Method Article

Primer Sıçan Epididimal Adipositlerinde Lipolizin Doğru Miktar Tayini için Gliserol Salınımının MTT Tabanlı Normalizasyonu

DOI:

10.3791/68853

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1College of Bee Science and Biomedicine, Fujian Agriculture and Forestry University, 2School of Pharmacy and Medical Technology, Putian University, 3School of Medicine, Huaqiao University, 4Department of Pharmacy, Taining County General Hospital, 5School of Pharmacy, Fujian Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre canlılığındaki dalgalanmalar ve tahlil girişimi dahil olmak üzere deneysel artefaktlar, lipid açısından zengin primer adipositlerde gliserol salınımının doğru bir şekilde ölçülmesini engeller. Bu zorlukları hafifletmek için, hücre metabolik aktivitesi için gliserol ölçümlerini ayarlamak için MTT tabanlı bir normalleştirme stratejisi kullanılır, böylece lipoliz ölçümünün güvenilirliği artar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritik bir metabolik yol olan lipoliz, depolanmış trigliseritlerin serbest yağ asitlerine ve gliserole hidrolizini içerir. Bununla birlikte, lipid açısından zengin primer adipositlerde gliserol çıktısının doğru bir şekilde ölçülmesi, hücre canlılığındaki değişkenlik ve tahlil girişimi gibi deneysel artefaktlarla sıklıkla karıştırılır. Bu sınırlamaları ele almak için, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) bazlı hücre canlılığı testi kullanılarak gliserol salınım ölçümlerini normalleştirmek için basit bir yöntem oluşturulmuştur. Bu protokol, adipositler ve sulu çözeltiler arasındaki özgül ağırlık farkından yararlanarak lipolitik çıktının ve hücre canlılığının aynı anda ölçülmesini sağlar. İlaç tarama deneylerinde, pravastatin ve simvastatin, abdominal adipositlerden gliserol salınımını önemli ölçüde arttırırken, atorvastatin ve lovastatin, gliserol çıkışını önemli ölçüde değiştirmedi. Bu bulgular, MTT tabanlı normalleştirmenin, obezite ve metabolik sendromu hedef alan ilaç keşfindeki potansiyel uygulamalarla birlikte lipolizin doğru bir şekilde ölçülmesi için sağlam ve kullanışlı bir yaklaşım sunduğunu göstermektedir. Bu çalışma, gerçek metabolik yanıtları spesifik olmayan membran sızıntısından ayırt etmek için geleneksel lipoliz testlerinin yeniden değerlendirilmesi ihtiyacının altını çizmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusu beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT) olarak ikiye ayrılabilir1. WAT, trigliseritler olarak fazla enerji depolama işlevini yerine getirirken, BAT, soğuk1'in uyarılması altında kimyasal enerjiyi ısı enerjisine dönüştüren vücut sıcaklığını korumak için ısı üretme işlevine sahiptir. Yağ dokusunun da endokrin işlevi vardır2. Çeşitli hormonlar, sitokinler ve metabolitler (topluca adipokinler olarak anılır) salgılayabilir ve merkezi sinir sisteminden yiyecek arama davranışını ve çevre dokuların metabolik aktivitesini düzenleyerek vücudun enerji dengesini kontrol edebilir2.

Lipoliz, bir dizi lipolitik enzimin 3,4 etkisi altında hücre içi lipidlerin adım adım hidroliz işlemidir. Adipositlerde, lipidler esas olarak trigliseritler5 formunda lipid damlacıklarında depolanır. Lipid damlacıkları, trigliseritlerin lipolitik enzimler 6,7 tarafından hidrolizini önleyen lipid damlacığı ile ilişkili protein perilipin ailesi ile kaplıdır. Bununla birlikte, lipoliz sinyali arttırıldığında, adipositlerde perilipin ailesinin ekspresyon seviyeleri azalır ve lipolitik enzimler lipid damlacıklarına girer 3,4. Sonuç olarak, trigliseritler gliserol ve serbest yağ asitlerine 3,4,5 ayrışır.

Depolanmış trigliseritlerin gliserol ve serbest yağ asitlerine parçalanması olan lipoliz, adiposit metabolizmasında temel bir süreçtir8. Gliserol gibi lipoliz ürünlerinin doğrudan ölçümü değerli bilgiler sağlarken, deney grupları arasındaki hücre sayılarındaki farklılıklardan kaynaklanan operasyonel hatalar nedeniyle özellikle askıya alınmış birincil adipositlerde doğru miktar tayini yapmak zor olmuştur. Bu çalışma, birincil sıçan abdominal adipositlerinden gliserol salınımının nicelleştirilmesini normalleştirmek için bir hücre canlılığı testi kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmeyi amaçladı. Ölçüm yöntemini standartlaştırarak, normalleştirilmiş gliserol salınım testi, adipositlerde obezite ve metabolik sendromu hedefleyen ilaç keşfi için potansiyel bir araç olarak uygulandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, gliserol salınımının (lipolizin bir göstergesi olarak) ve 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) hücre canlılığının 96 oyuklu bir plakanın aynı kuyucuklarında eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlamak için adipositler ve sulu çözeltiler arasındaki özgül ağırlık farkından yararlanır, böylece deneysel iş akışını kolaylaştırır ve verimliliği artırır.

Tüm hayvan prosedürleri ARRIVE yönergelerine uygundu ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna (NIH Yayın No. 8023, 1978'de revize edildi) uygun olarak yürütüldü. Çalışma protokolü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası 202112, 5 Mayıs 2021'de onaylandı). Bu çalışmada kullanılan erkek Wistar sıçanları, standart barınma koşulları altında vücut ağırlıkları ≥200 g olan en az 8 haftalıktı. Epididimal beyaz yağ dokusu, sıçan başına 0.6-0.8 g tipik verimle toplandı. Özellikle, yaşlı sıçanlar veya yüksek yağlı diyetlerle beslenenler, tutarlı doku ayrışma verimliliğini korumak için sindirim enzimi (örneğin kollajenaz) konsantrasyonlarının orantılı olarak ayarlanmasını gerektiren, önemli ölçüde artmış beyaz yağ dokusu kütlesi (genellikle 1.5-3 g) sergiledi. Erkek sıçanların özel kullanımı, dişi kızgınlık döngüsü hormonal dalgalanmalarından kaynaklanan potansiyel kafa karıştırıcı etkilerden kaçındı. Suş seçimi (örneğin, Sprague-Dawley, Wistar veya Long-Evans), yağ dokusu tepkilerinde genetik tekdüzeliği sağlamak için deneylerde tutarlı bir şekilde sürdürüldü. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Primer sıçan abdominal adipositlerinin izolasyonu

  1. Yetişkin bir erkek Wistar sıçanını% 7 kloral hidrat intraperitoneal enjeksiyonu (damıtılmış H2O içinde çözülmüş) ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  2. Refleks yanıtlarının olup olmadığını kontrol ederek tam anesteziyi onaylayın, ardından steril cerrahi makas kullanarak orta hat karın kesisi yapın.
  3. Epididimal yağ yastığının sol ve sağ taraflarından viseral yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
    NOT: Epididimal adipositler nispeten büyük ve yüzerdir, bu da ayırma ve analizi kolaylaştırır.
  4. Toplanan dokuyu fosfat tamponlu salin (PBS; Şekil 1A).
  5. Yapışmış kan damarları ve kan pıhtıları da dahil olmak üzere yabancı maddeleri gidermek için dokuyu PBS ile iki kez yıkayın.
  6. Yıkanan mendili küçük parçalar halinde kesin.

2. Birincil sıçan abdominal adipositlerinin saflaştırılması

  1. Diseke edilmiş yağ dokusunu tripsin ve tip II kollajenaz (10 mL tripsin çözeltisi içinde 10 mg) ile 37 ° C'de çalkalama altında 2 saat inkübe edin.
  2. Sindirilmiş yağ dokusunu bir hücre süzgecinden süzün (Şekil 1A).
  3. Artık enzimatik aktiviteyi gidermek için süzüntüyü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 120 × g'da santrifüjleyin.
  4. Askıdaki adipositleri (üstteki beyaz tabaka) temiz bir tüpe aktarın ve PBS ile yıkayın.
  5. PBS'yi çıkarmak için süzüntüyü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 120 × g'da santrifüjleyin.
  6. Filtrelenmiş adipositleri (üst beyaz tabaka), %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) 30 dakikadan fazla olmayacak şekilde inkübe edin.

3. Gliserol salınımının analizi

  1. Filtrelenmiş adipositleri (kuyucuk başına 104-10 5 hücre; 200 μL) 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasına tohumlayın.
    NOT: Adipositler standart bir hemositometre kullanılarak ölçüldü. Adiposit boyutundaki büyük varyasyon nedeniyle, bazı büyük hücreler doğru bir şekilde sayılamamıştır. Bu nedenle, hücre sayısı gerçek adiposit sayısını tam olarak yansıtmayabilir. Ana amaç, kesin nicelemeden ziyade hücrelerin kuyucuklar arasında eşit dağılımını sağlamaktı.
  2. Adipositleri% 0.05 dimetil sülfoksit (DMSO; kontrol grubu olarak) ve 50 μM atorvastatin, pravastatin, lovastatin ve simvastatin ile 37 ° C'de 4 saat boyunca hafifçe çalkalayın.
    NOT: Bu tedavi koşulları referans olarak verilmiştir ve deneyin özel hedeflerine ve tasarımına göre gerektiğinde ayarlanabilir.
  3. Lipolizin başlangıcını gösteren gliserol salınımını analiz etmek için hücre kültürü ortamını (alt kırmızı tabaka) toplayın (Şekil 1B).
  4. Farklı tedavilere yanıt olarak adiposit lipolizini değerlendirmek için ticari bir gliserol salınım test kiti kullanın.
  5. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 570 nm'de absorbansı ölçün.

4. Hücre canlılığının analizi

  1. MTT tozunu damıtılmış H₂O içinde 5 mg/mL konsantrasyonda çözün ve kullanmadan önce 0,22 μm'lik bir filtreden sterilize edin.
  2. Gliserol salınım analizini takiben, hücrelere MTT çözeltisi (son 0.5 mg / mL'ye kadar) ekleyin ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Hücre canlılığının analizi için asılı adipositleri (üst mor tabaka) DMSO içeren temiz bir tüpe aktarın (Şekil 1B).
  4. Mor formazan kristallerini çözmek için kısaca girdap oluşur.
  5. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 570 nm'de absorbansı ölçün.

5. Normalleştirme hesaplaması

  1. Tüm deneyleri üç kopya halinde yapın ve dört kez tekrarlayın (n = 4).
    NOT: Her bağımsız deney için (n = 4), adipositler üç sıçandan izole edildi ve her tedavi koşulu üç kopya halinde gerçekleştirildi.
  2. Her tedavi grubu için, gliserol salınım absorbans değerini karşılık gelen hücre canlılığı absorbans değerine bölün.
  3. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.
    NOT: Ortalama ve SD, Microsoft Excel kullanılarak =ORTALAMA(aralık) ve =STDEV işlevleriyle hesaplandı. S(aralık). Grup karşılaştırmaları için, Karşılaştırma ortalamalarının t-testi fonksiyonu ile GraphPad Prism 6 kullanılarak eşleştirilmemiş iki kuyruklu t-testleri yapıldı.
  4. Gruplar arasındaki farklılıkların istatistiksel anlamlılığını, 0,05'ten küçük bir P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilen Öğrenci t-testini kullanarak belirleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ön ilaç taramasından sonra, antihiperlipidemik ilaç statinleri, normalize gliserol salım yöntemi9 ile adipositlerdeki lipolitik etkileri araştırmak için kullanıldı.

Statinlerin primer sıçan abdominal adipositlerinden gliserol salınımı üzerindeki etkisi
Statinlerin primer sıçan abdominal adipositlerinde lipoliz üzerindeki etkisi, hücrelerin 4 saat boyunca 50 μM pravastatin, simvastatin, atorvastatin, lovastatin ve% 0.5 DMSO ile muamele edilmesiyle değ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, lipid yüklü primer adipositlerde lipolizi ölçmek için daha doğru bir yöntem sunmaktadır. Pravastatin ve simvastatinin, sıçan epididimal adipositlerinde gliserol salınımını indüklediği ve canlılığı azalttığı, atorvastatin ve lovastatinin ise önemli bir etki göstermediği bulundu. Simvastatin uygulaması, adipositlerden gliserol salınımında minimal bir artışa neden oldu. Bu sorunu çözmek için, lipoliz ölçümünü standartlaştırmak için MTT testi kullanıldı. Bu yaklaşım, hem pravasta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmada bildirilen çalışmayı etkileyebilecek hiçbir rakip finansal veya kişisel çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi ve Putian Üniversitesi (her ikisi de Leo Tsui'den) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22-&mikro; m filtresiSangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.F513165-0001Şırınga filtresi, aquo-system, steril
3-(4,5-Dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.A600799-00011 gr
96-kuyucuklu hücre kültürü plakaları Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.F603204-0001steril
Atorvastatin kalsiyum tuzuCayman Kimya10493-55 mg
Hücre süzgeci Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.F513450-000180 elek ağı
Kloral hidratSangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.A500288-0250250 gr
Dimetil sülfoksitSangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.A460700-0100100 mL
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.E600003500 mL, yüksek glikoz, steril
Fetal sığır serumuSangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.E600001100 ml, steril
Gliserol Kolorimetrik Test KitiCayman Kimya10010755-9696 kuyu
LovastatinCayman Kimya10010338-55 mg
Erkek yetişkin sıçanlar Putian ÜniversitesiWistaryaklaşık 10-12 hafta
Penisilin-streptomisin çözeltisi Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.B540732-001010 mL, steril
Fosfat tamponlu salinSangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.E607009-0500500 mL, steril, kalsiyum veya magnezyum içermez
Pravastatin sodyum tuzuCayman Kimya10010343-55 mg
Simvastatin Cayman Kimya10010344-55 mg
Tripsin çözeltisi Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.E607003-0100100 mL, EDTA ve fenol kırmızısı içermez, steril
Tip II kollajenaz Sangon Biyoteknoloji Ltd. Şti.A004174-0100100 mg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saely, C. H., Geiger, K., Drexel, H. Brown versus white adipose tissue: A mini-review. Gerontology. 58 (1), 15-23 (2012).
  2. Ahima, R. S., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab. 11 (8), 327-332 (2000).
  3. Lass, A., Zimmermann, R., Oberer, M., Zechner, R. Lipolysis - A highly regulated multi-enzyme complex mediates the catabolism of cellular fat stores. Prog Lipid Res. 50 (1), 14-27 (2011).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metab. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
  6. Blanchette-Mackie, E. J., et al. Perilipin is located on the surface layer of intracellular lipid droplets in adipocytes. J Lipid Res. 36 (6), 1211-1226 (1995).
  7. Sztalryd, C., Brasaemle, D. L. The perilipin family of lipid droplet proteins: Gatekeepers of intracellular lipolysis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (10 Pt B), 1221-1232 (2017).
  8. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
  9. Mangione, C. M., et al. Statin use for the primary prevention of cardiovascular disease in adults: us preventive services task force recommendation statement. Jama. 328 (8), 746-753 (2022).
  10. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nat Metab. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  11. Roh, E., Yoo, H. J. The role of adipose tissue lipolysis in diet-induced obesity: Focus on vimentin. Diabetes Metab J. 45 (1), 43-45 (2021).
  12. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. J Biol Chem. 237, 3354-3358 (1962).
  13. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12827(2021).
  14. Miller, C. N., et al. Isoproterenol increases uncoupling, glycolysis, and markers of beiging in mature 3T3-L1 adipocytes. PLoS One. 10 (9), e0138344(2015).
  15. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  16. Dias, S., Paredes, S., Ribeiro, L. Drugs involved in dyslipidemia and obesity treatment:Focus on adipose tissue. Int J Endocrinol. 2018, 2637418(2018).
  17. Redberg, R. F. Statins and weight gain. JAMA Intern Med. 174 (7), 1046(2014).
  18. Ferrieres, J., et al. Body mass index impacts the choice of lipid-lowering treatment with no correlation to blood cholesterol - Findings from 52,916 patients in the Dyslipidemia International Study (DYSIS). Diabetes Obes Metab. 20 (11), 2670-2674 (2018).
  19. Chait, A., Jden Hartigh, L. J. Adipose tissue distribution, inflammation and its metabolic consequences, including diabetes and cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 7, 22(2020).
  20. Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. J Clin Invest. 129 (10), 3990-4000 (2019).
  21. Reiter-Brennan, C., et al. ACC/AHA lipid guidelines: Personalized care to prevent cardiovascular disease. Cleve Clin J Med. 87 (4), 231-239 (2020).
  22. Sahebkar, A., et al. Statin therapy and plasma free fatty acids: a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. Br J Clin Pharmacol. 81 (5), 807-818 (2016).
  23. Zhai, W., et al. Increased lipolysis in adipose tissues is associated with elevation of systemic free fatty acids and insulin resistance in perilipin null mice. Horm Metab Res. 42 (4), 247-253 (2010).
  24. Teusink, B., et al. Contribution of fatty acids released from lipolysis of plasma triglycerides to total plasma fatty acid flux and tissue-specific fatty acid uptake. Diabetes. 52 (3), 614-620 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipolysis QuantificationGlycerol ReleaseMTT AssayCell ViabilityPrimary AdipocytesRat Epididymal AdipocytesTriglyceride HydrolysisDrug ScreeningStatin EffectsMetabolic Syndrome

Related Articles