Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farede Sekonder Orta Serebral Arter Oklüzyon Modelinde İskemik İnme Tekrarlayan Yaralanmanın Araştırılması

918 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68806

⸱

16 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis, 2Department of Nutrition, China Medical University, 3Division of Neurosurgery, Department of Surgery, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University, 4Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Medical Research, China Medical University Hospital, China Medical University, 6Department of Pediatrics, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Burada, tekrarlayan iskemik inmenin ilerlemesini araştırmak için farelerde sekonder orta serebral arter tıkanıklığı için bir yöntem sunuyoruz. Cerrahi prosedürler, postoperatif bakım, nöronal patolojik değişiklikler ve sağkalım oranı tanımlanmıştır.

Özet

İnme, mortalite ve sakatlığın ikinci önde gelen küresel nedenidir ve tekrarlayan inmeler, kötü sonuçlara ve artan nörolojik yüke önemli ölçüde katkıda bulunur. Akut klinik inme yönetimindeki ilerlemelere rağmen, tekrarlayan iskemik inme için deneysel modeller, prosedürel karmaşıklıkları ve yüksek mortalite oranları nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Bu çalışmada, bir fare modelinde tekrarlayan iskemik inme kurmayı ve iki aşamalı bir orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) protokolü kullanarak beyindeki patolojik değişiklikleri ve fonksiyonel eksiklikleri değerlendirmeyi amaçladık. Yetişkin erkek C57BL/6J farelere, Lazer Doppler kan akışı izleme altında geçici MCAO uygulandı. İnme nüksünü simüle etmek için ilk ameliyattan 14 gün sonra ikincil bir MCAO gerçekleştirildi. Ameliyat sonrası değerlendirmeler arasında lokomotor aktivite analizi, altı puanlık skorlama sistemi kullanılarak nörodavranışsal defisitlerin puanlanması, hipoksi ile indüklenebilir faktör-1α (HIF-1α) ve tümör nekroz faktör-α (TNF-α) dahil olmak üzere inflamatuar belirteçler ve hematoksilen ve eozin (H&E) boyama kullanılarak histopatolojik değerlendirme yer aldı. Tekrarlayan MCAO uygulamasından sonra fareler, kontrol gruplarına kıyasla önemli ölçüde azalmış lokomotor aktivite, azalmış hareket hızı ve azalmış nörodavranışsal skorların yanı sıra artan inflamatuar belirteçler sergiledi. Histopatolojik tespit, tekrarlayan MCAO farelerinin korteksi ve hipokampusunda orta ila şiddetli nöronal hücre nekrozu, nöropil vakuolasyonu ve lokalize kanama ortaya çıkardı. Bu tekrarlayan MCAO prosedüründe inflamatuar belirteçler de indüklendi. Bu iki aşamalı MCAO fare modeli, ilk kez, tekrarlayan iskemik inmeyi tutarlı nörolojik ve patolojik sonuçlarla etkili bir şekilde simüle eden ve postoperatif sağkalımı iyileştiren bir yöntem sunuyor. Bu model, mekanik çalışmalar için güvenilir bir platform sağlayabilir ve tekrarlayan inme için nöroprotektif tedavilerin gelecekteki değerlendirmesinde uygulanabilir.

Giriş

İnme, dünya çapında önde gelen ölüm ve uzun süreli sakatlık nedeni olmaya devam ediyor ve önemli bir klinik ve sosyoekonomik yük oluşturuyor. Dünya çapında 30 milyondan fazla insan inmeden ve hareketlilik kaybı, bilişsel bozukluk ve artan vasküler hastalık riski dahil olmak üzere sonuçlarından etkilenmektedir 1,2. Tromboliz ve endovasküler trombektomi gibi akut tedavideki ilerlemelere rağmen, hayatta kalanların çoğu, kötüleşen prognoz, daha fazla sakatlık ve artan ölüm oranları ile ilişkili olan yüksek inme nüksü riski altındadır. Tekrarlayan inmeler, birincil olaydan sonraki 90 gün içinde hastaların yaklaşık% 10-20'sinde meydana gelir ve en yüksek risk geçici iskemik atak veya minör inme döneminde görülür3. Daha da önemlisi, tekrarlayan inme sıklıkla vasküler bölgeleri etkiler ve beyin hemodinamik bozukluğu 4, akut ve kronik immün düzensizlikve subkortikal nöronal nekroz5 gibi daha kapsamlı enfarktüs ve ciddi yaralanmalarla sonuçlanır, bu da beynin daha savunmasız hale gelebileceğini ve ilk iskemik hakaretin ardından daha fazla komplikasyona neden olabileceğini düşündürür.

Son zamanlarda yapılan bazı çalışmalar, deney hayvanlarında iskemik veya hemorajik inme modelleri gerçekleştirmiş ve bölgeye özgü yaralanma paternlerini, bozulmuş nörovasküler yanıtları ve insan klinik koşullarına uyacak farklı endojen onarım mekanizmalarını ortaya çıkarmıştır 6,7. Bununla birlikte, tekrarlayan inme araştırma modelleri, karmaşık prosedürleri ve yüksek mortalite oranları nedeniyle daha az yerleşiktir. Önceki bazı çalışmalar, tekrarlayan iskemik inme 8,9,10'u incelemek için değerli bir araç olarak ortaya çıkan bir fototrombotik fare modeli oluşturmuştur. Tekrarlayan inmeli farelerde şiddetlenen nöronal hasarı, uzun süreli inflamatuar yanıtı ve bilişsel gerilemeyi gösterdiler ve çoklu enfarktüslü demans ve inflamatuar hazırlamadahil olmak üzere altta yatan mekanizmaları araştırdılar 8,9,10.

Başka bir çalışma, iki kez kollajenaz enjekte edilen, lokomotor fonksiyonda gecikmiş iyileşmeye neden olan ve tekrarlayan farelerde bilişsel kayıp ve nörolojik hasara neden olan bilateral striatumda tekrarlayan intraserebral kanamanın yeni bir yaşlı fare modelini göstermiştir11. Fototrombotik ve hemorajik inme fare modellerinin, tekrarlayan inme sırasında sıklıkla farklı anatomik bölgelerde lezyonlara neden olduğunu ve bu da doğal metodolojik farklılıkları yansıttığını belirtmekte fayda var. Bu tür varyasyonlar, heterojen nöronal hasar paternleri oluşturur, mikro dolaşım dinamiklerini bozar ve periferik bağışıklık tepkileri üzerinde farklı etkiler gösterir11,12. Buna karşılık, yaygın olarak iskemik inmenin en temsili kemirgen paradigması olarak kabul edilen MCAO modeli, prosedürel stabilite avantajı sunar ve serebral oklüzyonun hem yeri hem de süresi üzerinde hassas kontrole izin verir. Bununla birlikte, MCAO ve tekrarlayan MCAO, deneysel araştırmalarda daha geniş uygulanabilirliklerine önemli sınırlamalar getiren önemli ölçüde yüksek bir ölüm riski13,14 göstermiştir. Bu çalışmada, tekrarlayan inmeyi taklit eden stabil ve tekrarlanabilir iki aşamalı bir MCAO fare modeli oluşturmayı amaçladık. İlişkili nöronal hasar, fonksiyonel bozukluklar ve histopatolojik değişiklikleri değerlendirdik. Bu model aynı zamanda istikrarlı bir sağkalım oranı göstererek, tekrarlayan inme patofizyolojisi ve nöroprotektif tedavi stratejileri üzerine gelecekteki araştırmalar için uygulanabilirliğini ortaya koymaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Tayvan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (Çalışma Planı ID20230335) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için belirlenmiş etik yönergeler izlenerek yürütülmüştür.

1. Hayvan hazırlama

  1. 20-25 g ağırlığındaki 8 haftalık erkek C57BL/6J fareleri, %22 bağıl nem ve 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngü ile 22 ± 1 °C'de kontrollü çevre koşulları altında barındırın. Yiyecek ve damıtılmış suya ücretsiz erişim ile insani bakım sağlayın.
  2. 28 erkek fareyi rastgele üç gruba ayırın: sahte (n = 8), MCAO (n = 10) ve tekrarlayan MCAO (n = 10). Hayvanları 2 hafta karantinaya alın (−d14); −d7'de iklimlendirme, tartma ve gruplama gerçekleştirin; MCAO'yu d0'da yönetin; d0, d2, d14 ve d16'da davranış testleri yapmak; ve d14'te tekrarlayan MCAO ameliyatı gerçekleştirin.

2. İlk cerrahi MCAO uygulaması

  1. Tüm cerrahi aletleri otoklavlayarak sterilize edin, her fareyi tartın, ilk insizyondan 1 saat önce 5 mg / kg'da oral olarak karprofen uygulayın ve oksijenle karıştırılmış bir gazda% 3 izofluran ile anestezi indükleyin.
  2. Solunum hızını izleyin (100-120 nefes/dak, BPM) ve göz kapağını ve yutma refleksini kontrol ederek anestezi derinliğini değerlendirin. Vücut ısısını 37 °C'de tutmak için nesneyi elektronik bir ısıtma plakasına yerleştirin.
  3. Sırtınızı ve boynunuzu başınızın yakınında tıraş edin ve farelerin tüylerini ve kalıntılarını elektrikli süpürgeyle temizleyin. Oftalmik merhem sürün, cildi fırçalayın ve kemirgen hayatta kalma ameliyatı için aseptik prosedürlerle dezenfekte edin.
  4. Merkezi füzyon hattının sol tarafını ve kafatasındaki bregmanın arkasını ortaya çıkarmak için kulaklar arasında ilk 0,5 cm'lik kesi yapmak için makas ve deri forseps kullanın. Forseps kullanarak kafatasının üstündeki yumuşak dokuyu çıkarın.
  5. Lazer Doppler adaptörünü farenin beyninde ortalayın ve adaptör kenarının kafa tabanına uyacak şekilde önceden kesildiğinden emin olarak sola 3 mm yanal ve bregmaya 2 mm kaudal pozisyonda doku yapıştırıcısı ile yapıştırın, ardından sürekli kan akışı izlemeyi sağlamak için Lazer Doppler kapağını yapıştırıcı ile sabitleyin.
    NOT: Bu adımda, Lazer Doppler başlığını doku yapıştırıcısı kullanarak bregmaya güvenli bir şekilde yapıştırın ve serebral kan akışının stabil bir şekilde izlenmesini sağlamak için kalvaria'nın üst orta hattında koronal ve sagital sütürlerin kesiştiği noktaya yerleştirin.
  6. Kesitli alandan emin olduğunuzda, mikropipet kullanarak doku yapıştırıcısını çekin ve yapıştırıcıyı adaptörün tabanının etrafına uygulayın.
  7. Diş çimentosu hazırlayın ve işlem boyunca stabilitesini sağlamak için Doppler başlığını çevreleyecek kadar miktarda uygulayın.
  8. Hayvanı sırtüstü pozisyona döndürün ve boynun orta hattı boyunca torasik girişten çeneye doğru 1 cm'lik bir cilt kesisi yapın.
  9. Digastrik, sternohyoid ve sternomastoid kasların arka karnını ayırmak için künt diseksiyon ile devam edin, ardından ortak (CCA), eksternal (ECA) ve internal karotid arterleri (ICA) ortaya çıkarmak için kasları nazikçe çekmek için ekartörler kullanın ve CCA'nın etrafına 6-0 ipekten bir bölüm yerleştirin.
    NOT: Bu adımda, CCA ve ECA'nın çatallanmasının izolasyonunu kolaylaştırmak için tükürük bezleri yukarı doğru çevrilmelidir. ICA, CCA'nın üzerinde yer almaktadır. Deri forseps ile künt diseksiyon, damar yırtılmasını önlemek ve çevredeki yumuşak doku ve sinirleri izole etmek için kullanılır.
  10. ECA'dan çıkıntı yapan küçük bir dal (superior tiroid arteri, STA) bulun. Bu küçük dalı yakmak için bipolar dağlayıcıyı kullanın. Yanmış kabı kesmeye devam edin; bu, ECA'yı daha da izole edecektir.
    NOT: STA tipik olarak ECA'nın hyoid kemiğin büyük boynuz seviyesinin altında ortaya çıkan ilk dalıdır. Yaralanmayı önlemek için, hemostaz elde etmek için damar dalını yakmak için bipolar bir koterizatör kullanın.
  11. ECA'nın etrafına iki parça 6-0 İpek sütür yerleştirin. ECA'nın distal tarafında kalıcı bir düğüm ve çatallanma bölgesinde gevşek bir düğüm yapın.
  12. Lazer Doppler iğne probunu kafatasındaki prob adaptörüne yerleştirin. Toplama yazılımının bir serebral kan akışı (CBF) okuma değeri gösterdiğinden emin olun. Temel okumayı kaydedin.
    NOT: Lazer Doppler ile elde edilen CBF'nin standartlaştırılmış ölçüsü, perfüzyon üniteleri (PU) olarak sunuldu ve başlangıç değerleri tipik olarak 350 ila 450 aralığında kalibre edildi. Azalmış perfüzyon ünitesi (PU) değerleri gözlemlenirse, doğru ölçüm sağlamak için Lazer Doppler prob adaptörünün faredeki konumunu ayarlayın (bkz. adım 2.5).
  13. Mikrovasküler damar kelepçesini kullanarak ICA'yı kelepçeleyin ve CCA'yı geçici olarak bağlamak için bir kayma düğümü yapmak için CCA'nın etrafındaki 6-0 ipek bölümü kullanın.
    NOT: Bu adımda, Lazer Doppler monitöründe CBF'de bir azalma tespit edilir.
  14. Silikon kauçuk kaplı naylon monofilamenti hazırlayın. Silikon başlığın ucundan 9-10 mm uzakta gümüş Sharpie kullanarak filamenti işaretleyin ve sıkı dikiş ile ECA üzerindeki gevşek dikiş arasında küçük bir kesi yapmak için mikrocerrahi makas kullanın.
    NOT: Kesi bölgesinde kalan kan, vasküler bütünlüğü korumak için fosfat tamponlu salin (PBS) ile temizlenmeli ve durulanmalıdır.
  15. Filamenti (önce silikon başlık) küçük kesi yoluyla ECA'ya dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Bu filament yerleştirme adımı, sahte hayvanlarda atlanmıştır.
  16. Silikon başlığın yaklaşık yarısı yerleştirildiğinde, arter ve filament etrafındaki gevşek dikişi hafifçe sıkın ve ICA üzerindeki kelepçeyi çıkarın.
  17. İlk sıkı düğümün altındaki ECA'yı kesin, ECA kabını ve filamenti silikon başlık yukarı bakacak şekilde dikkatlice aşağı (saat yönünün tersine) döndürün ve filamentin ucunu ICA'ya doğru itin.
    NOT: Bu adım kritiktir ve vasküler bozulmayı en aza indirmek ve dolaşma veya yırtılma riskini azaltmak için saat yönünün tersine yavaşça gerçekleştirilmelidir.
  18. Silikon parçanın tamamı kan damarına girdikten sonra, tutma dikişini hafifçe sıkın, CCA üzerindeki kayma düğümünü gevşetin ve konum kılavuzu için filament üzerindeki gümüş işareti kullanarak filamenti içeri itmeye devam edin.
  19. Lazer Doppler yazılımını sürekli olarak izleyin ve CBF'de keskin bir düşüş gözlenirken direnç uygun kuvvet altında filamentin daha fazla ilerlemesini engellediğinde, distal orta serebral artere yerleştirmeyi sonlandırın.
    NOT: CBF'nin preiskemik durumun% 30'undan daha azına düşürülmesi, Longa'nın yöntemi15 olarak bilinen standart bir prosedürdür.
  20. Beyin iskemik hasarını indüklemek için filamenti 40 dakika MCA içinde tutun.
  21. CBF'yi yeniden oluşturmak için belirlenen 40 dakikalık iskemik süreden sonra filamenti çıkarın, hemostaz elde etmek için doku tutkalı uygulayın, ilgili restore edilmiş CBF ölçümünü kaydedin, tüm ekartörleri ayırın ve kafatasına monte adaptörü çıkarın.
  22. Damarın yakınındaki cilt kesisini bir yara klipsi ile kapatın, vücut ısısını 37 °C'de sürekli izleyin ve solunum hızını değerlendirin. 160-200 BPM içinde stabil kan basıncı ve solunumu doğruladıktan sonra anesteziyi bırakın ve iyileşmeye izin verin.

3. İkinci MCAO yönetimi

  1. İlk MCAO ameliyatından 14 gün sonra yara klipslerini çıkarın, ardından kafatası hazırlığını tamamlamak, Lazer Doppler probu yerleştirmeyi güvence altına almak ve CCA'yı ortaya çıkarmak için 2.1 ila 2.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
  2. CCA'yı çevre dokudan izole edin ve CCA'nın etrafına üç segment 6-0 ipek sütür yerleştirin.
  3. Lazer Doppler probunu adaptöre yerleştirin ve temel CBF'yi kaydedin.
  4. CCA'nın distal tarafında bir kayma düğümü, proksimal uçta kalıcı bir düğüm ve arada gevşek bir düğüm yapın.
  5. Oklüzyon filamentinin silikon kauçuk kaplı naylonunu, açıklanan Adım 2.14'e göre MCAO uygulaması için hazırlayın.
  6. CCA üzerinde kalıcıya yakın küçük bir kesi yapın ve filamenti CCA'ya yerleştirin.
    NOT: Kesi bölgesinde kalan kan da damar bütünlüğünü korumak için PBS ile temizlenmeli ve durulanmalıdır. Bu çok önemli.
  7. Gevşek düğümü hafifçe sıkın ve kayma düğümünü serbest bırakın. Filament uygun kuvvet altına girene ve CBF'de belirgin bir azalma tespit edilene kadar filamenti ICA'ya ilerletin.
    NOT: CBF'nin preiskemik durumun% 30'undan daha azına düşürülmesi de standart bir prosedür olarak kabul edilir.
  8. Adım 2.20'de belirtildiği gibi iskemik hasarı indüklemek için filamenti 40 dakika boyunca pozisyonda tutun.
  9. Belirlenen iskemik aralığın tamamlanmasının ardından, filamenti geri çekin ve ilk MCAO ameliyatının 2.21 ve 2.22 adımlarında belirtilen prosedürleri izleyerek cilt kesisini kapatın.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. MCAO ameliyatını takiben dehidrasyonu önlemek için art arda 3 gün boyunca günde iki kez 10 mL·kg-1·gün-1 oranında deri altından ılık normal salin uygulayın. Cerrahi bölgeye% 10 povidon-iyot çözeltisi uygulayın ve enfeksiyonu önlemek için amoksisilin (10 mg / kg) uygulayın. Hem birinci hem de ikinci MCAO prosedürlerinden sonra postoperatif stresi hafifletmek ve veteriner gözetiminde iyileşmeyi kolaylaştırmak için 3 gün boyunca ağızdan karprofen (5 mg/kg) sağlayın.
  2. Farelerin sağlık durumuna ilişkin günlük değerlendirmeler yapın. Birinci ve ikinci prosedürler sırasında görünümdeki değişikliklerin yanı sıra yiyecek ve su tüketimini kaydedin.

5. Hayvan lokomotor aktivitesi ve nörobiyolojik yaralanma değerlendirmesi

  1. Hareket yörüngesini, mesafeyi ve hızı değerlendirerek lokomotor aktiviteyi değerlendirin. Fareleri test kutularına (10 x 20 x 15 cm) yerleştirin ve düşük parlaklık koşulu altında yapılandırın.
  2. Fareyi 30 dakikalık bir stabilizasyon süresi ve ardından 10 dakikalık resmi bir değerlendirme ile test ortamına alıştırın. Lokomotor aktiviteyi belirlemek için hareket edilen mesafe (cm), hız (cm/s), hareket süresi (s), bölge içi toplam süre (ler), ilk oluşum gecikmesi (s) ve yön dereceleri (zamanlar) dahil olmak üzere tüm parametreleri kaydedin ve analiz edin.
  3. Modifiye edilmiş bir motor fonksiyon puanlama sistemi (0-6 puan)16 ve mNSS puanlarına atıfta bulunarak (motor fonksiyon değerlendirmesinin bir parçası olarak, 6 puan)17 nörobiyolojik hasarı değerlendirin.
  4. Yaralanma seviyelerini şu şekilde tanımlayın: nörolojik defisit yokluğu için puan 0, el bileği veya omuzu etkileyen ön ayak fleksiyonu için puan 1, yanal itmeye karşı direncin azalmasıyla birlikte ön ayak fleksiyonu için puan 2, açık tarafa doğru tek yönlü daire çizme için puan 3, açık tarafa doğru uzunlamasına dönme için puan 4, nöbet aktivitesinin eşlik ettiği uzunlamasına dönme için puan 5, ve tam hareket kaybı için 6 puan.

6. Hematoksilen ve eozin boyama protokolü

  1. MCAO ve tekrarlayan MCAO beyin dokusunu %10 formaldehit tamponunda sabitleyin ve numuneyi 1 mm'lik bir koronal fare beyin dilimleyici kullanarak dört eşit parçaya ayırın. Patolojik değerlendirme için üçüncü ön kısmı işleyin.
  2. Parafine gömülü numunelerin rehidrasyonunu gerçekleştirin: 10 dakika ksilen, 10 dakika %95 etanol, 10 dakika %75 etanol, 10 dakika %50 etanol, damıtılmış su (ddH2O) 10 dakika ve PBS 10 dakika.
  3. Numuneleri boyayın: hematoksilen boyasını 45 saniye boyunca uygulayın ve ılık ddH2O'da 30 °C'de 1 dakika durulayın; 30 saniye boyunca eozin boyası ve 45 saniye boyunca soğuk ddH2O'da.
  4. Numuneleri %75, %95, %100 etanol ve ksilen içinde her biri 45 saniye kurutun ve kurutun ve 60 saniye havayla kurutun.
  5. Slaytları monte edin ve karanlık bir odada saklayın.
  6. Lezyon şiddetini beş puanlık bir ölçekte belirlenmiş bir kritere göre değerlendirin: 1 = minimal (%<1); 2 = hafif (%1-25); 3 = orta (%26-50); 4 = orta ila şiddetli (%51-75); 5 = şiddetli (%76-100). Bir veteriner patolog tarafından kör değerlendirme altında beyin dokusunun patolojik incelemesini yapın.

7. Western blot protokolü

  1. MCAO'dan ve tekrarlayan farelerden gelen beyin dokularını, proteaz ve fosfataz inhibitörü (sodyum florür 30 mM, sodyum ortovanadat 30 mM ve sodyum pirofosfat 30 mM) ile desteklenmiş RIPA tamponunda homojenize edin.
  2. Santrifüj lizatları 10.000 x g'da çözün ve süpernatanı toplayın. Bir bisinkoninik asit (BCA) testi kullanarak süpernatan protein konsantrasyonunu ölçün.
  3. Western blotlamayı daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirin18: 100 °C kaynar suda kaynatılarak hazırlanan 20 μg denatüre toplam proteini %8-12 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jellere (SDS-PAGE) yükleyin.
  4. Proteinleri soğuk odadaki PVDF membranlarına ayırmak için 90 dakika boyunca 100 V ile aktarın ve 60 dakika boyunca% 3 sığır serum albümini ile membranları bloke edin.
  5. Tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α, 1:1000 dilüsyonlar), gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH, 1:2.000 dilüsyonlar) ve hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 alfa (HIF-1α, 1:1.000 dilüsyonlar) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Membranları uygun ikincil antikorlarla 1 saat inkübe edin.
  6. Gelişmiş bir kemilüminesans substrat kiti (ECL) kullanarak protein ekspresyonunu tespit edin ve dijital bir foto-görüntüleme sistemi ile görselleştirin.

8. İstatistiksel analiz

  1. Verileri ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak sunun ve tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanarak istatistiksel analiz yapın, ardından birden fazla grup arasındaki farklılıkları belirlemek için Tukey'in post hoc testini yapın. P 0,05 < olduğunda sonuçları istatistiksel olarak anlamlı olarak yorumlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İlk ve tekrarlayan MCAO farelerinde lokomotor aktivite ve nöronal yaralanma değerlendirmesi
İlk MCAO prosedürlerinde, silikon kauçuk kaplı bir naylon monofilament ECA, ICA'dan MCA'ya 40 dakika süreyle yerleştirildi. Serebral kan akışının (CBF), filament MCA alanında kalırken Lazer Doppler ekipmanı tarafından gözle görülür şekilde düştüğü (taban çizgisinin %<30'u düşer) tespit edilebilir. Bu prosedürde, tüm fareler bu eşiğe istikrarlı bir şekilde ulaştı ve hayatta kald...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnme, dünya çapında ikinci önde gelen ölüm ve sakatlık nedeni olmaya devam etmektedir ve tekrarlayan inme riski yüksektir. Günümüzde tıbbi teknoloji ve stratejilerin geliştirilmesindeki ilerlemelere rağmen inmenin önlenmesi ve tekrarlaması iyileşme için yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda, iskemik inme yaralanması ve mekanizmalarının araştırılmasında çeşitli inme çalışma modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunlar arasında, MCAO cerrahi yöntemi, nörolojik mekanizma araştırması ve kor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi ekipleri tarafından teknik olarak desteklendi ve Tayvan Ulusal Tayvan Üniversite Hastanesi Vakfı (112-S0074), Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi, Tayvan (CMU113-S-06) ve Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi, Taipei, Tayvan (112-2314-B-002 -219).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6-0 ipek dikiş ve nbsp;Shin-Teh Inc. TW.ST1N-ST6
1 mm koronal fare beyin dilimleyicisiThermo Fisher Scientific Inc., ABDV11335
Hayvan kıl makası makinesiURBANER. Inc. TWMB033
Koronal fare beyin dilimleyicisiZivic enstrüman. Inc USA BSMAS001-1
Dijital fotoğraf-görüntü sistemiAzure Biosystem, Inc., Dublin, CA, ABDAzure -300
Elektronik bipolar koterizörIndiamartAARON 940
Elektronik ısı plakasıReptizooAHM23
Göz merhemiLodi Veteriner Bakımı. ABD17033-21-38
Lazer Doppler dedektörüMoor enstrümanları Birleşik Krallık moorVMS-LDF1-HP
Lazer Doppler prob adaptörüThermo Fisher Scientific Inc.05-700-76
Lokomotor aktivite dedektörü Orchid scientific Inc.Tüm Maze takip yazılımları.
(Tüm Labirent Sistemi)Orchid scientific Inc.Trackezi. ver 7.39
Mikrovasküler damar kelepçesiShin-Teh Inc. TW.ST-M104
Mikrocerrahi damar makasıShin-Teh Inc. TW.ST-V108
Solunum oranı monitörlüğüSDR scientific Ltd. ABDSAR-830/AP
Silikon kauçuk kaplamalı naylon monofilamentFisher bilimselNC1773962
Deri forsepsShin-Teh Inc. TW.ST-H212
Deri makasShin-Teh Inc. TW.ST-S014PK
Steril Pamuk ÇubukWinner Medical401 003
Transfer sistemiYarı kuru sistem. Biyo-rad Laboratuvarı, ABD)1703940
kimyasallar
%10 povidon/dash; iyot çözeltisiYoshida Pharmaceutical Co., Ltd JAPPVP– I  10%
%75 Etanol çözeltisi Sigma-Aldrich. ABD111727
AmoksisilinSigma-Aldrich, ABD A5955
Sığır serum albüminiSigma-Aldrich, ABD.A2153
KarprofenPlexx Inc. Birleşik KrallıkMD150-2
GAPDH antikoruSanta Cruz Biyoteknoloji, CA, ABDSC-32233
H& E çözümüBioPioneer Tech. CO. TWG1005
Hipoksiye indüklenebilir faktör 1 alfa antikorHücre Sinyal Teknolojisi, MA, ABD#36169
İzofluran (anestezik)Yaşam BilimleriR510-22-10
Steril normal salinNova-Tech Inc. ABD1760RX
Tümör nekroz faktörü alfaHücre Sinyal Teknolojisi, MA, ABD#3707

Kaynaklar

  1. Johnson, W., Onuma, O., Owolabi, M., Sachdev, S. Stroke: a global response is needed. Bull World Health Organ. 94 (9), 634-634A (2016).
  2. Wu, C. T., et al. Low intensity pulsed ultrasound prevents recurrent ischemic stroke in a cerebral ischemia/reperfusion injury mouse model via brain-derived neurotrophic factor induction. Int J Mol Sci. 20 (20), (2019).
  3. Coull, A. J., Lovett, J. K., Rothwell, P. M., Oxford Vascular , S. Population based study of early risk of stroke after transient ischaemic attack or minor stroke: implications for public education and organisation of services. BMJ. 328 (7435), 326(2004).
  4. Hartkamp, N. S., et al. Relationship between haemodynamic impairment and collateral blood flow in carotid artery disease. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (11), 2021-2032 (2018).
  5. Khanevski, A. N., et al. Recurrent ischemic stroke: incidence, predictors, and impact on mortality. Acta Neurol Scand. 140 (1), 3-8 (2019).
  6. Matur, A. V., et al. Translating animal models of ischemic stroke to the human condition. Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).
  7. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  8. Schmidt, A., et al. Progressive cognitive deficits in a mouse model of recurrent photothrombotic stroke. Stroke. 46 (4), 1127-1131 (2015).
  9. He, X. F., et al. Extracellular ASC exacerbated the recurrent ischemic stroke in an NLRP3-dependent manner. J Cereb Blood Flow Metab. 40 (5), 1048-1060 (2020).
  10. Feng, Y., et al. Cortical microinfarcts potentiate recurrent ischemic injury through NLRP3-dependent trained immunity. Cell Death Dis. 15 (1), 36(2024).
  11. Wang, L. M., et al. A novel aged mouse model of recurrent intracerebral hemorrhage in the bilateral striatum. Neural Regen Res. 18 (2), 344-349 (2023).
  12. Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Transl Stroke Res. 9 (5), 437-451 (2018).
  13. Wen, Z., et al. The effect of anterior communicating artery flow on neurovascular injury and neurobehavioral outcomes in mice with recurrent stroke. Brain Res. 1724, 146440(2019).
  14. Shvedova, M., et al. Modified middle cerebral artery occlusion model provides detailed intraoperative cerebral blood flow registration and improves neurobehavioral evaluation. J Neurosci Methods. 358, 109179(2021).
  15. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), (2011).
  16. Zhang, Y., et al. Treadmill exercise promotes neuroprotection against cerebral ischemia-reperfusion injury via downregulation of pro-inflammatory mediators. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 3161-3173 (2016).
  17. Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
  18. Hsu, Y. M., Yin, M. C. EPA or DHA enhanced oxidative stress and aging protein expression in brain of d-galactose treated mice. Biomedicine (Taipei). 6 (3), 17(2016).
  19. Sayed, M. A., et al. Stroke promotes the development of brain atrophy and delayed cell death in hypertensive rats. Sci Rep. 10 (1), 20233(2020).
  20. Kotoda, M., et al. Role of myeloid lineage cell autophagy in ischemic brain injury. Stroke. 49 (6), 1488-1495 (2018).
  21. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  22. Maddahi, A., Kruse, L. S., Chen, Q. W., Edvinsson, L. The role of tumor necrosis factor-alpha and TNF-alpha receptors in cerebral arteries following cerebral ischemia in rat. J Neuroinflammation. 8, 107(2011).
  23. Mojsilovic-Petrovic, J., et al. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is involved in the regulation of hypoxia-stimulated expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) and MCP-5 (Ccl12) in astrocytes. J Neuroinflammation. 4, 12(2007).
  24. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: a review. Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).
  25. Qiao, M., et al. Development of a model of recurrent stroke consisting of a mild transient stroke followed by a second moderate stroke in rats. J Neurosci Methods. 184 (2), 244-250 (2009).
  26. Fan, C., et al. Reduced severity of outcome of recurrent ipsilateral transient cerebral ischemia compared with contralateral transient cerebral ischemia in rats. J Stroke Cerebrovasc Dis. 26 (12), 2915-2925 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Investigating Ischemic Stroke Recurrent Injury in a Secondary Middle Cerebral Artery Occlusion Model in Mouse
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68806

Etiketler

Tekrarlayan nmeMCAO Fare Modelinme TekrarlamasN rodavran sal DefisitlerLokomotor Aktivitenflamatuar Belirte lerHistopatolojik De erlendirmeN roprotektif Tedaviler

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.