Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropikal Irk 4'ün Tespiti için Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu CRISPR/Cas12a Testi

678 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68841

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokolde, istilacı bitki patojeni Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropikal ırk 4'ün tespiti için kombine bir rekombinaz polimeraz amplifikasyonu CRISPR/Cas12a testi gösterilmektedir.

Özet

Düzenli ve doğru gözetim, bitki hastalıklarının etkin yönetiminin merkezinde yer alır. Hangi hareket tarzının en uygun olduğunu ve önleme, yok etme veya herhangi bir eylemin gerekli olup olmadığını gösterebilir. Biyotik ve abiyotik streslerin neden olduğu semptomlardaki benzerlikler nedeniyle tek başına konukçu bitkilerde semptomolojiye dayalı sürveyans genellikle güvenilir değildir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif (q)PCR gibi laboratuvar tabanlı moleküler yöntemler, bitki patojeni tespiti için en yaygın ve güvenilir şekilde kullanılanlardır, ancak pahalı ekipmanlara ve yetenekli operatörlere dayanır. Burada, istilacı patojenin tespiti için basitleştirilmiş bir DNA ekstraksiyonu, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarları (CRISPR)/Cas12a'yı (RPA-Cas12a) birleştiren bir protokolü açıklıyoruz, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropikal ırk 4 (Foc TR4). Teknik, mevcut moleküler tespit testlerine kıyasla gelişmiş özgüllük ile analitik olarak sağlam olan ve pahalı ve sofistike laboratuvar ekipmanlarına olan ihtiyacı ortadan kaldıran basit bir tek tüplü tespit alternatifi sağlar.

Giriş

Toprak kaynaklı mantar patojeni Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), küresel olarak tarihteki en yıkıcı sınır ötesi bitki patojenlerinden biri olarak kabul edilmektedir1. Foc, yeni bir alana girdikten sonra, enfekte olmuş bitkiler semptomlar geliştirene kadar görünmez kalır. Bu aylar sürebilir ve mantarın bilmeden yerleşmesine ve yayılmasına izin verebilir. Bir kez kurulduktan sonra, dayanıklı klamidosporların üretimi ve muz üretiminin çok yıllık doğası nedeniyle ekonomik olarak yok edilmesi neredeyse imkansızdır. Bu nedenle, önleme ve erken teşhisin önemi, savunmasız yetiştiricilerin korunmasında çok önemlidir1. Foc tropikal ırk 4'ün (TR4) neden olduğu mevcut hastalık salgını, yüksek riskli bölgelerdeki semptomatik muz bitkilerini belirlemek için düzenli gözetim ile tespit edilmesini gerektirir. Su stresi ve bazı besin eksiklikleri gibi abiyotik kısıtlamalar, Foc TR4 enfeksiyonunun neden olduğu semptomlara benzer şekilde dış sararmaya neden olur. Ek olarak, farklı Foc ırklarının neden olduğu enfeksiyondan kaynaklanan semptomlar ayırt edilemez. Bu nedenle, güvenilir Foc TR4 tespiti2 için laboratuvar bazlı saflaştırma ve müteakip fenotipik ve moleküler bazlı tespit gereklidir. PCR, kantitatif (q) PCR ve döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) testleri 3,4,5,6,7 dahil olmak üzere Foc TR4 tespiti için çeşitli moleküler testler mevcuttur. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu, laboratuvar ortamlarında yürütülmesi gereken pahalı ve özel beceri ve ekipman gerektirir. Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) izotermal olarak gerçekleştirilebilir ve bu nedenle bu tür ekipmanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve saha içi tespit protokolleri için düşünülebilir8.

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas sistemleri, gelişmiş moleküler tanı9 için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu sistemler ucuz, basit oldukları ve özel enstrümantasyon kullanımı gerektirmedikleri için kullanılır ve bu nedenle sahada tespit için düşünülebilir. CRISPR tabanlı teşhis tipik olarak bir hedef dizinin izotermal amplifikasyonunu, ardından CRISPR-Cas proteinleri aracılığıyla hedef tanımayı ve hedef10,11'in varlığını belirtmek için bir DNA veya RNA floresan raportör boyasının kollateral bölünmesini içerir. CRISPR-Cas12a sistemlerinde, özellikle, CRISPR RNA (CRRNA), Cas12a'yı nükleik asit hedeflerini tanıması ve parçalaması için yönlendirir. Bu crRNA, tamamlayıcı bir diziye hibridizasyon yoluyla belirli bir DNA veya RNA ilgilenilen bölgeyi hedeflemek üzere tasarlanabilir. Bağlandıktan sonra, Cas12a'nın hedefi tek nükleotid özgüllüğü ile parçalaması ve ardından raportör moleküllerin12 kollateral bölünmesi ile sonuçlanır. Son zamanlarda, ekonomik açıdan önemli çeşitli mantar bitki patojenlerini 13,14,15,16,17,18,19,20 tespit etmek için CRISPR-Cas12a sistemleri kullanılmıştır.

Bu protokolde, hem taşınabilir bir florometrede hem de ucuz bir ışık yayan diyot (LED) mavi ışık transillüminatörü21 altında çıplak gözle görselleştirilen Foc TR4'ün tespiti için basitleştirilmiş bir DNA ekstraksiyonu, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve CRISPR/Cas12a teknolojisini (RPA-Cas12a) birleştiren tek tüplü bir tespit tekniğinin geliştirilmesi açıklanmaktadır. Yöntem, önleme ve kontrol altına alma stratejilerini geliştirmek amacıyla saha içi tespit için daha da optimize edilebilir. Benzer bir yaklaşım, diğer bitki patojenleri için Cas12a bazlı tespit testleri tasarlamak için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Bitki materyalinden basitleştirilmiş DNA ekstraksiyonu

NOT: Genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.

  1. DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    1. Her bir semptomatik psödostem parçasının 250 mg'ını ayrı bir ekstraksiyon torbasına aktarın (bkz.
    2. Bitki materyali içeren torbalara 2 mL 0,5 M NaOH-PVP (Malzeme Tablosu) ekleyin. Enfekte olmuş kapları, havaneli gibi manuel bir öğütücü kullanarak bir ekstraksiyon torbasında öğütün.
      NOT: Torbadan yeterli sıvı ekstrakt almak için gerekirse 1-2 mL ek 0,5 M NaOH-PVP ekleyin.
    3. 1,5 mL'lik tüplere 195 μL 100 mM Tris-HCL (pH 8.0) (Malzeme Tablosu) ekleyin.
    4. Torbadan 5 μL ekstraktı 195 μL 100 mM Tris-HCL (pH 8.0) ile 1.5 mL'lik tüpe pipetleyin ve ekstraktı 40 kat seyreltin.
    5. Tüpleri 15-30 saniye vorteksleyin ve kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

2. crRNA sentezi ve kalite kontrolü

  1. Transkripsiyon gerçekleştirin.
    1. RNA transkripsiyon kitini (Malzeme Tablosu) kullanarak, 0,2 mL'lik bir PCR tüpüne aşağıdakileri ekleyin: 1,5 μL 10x T7 Reaksiyon tamponu, her dNTP'den 1,5 μL, 1,5 μL T7 DNA polimeraz karışımı, 1 μL nükleaz içermeyen su ve toplam 20 μL hacim için 100 μM T7 şablon DNA.
    2. Tüpü 37 °C'de bir su banyosunda veya PCR makinesinde en az 4 saat inkübe edin.
    3. Kopyalanan RNA miktarını belirlemek için bir spektrofotometre (Malzeme Tablosu) kullanın. RNA'yı nükleaz içermeyen su veya TE tamponu kullanarak 40 μL'lik bir hacimde 250 ng/μL'ye (10 μg) seyreltin (Ek Dosya 1).
      NOT: Kopyalanan RNA, DNase işlemlerine ve temizleme adımlarına devam edene kadar -80 °C'de saklanabilir.
  2. DNase tedavisi ve crRNA temizliği gerçekleştirin.
    NOT: Tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin. RNA ve DNase I enzimini buz üzerinde tutun.
    1. RNA örneğini, RNA temizleme kitinde (Malzeme Tablosu) bulunan DNase I ile üretici talimatlarınagöre 22 işlemden geçirin.
    2. RNA örneğini, RNA temizleme kitini kullanarak Protokol II22'yi izleyerek üretici talimatlarına göre temizleyin.
    3. Mevcut miktarı ve kaliteyi belirlemek için temizlenmiş crRNA'yı nanodamlatın. RNA'yı nükleaz içermeyen su kullanarak 100 ng/μL'ye seyreltin ve kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
    4. crRNA'yı RNA yükleme boyası (Malzeme Tablosu) ile bir su banyosunda 10 dakika boyunca 70 °C'ye ısıtın ve sentezlenen crRNA'yı görselleştirmek için crRNA'yı %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutun (Şekil 2).

3. İn vitro Foc TR4 tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA)-Cas12a tek tüplü reaksiyon

NOT: Genel bir bakış için Şekil 3'e bakın.

  1. RPA ve Cas12a reaksiyon karışımlarını hazırlayın.
    NOT: Bu adımların, reaktifler ve malzemeler önceden soğutulmuş olarak buz üzerinde DNA'sız bir alanda gerçekleştirildiğinden emin olun. Deneyden önce çalışma yüzeyini ve pipetleri çamaşır suyu ve %70 etanol ile silin. Bu çalışmada kullanılan tüm oligonükleotitler hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız.
    1. Aşağıdaki reaktif hacimlerine sahip ayrı bir 0,5 mL'lik tüpte (Malzeme Tablosu) 20 μL'lik bir Cas12a reaksiyon karışımı hazırlayın: 2 μL 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL Rekombinant Albümin, pH 7.9), 0.4 μL 10 μM LbCas12a proteini, 0.6 μL 100 ng/μL crRNA, 0,4 μL 10 μM raportör ve 16,6 μL deiyonize su.
      NOT: LbCas12a proteini, crRNA ve raportörün nihai konsantrasyonları sırasıyla 200 nM'dir.
    2. Aşağıdaki reaktif hacimlerine sahip ayrı bir 0,5 mL'lik tüpte 9,5 μL'lik bir RPA reaksiyon karışımı hazırlayın: 5 μL 2x Reaksiyon Tamponu (üretici yönergelerine göre nihai konsantrasyon 1x), 1,6 μL dNTP Karışımı (nihai konsantrasyon 1,6 mM), 1 μL 10x Temel E-Mix (üretici yönergelerine göre nihai konsantrasyon 1x), 10 μM'de her bir RPA primerinden 0,5 μL (her biri 0,5 μM nihai konsantrasyon), 0,5 μL 20x Çekirdek Reaksiyon Karışımı (üretici yönergelerine göre nihai konsantrasyon 1x) ve 0,4 μL deiyonize su.
    3. 8 tüplü bir şeridi buz üzerindeki bir tüp rafına (Malzeme Tablosu) yerleştirin.
    4. 20 μL Cas12a reaksiyon karışımını tüp tabanına aktarın.
    5. 9,5 μL RPA reaksiyon karışımını tüp şeridi kapağına aktarın. Tüp şeridi kapağındaki RPA reaksiyon karışımına 0,5 μL 280 nM MgOAc (nihai konsantrasyon 14 nM) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    6. Şablon olmayan kontrol (NTC) tüp kapağına 0,5 μL deiyonize su ekleyin ve RPA ve Cas12a reaksiyon karışımlarının birleşmediğinden emin olmak için dikkatlice kapatın.
      NOT: Sonuçların güvenilirliğini sağlamak için şablon olmayan bir kontrol (NTC) dahildir.
  2. Şablon DNA ekleyin ve reaksiyonu başlatın.
    1. DNA yerine deiyonize su ile NTC hariç, tüp şeridi kapağında MgOAc içeren 10 μL RPA reaksiyon karışımına 0,5 μL şablon DNA ekleyin. Testin amaçlandığı gibi çalıştığından emin olmak için her zaman bir kuyuya bilinen bir pozitif kontrol Foc TR4 DNA'sı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    2. RPA ve Cas12a reaksiyonunun karışmadığından emin olmak için tüp şeridi kapaklarını dikkatlice kapatın.
    3. Taşınabilir florometreyi (Malzeme Tablosu) açın ve RPA-Cas12a testi için bir Çalıştırma Profili oluşturun (Ek Dosya 2). Kaydedilen Run Profile'ı açın ve tüp şeridini 37 °C'de 30 dakika inkübe etmek için portatif florometreye yerleştirin.
      NOT: Tüp şeridini tutarken tüplerin altına dokunmamaya dikkat edin; bunun yerine dış kenarları sol üst ve sağ uçta tutun.
    4. 30 dakika sonra tüp şeridini portatif florometreden çıkarın. RPA ve Cas12a reaksiyonlarını karıştırmak için tüpleri altı kez ters çevirin ve mini bir santrifüjde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 5 saniye boyunca döndürün.
    5. Tüp şeridini portatif florometreye geri yerleştirin ve kaydedilen Çalıştırma Profilini kullanarak 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.
  3. Sonuçları görselleştirin.
    1. Taşınabilir florometrede ölçülen ortalama bağıl floresan birimlerini (RFU'lar) yorumlayın (Ek Dosya 2 ve kullanım kılavuzu23).
    2. Bir mavi ışık transillüminatörü kullanarak tüpleri 465 nm uyarma dalga boyunda LED mavi ışık altında görselleştirin (Ek Dosya 3). Telefon kamerasıyla fotoğraf çekin.

   

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Genie III taşınabilir florometrede yürütüldüğünde, basitleştirilmiş DNA ekstraksiyonu ve ardından kombine RPA-Cas12a testi kullanılarak enfekte bitki materyalinden Foc TR4'ün başarılı bir şekilde saptanması Şekil 4A'da gösterilmektedir. Pozitif numuneler görünür floresans (Şerit 6-8) gösterirken, negatif numuneler düşük uç nokta floresansı (Şerit 1-5) gösterir. Numune tüpleri LED mavi ışık altında görüntülendiğinde, Foc TR4 ile enfekte olmuş numuneler de gör...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Düzenli sürveyans, Foc TR4 ve diğer önemli istilacı zararlıların etkili önleme ve kontrol altına alma çabaları için önemli bir stratejidir. Sahada uygulanabilen ve patojenleri hızlı ve doğru bir şekilde tanımlayabilen tespit protokolleri, karar verme sürecini hızlandırabilir ve sürveyans çabalarıyla ilişkili maliyetleri sınırlayabilir. Bu amaçla, burada sunulan protokol, Foc TR421'in hızlı ve hassas tespiti için doğrudan örneklenmiş bitki materyali üzerinde gerçek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal veya entelektüel çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Derecelendirilmemiş araştırmacılar programı için rekabetçi destek kapsamında Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı, Hibe Numarası: 138109'dan fon aldığını kabul ediyoruz. Ayrıca, INDICANTS Proje Hibe Numarası: 890856 kapsamında Avrupa Birliği Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie Bursu finansmanını da kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EnGen Lba Cas12a (Cfp1) ProteiniNew England BiolabsM0653T
EnGen Lba Cas12a DiluentNew England BiolabsB0653A
Eppendorf PCR TüpleriMerckEP0030124332
Eppendorf Güvenli Kilitli Mikro Test TüpleriMerckEP0030121708
Evrensel Çıkarma TorbalarıBIOREBA430100
GeneRuler 100 bp DNA MerdiveniThermo Fischer ScientificSM0241 / SM0242
Genie Santrifüj Mini-6KOOptiGeneOP-FUGE
Genie IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
Genie Şerit TutucuOptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
Cin ŞeritleriOptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 Yüksek Verimli RNA Sentez KitiNew England BiolabsE2040S
NanoDrop ND-1000 UV/Vis SpektrofotometresiThermo Fischer Scientifichttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3New England BiolabsB7003S
NEBuffer r2.1New England BiolabsB6002S
Polivinilpirrolidon (PVP) tozuSigma-Aldrich9003-39-8
RNA Temizliği ve Konsantretör-5 KitiZymo AraştırmasıR1013
RNA Yükleme BoyaThermo Fischer ScientificR0641
SmartBlue Mavi Işık TransilaydınatörüAccuris InstrumentsE4000-E
Sodyum hidroksit (NaOH) peletleriMerck, EMPARTAK277
Tris (hidroksilemetil) aminometanMerck77-86-1
TwistAmp Sıvı Temel KitTwistDxTALQBAS01

Kaynaklar

  1. Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
  2. Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for Diagnostics and Data Collection. , IITA, Ibadan. (2017).
  3. Dita, M. A., Waalwijk, C., Buddenhagen, I. W., Souza, M. T., Kema, G. H. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana. Plant Pathol. 59 (2), 348-357 (2010).
  4. Li, M., et al. Identification and application of a unique genetic locus in diagnosis of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Can J Plant Pathol. 35 (4), 482-493 (2013).
  5. Aguayo, J., et al. Development of a hydrolysis probe-based real-time assay for the detection of tropical strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. PLoS One. 12 (2), e0171767(2017).
  6. Matthews, M. C., Mostert, D., Ndayihanzamaso, P., Rose, L. J., Viljoen, A. Quantitative detection of economically important Fusarium oxysporum f. sp. cubense strains in Africa in plants, soil and water. PLoS One. 15 (7), e0236110(2020).
  7. Ordóñez, N., et al. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay based on unique markers derived from genotyping by sequencing data for rapid in planta diagnosis of Panama disease caused by tropical race 4 in banana. Plant Pathol. 68 (9), 1682-1693 (2019).
  8. Martzy, R., et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis. Anal Bioanal Chem. 411, 1695-1702 (2019).
  9. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and potential solutions toward point-of-care applications. ACS Synth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  10. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  11. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  12. Chen, Y., Mei, Y., Jiang, X. Universal and high-fidelity DNA single nucleotide polymorphism detection based on a CRISPR/Cas12a biochip. Chem Sci. 12 (12), 4455-4462 (2021).
  13. Shin, K., Kwon, S. H., Lee, S. C., Moon, Y. E. Sensitive and rapid detection of citrus scab using an RPA-CRISPR/Cas12a system combined with a lateral flow assay. Plants (Basel). 10 (10), 2132(2021).
  14. Zhang, Y. M., Zhang, Y., Xie, K. Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice. Mol Breed. 40 (1), 11(2020).
  15. Wang, Q., Qin, M., Coleman, J. J., Shang, W., Hu, X. Rapid and sensitive detection of Verticillium dahliae from complex samples using CRISPR/Cas12a technology combined with RPA. Plant Dis. 107 (6), 1664-1669 (2023).
  16. Sun, X., et al. Rapid and sensitive detection of two fungal pathogens in soybeans using the recombinase polymerase amplification/CRISPR-Cas12a method for potential on-site disease diagnosis. Pest Manag Sci. 80 (3), 1168-1181 (2024).
  17. Chen, Z., et al. A frontline, rapid, nucleic acid-based Fusarium circinatum detection system using CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Plant Dis. 107 (6), 1902-1910 (2023).
  18. Mu, K., et al. CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases. J Agric Food Chem. 70 (23), 7240-7247 (2022).
  19. Li, Y., et al. Visual detection of Fusarium temperatum by using CRISPR-Cas12a empowered LAMP assay coupled with AuNPs-based colorimetric reaction. LWT. 185, 115190(2023).
  20. Liang, X., et al. Development of an RPA-based CRISPR/Cas12a assay in combination with a lateral flow strip for rapid detection of toxigenic Fusarium verticillioides in maize. Food Control. 157, 110172(2024).
  21. Matthews, M. C., et al. A combined recombinase polymerase amplification CRISPR/Cas12a assay for detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Sci Rep. 15 (1), 2436(2025).
  22. RNA Clean & Concentrator-5: Instruction Manual Version 3.1.3. , Zymo Research Corporation. Irvine, CA. (2023).
  23. Genie III user manual, instrument software version v3.18.2. , Optigene. Horsham, U.K. (2021).
  24. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4, 1-4 (2018).
  25. Magdama, F., et al. Comparative analysis uncovers the limitations of current molecular detection methods for Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 strains. PLoS One. 14 (9), e0222727(2019).
  26. Mckillop, C. Independent review blames unreliable test, not Biosecurity Queensland, for false Panama diagnosis. , ABC News, Australia. (2016).
  27. Mckillop, C., Craig, Z. Quarantine lifted on Mareeba banana farm suspected of having Panama disease. , ABC News, Australia. (2015).
  28. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  29. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333 (2021).
  30. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat Commun. 11 (1), 4711(2020).
  31. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  32. Zeng, R., et al. CRISPR-Cas12a-driven MXene-PEDOT:PSS piezoresistive wireless biosensor. Nano Energy. 82, 105711(2021).
  33. Zhang, J., et al. Rapid and sensitive detection of toxigenic Fusarium asiaticum integrating recombinase polymerase amplification, CRISPR/Cas12a, and lateral flow techniques. Int J Mol Sci. 24 (18), 14134(2023).
  34. Manzo-Sánchez, G., Orozco-Santos, M., Martínez-Bolaños, L., Garrido-Ramírez, E., Canto-Canche, B. Diseases of quarantine and economic importance in banana tree (Musa sp.) in México. Rev Mex Fitopatol. 32 (2), 89-107 (2014).
  35. Blomme, G., et al. Bacterial diseases of bananas and enset: Current state of knowledge and integrated approaches toward sustainable management. Front Plant Sci. 8, 1290(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fusarium Oxysporum TespitiRPA Cas12aBitki Patojeni TespitiDNA EkstraksiyonuTa nabilir FlorimetreFloresans TespitiMuz Fusarium Solgunlu uMolek ler Tan y ntemleri
Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropikal Irk 4'ün Tespiti için Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu CRISPR/Cas12a Testi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.