Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akut Lenfoblastik Lösemi için İndüksiyon Kemoterapisine Nüks Löseminin Murin Modeli

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

Bu makalede

Özet

Protokol, indüksiyon kemoterapisine yanıtın dinamiklerine dayalı olarak akut lenfoblastik löseminin nüksetmesine neden olan bir fare modelini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Özet

Akut lenfoblastik lösemi (ALL), olgunlaşmamış lenfoid öncü hücrelerin bir neoplazmıdır ve en sık çocukluk çağı malignitelerinden biridir. Pediatrik ALL'de kür oranları %90'a yaklaşsa da, nüks ve ilaç direnci zorluklar olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, kanser biyolojisinin in vivo olarak incelenmesi esastır ve murin modelleri kullanılarak hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) bu amaçla yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, nükseden örneklerden alınan PDX'ler - veya tanısal olanlarla karşılaştırıldığında - nüksün başlaması ve ilerlemesinin arkasındaki mekanizmaları tam olarak değerlendirmez. Bu protokol, farelerde B-ALL PDX nüksleri oluşturmaya dayanır ve ilaç direnci kazanma süreci boyunca lösemik hücrelerin toplanmasına izin verir. B-ALL PDX hücreleri ile aşılanan hayvanlar, ALL tedavisinde yaygın olarak kullanılan ve farklı etki mekanizmalarını temsil eden dört ilacın bir kombinasyonu ile tedavi edilir: deksametazon, vinkristin, L-asparaginaz ve daunorubisin. 4 haftalık bir remisyon indüksiyon aşamasından sonra, hayvanlar dinlenme döneminde nüksler açısından izlenir. Tedavi ve nüks döngüsü, nüksetme süresi kısalana kadar tekrarlanır ve artan in vivo ilaç direnci için bir vekil görevi görür. Nüks ve direncin altında yatan mekanizmaları araştırmak için, fenotipik ve genetik analiz için her tedavi döngüsünden önce ve sonra lösemik hücreler toplanır. Modeli doğrulamak için, 7 günlük kortikosteroid tedavisinden sonra periferik kanda patlamaların varlığı ve 15, 33 ve 78/96. günlerde minimal rezidüel hastalık (MRD) ile değerlendirilen hem iyi hem de zayıf yanıt verenler dahil olmak üzere farklı pediatrik ALL numuneleri test edildi. Farelerde gözlemlenen sonuçlar hasta verileriyle tutarlıydı ve modelin kemoterapiye klinik yanıtı taklit etmedeki doğruluğunu doğruladı. Bu yaklaşım, B-ALL'de nüks ve ilaç direncinin dinamik olarak incelenmesine olanak tanıyarak mekanik araştırmaları ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini destekler.

Giriş

Akut lenfoblastik lösemi (ALL) çocuklarda en sık görülen kanserdir. Yüksek gelirliülkelerde 5 yıllık genel sağkalımda %90'a ulaşan son yıllarda elde edilen yüksek iyileşme oranlarına 1 ve yeni tedavi stratejileri arayışındaki büyük çabalara rağmen, gelişmiş ülkelerde hastaların %15-20'si hastalıktan nüksetmektedir, kimlere karşı hayatta kalma oranı, ilk nüksün tanıdan erken (18 ay altında) veya daha sonra (36 ay) meydana gelmesine bağlı olarak %30-%60 arasında değişmektedir2, 3. Bunun ışığında, refrakter ve nüksetme ALL'nin üstesinden gelinmesi gereken zorluklar olmaya devam ediyor. Tanı açısından, refrakter ALL, kemoterapiye zayıf duyarlılık ile nüksten ayırt edilirken, nüks ALL, bir remisyon döneminden sonra hastalığın tekrarlaması ile karakterizedir. Diğer kanserlerde olduğu gibi, ALL, anöploidiler, kromozomal yeniden düzenlemeler ve farklı terapötik yanıtlar ve nüks riski ile ilişkili çeşitli gen mutasyonları dahil olmak üzere genetik anormallikler ile karakterizedir4. ALL nüksleri, halihazırda maksimum yoğunlukta kemoterapi almış olan yüksek riskli hastalarda daha sık meydana geldiğinden, ilaç dozlarında veya kombinasyonlarında daha fazla ayarlama yapılmasının yeterli olması olası değildir. Bunun yerine, çabalar ilaç direnci ve nüksün altında yatan mekanizmaları belirlemeye yönelik olmalıdır.

Bunun ışığında araştırmacılar, kemoterapinin uyguladığı seçim baskısının dirençli hücrelerin ortaya çıkmasına nasıl katkıda bulunduğunu anlamaya çalıştılar. Mevcut literatürün çoğu, nüksetmeyi, tanı 5 sırasında zaten mevcut olan dirençli bir malign alt klonun yayılmasına bağlar. Bununla birlikte, yakın tarihli bir çalışma, transkripsiyonel programları düzenleyen epigenetik modifikasyonlar gibi alternatif mekanizmaların varlığını öne sürmektedir ve bu da nüksetmeye katkıda bulunabilir6.

TÜM nüksleri incelemek için doğru in vivo modeller oluşturmak için önemli çaba sarf edilmiştir. İmmün yetmezliği olan fareler, orijinal hastalık özelliklerini 7,8 koruyarak ALL aşılama için başarıyla kullanılmış ve hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX'ler) geliştirilmesine yol açmıştır. Bu model, orijinal tümör/lösemi hücrelerinin uyumlu bir mikro ortamda aşılanmasına ve çoğalmasına izin verir. En büyük avantajlarından biri, nakledilen ALL hücrelerinin kemoterapiye yanıtını değerlendirme yeteneğidir9.

PDX modelleri ayrıca TÜM nüksleri taklit etmek ve incelemek için kullanılmıştır. Örneğin, Samuels ve ark.10 tarafından geliştirilen bir protokolde, indüksiyon benzeri bir kemoterapi rejimine direnç mekanizmalarını araştırmak için hasta lösemi hücreleri ile nakledilen obez olmayan diyabetik/şiddetli kombine immün yetmezlikli (NOD/SCID) fareler kullanılmıştır. Yazarlar vinkristin, deksametazon, L-asparaginaz ve daunorubisin (VXLD) ile tedaviyi tanımladılar ve tedavi döngülerinin sayısı ve nüks zamanlaması hakkında örnekler verdiler. Bununla birlikte, model, tedaviden hemen sonra hücreleri analiz etmeye odaklandı - ilk tedaviden sağ kurtulanlar - muhtemelen nüksetmeden ziyade minimal rezidüel hastalığı (MRD) temsil ediyor.

Daha yakın tarihli bir çalışma, ALL nakledilen NOD'un kısa süreli tedavisinin olup olmadığını değerlendirdi. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gama veya NSG) immün yetmezliği olan fareler, karşılık gelen hastalarda nüksetmeyi öngörebilir11. Hem nükseden hem de nüksetmeyen hastalardan alınan orta riskli ALL numuneleri farelere nakledildi ve vinkristin, deksametazon ve L-asparaginazdan (VXL) oluşan indüksiyon benzeri bir rejimle tedavi edildi. Aşılama süresi ve tedavi sonrası nüksler ölçüldü ve karşılaştırıldı. Sonuçlar, bu PDX modelinin hasta sonuçlarını tahmin etmek için prognostik bir araç olarak hizmet edebileceğini gösterdi. Bu bulgu, PDX fare modellerinin ALL nükslerinin biyolojisini incelemede faydasını desteklemektedir. Örneğin, nükseden hücreler, nüksün altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için farklı zaman noktalarında incelenebilirdi.

Bu yazıda, B-ALL nüksünü incelemek için PDX fare modelinde iyileştirmeler sunuyoruz. İndüksiyon kemoterapisi ile şekillendirildikten sonra hastalık nüksünü ve nüks eden hücrelerin özelliklerini incelemeyi amaçlıyoruz. Dört ilaçlı, indüksiyon benzeri bir rejim - vinkristin, deksametazon, L-asparaginaz ve daunorubisin - NSG fare suşu kullanılarak standardize edildi. Bu suşun, Prkdcscid mutasyonu ve genotoksik strese karşı artan duyarlılık nedeniyle tekrarlanan kemoterapi döngülerine dayanmada sınırlamaları olduğu bilinmektedir12. Bu nedenle, hayvan vücut ağırlığı, tedavi toksisitesinin bir belirteci olarak izlendi. B-ALL nüks modeli üç ana adıma ayrılabilir: (1) periferik kanda %0,2-1 insan CD45⁺ hücrelerinin aşılama eşiğini hedefleyen ALL hücrelerinin farelere nakli; (2) 4 haftalık kemoterapi tedavisi, ardından ilk nüksetmeye kadar dinlenme süresi (R1); ve (3) R1'in saptanması üzerine, tekrarlanan 1 haftalık indüksiyon tipi tedavi döngüleri. Sonraki nüksler (R2, R3... RN) oluşabilir ve tedavi ile nüks arasındaki aralık (Δt) kaydedilir. Δt'nin ilerleyici bir kısalması, edinilmiş ilaç direncinin bir göstergesi olarak yorumlanır. Nüks mekanizmalarına ilişkin daha derinlemesine araştırmaların bir parçası olarak, B-ALL hücreleri, protokolün farklı aşamalarından önce ve sonra toplanabilir. Nüksün ortaya çıkması ile hücre iyileşmesi arasındaki süreye bağlı olarak, bu fenomenin doğal mekanizmalarının korunmayabileceğini vurgulamak önemlidir. Bunun ışığında, nüks onayından sonra nüks hücrelerinin hızla toplanması son derece önemlidir. Toplanan hücreler, diğerlerinin yanı sıra hücre döngüsü dinamikleri, hücre göçü, lösemiyi başlatan hücre frekansı, kromozomal değişiklikler ve epigenetik modifikasyonların değerlendirilmesi dahil olmak üzere gelecekteki fenotipik ve genetik analizler için kullanılabilir.

Bu makalenin amaçları doğrultusunda, nükseden fare modelini açıklamaya odaklanacağız. Üç deneysel aşama için ayrıntılı bilgi sağlanacaktır - transplantasyon, ilk nüksetmeye kadar tedavi (R1) ve çoklu nükslere kadar döngüsel tedavi (R2, R3...). Bu modelin, araştırmacıların çeşitli alt tiplerden kemoterapiye dirençli B-ALL hücreleri üretmesine olanak tanıyacağını ve nüksetmeyle ilişkili hücresel ve moleküler değişikliklerin daha derinlemesine araştırılmasına olanak sağlayacağını umuyoruz. Sonuç olarak, bu, direnç mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir ve daha etkili ve kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Centro Infantil Boldrini'den Comissão de Ética no Uso de Animais'in (CEUA/Boldrini 0047-2024) düzenlemelerine ve etik kurallarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışmada kullanılan lösemi örnekleri, bilgilendirilmiş onam formu aracılığıyla hücrelerinin kullanımına izin veren Centro Infantil Boldrini'de tedavi edilen hastaların biyo-bankalı şişelerinden elde edildi. Proje, Kurumsal Etik Kurul (CAAE 34601120.7.0000.5376) tarafından onaylandı.

1. Lösemi hücre nakli ve aşılama izleme

  1. Fare nakli için lösemi örneklerinin hazırlanması
    1. Hastanın kemik iliği aspiratından alınan ALL hücrelerinin önceden dondurularak saklanmış örneklerini çözdürün. 37°C'ye ayarlanmış bir su banyosu kullanın. Kriyotüpü dairesel hareketlerle hareket ettirerek numuneleri çözün.
    2. Çözülmüş numuneyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri yıkamak ve kriyoprezervasyon solüsyonunu çıkarmak için numuneye 14 mL 1x steril PBS ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  2. Nakil solüsyonunun hazırlanması
    1. Çözülmüş hücreleri steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Nakledilecek her hayvan için 100 μL PBS hacminde 5-10 x10 6 canlı hücre kullanın. Transplantasyon Solüsyonunu transplantasyona kadar buz üzerinde tutun.
      NOT: Hücreler yarı otomatik yöntem13 izlenerek sayıldı.
  3. Fare nakli
    1. 2 aylık erkek veya dişi NOD'u seçin. Lösemi transplantasyonu için Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri.
      NOT: Hayvan cinsiyet müdahalesi içermeyen homojen bir deneysel tasarımı sürdürmek için, TÜM numuneler her iki fare cinsiyetine de nakledildi ve tüm iyi ve kötü yanıt veren lösemilerin her iki cinsiyette de eşit olarak temsil edilmesini sağladı. Sonuç olarak, dişi farelerin erkek farelerden daha erken aşılandığını bulduk. Bunu göz önünde bulundurarak, fare cinsiyetinin gelecekteki analizlere (aşılama kinetiği gibi) olası müdahalesini önlemek için, aynı lösemi örneğiyle çalışırken yalnızca bir fare cinsiyeti kullanmanızı öneririz. Bir cinsiyeti diğerine tercih etmek için başka hiçbir parametre kullanılmadı.
    2. Hayvanın uygun şekilde tutulmasını sağlamak için her seferinde bir fareyi güvenli ve onaylı bir fare kapanına yerleştirin. Hayvanın kuyruğunun tuzağın dışında olduğundan ve nakil için kolayca erişilebilir olduğundan emin olun.
      NOT: Lösemi hücreleri intravenöz (i.v.) enjeksiyon yoluyla farelere nakledilir. Yerleşik protokoller bu amaçla kuyruğun yan damarlarını kullanır11.
    3. Uygun damar genişlemesini sağlamak için kızılötesi ışık kullanın. Steril, keskin, tek kullanımlık bir enjeksiyon iğnesi kullanarak 100 μL Nakil Solüsyonu enjekte edin. Nakledilen fareleri patojen içermeyen belirli bir tesiste tutun. 15 gün dinlenmelerine izin verin.
      1. Kızılötesi ışığı kullanmak için, zaten kısıtlanmış olan hayvanı kafesin dışında ve ışıktan 30 cm uzakta tutun. Potansiyel ışık gücüne bağlı olarak, pozlama süresini ayarlayın. Orta güçte bir ışık kullanıldığında, damar genişlemesini sağlamak için 5 dakikalık bir süre yeterlidir. Kuyruğu daha uzun süre açıkta bırakmak hayvanda yanıklara ve strese neden olabilir.
      2. Enjeksiyon için, 1 mL hacimli ve 12,7 mm x 0,33 mm iğne boyutuna sahip, iğne takılı bir insülin şırıngası kullanın. Kullanılan iğnenin özellikleri Malzeme Tablosunda bulunabilir. Fareleri 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngü rejiminde tutun. Ek olarak, bu çalışmada kullanılan hayvanları, yuva oluşturmak için çevresel zenginleştirme ile otoklavlanabilir yarı saydam kehribar polikarbonat bir kafeste barındırın.
  4. Periferik kan toplama
    1. Aşılamadan 2 hafta sonra ve daha sonra her hafta her fareden 50 μL periferik kan örneği alın.
    2. Hayvanı sol elinizle elle tutun ve başının güvenli bir şekilde tutulduğundan emin olun. Sağ elinizle, hayvanın submandibular pleksusunun yüz damarını delmek için steril, keskin, tek kullanımlık bir neşter kullanın.
      NOT: Bu, fareler için potansiyel olarak zararlı bir prosedürdür ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
      1. Kısıtlama sırasında hayvanın rahat nefes alabildiğinden emin olun. Solunum hızındaki değişikliklere (nefes darlığı) ve ağız rengindeki değişikliklere (mor veya koyu maviye dönmemelidir) dikkat edin. Submandibular pleksus doğru şekilde delinmezse, kulak kanalı delinmesi nedeniyle kulakta kanama meydana gelebilir. Gelecekteki deneycilere rehberlik etmek için, pleksusun doğru konumunu sağlamak için Ek Şekil 1 mevcuttur.
        NOT: Alternatif olarak, kuyruk damarı kanamaları kan örnekleri toplamak için de kullanılabilir.
    3. Toplama işleminden sonra hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Aktif ve zarar görmemiş olmalıdır. Fare düşme (baş veya vücut) ve hareketsizlik belirtileri gösteriyorsa, ötenazi yapılmalıdır. Daha fazla miktarda kan hayvanın ölümüne neden olabileceğinden hacmi 50 μL'yi aşmayın.
    4. Numune pıhtılaşmasını önlemek için toplanan kan örneğini 8 μL 50 mM EDTA içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde saklayın.
      NOT: Burada, antikoagülan olarak önceden hazırlanmış bir EDTA çözeltisi kullandık. Tercih edilirse, kan alımı için piyasada bulunan düşük hacimli EDTA tüpleri de bu adımda kullanılabilir. Kan örneklerinin aynı gün işlenmesi gerekir.
  5. Periferik kan örneklerinin işlenmek üzere hazırlanması
    1. Kanı EDTA ile homojenize edin. Karışımın 50 μL'sini bir akış sitometri tüpüne aktarın.
    2. Seyreltici olarak anti-fare CD45 antikoru (mCD45), anti-insan CD45 antikoru (hCD45), anti-insan CD19 antikoru (hCD19) ve steril 1x PBS'den oluşan her numuneye eklenecek bir antikor karışımı hazırlayın.
  6. Kan örneklerinin işlenmesi
    1. Her kan örneğine 10 μL antikor karışımı ekleyin. İşaret parmağınızla hafifçe vurarak homojenize edin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Sitometrenin mevcut kanallarını göz önünde bulundurarak yukarıda açıklanan uygun antikorları seçin. Numune başına kullanılan antikor miktarını belirlemek için, her antikor için bir titrasyon eğrisi gerçekleştirmeyi düşünün. Çalışmamızda kullanılan antikorlar, florokromlar ve örnekler için seçilen hacim Ek Tablo 1'de listelenmiştir. Antikorların, katalog numaralarının ve klon adlarının tam bir açıklaması Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
    2. Her numuneye 1 mL ticari 1x Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lizis Çözeltisi ekleyin. İşaret parmağınızla kuvvetlice homojenize edin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu adımda kullanılan lizis çözeltisi, piyasada bulunan 10x RBC Lizis Çözeltisidir. Farklı bir reaktif kullanılıyorsa, lizis için 1x çalışma hacmi ayarlanmalıdır.
    3. İlk yıkama adımı için her numuneye 2 mL steril 1x PBS ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da (döner rotorda) santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek yavaşça atın ve tüpün üst kısmında kalan sıvıyı kağıt havluyla hafifçe kurulayarak kurulayın.
      NOT: Yıkama adımlarında, lösemi hücreleri sitometre tüpünün dibinde peletlenecek ve kalan sıvı atılacaktır. Numuneleri tutarken dikkatli olmak zorunludur, çünkü bazı durumlarda pelet fark edilemeyebilir. Peletin bütünlüğünü sağlamak için numuneyi sallamaktan kaçının çünkü bu, kaybolmasına neden olabilir.
    4. Adım 1.6.3'ü tekrarlayın. Sitometri tüpüne işaret parmağıyla hafifçe vurarak lösemi hücrelerini 200 μL steril 1x PBS ile yeniden süspanse edin. Numuneler akış sitometrisi ile analiz edilmeye hazırdır. Aşılama takibi kan alımı ile aynı gün yapılmalıdır.
  7. Akış sitometrisi ile aşılama izleme
    1. Fare CD45+ hücrelerine (% hCD45+) göre periferik kandaki insan CD45+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için standart akış sitometrisi metodolojilerini 9,14 kullanın.
    2. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak toplam CD45 hücreleri (hCD45+ artı mCD45+) üzerindeki hCD45+ yüzdesinin müteakip analizi için akış sitometrisi tarafından oluşturulan verileri toplayın.
      NOT: Aşılamanın uygun şekilde izlenmesini sağlamak için, aşağıdaki analiz adımları aynı gün yapılmalıdır. Bu günlük dizi, Pazartesi günü başlamasını önerdiğimiz gelecekteki tedavi programının başlangıcı düşünüldüğünde özellikle önemlidir. Pazartesi günü başlamanın imkansızlığı durumunda, periferik kanda %45+ (%0.2-%1) hCD+ elde edilmesine bağlı olarak tedaviye haftanın herhangi bir günü başlanabilir.
  8. Akış sitometrisi veri analizi için ortamın hazırlanması
    1. Akış sitometrisi analiz yazılımını başlatın. Toplanan verileri içe aktarın ve araç tarafından tanınmasını bekleyin.
    2. Lenfositler etiketli kapıyı oluşturmak için ilk numunedeki verileri açın. Eksen ayarlarını doğrulayın: X ekseni için FSC-A'yı ve Y ekseni için SSC-A'yı seçin. Üst kapı oluşturma panelinde, poly-liner aracını seçin ve ana hücre popülasyonunun ana hatlarını çizin.
      NOT: Lenfositler tipik olarak X ekseninde 50.000-100.000 ve Y ekseninde 0-50.000 arasında görünür. Değerler her löseminin özelliklerine göre değişiklik gösterebilir.
    3. Yeni bir kapı oluşturmak için Geçitli Nüfus'a çift tıklayın. Hücre çiftlerini dışlamak için, X ekseninde FSC-A'yı ve Y ekseninde FSC-H'yi ayarlayın. Birincil hücre popülasyonunu izole etmek için poli-astar aracını kullanın. Kapıyı, X ekseni boyunca uzaktaki olayları hariç tutarak popülasyonun etrafına yakın bir şekilde çizin.
      NOT: Bu adım, tek tek hücre olaylarını ayırt eder.
  9. Hücre popülasyonlarını ayırt etmek için sitometri panelinin oluşturulması
    1. İnsanı fare CD45 hücrelerinden ayırt etmek için Seçilen Popülasyon'a çift tıklayın. X eksenini mCD45 floroforuna ve Y eksenini SSC-A'ya ayarlayın. Şekil aracını kullanarak mCD45 negatif popülasyonun etrafına bir kare çizin.
    2. hCD19+ ve/veya hCD45+ hücrelerini ayırt etmek için Ortaya Çıkan Popülasyon'a çift tıklayın. X eksenini hCD19 floroforuna ve Y eksenini hCD45'e ayarlayın. Kapı oluşturma panelinde, farklı popülasyonları ayırmak için Dikey Çizgiler'i seçin.
      NOT: Alternatif olarak, araştırmacı hCD45 ve mCD45 hücrelerini ayırt etmek için kapıyı veya olasılığı kullanabilir. Bu olasılık, olayların toplamını %100 olarak kabul ederek popülasyonları tanımlamak için daha kesin bir strateji oluşturur.
  10. Oluşturulan panele istatistik uygulama
    1. Elde edilen tüm olaylara göre izole edilmiş her hücre popülasyonunun yüzdesini hesaplayın. Ana yazılım penceresinde, her örneğin ana grafiğinden türetilen Alt Grafik simgesine sağ tıklayın ve İstatistik Oluştur'u seçin. Açılan pencerede Sıklık'a tıklayın ve Tek Hücreler'i seçin. Bu adımı her subgraph için ayrı ayrı gerçekleştirin.
    2. Geçit stratejisini ve ilişkili istatistikleri tüm örneklere uygulamak için yapılan tüm değişiklikleri seçin. Ardından, farenin sol düğmesini kullanarak seçilen değişiklikleri ana yazılım penceresindeki Tüm Örnekler seçeneğine sürükleyin.
    3. Hesaplanan tüm frekansları içeren bir tablo oluşturmak için ana pencerede Tablo Düzenleyici'ye tıklayın. Açılan pencerede .xls dosya biçimini seçin, hedef klasörü belirleyin ve Tablo Oluştur'a tıklayın.
      NOT: Akış sitometrisi analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilen tüm adımlar Ek Şekil 2'de görselleştirilebilir. Bu adımla oluşturulan son tablo, zaman içinde aşılama ilerlemesini analiz etmek için grafikler oluşturmak için gerekli olan hCD45+ yüzdesini içerir.
  11. Aşılama ilerlemesinin çizilmesi
    1. Bir grafik çizme ve analiz yazılımı başlatın. XY Tablo Formatı'nı seçin. Ana pencerede, Verileri Yeni Tabloya Gir veya Al'ı seçin, X'i Sayılar olarak ayarlayın ve Y'yi yan yana alt sütunlardaki yineleme değerlerini girin.
    2. Açılan tabloda sütun başlıklarını düzenleyin: X sütunu için aşılama günleri ve ilk Y alt sütun grubu için PB'de % hCD45+ girin. X sütununu, aşılama izleme için kan alma günlerine karşılık gelen enjeksiyondan sonraki günlerle tamamlayın. Y alt sütunlarına her fare için haftalık toplanan hCD45+ veri yüzdesini manuel olarak girin.
    3. Yazılım menüsünde, Aile alt kümesi altında Veri 1'i seçin. Açılır pencerede, Noktalar & Bağlantı Hattı ile Hata Çubukları adlı ikinci grafik seçeneğini seçin ve ortalama ve hata çubuklarının çizilmesini etkinleştirin.
    4. Grafik eksenlerini istediğiniz aralıklara ayarlayın. Son grafiği indirmek için menünün sağ üst köşesindeki Dışa Aktar'a tıklayın.
      NOT: Herhangi bir ALL ile yapılan deneyler sırasında toplanan tüm veriler, deneyin başlangıcından bu yana zaman içinde analizleri kolaylaştırmak için aynı grafik üzerinde çizilmelidir. Grafik çiziminin açıklayıcı bir örneği Ek Şekil 3'te bulunabilir.

2. Farelerin tedavisi

  1. İlaç çalışma solüsyonlarının hazırlanması
    1. 1 mg/mL konsantrasyonda vinkristin çalışma solüsyonu hazırlayın. 4 mg/mL'de bir deksametazon çalışma solüsyonu hazırlayın. L-asparaginaz çalışma solüsyonunu 2.000 IU/mL'de hazırlayın. Daunorubisin çalışma solüsyonunu 2 mg/mL'de hazırlayın.
      NOT: Bu protokolde kullanılan ilaçlar, hastaların klinik tedavisinde kullanılanlara eşdeğerdir15. Deksametazon çalışma solüsyonu aracı, kreatinin, sodyum sitrat dihidrat, sodyum hidroksit, sodyum bisülfit, metilparaben, propilparaben ve enjeksiyonluk sudan oluşur. Vincristine çalışma solüsyonu aracı, mannitol, sülfürik asit, sodyum hidroksit ve enjeksiyonluk sudan oluşur. L-asparaginaz ve daunorubisin sıklıkla liyofilize formda bulunur. Bu gibi durumlarda, sulandırma için önerilen araç, doğru konsantrasyonu elde etmek için kullanılması gereken enjeksiyonlar için steril sudur. Tekrarlanan çözülme döngüleri nedeniyle ilaç aktivitesi kaybını önlemek için, ilaçlar 3x'ten fazla kullanılmayan çalışma kısımlarına bölünmelidir.
  2. Lösemi tespit edildiğinde tartılan hayvanlar
    1. Farelerin periferik kanındaki hCD45+ hücrelerinin yüzdesinin medyan %0,2 ile %1 arasında bir aralığa ulaştığı noktada tedaviyi başlatın. Ulaştıktan sonra, nakledilen fareleri iki farklı gruba ayırın: biri tedavi görecek, diğeri kontrol görevi görecek.
    2. Belirlenen eşiğe ulaşıldığında, lösemi ilerlemesinin haftalık olarak izlenmesine devam edin. Tedaviye yanıtı, nükslerin oluşumunu ve ilaç direncinin tespitini izlemek için sürekli olarak %45 hCD45 verilerini toplayın.
    3. Tedavi edilecek hayvanları tartın. Gruba uygulanacak her ilacın dozunu belirlemek için ağırlıkların aritmetik ortalamasını kullanın. Gruplar arasındaki kilo alımını/kaybını karşılaştırmak için kontrol grubu hayvanlarını tartın.
      1. Aşağıdaki ilaç dozlarını kullanın: vinkristin, 0.15 mg/kg; deksametazon, 5 mg/kg; L-asparaginaz, 1.000 IU/kg; ve daunorubisin, 1.2 mg/kg. Tüm hayvanları haftada en az 3 kez tartın: Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri. İlaçların tedavi dozlarını ayarlamak ve tedavi toksisite seviyesini izlemek için ağırlıkları kullanın.
  3. Çalışma solüsyonu alikotlarından ilaç uygulama solüsyonlarının hazırlanması
    NOT: İlaç uygulama solüsyonları, seyreltici olarak steril 1x PBS'den ve haftanın her günü uygulanan doğru hacimde (hayvanın ağırlığına göre) çalışan ilaç solüsyonlarından (steril su sadece sulandırma için kullanılır, enjeksiyon için değil) oluşur. İntraperitoneal olarak uygulanan ilaçlar aynı solüsyonda birleştirilebilir; Bununla birlikte, herhangi bir ilaç intravenöz olarak uygulanırsa, bireysel bir solüsyona yerleştirilmelidir. Her hayvana uygulanacak ilaç uygulama solüsyonunun hacmi 100 μL'dir.
    NOT: Yukarıda açıklanan adımda iğneli steril bir insülin şırıngası (1 mL, iğne boyutları 12.7 mm X 0.33 mm) kullanılmıştır. Şırınganın tam bir açıklaması Malzeme Tablosunda bulunabilir.
    1. Pazartesi günü, deksametazon, vinkristin ve PBS'den oluşan bir ilaç uygulama solüsyonu hazırlayın. İlaçları intraperitoneal olarak uygulayın.
    2. Salı ve Perşembe günleri deksametazon, L-asparaginaz ve PBS'den oluşan bir ilaç uygulama solüsyonu hazırlayın. İlaçları intraperitoneal olarak uygulayın.
    3. Çarşamba günü, deksametazon ve PBS'den oluşan bir ilaç uygulama solüsyonu hazırlayın ve intraperitoneal olarak uygulayın. Daunorubisin ve PBS'den oluşan ikinci bir ilaç uygulama solüsyonu hazırlayın. İntravenöz olarak uygulayın.
    4. Cuma günü, deksametazon ve PBS'den oluşan bir ilaç uygulama solüsyonu hazırlayın. İlacı intraperitoneal olarak uygulayın.
    5. Hafta sonu günlerinde hayvanların dinlenmesine izin verin. Tedavi döngüsünü 4 hafta boyunca tekrarlayın.
      NOT: Kapsamlı bir tedavi programı Ek Tablo 2'de bulunabilir. Fare tedavisi için halihazırda oluşturulmuş diğer protokollerin test edildiğini, ancak NSG suşu için yüksek düzeyde toksisite ile sonuçlandığını açıklığa kavuşturmak önemlidir. Bu nedenle, önerilen tedavi programı ilk olarak toksisitenin azaltılması için bir standardizasyon sürecine tabi tutulmuş, bu da bu protokolde sunulan dozlar ve uygulama sıklığı ile sonuçlanmıştır. Tedavi uygulanan gruba bağlı olarak tedavi edilen gruptaki hCD45+ yüzdesinin, kontrol grubundaki hCD45+ yüzdesine göre azalması beklenmektedir.
  4. İlaç uygulaması ve lösemi yanıtının izlenmesi
    1. İlaçları intraperitoneal olarak uygulamak için hayvanı sol elinizle manuel olarak kısıtlayın. Hayvanı karın kısmı yukarıda olacak şekilde tutun. Ventral kısımda sağ alt kadranı bulun.
    2. Sağ elinizle steril, keskin, tek kullanımlık bir enjeksiyon iğnesi kullanın ve farelerin sağ alt kadranına 100 μL ilaç uygulama solüsyonu enjekte edin.
      NOT: Hayvanı zapt ederken dikkatli olun; fareler için zararlı bir işlem olmamalıdır. Kan alımında olduğu gibi, herhangi bir solunum komplikasyonunun farkında olun. İntraperitoneal enjeksiyonlarda, organ delinmesini önlemek için iğneyi daima dik tutun.
    3. İlaçları intravenöz olarak uygulamak için lösemi hücrelerini nakletmek için kullanılan talimatların aynısını izleyin. Farelerin, burada ilk nüks (R1) olarak adlandırılan TÜM hücrelerin yeniden ortaya çıkmasına kadar 4 haftalık tedavi uygulamasından sonra dinlenmesine izin verin.
      NOT: Uygulama yolundaki farklılığa rağmen, intravenöz enjeksiyon intraperitoneal olarak enjekte edilenle aynı hacmi kullanır.
  5. Lösemi yanıtının izlenmesi ve ilk nüksün saptanması ( R1 )
    1. Tedavi veya dinlenme aşamalarında löseminin haftalık akış sitometrisi izlemesini bırakmayın.
      NOT: Haftada 5 gün tedavi göz önüne alındığında, izlemenin hafta başında yapılması şiddetle tavsiye edilir. Çalışmamızda kan alımı, örnek işleme ve analiz işlemleri her zaman Pazartesi günleri yapıldı.
    2. Kan alma ve izleme için gerekli sonraki prosedürleri 1.4 - 1.11 adımlarına göre gerçekleştirin.
      NOT: Verilen dinlenme süresinden sonra, R1 hücreleri, farelerin periferik kanındaki hCD45 + yüzdesindeki ani artışla tespit edilecektir. Tedavinin bitimi ile nüksün ortaya çıkması arasındaki süre değişkendir ve taranan her lösemi için farklı olabilir. R1'in tespitinde, önerilen fare nüks modelinin üçüncü ve son aşaması gerçekleştirilmelidir. İzleme ve yanıt analizlerini iyileştirmek için, Randall ve ark. (2024)16.

3. Dirençli hücreler ortaya çıkana kadar tekrarlanan tedavi döngüleri

  1. İlk nüksün tespiti
    1. Lösemi nüksü olan (R1 olarak adlandırılan) herhangi bir fareye, yani periferik kanda %0.2 hCD45+ eşiğine ulaşıldığında tam bir haftalık indüksiyon tipi tedavi uygulayın. 1 hafta boyunca, Pazartesi-Cuma arasında, 4 haftalık indüksiyon tipi tedavi için kullanılan ilaç uygulama programını takip edin.
      NOT: Bu noktada sadece 1 haftalık tedavinin uygulanması, lösemi hücrelerinin kemoterapiye direnç kazanıp kazanmadığını in vivo olarak test etmeyi ve sonunda löseminin kemoterapi baskısı altında zaman içinde ardışık nükslere ilerlemesini sağlamayı amaçlamaktadır. Aşırı toksisiteyi ve hayvan kaybını önlemenin bir yolu olarak ikinci bir 4 haftalık program uygulamamayı seçtik.
    2. İlaç uygulamasının tam haftasının sonunda farelerin dinlenmesine izin verin. 1.4 - 1.11 adımlarını izleyerek akış sitometrisi ile lösemi yanıtının haftalık izlenmesine devam edin.
      NOT: Bu noktada, lösemi hücrelerinin tedaviye yanıt vermesi beklenir. Sonuç olarak, lösemi izlenirken, farelerdeki hCD45+ yüzdesi azalmalı ve belirli bir süre negatif kalmalıdır.
  2. R2 görünümünün izlenmesi
    1. Nüks R2'nin görünmesini bekleyin (hCD45+ hücreleri %0,2≥). Göründüğünde, tedavinin sonu ile R2'nin ortaya çıkması arasında geçen süreyi sayın. Bu döneme Δt1 adını verin.
    2. İndüksiyon tipi tedavi uygulamasının ikinci bir tam haftasına geçin. Bu programın ilk uygulamasıyla aynı yönergeleri izleyin.
    3. Tedavinin sonunda farelerin dinlenmesine izin verin. Lösemi izlemeye devam edin.
  3. R3 görünümünü izleme
    1. Nüks R3'ün görünmesini bekleyin. Zamanı adım 3.2.1'dekiyle aynı şekilde sayın. Buna Δt2 deyin.
    2. Δt1 ve Δt2'yi karşılaştırın. Birden fazla lösemi nüksü elde etmek için yukarıdaki adımları N kez tekrarlayın (R1, R2... RN) Δt periyodu aynı kalırsa. Δt süresi kısaldığında tedavi döngülerini durdurun.
      NOT: Nüksetmeye karşı Δt'deki azalma, lösemi hücreleri tarafından kazanılan ilaç direncinin bir göstergesidir. Bu sonuç, farelerin nüks modelinin kemoterapiye dirençli ALL hücreleri üretme yeteneğini güçlendirir.
    3. Aşağıdaki 4. adımda açıklandığı gibi lösemi hücrelerini kurtarın. Bunları kriyoprezervasyon veya amaçlanan sonraki analizlerle uyumlu herhangi bir koruyucu madde ile canlı olarak saklayın.
      NOT: Lösemi hücrelerinin iyileşmesi için önerilen olay, son literatürde16 açıklandığı gibi, periferik kandaki hCD45+'nın% 25'ine kadardır.

4. Organ toplama yoluyla lösemik hücrelerin geri kazanılması

  1. Aşırı dozda kimyasal anestezik ile fare ötenazisi
    1. Fareleri aşırı dozda kimyasal anestezik ile ötenazi yapın, ardından aşağıda açıklandığı gibi ötenazi onayı için servikal çıkık yapın.
    2. Derin anestezi için steril 1x PBS'de seyreltilmiş üç anestezik içeren bir karışım hazırlayın. Ötenazi yapılacak her hayvan için 150 μL ticari Asepromazin maleat, 50 μL ticari Ksilazin, 80 μL ticari Ketamin ve 220 μL PBS kullanın.
    3. Hazırlanan karışımın 500 μL'sini intraperitoneal enjeksiyonla uygulayın. Adım 2.4'te açıklanan aynı kısıtlama ve enjeksiyon yönergelerini izleyin.
    4. Aşırı dozda kimyasal anesteziklerin etkisi altında fareler kafesin dibine uzanacaktır. Birkaç dakika sonra, farelerin solunum durması olup olmadığını gözlemleyin. Eğer öyleyse, solunum çabasının durmasını bekleyin. Ötenazi prosedürünün etkili olduğunu doğrulamak için, hayvanın arka ayaklarından birine baskı uygulayarak istemsiz bir refleksin varlığını kontrol edin. Ötenaziyi doğrulamak için servikal çıkığa geçin.
  2. Servikal çıkık
    1. Hayvanı vücudunun arkası kafes besleme ızgarasına gelecek şekilde tutun. Cımbız şeklini oluşturmak için sol elin işaret ve başparmak parmaklarını kullanın. Cımbız şeklindeki parmakları doğrudan hayvanın başının altına yerleştirin. Omurganın servikal kısmına sıkıca bastırın.
    2. Hayvanın kuyruğunu sağ elinizle kavrayın. Hayvanın kafası vücudunun geri kalanından ayrılana kadar sert ve sabit bir hareketle geri çekin.
      NOT: Servikal çıkık, ötenazi 17,18,19'u doğrulamak için kabul edilen yöntemlerden biridir. Solunum durmasından sonra en az 15 dakikaCO2'ye sürekli maruz kalma gibi diğer yöntemler alternatif olarak kullanılabilir.
  3. Organ toplama için hayvan hazırlığı
    1. Fareleri tüm vücutlarına %70 alkol uygulayarak sterilize edin. Hayvanın vücudunu, ventral kısmı yukarı gelecek şekilde kemirgenler için cerrahi bir platformun üzerine yerleştirin. Vücudun karın kısmını tıraş edin.
      NOT: Kemirgenler için cerrahi ameliyat platformunun tam bir açıklaması Malzeme Tablosunda bulunabilir.
  4. Dalak hasadı
    1. Karın derisinde steril cerrahi makas ve cımbızla küçük bir kesi yapın. Peritonu açığa çıkararak karın bölgesinden çıkarın.
    2. Peritonda küçük bir kesi yapın. Karında bulunan organlara tam erişim sağlanana kadar kesin.
    3. Dalağı, hayvanın midesinin hemen altına yerleştirin. Dalağı çıkarın. Daha fazla işlem için steril 1x PBS içeren bir alıcıya yerleştirin.
  5. Femur hasadı
    1. Hayvanın arka ayaklarına erişmek için periton boşluğunu açmaya devam edin.
    2. Femurun yerini belirleyin. Pelvis kemiği, tibia ve fibula ile birleştiren eklemleri keserek çıkarın. Bu işlemi her iki femur kemiği için de yapın.
    3. Kalan kas, deri veya dokuyu çıkararak kemikleri temizleyin. Daha ileri işlemler için bunları steril 1x PBS içeren bir alıcıya yerleştirin. Hayvanın karkasını Hayvan Etik Kurulu'nun yönergelerine göre atın.
      NOT: Çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, TÜM hücreler karaciğer, merkezi sinir sistemi, timus, lenf düğümleri vb. Bu yazıda, örnek olarak, dalak ve kemik iliğinden TÜM hücrelerin toplanmasını açıklıyoruz.
  6. Organ işleme için hazırlık
    1. Bir adet 50 mL steril santrifüj tüpü, iki adet 1 mL steril şırınga, bir adet steril 25 mm x 0,6 mm hipodermik iğne ve iki adet steril 70 μm hücre süzgeci toplayın.
  7. Dalak işleme
    1. Bir hücre süzgecini 50 mL'lik açık bir santrifüj tüpünün üstüne yerleştirin. Dalağı hücre süzgecinin yüzeyine koyun. Büyük kısımlar görünmeyene kadar organı şırınga pistonunun düz kısmıyla yumuşatın.
    2. Masere dalağa steril 1x PBS ekleyin. Hücre filtrasyonunu sağlamak için şırınga pistonunun düz kısmı ile dairesel hareketler yapın.
      NOT: PBS dökümü kademeli olarak yapılabilir; ancak kullanılan nihai hacim 6 mL'yi geçemez. Dalak işleminin tamamlanmasının ardından, hücre süzgeci berrak olmalı ve herhangi bir kalıntı doku içermemelidir. Hücre süzgecinin doyması durumunda alternatif bir hücre süzgeci kullanmak mümkündür. İlk süzgecin içeriği ikinci süzgecin içine aktarılabilir ve daha sonra işleme devam edilebilir. Bu organ içindeki tümör yüküne erişmek için dalağın bir kısmı histopatolojik değerlendirme için ayrılabilir.
  8. Kemik iliği işleme
    1. Halihazırda kullanılmış santrifüj tüpüne kemik iliği işleme için yeni bir hücre süzgeci ekleyin. Kemik iliği açıklıklarına erişilene kadar femur kemiğinin kenarlarını kesin. Hipodermik iğneyi yeni bir şırıngaya yerleştirin. Şırıngaya 1 mL steril 1x PBS ekleyin.
      NOT: Çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, dalak ve kemik iliğinden elde edilen TÜM hücreler ayrı ayrı toplanmalıdır. Bu durumda her doku için ayrı bir santrifüj tüpü kullanılmalıdır. Femurun bir kısmı, bu organ içindeki tümör yükünü değerlendirmek için histopatolojik değerlendirme için ayrılabilir.
    2. Hücre süzgecinin üzerine kemik iliği yıkaması uygulayın. İğne ucunu kemik iliği açıklığının bir tarafına sokun. Şırınga pistonunu sert ve sabit bir hareketle itin. İşlemi diğer femur kemiği ile tekrarlayın.
    3. İğneyi ayırın. Yıkanmış kemik iliğini yumuşatmak için şırınganın düz kısmını kullanın. Masere kemik iliğine steril 1x PBS ekleyin. Hücre filtrasyonunu sağlamak için şırınga pistonunun düz kısmı ile dairesel hareketler yapın. İşleme prosedürünün tamamlanmasının ardından, 50 mL'lik santrifüj tüpü, PBS içinde seyreltilmiş dalak ve kemik iliği hücrelerinin bir karışımını içeren toplam 10 mL'lik bir hacim içerecektir.
      NOT: PBS dökme işlemi kademeli olarak gerçekleştirilebilir; ancak kullanılan nihai hacmin 2 mL'yi geçmediğinden emin olmak zorunludur.

5. Lösemik hücrelerin gradyan santrifüjleme ile izolasyonu

  1. Lösemik hücre izolasyonu için hazırlık
    1. Bir adet 15 mL'lik santrifüj tüpü, steril tek kullanımlık Pasteur pipetleri, işlenmiş organları içeren 50 mL'lik santrifüj tüpü ve lenfosit izolasyonu için yoğunluk gradyan ortamını toplayın.
      NOT: Ortam, santrifüjleme yoluyla bir yoğunluk gradyanı oluşturarak mononükleer hücrelerin izolasyonunu kolaylaştırır. Mononükleer hücreler (lenfositler, monositler ve ALL hücreleri), ortam ve plazma arasındaki arayüzde bir katman oluşturur.
  2. Lösemik hücre izolasyonu
    1. Tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak 15 mL'lik santrifüj tüpüne lenfosit izolasyonu için 5 mL yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Dalak ve kemik iliği hücrelerinin karışımının 10 mL'sini yavaş yavaş orta tabakanın üzerine ekleyin. Tüpü yaklaşık 30° veya daha az sığ bir açıyla tutun ve yoğunluk ortamı tabakasının bozulmaması için hücre karışımını tüp duvarı boyunca yavaşça ekleyin.
      NOT: Hücrelerin yoğunluk ortamıyla karışmamasını sağlamak için bu işlem sırasında dikkatli olun. Bu işlem sırasındaki rahatsızlık, santrifüjleme sırasında yoğunluk gradyanı oluşumunun başarısız olmasına neden olabilir.
    2. Oluşan fazları bozmamak için 15 mL'lik tüpü 420 x g'da döner kova rotoru üzerinde 30 dakika boyunca hızlanmadan ve ara vermeden santrifüjleyin.
      NOT: Lösemik hücreler, yoğunluk ortamı ile sulu fazlar arasında bir tabaka oluşturacaktır.
    3. Steril tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak üst sulu fazı çıkarın ve atın. Steril tek kullanımlık bir Pasteur pipeti ile oluşturulan lösemik hücre tabakasını toplayın. Yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Düşük yoğunluklu orta tabakanın bir kısmı lösemi hücreleriyle birlikte pipetlenirse endişelenmeyin.
  3. Lösemik hücrelerin yıkanması
    1. Toplanan hücreleri içeren tüpe 15 mL sınırına ulaşılana kadar steril 1x PBS ekleyin.
    2. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'dasantrifüjleyin. Maksimum hızlanma ve frenlemeyi geri yükleyin. Süpernatanı çıkarın ve atın. Hücreleri yeni steril soğukta yeniden süspanse edin 1x PBS.5.3.3.Hücre ve hücre canlılığı kontrolüne geçin. Standart hücre sayımı prosedürü yönergelerini izleyin13. Yıkanan hücreler, anti-fare CD45 antikoru (mCD45), anti-insan CD45 antikoru (hCD45) ve anti-insan CD19 antikoru (hCD19) ile boyanabilir, ardından yıkama adımları ve veri toplama yapılabilir.
      NOT: Dalak hücrelerinin ve kemik iliği hücrelerinin farklı santrifüj tüplerinde işlenmesi durumunda, bu örneklerin bir kısmı akış sitometrisi yoluyla bu organlardaki tümör yüküne erişmek için kullanılabilir.
  4. Lösemik hücrelerin dondurularak saklanması
    1. Hücreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın. Hücreleri buz üzerinde tutun.
    2. %90 steril soğuk fetal sığır serumu (FBS) ve %10 dimetil sülfoksitten (DMSO) oluşan bir dondurma ortamı hazırlayın. Her kriyoprezervasyon şişesi için bu çözeltiden 1 mL kullanın.
    3. Buz üzerinde, hazırlanan çözeltideki hücreleri 2 x 107 hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Hücreleri kriyoprezervasyon tüplerine ayırın. Standart hücre kültürü kriyoprezervasyon yönergelerini izleyerek hücreleri kriyoppreserve edin20.
      NOT: Bu hücreler daha ileri analizler için kullanılabilir. Canlı hücreleri dondurmak yerine, sonraki DNA, RNA, protein ve metabolit analizleri için hücreler farklı koruyucularda bölünebilir ve korunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çalışmalarımız bağlamında, öncü B hücresi ALL örnekleri iki hasta grubundan seçildi: biri 8. gün periferik kanda lösemik hücrelerin yokluğu ve 15, 33 ve 78/96. günlerde kemik iliğinde rezidüel lösemi hücrelerinin yokluğu ile belirlendiği üzere olumlu yanıt gösterdi. Diğer grup, Tablo 1'de gösterildiği gibi, Minimal Rezidüel Hastalık (MRD) ile değerlendirilen zayıf klinik yanıtı olan hastalardan elde edilen, öncekilerin moleküler alt grupl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Neoplastik hastalıkların altında yatan biyolojik mekanizmaların anlaşılması, daha etkili tedavilerin geliştirilmesi ve hasta sonuçlarının iyileştirilmesi için esastır. Pediatrik akut lenfoblastik lösemi gibi durumlarda, bu araştırma yaklaşımları yalnızca artan tedavi oranları için geçerli olmakla kalmaz, aynı zamanda standart tedavilerin terapötik yoğunluk ve tolere edilebilirlik sınırlarına ulaştığı hastalar için de özel bir değere sahiptir. Nüks ve tedavi direnci ortamında, zorluk artı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Centro Infantil Boldrini'ye ve çalışma için örneklerini bağışlayan tüm hastalara teşekkür ederiz. Manuella M. Hoff, São Paulo Araştırma Vakfı'ndan Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) tarafından burs aldı (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes, Ulusal Teknolojik ve Bilimsel Kalkınma Danışmanı'ndan (CNPq, 308399/2021-8) üretkenlik bursu aldı. Bu çalışma, Brezilya Sağlık Bakanlığı'nın PRONON programı (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45) tarafından sağlanan araştırma fonu ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL  şırıngaBD #309628Organ toplama
Enjeksiyon için 10 mL steril suHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/İlaç yeniden yapılandırılması
10X RBC Liz ÇözümüBioLegend#420302Fare kan örneği işleme
5 kanallı hücre analizörüBD Biosciences658226R1Akış Sitometresi 
70 uM Hücre SüzcüFalcom#352350Organ toplama
Acepromazine maleate Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Fare anestezisi
APC anti-insan CD45 - izotip fare IgG1 - HI30 klonuBioLegend#304037Lenfosit boyama
Asparaginase 10000 UAgenaz/medac#88660100Fare tedavisi
Brilliant-Violet 605 anti-fare CD45 - izotip fare IgG2 - 30-F11 klonuBioLegend#103139Lenfosit boyama
DaunorubicinFarmarin#116880025Fare tedavisi
DeksametazonAché#00000066Fare tedavisi
Dimetil sülfoksitSigma-Aldrich#589569Lenfositlerin kriyokonserasyonu
Tek kullanımlık iğne - 0.60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388Organ toplama
Esteril tek kullanımlık lancet Yancheng Huida Tıbbi Aletleri https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Fare kanı toplama
Etilen diaminetetracetik asitYaşam teknolojileri#15576-O28EDTA çözümü
Fetal Sığır SerumuCultilab#F083Lenfositlerin kriyokonserasyonu
Akış Sitometrisi Yazılım Analizi - Sürüm 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/Akış sitometrisi analizi
Grafik ve Çizim Yazılımı Analizi - Sürüm 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/featuresGrafik çizimi ve analizi
İğneli insülin şırıngası 1mL FX 12.7 mm X 0.33 mmDescarpacke0342101Fare nakli ve ilaç yönetimi
Ketamin InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Fare anestezisi
Kemirgenler için Çok Fonksiyonlu Cerrahi PlatformKent Bilimsel Şirketihttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Fare cerrahi işlemleri
PE anti-insan CD19 - izotip fare IgG1 - HIB19 klonuBioLegend#302208Lenfosit boyama
Potasyum klorürSigma-AldrichP3911-1KGPBS çözümü
Potasyum fosfat dibaziSigma-AldrichP0662-1KGPBS çözümü
Lenfosit izolasyonu için reaktifCytiva#17-1440-02, 6 ve Times paketi; 100  MlAlınan organlardan lenfosit izolasyonu
Sodyum klorürSigma-AldrichS9888-1kgPBS çözümü
Sodyum fosfat dibazik Sigma-AldrichS9763-1KGPBS çözümü
Steril Anatomik Diseksiyon Cimbizleri - 12 cm ABC 0170Lab Lí Der120Cerrahi fare işlemleri
Steril Makas 12 cm - ABC 0321Lab Lí Der136Cerrahi fare işlemleri
VincristineLibbs#7896094208483Fare tedavisi
Xylazine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Fare anestezisi

Kaynaklar

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hasta Kaynakl Xenograftla DirenciAk SitometrisiPeriferik Kan BlastlarMinimal Rezid el Hastal kL kemik H cre zolasyonu
Akut Lenfoblastik Lösemi için İndüksiyon Kemoterapisine Nüks Löseminin Murin Modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.