Yöntem makalesi

Düşük Yoğunluklu Lipoprotein Varlığında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Kullanılarak Vasküler Endotel Hücrelerinin Uyarılması

979 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68830

⸱

12 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

Bu makalede

Özet

İnsan plazmasından düşük yoğunluklu lipoproteinin (LDL) izolasyonu, HL-60 hücrelerinin nötrofil benzeri hücrelere farklılaşması, LDL varlığında nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) hazırlanması ve insan aort endotel hücrelerinin NET'ler ve LDL karışımı ile uyarılması dahil olmak üzere bir dizi yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli bulaşıcı olmayan hastalıklarda nedensel faktörler olarak ortaya çıkmış ve ateroskleroz ve tromboz gibi kardiyovasküler bozukluklarda rol oynamıştır. Vasküler duvarda NET oluşumu gözlenir ve NET oluşumunun plazma belirteçlerinin hastalık şiddeti ile arttığına dair ikna edici kanıtlar vardır. Miyeloperoksidazlar ve proteazlar dahil olmak üzere nötrofil türevi NET bileşenleri, plazma lipoproteinlerini ve vasküler homeostazı etkiler. Burada, düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) varlığında oluşan NET'lerle vasküler hücrelerin uyarılması için bir dizi yöntem açıklanmaktadır. LDL, ultrasantrifüjleme ile insan plazmasından fraksiyone edildi. HL-60 hücreleri, nötrofil benzeri hücrelere farklılaştırılmaları için all-trans retinoik asit ile muamele edildi ve daha sonra NET oluşumunu indüklemek için forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile uyarıldı. PMA'nın çıkarılması ve yıkanmasının ardından, hücreler LDL ile daha fazla inkübe edildi. NET'ler ve LDL içeren toplanan süpernatanlar, insan aort endotel hücrelerini (HAEC'ler) uyarmak için hemen kullanıldı. Temsili bir yanıt olarak, NET tedavisi ile indüklenen HAEC'lerin morfolojik değişimi, LDL'nin varlığı ile artmıştır, bu da NET oluşumunun LDL ile kombinasyon halinde HAEC'lerin yanıtını arttırdığını düşündürmektedir. Bu yöntemler, LDL'nin nötrofil aktivasyonu ve NET ile ilişkili inflamasyon altında endotel hücreleri üzerindeki etkilerini araştırmak için faydalıdır, böylece artmış plazma LDL ile ilişkili kardiyovasküler hastalıkların altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Giriş

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyon üzerine ve ayrıca enfeksiyöz olmayan fizyolojik olarak makul koşullar altında aktive edilmiş nötrofiller tarafından üretilir, histonlar, miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz1 gibi yoğunlaştırılmış DNA ve proteinleri serbest bırakır. Bu bileşenler marjinal hücreleri ve dokuları parçalayarak kalıcı inflamasyona neden olabileceğinden, NET oluşumu romatoid artrit, sedef hastalığı, diyabet, Alzheimer hastalığı, kanser metastazı ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli akut ve kronik hastalıkların başlamasında ve ilerlemesinde nedensel bir faktör olarak ortaya çıkmıştır2. Ateroskleroz3 ve abdominal aort anevrizması4'ün insan vasküler lezyonlarının histolojik analizleri, nötrofil infiltrasyonu ve NET oluşumunun kolokalize olduğunu gösterdi. Dolaşımdaki kanda, sitrülinli histonlar, NET-DNA ve MPO gibi NET belirteçlerinin seviyeleri, koroner arter hastalığının şiddeti ile artar5. Aterosklerozun erken evrelerinde, NET oluşumu genellikle makrofaj güdümlü köpük hücresi oluşumu yoluyla meydana gelen lipid birikiminden önce gelir 6,7. Bu fenomenler, NET oluşumu sırasında hücre dışı olarak salınan MPO ve proteolitik enzimlerin sadece vasküler dokular üzerinde değil, aynı zamanda lipoproteinler gibi kan bileşenleri üzerinde de etkili olabileceğini kuvvetle düşündürmektedir. Lipoproteinler, MPO8 gibi NET türevli proteinler tarafından zarar görebilen kırılgan lipit-protein kompleksleridir; bu nedenle, NET oluşumu lipoproteinlerde yapısal ve biyokimyasal değişikliklere neden olarak vasküler homeostazı etkileyebilir. Bununla birlikte, NET oluşumunun ve lipoproteinlerin vasküler hücre kaynaklı düzensizlik ve inflamatuar yanıtlar üzerindeki sinerjik etkileri belirsizliğini korumaktadır.

Bu makalede, HL-60'tan türetilen nötrofil benzeri hücrelerden hazırlanan NET'ler ve insan plazmasından fraksiyone edilen düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL) ile tedavi ile indüklenen insan vasküler endotel hücrelerinin hücresel yanıtlarının incelenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Temsili sonuçlar, LDL'nin ultrasantrifüjleme ile insan plazmasından fraksiyonasyonunu ve LDL ile birlikte inkübasyondan sonra NET'lerle uyarılan insan aort endotel hücrelerinin (HAEC'ler) hücresel yanıtlarını göstermektedir. Bu yöntem, diğer lipoproteinleri içeren vasküler hücrelerin incelenmesine geniş ölçüde uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

LDL hazırlama protokolü, Showa Tıp Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (No. 231) etik kurulu tarafından onaylanmıştır. Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ve tüm katılımcılar bu çalışmaya katılmak için gönüllü olarak imzalarını verdiler. Hücreler, laminer bir akış başlığı kullanılarak aseptik olarak manipüle edildi. Dahil edilme kriteri 22-65 yaş aralığıydı. Dışlama kriterleri arasında sigara içme alışkanlıkları, önceden var olan kardiyovasküler hastalıklar (koroner kalp hastalıkları, felç ve periferik arter hastalıkları gibi), ciddi karaciğer fonksiyon bozukluğu ve diyabet, hipertansiyon, dislipidemi, şiddetli inflamatuar hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere kontrolsüz kronik durumlar vardı. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. LDL'nin insan plazmasından izolasyonu

  1. Antikoagülan heparin (10 ünite / mL) varlığında sağlıklı bir insan gönüllüden tam kan toplayın.
  2. Bir heparin tüpünde (4 ° C'de 15 dakika boyunca 700 × g ) elde edilen 45-50 mL insan tam kanını santrifüjleyin. Santrifüjün hızını yavaşça azalttığınızdan emin olun. Plazma fraksiyonunu içeren üst tabakayı toplayın.
  3. Kan hücrelerini ortadan kaldırmak için santrifüjlemeyi iki kez (700 × g, 4 °C'de 15 dakika) adım 1.2'deki gibi aynı yavaşlama ayarında gerçekleştirin. Lipoproteinlerin iki değerlikli metal iyonu aracılı oksidasyonunu önlemek için 1: 1.000 hacim 250 mM EDTA (pH 7.4) ekleyin.
  4. 2,7 mL plazmayı 4 mL'lik polikarbonat (4PC) tüpe yerleştirin, 250 μM EDTA (PBS / EDTA) ve ultrasantrifüj (600.000 × g, 4 ° C'de 7 dakika) içeren 900 μL fosfat tamponlu salin (PBS) kaplayın.
  5. Şilomikronu ortadan kaldırmak için üst tabakanın 900 μL'sini atın. Plazma ve ultrasantrifüj üzerine 900 μL PBS/EDTA istifleyin (600.000 × g, 4 ° C'de 2,5 saat).
  6. Çok düşük yoğunluklu lipoproteini (VLDL) ortadan kaldırmak için üst tabakanın 900 μL'sini atın. Bu adım, LDL'nin diğer lipoprotein fraksiyonları ile kontaminasyonunu önlemek için önemlidir.
  7. Yoğunluğu d = 1.063'e ayarlamak için 540 μL 0.5 mg / mL KBr çözeltisi ekleyin, ardından bir pipet ve ardından ultrasantrifüj (600.000 x g, 4 ° C'de 2.5 saat) ile hafifçe karıştırın.
  8. LDL içeren üst tabakanın 540 μL'sini toplayın. Sarı-turuncu bir tabaka, LDL ayrımınınbaşarılı olduğunu gösterir 9. Diyaliz membranına aktarın.
  9. KBr'yi ortadan kaldırmak için karanlıkta 4 ° C'de LDL fraksiyonunu 2 L PBS / EDTA'ya karşı üç kez diyalize edin.
  10. LDL'yi kullanmadan önce karanlıkta 4 °C'de saklayın.

2. Poli-L-lizin veya jelatin kaplı kuyucukların hazırlanması

  1. % 0.1 poli-L-lizin çözeltisini steril su ile seyrelterek% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi10 hazırlayın ve ardından 0.2 μm steril filtre ile süzün. Kullanmadan önce 4 °C'de saklayın.
  2. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 152 μL / oyuk% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi ekleyin ve en az 5 dakika inkübe edin.
  3. Solüsyonu çıkarın ve ardından 200 μL / kuyu steril su ile bir kez yıkayın ve en az 2 saat kurulayın.
  4. NET'lerin hazırlanmasında kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.

3. Jelatin kaplı kuyuların hazırlanması

  1. Kullanmadan önce %2 jelatin solüsyonunu steril su ile seyrelterek %0.1'lik bir jelatin solüsyonu hazırlayın.
  2. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 152 μL / oyuk% 0.1 jelatin çözeltisi ekleyin ve en az 5 dakika11 inkübe edin.
  3. Solüsyonu çıkarın ve ardından 200 μL / kuyu steril su ile bir kez yıkayın ve en az 2 saat kurulayın.
  4. Kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.

4. İnsan aort endotel hücrelerinin (HAEC'ler) bakımı ve hazırlanması

  1. %2 fetal buzağı serumu (FCS), 5 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 10 ng/mL bazik fibroblast büyüme faktörü, 20 ng/mL insülin benzeri büyüme faktörü, 0.5 ng/mL vasküler endotelyal büyüme faktörü, 1 μg/mL askorbik asit, 22.5 μg/mL heparin ve 0.2 μg/mL hidrokortizon içeren tam ortam kullanılarak kaplamasız bir kültür şişesinde birincil HAEC'lerin kültürü, imalatçıların talimatında belirtildiği gibi. Hücreler %70-80 birleşene kadar ortamı her alternatif günde bir değiştirin.
  2. Stimülasyon için, HAEC'leri jelatin kaplı 12 oyuklu plakalarda tohumlayın. Birleşme noktasına ulaşılana kadar ortamı her alternatif günde bir değiştirin. Deneyi 4. ve 7. bölümler arasında gerçekleştirin.

5. HL-60 türevi nötrofil benzeri hücrelerin hazırlanması ve ardından NET'lerin hazırlanması

  1. HL-60 hücrelerini, tedavi edilmemiş bulaşıklar kullanarak% 5 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamı ile koruyun.
  2. HL-60'tan türetilmiş nötrofil benzeri hücrelerin hazırlanması için, 2 μM all-trans retinoik asit (AtRA) içeren RPMI-1640 ortamında 4 gün boyunca 10 mL HL-60 hücresi başına 2 × 106 hücre kültürü.

6. LDL ile NET'lerin hazırlanması

  1. HL-60 hücrelerini 2 μM AtRA ile tedaviden 4 gün sonra toplayın. HL-60 hücrelerinin nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmasından sonra hücreler küçülür.
  2. Santrifüj hücreleri (220 × g, 18-22 °C'de 4 dakika). Süpernatanı aspire edin ve hücreleri eşit hacimde serumsuz RPMI-1640 ile yıkayın.
  3. Hücreleri santrifüjleyin (220 × g, 18-22 ° C'de 4 dakika) ve ardından hücreleri serumsuz RPMI-1640 ile yeniden süspanse edin.
  4. Hücreleri sayın, daha sonra hücreleri serumsuz RPMI-1640'ta 2 ×10 6 hücre / mL'ye yeniden süspanse edin ve poli-L-lizin ile önceden kaplanmış 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında 0.5 mL hücre süspansiyonu tohumlayın. En az 30 dakika kültür.
  5. 0 veya 50 nM PMA'nın nihai konsantrasyonuna 300 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile veya olmadan 100 μL serumsuz RPMI-1640 ekleyin. 30 dakika boyunca kültür.
  6. Ortamı çıkarın ve hücreleri serumsuz RPMI-1640 ile bir kez yıkayın. Ortamı 20 μg / mL LDL olsun veya olmasın serumsuz RPMI-1640 ile değiştirin ve ardından 2 saat boyunca kültürleyin.
  7. Hücre kalıntılarını gidermek için kültür ortamını ve santrifüjü (700 × g, 18-22 ° C'de 3 dakika) toplayın.

7. HAEC'lerin NET'ler ve LDL ile uyarılması

  1. Ortamı 0,5 mL taze kültür ortamı ile değiştirin. Stimülasyondan önce en az 30 dakika kültür.
  2. HAEC kaplarına NET'ler ve LDL (adım 6.7) ve LDL içeren 167 μL kültür ortamı ekleyin. 12 saat veya daha uzun süre stimülasyondan sonra indüklenen HAEC'lerdeki morfolojik değişiklikleri kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şilomikronların çıkarılmasından ve ardından sıralı ultrasantrifüjleme yoluyla insan plazmasından VLDL fraksiyonlarının çıkarılmasından sonra, yoğunluğu d = 1.063'e ayarlamak için insan plazması bir KBr çözeltisi ile karıştırıldı. Bu adımda, kalan çökeltici çözelti içinde tamamen çözülmedi ve LDL'yi sağlam tutmak için gaz kabarcıkları oluşturan şiddetli karışımdan kaçınıldı. Ultrasantrifüjden sonra, LDL üst tabaka üzerinde sarı-turuncu rengi9 ile görsel olarak değerlendirildi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, LDL'nin bir arada bulunmasıyla indüklenen ve daha sonra HAEC yanıtlarını analiz etmek için kullanılan dHL-60 hücrelerinden NET'lerin hazırlanmasını tanımlar. Bu protokolün önemi, hücrelerin uyarılması için NET ve LDL içeren taze besiyerinin kullanılmasıdır, ancak diğer birçok çalışma -20 ° C'de donmuş NET'lerin stok çözeltisini kullanır. Lipoproteinler lipit-protein kompleksleri olduklarından, donma-çözme sırasında sağlam yapıları ve özellikleri kaybolur ve LDL'nin denatüra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Japonya Bilimi Teşvik Derneği, KAKENHI (hibe numaraları 23K10897 ve 19K07069) tarafından desteklenmiştir. İngilizce dilini düzenlediği için Editage'a (www.editage.jp) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,1 Poli-L-LizinSigma Aldrich HakkındaP8920-100ML
10 cm çanakCorning430591
12 oyuklu Doku Kültürü PlakalarıDoğan353043
%2 JelatinSigma Aldrich HakkındaG1393-20ML Serisi
4 adet tüpHimacS404332A
All-Trans Retinoik AsitUyan188-01113Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
Selülozlu diyaliz tüpüMISUMI Grup A.Ş.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
EDTADojindo345-01865Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2 KitPromosyon HücresiC-22111 (İngilizce)
Fetal Sığır SerumuGibco10270-106Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
Heparin Sodyum (5.000 ünite/5 mL)Mochida İlaç Co., Ltd.Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
Yüksek Hızlı Soğutmalı SantrifüjTOMİSRX-201 SerisiHızlanma: 9, Yavaşlama: 7
İnsan Aort Endotel HücreleriLonzaCC-2535 Serisi
KBrUyan168-03475Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
KEYENCE Mikroskopi yazılımıANAHTARLIKBZ-II Analizörü
Mikro UltrasantrifüjHimacCS150GX
MikroskopiOLYMPUSCK40 Serisi
MikroskopiANAHTARLIKBZ-9000 SerisiZaman atlamalı görüntüleme için (isteğe bağlı)
Mikroskopi kamerasıNikonDS-Fi3
Mikroskopi kamera yazılımıNikonDS-L4 Serisi
Penisilin/StreptomisinGibco15140-122 100MLHerhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
fosfat tampon salin (× 10)2,6 g NaH2PO4· 2H2O, 29 g Na2HPO4· 12H2O, 80 g NaCl ve 2.0 g KCl damıtılmış suda ve 1 L.  hacmine ayarlayın; (Herhangi bir satıcı ile değiştirilebilir)
PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Asetat)Uyan162-23591Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
Reaktif PaketiLonzaCC-5034 Serisi(CC-5022: HEPES Tamponlu Salin Çözeltisi, CC-5012: Tripsin/EDTA, CC-5002: Tripsin Nötralize Edici Çözelti) 
RotorHimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (Fenol kırmızısı ile)Uyan189-02025Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
RPMI-1640 (Fenol kırmızısı olmadan)Uyan186-02155Herhangi bir satıcıyla değiştirilebilir
T-25 şişesiCorning3275

Kaynaklar

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NET Olu umuHL 60 H creleriUltrasantrif jlemensan Plazma FraksiyonasyonuForbol Miristat AsetatMorfolojik De i imKardiyovask ler Hastal k Mekanizmalar

İlgili makaleler