Method Article

Minibiyoreaktör Dizisinin (MBRA) montajı ve kullanımı için güncellenmiş protokol

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minibiyoreaktör Dizisi (MBRA), mikrobiyom dinamiklerini, terapötik etkileşimleri ve çevresel faktörlere mikrobiyal tepkileri incelemek için paralel deneyleri destekleyen, karmaşık mikrobiyal toplulukların yetiştirilmesini sağlayan yüksek verimli, özelleştirilebilir, sürekli akışlı bir kültür sistemidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan mikrobiyomu, konak sağlığında önemli roller oynayan çeşitli ve dinamik mikrobiyal toplulukları içerir. Bu toplulukları ve çevresel faktörlere verdikleri tepkileri anlamak, mikrobiyom bazlı terapötiklerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. İnsan kaynaklı mikrobiyota yetiştirmek için kullanılan geleneksel in vitro modeller genellikle ölçeklenebilirlikten yoksundur ve erişilebilirliklerini ve verimlerini sınırlayan kapsamlı teknik uzmanlık gerektirir. Bu sınırlamaları ele almak için, mikrobiyal toplulukların yüksek verimli bir şekilde yetiştirilmesi için modüler, tek aşamalı, sürekli akışlı bir platform olan Minibiyoreaktör Dizisi (MBRA) sistemini geliştirdik. Bu sistem, karmaşık ekosistemlerin istikrarlı büyümesini sürdürürken deneysel esnekliği destekleyerek 48 adede kadar farklı mikrobiyal topluluğun paralel olarak yetiştirilmesini sağlar. Bu protokol, MBRA üretimi, montajı, sterilizasyonu ve çalıştırılması hakkında ayrıntılı rehberlik sağlar. Sistemin modüler tasarımı, anaerobik odalara kolay entegrasyon sağlar ve çok çeşitli deneysel uygulamalar için özelleştirmeyi destekler. Antibiyotiklere, diyet bileşiklerine ve patojen istilasına mikrobiyal tepkileri incelemek ve patojene dirençli toplulukları taramak için kullanılmıştır. Erişilebilirliği, ölçeklenebilirliği ve tekrarlanabilirliği ile MBRA, mikrobiyal etkileşimleri araştırmak ve mikrobiyom araştırmalarını ilerletmek için güçlü bir model sistemi temsil eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan mikrobiyomu, çok sayıda fizyolojik süreçte kritik bir rol oynayan ve insan sağlığını derinden etkileyen karmaşık bir mikroorganizma ekosistemidir. İnsan mikrobiyomu, vücudumuzdaki birçok anatomik bölgeyi kapsar ve her biri henüz tam olarak anlamadığımız şekillerde aktif olarak etkileşime giren dinamik mikrobiyal topluluklar içerir1. Mikrobiyal toplulukların sağlık ve hastalıklara katılımı hakkındaki bilgimizi genişletmek, bu ortamlarda meydana gelen mikrobiyal etkileşimleri anlamamıza bağlıdır1. Bu karmaşık sistemleri terapötik amaçlar için etkili bir şekilde incelemek ve manipüle etmek için indirgemeci bir yaklaşım gereklidir. Basitleştirilmiş model sistemleri kullanarak bireysel mikrobiyal etkileşimleri keşfetmek, mikrobiyom2'nin tüm karmaşıklığının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırır.

İnsan kaynaklı mikrobiyal toplulukları büyütmek için çok çeşitli model sistemler mevcuttur. Bu sistemler, insanla ilişkili mikrobiyal topluluklar hakkındaki anlayışımızı geliştirmiştir ve tek aşamalı parti kültüründen daha karmaşık çok aşamalı sürekli akış sistemlerine kadar uzanmaktadır. İnsan Bağırsak Mikrobiyal EkosistemiSimülatörü 3, İkiz Damar Tek Aşamalı Kemostat sistemi4 ve Bağırsak Mikrobiyotası için Çevre Kontrol Sistemi5 gibi model sistemler, belirli anatomik bölgelerin fizyolojik koşullarını çoğaltır ve mikrobiyal ortamların yakın in vitro yaklaşımlarını sağlar. Bununla birlikte, mikrobiyologlar tarafından benimsenmeleri sınırlıdır çünkü maliyetlidirler, çalıştırılmaları ve sürdürülmeleri için üst düzey teknik uzmanlık gerektirirler ve sınırlı verime sahiptirler.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, kontrollü bir ortamda çeşitli kaynaklardan mikrobiyal toplulukların istikrarlı büyümesini kolaylaştırmak için tasarlanmış sürekli akışlı, tek aşamalı bir kültür sistemi olan Minibiyoreaktör Dizisi (MBRA) sistemini geliştirdik 6,7,8. MBRA sistemi, birden fazla mikrobiyal topluluğun aynı anda yetiştirilmesine izin veren ve deneysel verimliliği artıran yüksek verimli yeteneklerle birlikte montaj ve çalıştırma kolaylığı ile diğer bağırsak modellerinden sıyrılıyor. Ayrıca, bu sistemin basit ve kompakt yapısı, gastrointestinal ve vajinal sistem gibi anaerobik ve hipoksik bölgelerden bakterilerin büyümesini kolaylaştırmak için anaerobik ve mikrooksik odalar içinde çalışmasına izin verir. Bu sistemin çok yönlü doğası, Clostridioides difficile'ye dirençli gastrointestinal toplulukların9 taranmasının yanı sıra antibiyotiklerin10,11 ve diyet substratlarının12 mikrobiyal topluluklar üzerindeki etkilerinin test edilmesi için kullanılmıştır.

MBRA'lar, malzeme seçimimizde netlik ve su direncine öncelik verilerek 3D baskı veya eklemeli üretim yoluyla üretilir (polimer bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın). Her dizi, tümü medya içe aktarma, atık dışa aktarma ve numune toplama için bağlantı noktalarıyla donatılmış altı ayrı oda içerir. Sisteme sürekli olarak taze ortam verilirken, atıklar aynı anda çıkarılır ve akış hızları iki peristaltik pompa tarafından hassas bir şekilde kontrol edilir. Sistemdeki içerikler, homojen kültürleri kolaylaştırmak için karıştırma çubukları ve 60 noktalı bir karıştırma plakası kullanılarak sürekli olarak çalkalanır. Burada açıklanan protokol, oda başına 15 mL'lik bir çalışma hacmi için optimize edilmiştir, ancak her biyoreaktör, deneysel gereksinimlere bağlı olarak 1-20 mL'lik bir aralığı barındırabilir. Peristaltik pompa ve pompa hortumu, sırasıyla yaklaşık 15,63 ila 0,09 saatlik devir hızlarına karşılık gelen 0,016 ila 2,9 mL/dak arasında değişen akış hızlarını barındırabilir. Sistem, çok çeşitli ortam formülasyonları ve diyet veya besin ilaveleri ile uyumlu olsa da, bazı pratik hususların dikkate alınması gerekir: yüksek viskoziteli ortam, akış hızlarının yeniden kalibre edilmesini gerektirebilir ve çözünmemiş parçacıkların veya çözünmeyen bileşenlerin varlığı, özellikle düşük akış hızlarında pompa borusunu veya dar konektörleri tıkayabilir. Sistemin modülerliği, ortam seçimini, numune toplamayı, akış hızlarını ve çalışma hacmini ayarlayarak deneylerin hızlı ve kolay bir şekilde uyarlanmasına olanak tanır. Dört adet 24 kanallı peristaltik pompa ve iki adet 60 noktalı karıştırma plakası ile birlikte sistem, tek bir anaerobik odada deney başına 48 ayrı oda çalıştırabilir ve yüksek verimli anaerobik taramayı destekler.

Bu protokol, laboratuvarımız4 tarafından geliştirilen, daha önce yayınlanmış bir MBRA montaj ve çalıştırma yönteminin görsel bir kılavuz ve güncellenmiş versiyonu niteliğindedir. Tekrarlanabilirliği artırmak, iş akışını kolaylaştırmak ve kontaminasyonu en aza indirmek için çeşitli önemli iyileştirmeler dahil edilmiştir. İlk olarak, PTFE pipetleri, ayrılmalarını ve biyoreaktör odalarına düşmelerini önlemek için artık kimyasal olarak kazınmıştır. İkinci olarak, medya akışını odaların dibine yönlendirmek ve medyanın hazne duvarlarından aşağı damlamasını önlemek için besleme hatlarına bir medya pipeti eklenmiştir. Bu, bilinen bir biyofilm oluşumu kaynağıydı. Üçüncüsü, C-flex boru uzunlukları standartlaştırıldı ve kısaltıldı ve daha kompakt, düzenli bir kurulum oluşturmak için 3D baskılı bir boru tutucu tasarlandı. Son olarak, biyoreaktörler artık her kullanım arasında tamamen demonte edilmemektedir, bu da tekrarlanan deneylerle ilişkili zaman ve malzeme maliyetlerini önemli ölçüde azaltır. Bu ve diğer artımlı iyileştirmeler, sistemin laboratuvarımızdaki birden fazla projede kapsamlı kullanımına dayalı yinelemeli optimizasyonu yansıtır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol, tek bir MBRA şeridinin hazırlanması ve montajı içindir (Şekil 1). Her MBRA, 3D baskılı bir biyoreaktörden, bir büyüme ortamının akışını kolaylaştırmak için borulardan ve biyoreaktör odalarından atık akışını kolaylaştırmak için borulardan oluşur. Görüntüler de dahil olmak üzere tek bir MBRA'yı oluşturan parçaların tam listesi Tablo 1'de bulunabilir. Gerekli ek ekipman, iki peristaltik pompa ve bir karıştırma plakası içerir (cihaz özellikleri için Malzeme Tablosuna bakın).

1. Montaj öncesi hazırlık

  1. Politetrafloroetilen (PTFE) aşındırma
    NOT: PTFE'nin kimyasal özellikleri onu bu MBRA sisteminde kullanım için ideal kılarken, kayganlığı tek başına epoksi kullanılarak diğer biyoreaktör parçalarına bağlanmayı imkansız hale getirir. PTFE borusunu dişli erkek luerlere sabitlemek için, önce epoksinin bağlanmasına izin vermek için kimyasal olarak kazınmalıdır. Bir florokarbon aşındırıcı kullanılır (bkz . Malzeme Tablosu). Şekil 2A , bu aşındırma işlemini kolaylaştırmak için PTFE borunun bantlanması için görsel bir kılavuz görevi görür.
    1. On iki adet 25 mm uzunluğunda PTFE boru kesin. Bunlardan altısı, besleme hatları ("medya samanı") için pipet görevi görmek üzere aşındırma işleminden sonra ikiye kesilecektir.
      NOT: Sadece yapıştırılan bölüm kazınmalıdır. İç yüzeyin ve istenmeyen alanların aşınmasını önlemek için, boru her iki ucundan bantlanmalı ve kapatılmalıdır.
    2. Genel Amaçlı Laboratuvar Etiketleme Bandı (19 mm genişlik) kullanarak, PTFE borunun ~5 mm'sini kaplayacak şekilde bandı tamamen üst tarafa sarın (Şekil 2A). PTFE borunun ~10 mm'sini kaplayacak şekilde alt tarafa başka bir bant bölümü uygulayın (Şekil 2A).
    3. Aşındırma solüsyonunun PTFE'nin iç kısmına ulaşmasını önlemek için bandın uçlarını sıkıca sıkıştırın (Şekil 2A). Bu, aşındırma için ~ 10 mm PTFE boruyu açıkta bırakmalıdır.
    4. Dört çözelti hazırlayın: 55 ° C'ye ısıtılmış florokarbon aşındırıcı çözelti (florokarbon aşındırıcı çözeltinin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın),% 100 etanol (EtOH), 70 ° C'ye ısıtılmış Damıtılmış H2O ve damıtılmış H2O +% 2-5 asetik asit 70 ° C'ye ısıtılır.
      DİKKAT: Florokarbon aşındırıcı çözelti oldukça aşındırıcıdır. KKD ile çeker ocaktaki tüm adımları gerçekleştirin. Kimyasalları kurumsal yönergelere göre atın.
    5. Tüm çözeltileri adım 1.1.4'te belirtilen sıcaklıklara ısıtın. Florokarbon aşındırıcı çözelti bir su banyosunda ısıtılmalıdır, diğer çözeltiler sıcak bir plaka üzerinde ısıtılabilir. Solüsyonları, bantlanmış boruyu tamamen batıracak kadar derin 4 ayrı cam kaba dökün.
    6. Tüm PTFE borularını florokarbon aşındırıcı solüsyona batırın. Düzgün yüzey maruziyeti sağlamak için döndürün. Kazınmış yüzey kahverengiye dönene kadar 1 dakika bekletin.
      NOT: PTFE borularını çözeltiler arasında aktarmak için metal bir sıyırıcı süzgeç kaşığı kullanılabilir.
    7. Hortumu 5-20 saniye boyunca EtOH banyosuna aktarın.
    8. Hortumu 70 °C H20 banyosuna 15-30 saniye boyunca aktarın.
    9. Hortumu 70 °C H20 + %2-5 asetik asit banyosuna 1 dakika boyunca aktarın.
    10. Hortumu çıkarın ve çeker ocak içindeki emici bir ped üzerine yerleştirin. Kazınmış borunun gece boyunca kurumasını bekleyin (en az 16 saat). Kuruduktan sonra, bandı kazınmış borudan çıkarın.
    11. Kazınmış PTFE yapışmaya hazırdır ve oda sıcaklığında saklanırsa birkaç ay boyunca yapıştırılabilir durumda kalacaktır. Aşındırma yüzeylerindeki kahverengi renk solduğunda, artık yapıştırılamaz.
      NOT: Aşındırmayı bozacağı için kazınmış PTFE'yi UV ışığına maruz bırakmayın.
    12. Kazınmış PTFE borulardan 6 tanesini besleme hatları için pipet görevi görmesi için ikiye bölün (Şekil 2A).
  2. Epoksi atıkları ve medya pipetleri
    1. 6 kazınmış PTFE atık pipetinin ve 6 kazınmış PTFE medya pipetinin her birini ilgili dişli erkek luerlerine yerleştirin. Kazınmış yüzeylerin erkek luerin alt kısmı ile aynı hizada olduğundan emin olun (Şekil 2).
    2. Epoksi reçineyi ve sertleştiriciyi bir tartı teknesinde veya Petri kabında 1:1 oranında karıştırın. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, dişli erkek luer'in tabanının PTFE borularıyla buluştuğu yere epoksi uygulayın.
    3. Her parçayı dikey olarak yerleştirin ve epoksinin 24 saat sertleşmesine izin verin.
      NOT: Boş bir pipet 1 mL uç kutusu, onları dik tutmak için iyi çalışır.

2. MBRA montajı

  1. MBRA ve parça hazırlama
    1. Minibiyoreaktör dizi şeritlerinin 3D baskılı olduğundan ( Ek Dosya 1'e bakın) ve 6 bağımsız biyoreaktör odası içerdiğinden emin olun. Her bölme, bağlantı parçalarını yerleştirmek için dişli olması gereken üç adet 1/4 inç bağlantı noktası içerir. Diş açmayı, T kollu musluk anahtarı ile 1/4 inç-28NF fraksiyon musluğuyla yapın.
      NOT: Bir çekül dişi sağlamak için bağlantı noktalarına diş geçirirken bir musluk kılavuzu kullanılması önerilir.
    2. Diş açıldıktan sonra, plastik kalıntıları gidermek için her bir biyoreaktör odasını suyla yıkayın. Her hazneye 10 x 3 mm manyetik karıştırma çubuğu ve 1 mL damıtılmış su ekleyin. Su, otoklavlama sırasında sterilizasyon işlemine yardımcı olacaktır.
    3. Biyoreaktörün her bir portunun üzerine bir lastik rondela yerleştirin. Her hazne için, Şekil 1B'de gösterildiği gibi 1 atık saman dişli erkek luer, 1 ortam saman dişli erkek luer ve 1 boş dişli erkek luer 2 boş dişli erkek luer vidalayın.
    4. 3/32 inç dişi luer dikenlerine 6 kauçuk septa yerleştirin. Boynu örtmek için septanın üst manşonunu aşağı katlayın. Bunları Şekil 2B'de gösterilen her odanın bağlantı noktalarına takın.
    5. Aşağıdaki uzunlukta C-flex boru şeritlerini kesin: 2 3/8 inç, 3 11/16 inç, 5 1/4 inç, 6 1/2 inç, 7 13/16 inç ve 9 inç ve 9 inç (hem atık hatları hem de besleme hatları için her uzunluktan iki tane gerekecektir). Kesildikten sonra, bir ucuna 1/8 inçlik bir dişi luer dikeni ve her bir boru uzunluğunun karşı ucuna bir erkek luer kilit konektörü takın.
      NOT: Burada kullanılan uzunluklar, dağınıklığı azaltmak ve karıştırma plakasından ~ 1 inç uzağa yerleştirilen pompalar için optimize edilmiştir. İstenen kuruluma bağlı olarak, daha uzun uzunluklar gerekebilir.
    6. Kırmızı 16 duraklı E-lab tüpünün (2 mm ID) ve turuncu 2 duraklı E-lab tüpünün (0.89 mm ID) her iki ucuna bir 1/0.89 inç dişi luer dikeni yerleştirin. Her MBRA şeridi için bu işlemi altı kez tekrarlayın.
      NOT: 1/16 inç dişi luer dikeninin daha kolay yerleştirilmesi için, plastiği yumuşatmak için E-lab hortumunun uçlarını kısa bir süre kaynama noktasına yakın suya batırın.
    7. E-lab hortumunu adım 2.1.5'te hazırlanan C-flex hortumuna bağlayın. 6 uzunluktaki C-flex borunun her biri, dişi luerler aracılığıyla bir kırmızı ve bir turuncu E-lab hattına bağlanmalıdır.
    8. Yirmi bir adet 1 inçlik parça, bir adet 2 inçlik parça, üç adet 3 inçlik parça ve bir adet 12 inçlik C-flex boru kesin. 3 inçlik bir parçanın ve 12 inçlik boru parçasının uçlarına 1/8 inçlik bir dişi luer dikeni ve bir erkek luer kilit konektörü takın. Kalan boruya, erkek luer kilit konektörlerini her iki uca da takın. Bu parçalar, atık hattı ve besleme hattı ağacı montajlarını içerecektir.
  2. Atık hattı ağacı montajı
    1. Atık hattı ağacını monte etmek için Şekil 3B'de gösterilen 3B diyagramı izleyin.
    2. Kırmızı 2 duraklı E-lab hortumunun (1.14 mm ID) açıkta kalan uçlarını, monte edilmiş atık hattı ağacındaki terminal erkek luer kilitlerine takın. Bunları, 2 duraklı E-lab borusuna bağlı C-flex borunun uzunluğuna bağlı olarak artan sırada takın. 3/1 inç dişi luer dikeni ve erkek luer kilit konektörü ile 8 inç C-flex boruyu atık hattı ağacının üstüne takın.
  3. Besleme hattı ağacı montajı
    1. Besleme hattı ağacını monte etmek için Şekil 3A'da gösterilen 3B diyagramı izleyin.
      NOT: Besleme hattı ağaçları, atık hattı ağacında kullanılan erkek-erkek luer konektörlerini içermez. Deneyimlerimize göre, bu konektörler sızıntıya eğilimlidir ve kolayca gevşeyebilir, bu da hem biyoreaktör odalarında hem de ortam şişelerinde kontaminasyon riskini artırır. Bunu azaltmak için, besleme hattı ağacı bu bileşenler olmadan inşa edilir.
    2. Turuncu 2 duraklı E-lab hortumunun (0.89 mm ID) açıkta kalan uçlarını, monte edilmiş besleme hattı ağacındaki terminal erkek luer kilitlerine takın. Bunları, 2 duraklı E-lab borusuna bağlı C-flex borunun uzunluğuna bağlı olarak artan sırada takın. 12 inç C-flex boruyu besleme hattı ağacının üstüne takın.
  4. Komple montaj: Hazırlanan bileşenleri MBRA kültür sisteminde birleştirin.
    1. Besleme hattı ağacının ucundaki değişken uzunluktaki C-flex boruyu, en kısa çizgi biyoreaktör şeridinin sol tarafında ve en uzun çizgi sağda olacak şekilde artan sırada biyoreaktöre takın.
    2. Atık hattı ağacının ucundaki değişken uzunluktaki C-flex boruyu, en uzun hat solda ve en kısa hat sağda olacak şekilde azalan sırada biyoreaktör şeridine takın. En kısa atık hattı, atık pompasına en yakın olduğu için biyoreaktör şeridinin sağ tarafında bulunur. Buna karşılık, besleme pompası solda yer aldığı için en uzun besleme hattı sağ taraftadır (Şekil 1).
  5. Birleştirilmiş dizilerin sterilizasyonu: Monte edilmiş sistemi sterilizasyon için hazırlayın.
    1. Tüm C-flex besleme hatlarını MBRA'nın sol tarafında bir araya getirin ve bir bükümlü bağ ile sabitleyin. Şeridin sağ tarafındaki atık hatları için de aynısını yapın.
    2. Turuncu renkli 2 stoplu E-lab hortumu ile C-flex hatları arasında bir döngü oluşturun. Otoklav bandı kullanarak halkayı sabitleyin. Biyoreaktör şeridinin atık tarafındaki kırmızı 2 duraklı E-lab hortumu için de aynısını yapın. Bu, otoklavlama sırasında yerden tasarruf sağlayacaktır.
    3. Otoklavdan çıkarıldıktan sonra kontaminasyonu önlemek için atık hattının ve besleme hattı ağacının ucundaki dişi luer'i bir parça folyo ile örtün. Otoklavlama sırasında buharın kaçmasına izin vermek için her bir biyoreaktör odasındaki septa ile erkek dişli luerleri gevşetin.
      NOT: Bu adım, otoklavlama sırasında buharın biyoreaktörden kaçmasına izin verilmesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Düzgün havalandırılmazsa, biyoreaktör odalarında çatlama meydana gelebilir.
    4. MBRA'yı bir otoklav kutusuna yerleştirin ve besleme hattını ve atık hattı ağaçlarını MBRA'ları içeren çöp kutusuna bitişik ayrı kutulara uzatın. Otoklavlama sırasında 1/16 inç dişi luer dikeninin yakınındaki E-lab borusu veya C-flex borunun herhangi bir bölümü bükülürse, boru tıkanarak ortamı veya atık akışını engelleyebilir.
    5. 121 °C'de otoklav, 25 dakika boyunca 15 psi ≥. Sıvı döngüleri için tipik olan yavaş bir egzoz programı kullanın. Otoklav döngüsünün ardından biyoreaktörün oda sıcaklığında soğumasına izin verin. MBRA yeterince soğuduktan sonra, dişli erkek luerleri septa ile tekrar sıkın.
      NOT: Otoklavlanmış biyoreaktör şeritleri sıkıştırılırsa dövülebilir ve çatlamaya eğilimli hale gelir. Bağlantı parçalarını sıkmadan önce soğuması için yeterli zaman tanıyın.
      NOT: Turuncu 2 duraklı E-lab hortumu, otoklav işlemi sırasında çatlamaya eğilimlidir ve 1/16 inç dişi luer dikeninden ayrılabilir. Çatlama meydana gelirse, her iki uca da %70 etanol püskürtün, ardından çatlamış ucu steril bir tıraş bıçağıyla kesin ve boruyu luer dikenine yeniden takın. Alternatif olarak, 1/16 inç dişi luerlerin takılı olduğu ek E-lab hortumu, bir otoklav torbasında ayrı olarak sterilize edilebilir ve tüm boru değiştirilebilir.

3. Medya ve atık şişe montajı

  1. Medya şişesi montajı
    NOT: Mevcut örnekte, tüm sistem tek bir 2L şişe ile beslenmiştir. Medya şişesi kapağı tertibatının bir görüntüsü için Şekil 4A'ya bakın.
    1. Dibafit Adaptörlerini (şişe kapağı adaptörleri) Q serisi şişe kapağının üstündeki iki dişli bağlantı noktasına vidalayın. Adaptörlerden birine 3 inçlik bir C-flex boru bölümü ve diğerine 12 inçlik bir C-flex boru bölümü ekleyin. Her boru bölümünün sonuna bir erkek luer kilit konektörü ekleyin.
      NOT: MBRA'nın besleme hattı ağacına ulaşmak için gereken boru uzunluğu değişebilir ve buna göre ayarlanabilir.
    2. Ortam çekmek için saman görevi görmesi için 12 inçlik bir PTFE boru parçası kesin. Şişenin yan duvarında tıkanmayı önlemek için ucunu bir tıraş bıçağı kullanarak 45° açıyla kesin. PTFE'yi, C-flex borunun 12 inçlik bölümüne bağlı şişe kapağının altındaki küçük deliğe yerleştirin.
    3. 2 inçlik bir C-flex boru parçasını kesin ve bir ucuna dişi luer dikeni ve diğer ucuna bir erkek luer kilit konektörü takın. Bu boruyu, sonunda besleme hattı ağacına bağlanacak olan borunun 12 inçlik bölümüne takın. 2 inçlik parçayı bir Pinchcock ile sabitleyin. Pinchcock'un halkasını şişe kapağının 3 inçlik borusunun etrafına yerleştirin. Bu, otoklavlama sırasında ve sonrasında ortam sızıntısını önlemek için geçici bir durdurucu görevi görecektir.
    4. İstediğiniz ortamı hazırlayın. Tamamen monte edilmiş şişe kapağını medya şişesine takın. 12 inçlik C-flex boruyu şişenin etrafına sarın ve ucunu Pinchcock ile yukarıda açıklandığı gibi 2 inçlik boruya sabitleyin. Otoklavlama sırasında basınç birikmesini önlemek için kapağı sıkıca vidalamayın, bunun yerine hafifçe gevşetin.
    5. Şişe kapağından çıkan 3 inçlik borunun ucunu kapatmak için folyo kullanın. Medyanın protokolüne uygun bir süre otoklavlayın. Sterilizasyondan sonra, folyoyu 3 inçlik borudan çıkarın ve 0.22 μm'lik bir şırınga filtresini erkek luer kilit konektörüne vidalayın. Bu, pompalama sırasında medya şişesine hava akışına izin verecek, ancak kontaminasyonu önleyecektir.
      NOT: Kullanmadan önce, Q serisi şişe kapaklarının şişelere sıkıca kapatıldığından emin olun, çünkü uygun olmayan bir sızdırmazlık düzgün akışı engelleyebilir.
  2. Atık şişesi montajı: Atık şişelerinin her gün değiştirilmesini önlemek için laboratuvar, deney sırasında birden fazla 2 litrelik şişenin atıklarla doldurulmasına izin veren katmanlı bir atık toplama sistemi (Şekil 4B) oluşturmuştur. Bu kademeli atık sisteminin kurulumu aşağıdaki gibidir:
    1. Şişe kapağı adaptörlerini Q serisi şişe kapağının üstündeki iki dişli bağlantı noktasına vidalayın. Gerekli atık depolama şişelerinin sayısına bağlı olarak 2-4 şişe kapağı için tekrarlayın.
    2. Her şişe kapağı için 2 inçlik bir PTFE parçası kesin. Bu parçayı şişe kapağının içine, atıkları sistemdeki bir sonraki şişeye çıkarmak için belirlenmiş deliğe yerleştirin.
    3. Pompadan çıkan atık hattı ağacı ile atık şişe sisteminin bulunduğu yer arasında gerilecek kadar uzun bir C-flex boru kesin. Atık hattı ağacının bitişiğindeki uca bir erkek luer kilit konektörü takın ve diğer ucunu şişe kapağındaki PTFE borusu olmadan şişe kapağı adaptörüne bağlayın.
    4. Şişe kapaklarını birinci ve ikinci atık şişelere bağlamak için ikinci bir C-flex boru uzunluğu kesin. İlk şişedeki PTFE pipeti ile şişe kapağı adaptörüne ve ikinci şişedeki PTFE pipeti olmadan şişe kapağı adaptörüne boru takın.
      NOT: Katmanlı atık şişe kaskadındaki her şişe, yerçekiminin bir şişeden diğerine akışa yardımcı olmasına izin vermek için birincinin üzerine yerleştirilmelidir (Şekil 4B). Tüm şişelerin ikincil bir kaba (örn. açık bir plastik saklama kutusu) yerleştirilmesi ve ters çevrilmiş kesici kaplar gibi yükselticiler kullanılarak azalan sırada düzenlenmesi önerilir.
    5. Bu zincire istediğiniz kadar şişe devam ettirin. Son şişede, erkek luer kilit konektörlü 3 inçlik bir C-flex boru segmentini ücretsiz şişe kapağı adaptörüne takın. Ardından, vakum uygulamak ve atık kaskadını kolaylaştırmak için 20 mL'lik bir şırınga bağlayın.

4. MBRA bağlantısı, çalıştırılması ve sökülmesi

  1. Pompalara takma
    1. Hem atık hem de besleme hatları için E-lab hortumunu bir arada tutan otoklav bandını çıkarın. C-flex boru demetlerini çözün.
    2. MBRA'yı karıştırma plakasının üstündeki iki pompa arasına yerleştirin. 3D baskılı tutucular kullanılarak plakaya sıkıştırılabilir (bkz. Ek Dosya 2). Karıştırma plakası üzerinde belirtilen karıştırma konumlarıyla hizalandığından emin olun.
    3. Besleme hattı E-lab hortumunu peristaltik pompa kartuşlarına takın. E-lab hortumunun durdurucularını kartuşların üzerindeki yuvalara yerleştirin. Karıştırma plakasının sağındaki pompa üzerindeki atık hattı E-lab hortumu için de aynısını yapın.
    4. Peristaltik pompa kartuşlarını pompaya kilitleyin. Kartuşların pompaya tam olarak oturduğundan ve hortumun kartuş kanalının içinde olduğundan emin olun.
      NOT: Akışı 24 saat içinde başlatmak istiyorsanız, kartuşları yalnızca pompaların üzerindeki yerine kilitleyin. 24 saatten daha uzun süre ortam akışı olmadan kenetlenmiş halde bırakılırsa, tüpler sıkışabilir ve tıkanabilir. Bu durumda, kelepçeyi çıkarın ve sıkıştırma noktasında boruya hafifçe masaj yapın.
    5. 3D baskılı tüp tutucuları kullanarak C-flex boruyu düzenleyin (Ek Dosya 3).
    6. Atık hattı ağacının ucunu atık şişelerine giden boruya takın.
      NOT: Birden fazla MBRA çalıştırırken, atık şişelerine giden boruya bağlanmadan önce atık hattı ağaçlarının birbirine çatallanması gerekecektir. Bu, her ek MBRA için basit bir dallanma ağacı oluşturularak yapılabilir.
    7. Besleme hattı giriş borusundaki dişi luer'i, medya şişesi kapağından 12 inçlik tüp üzerindeki erkek konektöre takın.
      NOT: Bu noktada her iki uç da steril olmalıdır. Onlara herhangi bir potansiyel kontaminasyon kaynağı ile dokunmaktan kaçının. Kontaminasyondan şüpheleniliyorsa, bağlamadan önce her bir ucu 10 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyuna batırın.
    8. Medya akışını başlatmak için her iki pompayı da açın. Pompaların doğru yönde aktığından emin olun (atık pompaların sağındaysa her ikisi de saat yönünde ("CW") olarak ayarlayın).
    9. Her bir biyoreaktör odasına düşen ortam damlacıklarının boyutunu ve ritmini gözlemleyin; Buradaki herhangi bir büyük fark, akış hızı değişkenliğini gösterebilir. Değişkenlik gözlenirse, rahatsız edici biyoreaktör odasına bağlı herhangi bir turuncu 2 duraklı E-lab besleme hortumunun değiştirilmesi önerilir. Bu, deneysel çalıştırmadaki akış hızı değişkenliğini sınırlamaya yardımcı olacaktır.
      NOT: Bu, sistemdeki herhangi bir sızıntıyı teşhis etme ve düzeltme zamanıdır, bu nedenle ilk doldurma işlemini yakından izleyin.
    10. Biyoreaktör odaları kapasiteye ulaştığında, her iki pompayı da kapatın ve biyoreaktörlerin 24-48 saat oturmasına izin verin. Bu adım, deney başlamadan önce odalarda herhangi bir potansiyel kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için gereklidir.
  2. MBRA aşılaması
    NOT: Burada septayı sterilize etmek ve bir aşı enjekte etmek için temel protokolü açıklıyoruz.
    1. Aşıyı istenen özelliklere göre hazırlayın.
    2. Plastik bir damlalık kullanarak her bir biyoreaktör odasındaki septanın üstüne yeni yapılmış %10'luk bir çamaşır suyu solüsyonu uygulayın. Septanın üstünü tamamen kaplayacak kadar çamaşır suyu biriktirin. 10 dakika bekletin. Septayı steril bir laboratuvar mendili kullanarak kurulayın.
    3. 3 inç uzunluğunda 22 G'lik bir iğne ve numuneyi içeren bir şırınga kullanarak septanın merkezini delin. İğnenin haznenin içindeki ortama temas ettiğinden emin olun, ardından aşıyı biyoreaktör haznesine enjekte edin. Ortamı çıkararak ve hazneye geri enjekte ederek şırıngayı yıkayın. İğneleri septadan çıkarın ve keskin bir kaba atın.
    4. Akışa başlamadan önce aşının deneysel tasarıma dayalı olarak uygun bir süre büyümesine izin verin. Örneğin, dışkı bakteri toplulukları, yeterli biyokütleyi artırmak için 4-16 saatlik bir ilk parti büyümesi gerektirir8.
    5. Gerekli devir süresine bağlı olarak her iki pompayı da istenen akış hızına getirin. Akış hızları hakkında daha fazla bilgi için peristaltik pompa kılavuzuna bakın.
      NOT: İstenen akış hızından bağımsız olarak, biyoreaktör odalarının taşmamasını sağlamak için atık pompası her zaman ortam pompasından daha yüksek bir hızda çalıştırılmalıdır. Gastrointestinal bakteri topluluğu yetiştiriciliğimiz için, medya pompasını 1,0 rpm'ye ve atık pompasını 2,0 rpm'ye ayarlayarak elde edilen 1,92 mL/s devir hızı kullanıyoruz.
    6. Yine, her bir biyoreaktör odasına düşen ortam damlacıklarının boyutunu ve kadansını gözlemleyin, buradaki herhangi bir büyük farklılık akış hızı değişkenliğini gösterebilir. Değişkenlik gözlenirse, rahatsız edici biyoreaktör odasına bağlı herhangi bir turuncu 2 duraklı E-lab besleme hortumunun değiştirilmesi önerilir. Bu, deneysel çalışmalarda akış hızı değişkenliğini sınırlamaya yardımcı olacaktır.
  3. MBRA örneklemesi
    1. Her bir biyoreaktör odasındaki septanın üst kısmına, yüzeyi tamamen kaplayacak kadar %10'luk bir ağartıcı solüsyon uygulayın. 10 dakika bekletin. 10 dakika sonra, septayı steril bir laboratuvar mendili kullanarak kurulayın.
    2. 3 inç uzunluğunda 22 gauge iğne ve şırınga kullanarak septanın merkezini delin ve iğneyi biyoreaktör odasına tamamen yerleştirin. Şırıngayı tutarken, numuneyi hazneden çıkarmak için pistonu geri çekin.
      NOT: Biyoreaktör odasının toplam hacminin %20'sinden fazlasını bir seferde çıkarmaktan kaçının. Bundan daha fazlasının çıkarılması mikrobiyal topluluğu bozabilir, çünkü taze ortam hazneyi PTFE atık saman seviyesine kadar yeniden doldurana kadar atık akışı kesintiye uğrar.
    3. İğneyi çıkarın ve numuneyi uygun bir kaba dağıtın. İğneyi keskin bir kaba atın.
  4. MBRA demontaj ve yenileme
    NOT: Deneylerden sonra, MBRA'nın sterilize edilmesi ve gelecekteki deneyler için hazırlanması gerekecektir.
    1. Medya girişini deiyonize (DI) suda 1 L %10 çamaşır suyu ile değiştirin. Biyoreaktör odalarının içeriğini ağartma çözeltisi ile değiştirmek için her iki pompadaki akış hızını maksimuma çıkarın.
    2. Hazneler berraklaştığında (tüm ortamlar ağartıcı ile değiştirilmiştir), doldurma çizgisinin üzerinde 5 dakika boyunca dezenfekte etmek için MBRA'yı ters çevirin. 5 dakika sonra şeridi düzeltin ve sterilizasyon için 5 dakika daha bekleyin.
      NOT: Ağartıcının yukarıda açıklandığı gibi 10 dakikadan fazla kalmasına izin vermeyin, çünkü bu, plastiğin renginin solmasına ve ortamın ve atık boruların zayıflamasına neden olur.
    3. % 10'luk çamaşır suyu çözeltisini 1 L DI su ile değiştirin. Tüm su geçene kadar sistemi DI suyuyla yıkayın. Biyoreaktör E-lab hortumunu pompalardan ayırın ve MBRA'ları çıkarın.
    4. Yenilemek için, kullanılmış septayı ve her odadan 1 mL hariç tüm suyu çıkarın.
    5. Septayı ve turuncu 2 duraklı E-lab hortumunu değiştirin ve otoklavlamaya hazırlanmak için önceki adımları izleyin (2.5.1 ila 2.5.5. adımlar) en fazla 3 kez. Üçüncü yeniden kullanımdan sonra, MBRA tamamen sökülmeli, C-flex boru değiştirilmeli ve her bir parça %70 EtOH ile sterilize edilmeli veya kırılırsa değiştirilmelidir. Atık ve besleme PTFE'sini tutan epoksi, birkaç otoklav döngüsünden sonra kırılgan hale gelecek ve yeniden uygulanması gerekecektir.
      NOT: Turuncu renkli 2 duraklı E-lab hortumu, aşınma ve tekrarlanan otoklav döngülerinin neden olduğu akış hızı değişkenliğini sınırlamak için her çalışma arasında değiştirilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrointestinal sistemde bulunanlar gibi anaerobik bakterilerin büyümesini kolaylaştırmak için MBRA, anaerobik odaların içinde kurulabilir ve çalıştırılabilir. Karmaşık bakteri topluluklarını doğrudan insan vücudundaki ilgili bölgelerden büyütme yeteneğini göstermek için, bir insan dışkısı örneği hazırlandı ve bu sistemde büyütüldü. Tüm çalışmalar 37°C'ye ayarlanmış anaerobik bir odada gerçekleştirildi ve kültürler biyoreaktör ortamımız BRM37'de büyütüldü.

Dışkı bulamacı, insan dışkısının anaerobik olarak çözülmesi ve daha sonra fosfat tamponlu salin (PBS) ile ağırlıkça %'lik bir nihai konsantrasyona kadar karıştırılmasıyla hazırlandı. Steriliteyi doğruladıktan sonra, dokuz biyoreaktör odası, her biri 3 mL aynı dışkı bulamacı ile aşılandı. Mikrobiyal topluluklar, ortam girdisi veya atıkların uzaklaştırılması olmadan gece boyunca büyütüldü ve bu da 16 saatlik bir süre boyunca ayrı toplu kültürlerle sonuçlandı. Daha sonra, besleme pompaları açıldı ve saatte 1,92 mL'lik bir akış hızına ayarlandı. Dört günlük sürekli akıştan sonra, biyoreaktörlerden numuneler toplandı ve 16S rRNA gen dizilimi kullanılarak mikrobiyal topluluk bileşimi için analiz edildi, ardından QIIME 213'te Deblur ile gürültü giderme ve SILVA 138 SSU veritabanı ile taksonomik sınıflandırma yapıldı. Dokuz kopyanın tamamında toplam 65 cins tespit edildi, ancak biyoreaktörlere, her biri dokuz kopyanın herhangi birinde en az %2 bolluk içeren yalnızca 18 cins hakim oldu (Şekil 5). Biyoreaktörler, 65 cinsin 22'sinin dokuz kopyanın hepsinde tespit edildiği ve kopyaların en az yarısında ek 17 cins tespit edildiği kadar yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi. En az bir reaktörde bulunmayan cinslerin çoğunluğu (43 cinsten 37'si), her biri biyoreaktörlerde nispi bolluğu %2'nin altında olan nadir türlerdi. Özetle, sürekli akışlı MBRA kültürleri, her bir biyoreaktör odasında 16 saat boyunca ayrı kesikli kültürlerden sonra bile, aynı dışkı örneğinden türetilen karmaşık, tekrarlanabilir mikrobiyal toplulukları destekledi.

figure-results-1
Resim 1: Minibiyoreaktör Dizisi (MBRA). Besleme ve atık hattı boru ağacı, biyoreaktör odaları ve biyoreaktör şeridi için etiketler de dahil olmak üzere tamamen monte edilmiş MBRA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: PTFE aşındırma kılavuzu ve MBRA bağlantı noktası düzeni. (A) Ortamın aşındırılması ve atık PTFE pipetleri için izlenecek akış şeması. (B) Her biyoreaktör odası, bir ortam pipeti + dişli erkek luer, bir atık pipet + dişli erkek luer ve bir septum + dişli erkek luer için bir port içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: MBRA yem ve atık hattı ağaçları. (A) besleme hattı ağacı ve (B) atık hattı ağacının montajında izlenecek temsili resimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Medya şişesi kapağı ve atık katmanı sistemi. (A) Medyayı MBRA'lara çekmek için kullanılan monte edilmiş bir Q serisi şişe kapağı örneği. (B) Kademeli atık toplama sisteminin bir görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Bakteri cinslerinin nispi bolluğu. (A) Yığılmış çubuk grafik, görüntülenen örneklerin herhangi birinde en az %2 bolluk içeren tüm cinslerin nispi bolluğunu gösterir. (B) Gözlemlenen OTU'ların alfa çeşitliliği ölçümleri ve dokuz biyoreaktör odasının tümü arasındaki Shannon Çeşitliliği. Dokuz biyoreaktör odasının tümü, insan dışkısından hazırlanan aynı dışkı bulamacı ile aşılandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: MBRA bileşenleri. MBRA'yı tam olarak monte etmek için gereken tüm münferit parçaların görüntüleri ve açıklamaları ile her bir bileşen için gereken miktar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Sorun giderme kılavuzu. MBRA'nın çalıştırılmasıyla ilgili yaygın sorunlar, olası nedenleri ve önerilen çözümleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Minibiyoreaktör Dizisi şeritlerini 3D yazdırmak için Stl dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Biyoreaktörleri karıştırma plakalarına sabitlemek için kullanılan biyoreaktör tutucuların 3D baskısı için Stl dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3.: MBRA'lardan uzanan C-flex atıklarını ve besleme borularını düzenlemek için kullanılan tüp tutucuların 3D baskısı için Stl dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bakteri topluluklarının yüksek verimli bir şekilde yetiştirilmesi için bir Minibiyoreaktör Dizisinin (MBRA) tam montajını ve temel çalışmasını açıklar ve daha önce yayınlanan yönteme birkaç önemli iyileştirme içerir. MBRA sistemi, araştırmacıların karmaşık mikrobiyal ekosistemleri geliştirmelerine olanak tanıyan ve paralel olarak çok sayıda deneysel kopyayı destekleyen çok yönlü ve uygun maliyetli bir araç olmaya devam ediyor. Bu güncellenmiş sürümde, tekrarlanabilirliği artıran, iş akışını kolaylaştıran ve kontaminasyon riskini azaltan iyileştirmeler sunuyoruz. Bunlar arasında, ayrılmayı önlemek için kimyasal olarak kazınmış PTFE pipetleri (Şekil 2), biyofilm oluşumunu en aza indirmek için medya hattında bir besleme pipeti (Şekil 2), daha kompakt ve düzenli bir kurulum için eşlik eden bir 3D baskılı boru tutucusu (Ek Dosya 3) ile standartlaştırılmış boru uzunlukları ve deneyler arasında tam sökme ihtiyacını ortadan kaldıran optimize edilmiş bir yeniden kullanım protokolü bulunur. Birlikte, bu iyileştirmeler, laboratuvarımızdaki çeşitli deneysel uygulamalarda MBRA sisteminin kapsamlı kullanımı yoluyla geliştirilen yinelemeli iyileştirmeleri temsil eder. Bu tartışma, hem kritik montaj adımlarını hem de pratik iyileştirmeleri ele alarak, MBRA'nın mikrobiyom araştırmaları için sürekli gelişen bir model sistem olarak faydasının altını çizmektedir.

MBRA sisteminin başarısı, kontaminasyonsuz çalışmayı sağlamak için bileşenlerin hassas bir şekilde monte edilmesine ve sterilizasyonuna büyük ölçüde bağlıdır. Önemli adımlar, modüler montajı kolaylaştıran ve medya girişi ve atık toplamayı mümkün kılan Q serisi kapakların, boruların ve konektörlerin uygun şekilde takılmasını içerir. Medya şişeleri, atık rezervuarları ve biyoreaktör odaları arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak, sızıntıları önlemek ve steril koşulları korumak için çok önemlidir. Bir diğer kritik adım, deneyden önce peristaltik pompa akış hızlarının doğrulanmasıdır, çünkü tutarsızlıklar eşit olmayan ortam dağıtımına yol açabilir ve mikrobiyal büyüme dinamiklerini etkileyebilir. Kasetleri kullanan çok kanallı peristaltik pompaların çoğu, her kanalın akış hızına ince ayar yapmak için kullanılması gereken bir oklüzyon ayar mekanizması içerir. Uygun kalibrasyonla bile, E-lab hortumu birincil değişkenlik kaynağı olmaya devam etmektedir. Bunu azaltmak için, hem ilk dolum sırasında hem de deneylerin başlangıcı sırasında her bir biyoreaktör odasına giren ortam damlacıklarının sıklığını ve boyutunu görsel olarak izlemek önemlidir. Bu görsel kontroller, aksi takdirde deneysel tekrarlanabilirliği tehlikeye atabilecek akış hızı tutarsızlıklarının erken tespit edilmesini sağlar. Tablo 2 , MBRA'ların montajı ve kullanımı sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar için sorun giderme stratejileri sağlar. Bu sorun giderme adımları, deneyler arasında tekrarlanabilirliği sağlar ve uzun vadeli yetiştirme sırasında kesintileri önler.

Güçlü yönlerine rağmen, MBRA sisteminin deney tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken bazı sınırlamaları vardır. Daha gelişmiş sistemlerden farklı olarak MBRA, gerçek zamanlı optik yoğunluk (OD) ölçümleri, pH kontrolü ve sıcaklık regülasyonu gibi aktif izleme yeteneklerinden yoksundur. Bu aktif ölçüm eksikliği, sistemin mikrobiyal büyüme ve metabolik aktivitedeki dinamik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izleme yeteneğini kısıtlar. Ayrıca, sistem odalar içinde anaerobik yetiştiriciliği desteklerken, hassas mikroaerofilik veya CO2 ile zenginleştirilmiş ortamlar gerektiren uygulamaları sınırlayabilecek entegre gaz kontrolünü içermez. Bu tür bir kontrol gerektiren çalışmalar için, dahili gaz regülasyonuna sahip alternatif sistemler daha uygun olabilir.

MBRA sistemi, insan gastrointestinal sistemi 6,8,10 gibi dinamik ortamları taklit etmek için sürekli akış altında karmaşık bakteri topluluklarını yetiştirme yeteneğini korurken, yüksek verim, ölçeklenebilirlik ve maliyet etkinliği dahil olmak üzere mevcut biyoreaktör modellerine göre önemli avantajlar sunar. Kompakt, modüler tasarımı, birden fazla biyoreaktörün aynı anda çalışmasına izin vererek, dışkıdan türetilmiş toplulukların patojen istilasına karşı direnç açısından taranması gibi yüksek verimli çalışmalar için idealdir9. Bu modüler tasarım, kapsamlı deneysel esneklik sağlar: her şerit, bu protokolde gösterildiği gibi tek bir ortam şişesi veya her bir biyoreaktör odası için bir tane olmak üzere altı adede kadar farklı ortam kaynağı ile sağlanabilir. Çalışma hacmi, sıvı yüksekliğini ayarlayan her bir haznenin atık portuna yerleştirilen ince bir PTFE atık pipetinin uzunluğuna tabidir; Bu protokolde, 25 mm'lik pipetler 15 mL'lik bir çalışma hacmini korur, ancak pipetin kırpılması veya uzatılmasıyla 1-20 mL arasındaki hacimler elde edilebilir. Ek olarak, akışı hazne tabanına yönlendirmek için hazne girişine daha kısa besleme çubukları yerleştirilir, bu da medyanın hazne duvarlarından aşağı damlamasını önler ve doldurma hattının üzerinde biyofilm oluşumunu azaltır. Sistemin devir hızını değiştirmek için pompa hızları veya pompa borusu çapı da ayarlanabilir. Bugüne kadar, MBRA sistemi, antibiyotikler10, kanser ilaçları14 ve çeşitli diyet bileşikleri 12,15,16,17 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere yanıt olarak mikrobiyal toplulukların fonksiyonel ve bileşimsel değişikliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Basit, modüler tasarım, çeşitli deneysel ihtiyaçlara uyum sağlamak için idealdir. Örneğin, MBRA, kemostat benzeri koşullar18 altında biyofilmleri incelemek üzere modifiye edilmiştir ve planktonik kültürlerin ötesinde mikrobiyal ekoloji çalışmaları için çok yönlülüğünü göstermiştir.

MBRA sisteminin gelecekteki yinelemeleri, işlevselliğini, hassasiyetini ve verim potansiyelini artıran ek mühendislik yükseltmelerinden yararlanabilir. Bu tür bir geliştirme, her bir biyoreaktör odasına ek portların dahil edilmesidir. Bu bağlantı noktaları, pH, sıcaklık, gaz veya optik yoğunluk gibi çevresel parametrelerin aktif olarak izlenmesini desteklemek için kullanılabilir. Bu, gerçek zamanlı geri bildirim ve izlemeye izin vererek modelin en önemli sınırlamalarından birini ele alacaktır. Hazne veya port geometrisinde yapılan iyileştirmeler, daha kapsamlı ve erişilebilir temizliği kolaylaştırabilir, kalıntı birikimini ve renk bozulmasını azaltabilir ve uzun vadeli yeniden kullanılabilirliği iyileştirebilir. Ek peristaltik pompaların programlanabilir zamanlayıcılarla entegrasyonu, darbeli veya günlük ortam girişlerine izin vererek, insan bağırsağındaki besleme döngüleri gibi konakla ilişkili ortamları daha iyi simüle edecektir. Son olarak, kimyasal olarak dirençli, otoklavlanabilir polimerler gibi alternatif malzemelerle 3D baskı, daha geniş bir reaktif yelpazesiyle daha fazla dayanıklılık ve uyumluluk sağlayabilir. Birlikte, bu iyileştirmeler MBRA platformunun deneysel kapsamını ve aslına uygunluğunu önemli ölçüde genişletebilir.

Sonuç olarak, MBRA, kontrollü koşullar altında mikrobiyal toplulukların yetiştirilmesi ve incelenmesi için güçlü, yüksek verimli bir platform sağlar. Aktif izleme ve pH kontrolünde sınırlamaları olsa da, esnekliği, ölçeklenebilirliği ve maliyet etkinliği, onu özellikle yüksek tekrarlanabilirlik ve deneysel verim gerektiren çok çeşitli mikrobiyolojik çalışmalar için paha biçilmez bir araç haline getirir. Daha da önemlisi, sistemin modüler tasarımı ve üretim yaklaşımı, onu doğası gereği uyarlanabilir kılar; araştırmacılar MBRA'yı çok çeşitli deneysel hedeflere uyacak şekilde uyarlamaya devam ettiler ve edebilirler. Bu uyarlanabilirlik, MBRA'nın ortaya çıkan bilimsel sorular ve teknolojilerle birlikte gelişmeye devam etmesini ve mikrobiyom araştırmaları için çok yönlü bir platform olarak alaka düzeyini korumasını sağlar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH T32 Bulaşıcı Hastalıkların Moleküler Temeli Doktora Öncesi Bursu, NIH T32DK007664 ve NIH U19AI157981 Mikrobiyom Keşfi ve Mukozal Yüzeylerde Antibiyotik Direnciyle Mücadele Mekanizmaları tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar, bu sistemde kullanılan biyoreaktör tutucuların ve boru tutucuların tasarımına ve imalatına yaptığı katkılardan dolayı Hayden Curnyn'e teşekkür eder.

Şekil 2 ve Şekil 3 kısmen https://BioRender.com'da oluşturulmuştur

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  V-Tap Kılavuzu, Standart Boyutlar 0-80 ila 5/8"Büyük Timsah AraçlarıSTD500NP 
0.22 μ m şırınga filtresiBalıkçıSLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Karıştırma Sürücüsü (yalnızca sürücü)2MAGMF 41060 Serisi
Air-tite Hipodermik İğneler, 22G x3"VWR89219-274
BD 1mL Kayma Uçlu Steril Şırıngalar SterilBalıkçı14-823-434
BiyoreaktörProto-LaboratuvarlarNADMS Somos Havza Plastikten 3D baskı. Şablon için ek dosya 1'e bakın
Biyoreaktör TutucularProto-LaboratuvarlarNAPA 12 Siyah'tan 3D baskı. Şablon için ek dosya 2'ye bakın.
Diba Omnifit Q-Series Solvent Şişe Kapağı, GL38/38-430 (cam), 2 UNF(F) Portları Valfsiz, MaviCole ParmerEW-21942-86
Diba Omnifit Boru, PTFE, 1/8" (3.2 mm) OD x 1.5 mm IDCole ParmerEW-21942-76
Dibafit Adaptör, 1/4"-28 UNF(M) düz tabanlı - 3,2 mm ID, PEEKCole ParmerEW-21941-49
IRWIN 12001ZR Musluk Anahtarı #0-1/4" T-KoluAmazonB00004YOB0
Irwin Hanson Yüksek Karbonlu Çelik SAE Fraksiyonlu Musluk 1/4 in. 1 bilgisayarZoroG7695682
Loctite Ağır Hizmet Epoksi Hızlı Set 8-Sıvı Ons ŞişeAmazonB0044F59N0
Erkekten Erkeğe Luer Lock KonnektörüDarwin MikroakışkanlarDM-MM-LUER-PP Alternatif: Strategic Applications Inc Erkekten Erkeğe Luer Konnektör - 10/pk - Fisher - NC9876577
Masterflex Adaptör Bağlantı Parçaları, Luer'den Luer'e, Naylon, AvantorVWRMFLX45502-56
Masterflex Bağlantı Parçası, Naylon, Düz, Dişi Luer Hortum Barb Adaptörü, 1/16" IDVWRMFLX45502-00
Masterflex Bağlantı Parçası, Naylon, Düz, Dişi Luer Hortum Barb Adaptörü, 3/32" IDVWRMFLX45502-02
Masterflex Bağlantı Parçası, Naylon, Düz, Dişi Luer Hortum Barb Adaptörleri, 1/8"VWRMFLX45502-04
Masterflex Bağlantı Parçası, Naylon, Düz, Erkek Luer Lock to Hose Barb Adaptörü, 1/8VWRMFLX45505-04
Masterflex Bağlantı Parçası, Naylon, Düz, Erkek Luer x 1/4-28 UNFVWRMFLX45505-82
Masterflex Bağlantı Parçası, Polipropilen, Dirsek, Dişi Luer'den Dişi Luer AdaptörüVWRMFLX45508-26
Masterflex Ismatec Pompa Hortumu, 2-Stop, Tygon S3 E-Lab, 0.89 mm İç ÇapVWRMFLX96460-26
Masterflex Ismatec Pompa Hortumu, 2-Stop, Tygon S3 E-Lab, 1.14 mm IDVWRMFLX96460-30
Masterflex® Transfer Tüpü, C-Flex, Opak Beyaz, 1/8" İç Çap x 1/4" Dış Çap; 25 ftVWRMFLX06424-67
Mohr' s Pinchcock for Tubing VWR470201-374
Neopren Kauçuk Çamurluk Yıkama ½ ” OD x ¼ ” Kimlik x 1/16" Kalınlık AmazonB01A29F1R0
Hassas Conta Kauçuk SeptaSigma AldrichZ553905
Spinbar Mikro Karıştırma ÇubuklarıVWR58948-375
Tetra-AşındırmaRS Hughest ŞirketiTE-500 Standardı
Boru TutucuProto-LaboratuvarlarNAPA 12 Siyah'tan 3D baskı. Şablon için ek dosya 3'e bakın.
Watson-Marlow 205S Çok Kanallı Kartuş PompasıWatson-Marlow020.3724.00Aİndirimli, alternatif: Ismatec IPC Dijital Peristaltik Pompalar MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 veya Masterflex Ismatec IPC Peristaltik Pompa, 0,1 ila 11,25 rpm, 24 Kanal, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).">Gilbert, J. A., et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).
  2. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).">Sarkar, S., et al. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).
  3. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).">Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).
  4. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).">McDonald, J. A. K., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  5. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).">Feria-Gervasio, D., Denis, S., Alric, M., Brugère, J. F. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).
  6. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  7. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).">Robinson, C. D., Auchtung, J. M., Collins, J., Britton, R. A. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).
  8. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).
  9. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).">Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).
  10. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).">Hobson, C. A., et al. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).
  11. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).">Auchtung, T. A., Lerma, A. I., Schuchart, K., Auchtung, J. M. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).
  12. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).">Naimi, S., Viennois, E., Gewirtz, A. T., Chassaing, B. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).
  13. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).">Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
  14. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).">Hobson, C. A., et al. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).
  15. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).">Jensen, N., et al. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).
  16. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).">Ghimire, S., et al. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).
  17. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).">Hu, W., et al. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).
  18. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).">Jens, J. N., et al. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Minibioreactor ArrayGut MicrobiomeMicrobial CommunitiesContinuous Flow CultureIn Vitro Gut ModelHigh Throughput CultivationMicrobiome ResearchBioreactor AssemblyMicrobial Community AnalysisColonization Resistance

Related Articles