.2-7.4) korun.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar tarafından potansiyel bir çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [No. 82373967] tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mL steril santrifüj tüpleri | Nest | 602052 | |
| anti-HNF4 ve alfa; antikor | İmmünoway | YM8517 | |
| anti-IgG antikoru | Proteintech | 30000-0-AP | |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| CaCl2 | Merck (SigmaAldrich) | C5670 | |
| Santrifüj | Termo | Sorvall ST16R | |
| Kollajen Tip I | Corning | 354236 | |
| Kollajenaz, Tip 4 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| Tutma iğnesi | BRAUN | 4254074B | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| EGTA | Yeasen | 60339ES10 | |
| Etanol | Merck (SigmaAldrich) | 493511 | |
| Fetal Sığır | Serumu Sigma | F2442 | |
| Glikoz | Merck (SigmaAldrich) | G7021 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| İzoginketin ve nbsp; | MedChemExpress | HY-N2117 | |
| K2HPO4 | Merck (Supelco) | PHR2900 | |
| KCl | Merck (SigmaAldrich) | P3911 | |
| Na2HPO4 & orta nokta; 12H2O | Merck (SigmaAldrich) | 04273 | |
| NaCl | Merck (SigmaAldrich) | S9888 | |
| NaHCO3 | Merck (SigmaAldrich) | S6014 | |
| İğne filtresi 0.22&mikro; M | Millex-GP | SLGV033RB | |
| Nil Kırmızısı | Invitrogen | N1142 | |
| Penisilin / streptomisin (100X) | Gibco | 15140122 | |
| Rekombinant adenovirüs | Obio Technology Corp., ltd. | Bayrak etiketli fare IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) ve kontrol adenovirüsünü (Ad-NC) kodlayan rekombinant adenovirüsler, Obio Technology Corp., ltd. tarafından oluşturulmuştur. | |
| Sodyum pentobarbital | Merck (SigmaAldrich) | P3761 | |
| Steril hücre süzgeçleri, 100 & mu; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Trypan Blue | Beyotime | ST2780-5g | |
| Değişken akışlı peristaltik pompa | Daha Uzun | BT100-1F |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında