Yöntem makalesi

MASLD Farelerinden Hepatositlerin İzolasyonu ve Kültürü için Basit Bir Protokol

DOI:

10.3791/68782

⸱

18 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD) farelerinden primer hepatositleri izole etmek için standart bir protokol oluşturarak, yapay lipid yüklemesi olmadan steatoz ve metabolik disfonksiyonun hastalıkla ilgili araştırmalarını mümkün kılmaktadır. Yöntem, mekanik ve terapötik çalışmalar için uygun, yüksek verimli ve yüksek canlılığa sahip hepatositler verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatositler içinde patolojik lipid birikimi (steatoz) ile karakterize metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), önemli ve büyüyen bir küresel sağlık yükünü temsil eder. Primer fare hepatosit kültürleri, MASLD patogenezini ve terapötik müdahaleleri aydınlatmak için vazgeçilmez ex vivo modeller olarak hizmet eder. Bununla birlikte, yüksek kaliteli hepatositlerin steatotik karaciğerlerden güvenilir bir şekilde izole edilmesi teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak MASLD farelerinden primer hepatositlerin etkili izolasyonu için basit bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, palmitat ve oleik asit takviyesi yoluyla yapay indüksiyon gerektirmeden doğal steatoz sergileyen hepatositler üretir ve böylece fizyolojik olarak daha ilgili bir fenotipi korur. Protokol, yüksek derecede canlı ve yüksek saflıkta hepatositler verir ve MASLD farelerinden yüksek miktarlarda hepatositleri izole etmek için evrensel olarak uygulanabilir. Ayrıca, farmakolojik değerlendirme veya genetik müdahale çalışmaları için uygundur. Özetle, MASLD için yeni terapötik hedeflerin ve ilaçların keşfini kolaylaştırmak için alt hücre biyolojik çalışmaları için yüksek verimli, yüksek saflıkta ve yüksek derecede canlı hepatositleri izole etmek için tekrarlanabilir bir protokol sağlıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), hepatositlerde patolojik lipid birikimi ile karakterizedir ve dünya çapında en yaygın kronik karaciğer bozukluğunu temsil eder1. MASLD'nin dünyadaki yetişkin nüfusun %38'ini etkilediği tahmin edilmektedir ve insan sağlığı için önemli bir tehdit haline gelmiştir2. MASLD'nin mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır ve tedavi seçenekleri oldukça sınırlıdır. MASLD için yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesi ve hedefe yönelik ajanların geliştirilmesi kritik bir klinik ihtiyaç haline gelmiştir. Karaciğeri oluşturan baskın hücre tipi olan hepatositler, hepatik glukoz-lipid-ilaç metabolizmasının birincil bölgesidir. Primer hepatositler, hepatosit hücre hatlarından daha eksiksiz bir hepatosit işlevini korur ve karaciğer hastalığı mekanizmalarını ve ilaç geliştirmeyi incelemek için yararlı bir araçtır3. Yağlı karaciğeri olan farelerden primer hepatositlerin izolasyonu ve kültürü, lipid metabolizması, insülin direnci ve inflamatuar yanıtlar dahil olmak üzere karaciğer patofizyolojisini incelemek için temel bir tekniktir. Yağlı karaciğer hastalığının murin modellerinden hepatosit izolasyonu için oluşturulan önceki bir protokol, hem normal hem de lipid biriktiren hepatosit popülasyonlarının ayrılmasını spesifik olarak sağlamak için gradyan santrifüjleme kullanmıştır. Bu izole lipid yüklü hepatositler, yağlı karaciğer hastalığı patobiyolojisini araştırmak için kritik bir in vitro model sistemi oluşturur3. Bu yaklaşımın birincil amacı, hastalığa özgü fenotipik özellikleri koruyan ve böylece in vitro olarak MASLD'yi taklit edebilen, yüksek canlı ve yüksek verimli hepatositleri kolay ve ekonomik bir şekilde elde etmektir.

Farelerde hepatosit izolasyonu için genel prosedür, Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) gibi izotonik bir perfüzyon çözeltisi ile karaciğerden kanın yıkanması ve ardından karaciğerin kollajenaz içeren bir sindirim çözeltisi kullanılarak sindirilmesi ile başlayan iki aşamalı bir işlemden oluşur. Karaciğer perfüzyonu ve enzimatik sindirim tekniklerindeki son gelişmeler, dişi farelerde primer hepatositlerin verimini ve canlılığını iyileştirmiştir4. Tampon bileşiminin optimize edilmesi ve sindirim sürelerinin kısaltılması gibi geleneksel iki aşamalı kollajenaz perfüzyon yöntemlerinde yapılan iyileştirmeler, deneysel protokollerin yağlı karaciğer örneklerine uyarlanmasında kritik öneme sahiptir. Primer hepatositler, özellikle endotel mediatörleri ve anjiyojenik faktörler aracılığıyla kalp-karaciğer karışması ve karaciğer-vasküler eksen etkileşimlerine aracılık etmedeki rolleri aracılığıyla, MASLD'nin altında yatan patofizyolojik mekanizmaların ve kardiyometabolik komplikasyonlarının aydınlatılmasında vazgeçilmez modeller olarak hizmet eder 5,6. Bu hücreler, metabolik sendromun hem hepatik hem de kardiyovasküler belirtilerini ele alan hedefe yönelik tedaviler geliştirmek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sunarken, MASLD, kronik böbrek hastalığı ve iskemik kalp hastalığı7 arasındaki klinik ilişkilerle kanıtlandığı gibi, hastalığın ilerlemesini yönlendiren çok organlı iletişim ağları hakkında kritik bilgiler sağlar. MASLD'nin mevcut in vitro araştırması, ağırlıklı olarak palmitik / oleik asit (PA / OA) ile uyarılan normal hepatositlere veya insan hepatosit hücre hatlarına (örneğin, HepG2 ve Huh7) dayanır, bu da hastalıklı koşullar altında steatotik hepatositlerin patofizyolojik özelliklerini yetersiz bir şekilde çoğaltır ve kalp-karaciğer-vasküler etkileşimleri incelemek için translasyonel ilgilerini sınırlar. Bu yaklaşım, MASLD ilerlemesinin kronik metabolik disfonksiyonunu, inflamatuar mikro çevreyi ve hastalığa özgü organlar arası karışma karakteristiğini yakalayamaz.

Bu protokol, yapay olarak palmitik ve oleik asit tedavileri eklemeye gerek kalmadan MASLD farelerinden hepatositleri izole etmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, MASLD için yeni terapötik hedeflerin keşfini ve ilaç geliştirmeyi desteklemek için alt hücre biyolojisi araştırmalarına uygun, mükemmel canlılığa sahip yüksek verimli hepatositler elde etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel adımlar, Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Erkek C57BL / 6J fareleri, bu çalışmada 12 haftadan fazla bir süre boyunca yüksek yağlı bir diyetle (HFD, # 12492, Araştırma Diyeti) beslendi.

1. Kollajen kaplı bir kültür plakasının veya tabağının hazırlanması

  1. 35 mL çift damıtılmış H2O'ya (ddH2O) 15 mL% 100 EtOH ekleyin. % 30 EtOH içinde 50 μg / mL'lik bir kollajen tip I çözeltisi hazırlayın. Steril 0,22 μm filtre ucu ile filtreleyin.
  2. Bir hücre kültürü plakasını veya kabınıcm2 başına 30 μL kollajen çözeltisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
  3. Fazla sıvıyı bir pipetle alın ve kültür plakasını veya kabını kurulayın. Kaplanmış bulaşıkları sterilizasyon için 0,5 saat ultraviyole ışıkla ışınlayın. 4 °C'de 1 aydan daha kısa süre saklayın.
    NOT: UV lambasının dalga boyu 254 nm'dir ve UV yoğunluğu 400 mw/m2'den az değildir. UV lamba kaynağının kollajen kaplı bulaşıklara olan mesafesi 1 m'dir.

2. Perfüzyon çözeltisinin hazırlanması

  1. Hepatositleri izole etmeden birkaç gün önce, Tablo 1'de belirtilen hepatosit izolasyon reaktiflerini ve kültür ortamını hazırlayın. Perfüzyon çözeltisi A ve B'yi steril 0.22 μm filtre ucu ile filtreleyin. 4 °C'de 1 aydan daha kısa süre saklayın. Bir su banyosu hazırlayın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
  2. Perfüzyon çözeltileri A ve B'yi 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtın. Ameliyattan önce 80 mL perfüzyon çözeltisi B'ye 40 mg kollajenaz tip IV ekleyin.
  3. RT'de peristaltik bir pompa kullanarak 5 dakika boyunca 4 mL/dk hızında% 75 EtOH pompalayın. Pompa hortumunu %75 EtOH'den önceden ısıtılmış perfüzyon çözeltisi A'ya geçirin.
    NOT: Isıtmalı sirkülasyon doldurma ünitesini Şekil 1A'da gösterilen konfigürasyona göre monte edin.

3. Cerrahi prosedür

  1. Onaylanmış bir yöntem kullanarak fareyi uyuşturun. Sodyum pentobarbital (50 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte edin. Devam etmeden önce dönme refleksi kaybını doğrulayın.
  2. Farenin üst ve alt uzuvlarını bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Cerrahi bölgeyi% 75 alkol ile sterilize edin.
  3. Diseksiyon aletleri kullanarak iç ve dış karın zarlarını kesin. İnferior vena kava (IVC) ve hepatik portal veni (PV) ortaya çıkarmak için iç organları bir pamuklu çubukla farenin sol tarafına doğru döndürün.
  4. İnferior vena kava'yı şişirmek için pamuklu çubukla bastırın. İnferior vena kavaya paralel bir 22-G kalıcı iğne yerleştirin.
  5. Kalıcı iğnenin demir kısmını geri çekin. Kateteri inferior vena kavada bırakın. İğneyi 0,22 μm filtre ucu ile bir perfüzyon hattına bağlayın.
    NOT: Kalıcı bir iğne, bir demir iğne parçası ve bir plastik kateter parçasından oluşur. İnferior vena kavaya doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun ve kalıcı iğne kanla dolana kadar bekleyin. Kalıcı iğnedeki tüm hava kabarcıklarından kurtulun. Trombozu önlemek için tüm prosedürü hızlı bir şekilde tamamlayın.
  6. Perfüzyon hızını 5 mL / dk perfüzyon sıvısı A'ya ayarlayın. Perfüzyona başlayın ve karaciğeri şişmiş görünene kadar gözlemleyin. Portal damarı hemen kesin.
  7. Kanın iyice yıkanmasını sağlamak için pamuklu bir bez kullanarak karaciğere nazikçe masaj yapın. Karaciğer toprak sarısına dönene kadar perfüzyona devam edin.
  8. % 0.05 kollajenaz tip IV içeren perfüzyon sıvısı B'ye geçin. Karaciğer tamamen solana kadar perfüzyona devam edin.
    NOT: Karaciğerin sindirilmesi fare başına en az 10 dakika sürer. Bir farenin karaciğerini sindirmesi için kollajenaz içeren 80 mL perfüzyon çözeltisi B'nin hacmi yeterlidir. Hepatik doku, maksimum yumuşamaya ulaşana kadar tam enzimatik sindirime uğrar ve kapsülle çevrili parankim, mekanik bozulmaya duyarlı aşırı kırılganlık durumuna ulaşır.
  9. Karaciğeri farenin karnından çıkarın. Karaciğeri DMEM içeren 10 cm'lik bir tabağa koyun.
  10. Bir biyogüvenlik kabininde ilerleyin. Cımbız kullanarak karaciğeri toz haline getirin (iyi sindirilmiş karaciğer hepatositleri kolayca serbest bırakır).
  11. Süspansiyonu 70 μm'lik bir gözenekli filtreden steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. DMEM ortamı ile ses seviyesini 45 mL'ye (fare başına) ayarlayın.
  12. 50 × g'da 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen dökün.
  13. Peletleri DMEM ortamı ile 25 mL'lik (fare başına) nihai hacme kadar yeniden süspanse edin. 50 × g'da tekrar 2 dakika santrifüjleyin.
  14. Süpernatanı tamamen dökün. Pelet% 10 FBS ile desteklenmiş 25 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  15. Süspansiyonu iyice karıştırın. Saymak için hücreleri Tripan mavisi ile boyayın. Hemen kültür için aşılamaya devam edin.
    NOT: Kollajen kaplı 6 oyuklu tabaklara kuyucuk başına 2 × 105 hücre içeren 2 mL ortamı yerleştirin. 2 saat hücre aşılamasından sonra DMEM ortamını değiştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, 12 haftadan uzun süredir HFD ile beslenen erkek C57BL / 6J farelerine uygulandı. İzole edilen primer hepatositler morfoloji ve fonksiyon açısından incelendi. Yaklaşık 40 g fare karaciğerinden izolasyon başına ortalama 2 × 107


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı fare hepatositlerinin izolasyonu, kan bileşenlerini uzaklaştırmak için izotonik çözelti kullanılarak kapsamlı vasküler perfüzyon ile başlayan ve ardından aktif kollajenazçözeltisi 9,10 ile kontrollü enzimatik sindirim ile başlayan kritik iki aşamalı bir prosedürü içerir. Başarılı izolasyon, proses boyunca optimal fizyolojik koşulların, özellikle perfüzyon çözeltilerinin stabil sıcaklığının (37 °C) ve pH'ının (7.2-7.4) korun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar tarafından potansiyel bir çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [No. 82373967] tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
50 mL steril santrifüj tüpleriNest602052
anti-HNF4 ve alfa; antikorİmmünowayYM8517
anti-IgG antikoruProteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
SantrifüjTermo Sorvall ST16R
Kollajen Tip I Corning354236
Kollajenaz, Tip 4Sangon BiotechA004186-0001
Tutma iğnesiBRAUN4254074B
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
EtanolMerck (SigmaAldrich)493511
Fetal SığırSerumu SigmaF2442
GlikozMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
İzoginketin ve nbsp;MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 & orta nokta; 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
İğne filtresi 0.22&mikro; MMillex-GPSLGV033RB
Nil KırmızısıInvitrogenN1142
Penisilin / streptomisin (100X)Gibco15140122
Rekombinant adenovirüsObio Technology Corp., ltd. Bayrak etiketli fare IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) ve kontrol adenovirüsünü (Ad-NC) kodlayan rekombinant adenovirüsler, Obio Technology Corp., ltd. tarafından oluşturulmuştur.
Sodyum pentobarbitalMerck (SigmaAldrich)P3761
Steril hücre süzgeçleri, 100 & mu; mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
Değişken akışlı peristaltik pompaDaha UzunBT100-1F

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
  4. Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
  5. Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
  6. Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
  7. Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
  8. Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
  9. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
  10. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  11. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hepatosit zolasyonuKollajenaz Perf zyonuPrimer HepatositlerSteatotik Karaci erHepatosit K lt rLipid Ak m lasyonuEx Vivo ModellerGenetik M dahaleFarmakolojik De erlendirme
Video yakında

İlgili makaleler