Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan kolonoid tek tabakaları boyunca floresan izleyicilerin akışını tespit ederek bağırsak bariyeri geçirgenliğinin ölçülmesi

1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

17 Ekim 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

Bu makalede

Özet

Bağırsak bariyeri bütünlüğünü ölçmek için, bilinen boyuttaki floresan etiketli bir şekerin translokasyon hızının, doku kaynaklı insan bağırsak kolonoidlerinin geçirgenliğini yansıttığı bir teknik tanımlıyoruz.

Özet

Bağırsak bariyeri, luminal antijenler ve konakçı bağışıklık sistemi arasında kritik bir düzenleme bölgesidir ve düzensizliği birçok gastrointestinal hastalıkta rol oynar. Bağırsak organoidleri, bağırsak bariyeri bütünlüğündeki farklılıkları anlamak ve modellemek için yararlı bir araç olabilir. Burada, organoid tek tabakalar boyunca floresan izleyicilerin akışını ölçerek fonksiyonel bağırsak bariyeri farklılıklarını ölçmek için insan kolonoidlerini kullanan bir protokolü açıklıyoruz. Tek tabakaları birleşmeye kadar büyüttükten sonra, apikal odaya FITC-dekstran gibi bir floresan izleyici ekliyoruz ve zamanla bazolateral odaya translokasyonunu tespit ediyoruz. Floresan izleyicinin artan translokasyonu, daha geçirgen veya daha zayıf bir epitel bariyerini yansıtır. Bu protokol, birden fazla koşulda fonksiyonel bağırsak bariyeri farklılıklarının paralel olarak değerlendirilmesine izin veren uyarlanabilir bir platformdur. Bu protokolün varyasyonları kullanılarak, çeşitli boyut, şekil ve kimyasal yapıdaki moleküllere transepitelyal geçirgenliğin yanı sıra epitel hücrelerinin apikal veya bazolateral taraflarında izole tedaviler veya mikroçevresel değişiklikler bağlamında geçirgenlik farklılıkları değerlendirilebilir. Bu, hastalık durumlarında bariyer bozulmasının mekanizmasının ve tedavisinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

Bağırsak mukozası, bağırsak lümenindeki metabolitler, antijenler ve mikroplar ile bağışıklık sistemi ve enterik dolaşım arasındaki temasın düzenlenmesinde önemli rol oynayan karmaşık bir yapıdır. Bağırsak epitel hücreleri bu sistemin önemli bir bileşenidir ve sağlıklı koşullarda oldukça seçici bir bariyer oluşturur. Epitel boyunca taşıma birden fazla mekanizma yoluyla gerçekleşebilir: transselüler aktif veya pasif taşıma, sıkı bağlantılar ve yapışık bağlantılar tarafından düzenlenen hücre dışı gözenek veya sızıntı yolları. Bu yollardan herhangi birinin bir molekül tarafından epitel boyunca yer değiştirmek için kullanılıp kullanılamayacağı hidrofobiklik, boyut ve kimyasal yapı ile belirlenir. Epiteli geçtikten sonra, bu moleküller mukozal bağışıklık hücreleri ile daha kolay etkileşime girebilir ve bağırsağın kan veya lenfatik dolaşımına girebilir 1,2 Bağırsak bariyerinin bozulması, inflamatuar bağırsak hastalığı ve çölyak hastalığı gibi çeşitli inflamatuar gastrointestinal hastalıkların ayırt edici özelliğidir 1,3,4,5,6,7. Bu zayıflamış bağırsak bariyerinin, patojenik antijenlerin düzensiz translokasyonu yoluyla bu hastalık süreçlerinin patofizyolojisinde rol oynadığı ve bunun daha sonra lokal veya sistemik bir inflamatuar yanıt oluşturabileceği düşünülmektedir.

Bağırsak bariyerini ölçmek için yerleşik birkaç protokol vardır. İn vitro çalışmalar, transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçmek ve sıkı bağlantı ve yapışık bağlantı bileşenlerini ölçmek için geleneksel olarak T84 veya Caco-2 hücreleri gibi kanser hücre hatlarını kullanır8. Ex vivo, biyopsi veya rezeke edilmiş bağırsak örneklerinde Ussing odaları kullanılarak transepitelyal akım ölçümleri alınabilir9. İn vivo çalışmalar tipik olarak oral yoldan inert izleyicilerin verilmesini ve ardından bu izleyicilerin kan veya idrar emiliminin ölçülmesini içerir10,11. Bu tekniklerin bağırsak bariyeri çalışmasında yararlı olduğu kanıtlanmış olsa da, çeşitli sınırlamalar sunarlar: dönüştürülmüş ölümsüz hücre dizileri doğal olarak bağırsak bariyerini kötü tanımlanmış şekillerde etkileyen metabolik ve hücre iskeleti değişikliklerine sahiptir; hastalara, hasta örneklerine veya model organizmalara erişim sınırlı olabilir; in vivo çalışmaların kafa karıştırıcı faktörleri kontrol etmesi veya moleküler düzeyde sonuçlara varması zordur. Bu nedenle, bu bariyer bozulmasının kanıtı birden fazla hastalık modelinde bildirilmiş olsa da, bu bağırsak bariyer kusurlarının mekanizmasının anlaşılması sınırlı kalmaktadır ve gastrointestinal hastalığın bu yönünü hedefleme ve tedavi etme yeteneğimiz belirsizliğini korumaktadır.

İnsan bağırsak organoidleri, bağırsak bariyer kusurlarının nedenini ve tedavisini aydınlatmak için benzersiz ve heyecan verici bir yetenek sunar. Doku kaynaklı insan bağırsak organoidleri, bağırsak kriptlerinin12 tabanında bulunan yetişkin kök hücrelerden türetilen birincil hücre kültürleridir. Bu hücreler, biyopsi veya cerrahi örneklerden izole edilebilir ve türetildikleri hastalarda görülen genetik ve epigenetik değişiklikleri sürdürmek için kültürlenebilir 13,14,15. Geleneksel ölümsüz hücre dizilerinden fizyolojik olarak daha alakalı bir model olarak hizmet ederler, çünkü kanser hücre dizilerinin metabolik değişikliklerine sahip değildirler ve olgun bağırsak epitelindebulunan çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilirler 16,17,18. Ek olarak, in vitro olarak genişletilebildikleri için, çeşitli tedavilerin hücresel etkisinin ve paralel olarak büyüme koşullarının kontrollü çalışmaları için daha erişilebilir ve faydalıdırlar. Bağırsak organoid modellerinde de doğal sınırlamalar olmasına rağmen, en önemlisi diğer epitelyal olmayan hücre tiplerinin yokluğu ve tüm vücut sisteminin bağlamı, insan bağırsak organoidlerinin gastrointestinal hastalığın birçok yönü için güvenilir bir model sağladığı gösterilmiştir13.

Bunlar arasında, bağırsak organoidlerinin bağırsak bariyer kusurlarını yakından modellediği, bariyer hakaretleri 19,20,21 ortamında sıkı bağlantı organizasyonunda ve TEER'de beklenen değişiklikleri gösterdiği gösterilmiştir. Burada, organoid tek tabakalar boyunca floresan etiketli moleküllerin akışının tespit edildiği insan kolonoidlerinde bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir tekniği uyarlıyoruz22. Bu protokolde, organoidler yarı geçirgen zarlar üzerinde polarize iki boyutlu tek tabakalar halinde büyütülür ve olgunlaştırılır. Test, epitelyal tek tabakanın apikal yüzeyine bir floresan izleyicinin eklenmesini gerektirir ve karşı taraftaki varlığı zamanla ölçülür. İzleyicinin artan akışı, daha sızdıran veya daha geçirgen bir epiteli yansıtır. Bu tahlil, sıkı ve yapışık bağlantıların yapısının değerlendirilmesine katkı sağlayabilecek fonksiyonel bir bariyer okuması sağlar. Ek olarak, TEER ölçümleri genellikle bariyer bütünlüğünün temel bir değerlendirmesini sağlamak için kullanılsa da, burada açıklanan akı testi, çeşitli sınıflardaki, yükteki ve boyuttaki moleküllerin geçirgenliğini tespit etmek için uyarlanabilir ve böylece bariyeri çok daha ayrıntılı olarak karakterize edebilir. Bu amaçla piyasada bulunan birkaç floresan izleyici kullanılabilir. Ayrıca, örtüşmeyen floresan spektrumların kullanılmasıyla, birden fazla izleyiciye geçirgenlik aynı anda değerlendirilebilir. Ayrıca, bu testin tek katmanlı konfigürasyonu, yalnızca hücrelerin apikal veya bazolateral yüzeyine spesifik olarak uygulanan büyüme koşullarına bariyer yanıtının değerlendirilmesine izin verir. Bununla, terapötiklerin, mikroçevresel değişikliklerin ve ortak kültür koşullarının etkisinin kontrollü bir değerlendirmesi mümkündür.

Bağırsak bariyeri kusurlarının çeşitli gastrointestinal hastalıkların gelişiminde önemli bir patojenik rol oynadığı bilinmektedir, ancak "sızdıran bağırsak" terimi popüler medyada kesinlik23 olmadan giderek daha fazla kullanılmaktadır ve kusurlu bağırsak bariyerini hedefleme çabalarının başarısı sınırlıdır. Bu, bağırsak bariyerini değerlendirmek ve karakterize etmek için geliştirilmiş modellere olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Tarif edilen sistem, kontrollü koşullar altında fonksiyonel bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için fizyolojik insan dokusundan türetilmiş bağırsak organoid tek tabakalarını kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm numuneler, Colorado Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan, protokol numarası 14-2012 olan bir protokole uygun olarak elde edildi ve kullanıldı.

NOT: Adım 1-3'teki tüm prosedürler steril teknikle steril bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Protokolün bir şeması Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Dondurulmuş kültürlerden insan kolonoidlerinin oluşturulması

NOT: Çözülmüş organoidlerin donma ortamına maruz kalmasını en aza indirmek için hücreleri çözmeden önce tüm malzemelerin biyogüvenlik kabininde hazır olduğundan emin olun. Protokol, dondurularak saklanmış dokudan türetilmiş insan kolonoidleri ile başlar. İnsan kolonoidlerinin türetilmesi ve dondurularak saklanması için protokoller daha önce açıklanmıştır24.

  1. İnsan bağırsak organoid kök ortamının hazırlanması
    1. Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 şartlandırılmış ortamı (L-WRN) daha önce açıklanan protokolleregöre hazırlayın 25,26.
    2. L-WRN ortamını aşağıdaki büyüme faktörleriyle destekleyin: Epidermal büyüme faktörü [50 ng/mL], Nikotinamid [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], Tiazovivin [4 μM], SB431542 [4 μM], Gastrin I [10 nM].
    3. Takviye edilmiş L-WRN ortamını ticari bağırsak organoid ortamıyla 1:1 oranında karıştırın.
    4. Kullanmadan hemen önce Y-27632 [10 μM] ile takviye edin.
      NOT: Optimal bağırsak organoid gövde ortamı bileşimi laboratuvar ve kolonoid hattına göre değişebilir. Tek başına takviye edilmiş L-WRN ortamının kullanımı veya tek başına ticari bağırsak organoid ortamının kullanılması da mümkün olabilir. Bu protokolün eşit miktarda L-WRN koşullandırılmış ortam ve ticari ortam kullanımı, tek başına koşullandırılmış ortam kullanımına kıyasla partiden partiye değişkenliğe karşı daha dayanıklıdır ve tek başına ticari ortam kullanımına kıyasla daha uygun maliyetlidir.
  2. Farklılaşma ortamının hazırlanması
    1. DMEM/F12'yi %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin-streptomisin ve 2 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid ile destekleyin.
    2. Takviyeli DMEM/F12 1:1'i adım 1.1'den itibaren bağırsak organoid gövde ortamıyla karıştırın
  3. Hücre dışı matrisin (ECM) hazırlanması
    1. ECM'yi gece boyunca buz üzerinde çözdürün, ardından 100 μL'lik alikotlar hazırlayın.
      NOT: Alikotlar -20 °C'de yeniden dondurulabilir. Ayrıntılar için üretici talimatlarına bakın.
    2. Alikotları, hücrelerin kaplanma zamanına kadar buz üzerinde inkübe edin.
  4. Organoidlerin çözülmesi ve kaplanması
    1. Dondurularak saklanan içeriği 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün, şişenin su altında kalmasını, ancak kapağın sadece çözülene kadar suyun üzerinde kalmasını sağlayın.
    2. Şişenin içeriğini 13 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM/F12 ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın (adım 1.2.1'den itibaren).
    3. 200 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin.
    4. Hücre peletinin üzerinde yaklaşık 1 mL kalıntı hacim bırakarak süpernatanı aspire edin.
    5. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. 1 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM/F12 ekleyin (adım 1.2.1'den itibaren) ve peleti yeniden süspanse etmek için süspansiyonu 10-15 kez pipetleyin.
    6. 200 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın ve hücre peleti üzerinde mümkün olduğunca az yıkama ortamı kalıntısı bırakın.
    8. Pelete 100 μL çözülmüş ECM ekleyin. Organoidlerin topaklanmadan eşit şekilde dağıldığından emin olarak iyice yeniden askıya alın. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için yavaşça pipetleyin.
    9. Her biri yaklaşık 10 μL olan yaklaşık 10 kubbe veya üç boyutlu ECM damlacıklarını 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna pipetleyerek ECM'yi plakalayın.
    10. Plakayı hızlı bir şekilde ters çevirin ve 37 °C'de 5-10 dakika veya kubbeler katılaşana kadar inkübe edin.
    11. Kubbeler ayarlandıktan sonra, kuyuya 2 mL bağırsak organoid kök ortamı (adım 1.1'den itibaren) ekleyin.
    12. 37 °C'de,% 5CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Medyayı 2 günde bir değiştirin.
    13. Organoidler ECM kubbesinin alanının yaklaşık %75'inden fazlasını kapladığında veya merkezi döküntü biriktirdiğinde 2. adıma geçin.

2. İnsan kolonoidlerinin geçişi ve genişlemesi

  1. Her kuyu için, ECM kubbelerini bozmadan kuyulardan büyüme ortamını aspire edin.
  2. Kubbeleri 1 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın, ardından PBS'yi çıkarın.
  3. Her kuyucuğa 1 mL buz gibi tripsin ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek ECM kubbelerini parçalamak için bir pipet kullanın. ECM'yi tamamen ayrıştırmak için karışımı 10-15 kez pipetleyin.
  4. Plakayı 37 °C'de 3-5 dakika inkübe edin.
  5. Tripsini nötralize etmek için kuyuya 1 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM/F12 (adım 1.2.1'den itibaren) ekleyin. Hücreler her biri 2-3 hücreden oluşan kümelere ayrılana kadar karışımı 20-30 kez kuvvetlice pipetleyin.
  6. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir koniğe aktarın.
  7. Kuyuyu yıkamak için ilave 1 mL takviyeli DMEM/F12 (adım 1.2.1'den itibaren) kullanın ve yıkama solüsyonunu 15 mL'lik koniğe ekleyin.
  8. 15 mL'lik konikte toplam 13 mL hacme ulaşmak için ilave DMEM/F12 (adım 1.2.1'den itibaren) ekleyin.
  9. Ek kuyulara genişletmek için uygun miktarda ECM kullanarak adım 1'in 1.4.3-1.4.12 adımlarına geçin.
    NOT: 100 μL ECM'de birleşik bir organoid kuyusu tipik olarak 2-3 kuyuya (200-300 μL ECM) geçirilebilir. 3. adımda yaklaşık 3-6 tek tabaka için bir birleşik organoid kuyusu yeterlidir.

3. İnsan kolonoid tek tabakalarının oluşumu

  1. Kollajen kaplama hücre kültürü ekleri
    1. Polistiren hücre kültürü eklerini (0,4 μm gözenek boyutu) 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve her bir ekin apikal odasına 100 μL kollajen kaplama çözeltisi ekleyin.
    2. Buharlaşmayı önlemek için plakayı sızdırmazlık filmi ile kapatın.
    3. 4-24 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: Bu inkübasyon süresi içinde sonuçlarda bir fark yoktur, ancak uygun bir duraklama noktasına uyacak şekilde daha kısa veya daha uzun bir inkübasyon süresi seçilebilir.
  2. Kaplama organoid tek tabakalar
    1. Organoidleri ayrıştırmak için 2.1-2.5 adımlarını izleyin.
    2. Hücre süspansiyonunu 70 μm hücre süzgecinden 50 mL'lik konik bir tüpe geçirin.
    3. Kuyucukları her biri 1 mL takviyeli DMEM/F12 ile durulayın (adım 1.2.1'den itibaren). Bu yıkama ortamını toplayın ve hücre süzgecinden geçirin.
    4. Hücre süzgecini 50 mL konik tüpteki toplam hacim 15 mL'ye ulaşana kadar takviye edilmiş DMEM/F12 (adım 1.2.1'den itibaren) ile yıkayın.
    5. Süzüntüyü 15 mL'lik bir koniğe aktarın.
    6. 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    7. Peletin üzerinde 1 mL bırakarak süpernatanı aspire edin.
    8. İlave 1 mL takviyeli DMEM/F12 ortamı ekleyin (adım 1.2.1'den itibaren) ve yeniden süspanse edin.
    9. Tam ayrışmayı doğrulamak için süspansiyonu mikroskop altında inceleyin. Gerekirse, hücreleri çoğunlukla tek hücre olana kadar kuvvetlice pipetleyin.
    10. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın ve hücre peleti üzerinde mümkün olduğunca az yıkama ortamı kalıntısı bırakın.
    11. Küçük bir hacimde (200-1000 μL) bağırsak organoid gövde ortamında yeniden süspanse edin (adım 1.1'den itibaren). Buz üzerinde kalın.
    12. Tercih edilen yöntemi kullanarak canlı hücreleri saymak için kullanmak üzere hücre süspansiyonunun bir kısmını alın. Ek başına 100.000 canlı hücreyi plakalamak için gereken hücre süspansiyonu hacmini belirlemek için canlı hücre sayısını kullanın.
    13. Kollajen kaplama solüsyonunu, ek parça membranına dokunmadan her bir ek parçadan aspire edin.
    14. Hücre süspansiyonu eklendikten sonra nihai hacmi 200 μL'ye getirmek için her bir ekin apikal odasına uygun hacimde bağırsak organoid kök ortamı (adım 1.1'den itibaren) ekleyin.
      NOT: Tercih edilirse, adım 3.2.12'deki hücre süspansiyonu 100.000 hücre / 200 μL'lik bir nihai konsantrasyona ayarlanabilir, daha sonra apikal odaya 200 μL kaplanabilir. Bununla birlikte, hücre süspansiyonunun tamamı tek katmanlı kaplama için kullanılmazsa, bu aşırı ortam israfına yol açabilir.
    15. Apikal odaya uygun hacimde hücre süspansiyonu ekleyin.
    16. Bazolateral odaya 500-1000 μL bağırsak organoid kök ortamı ekleyin.
      NOT: Tipik kolonoidler için 500 μL yeterlidir. Hücreler metabolik olarak daha aktifse veya atık ürün birikimine karşı başka bir şekilde duyarlıysa, bazolateral odada daha büyük bir hacmin kullanılması büyümeyi sürdürmek için yardımcı olabilir.
    17. Tüm ekler/kuyucuklar için tekrarlayın.
    18. 37 °C'de,% 5CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
    19. Medyayı haftada bir kez değiştirin.
      NOT: İlgilenilen tedaviler, kaplamadan önce veya sonra herhangi bir zamanda eklerin apikal ve / veya bazolateral odalarına uygulanabilir.

4. Transepitelyal elektrik direncinin (TEER) ve tek tabaka olgunlaşmasının ölçülmesi

  1. Direnci ölçün
    1. Ohm ayarında bir epitel volt/ohm metre kullanın. Probu %70 etanole batırılmış bir görev mendili ile silerek temizleyin. Elektrotun uzun kolunu bazolateral bölmeye ve kısa kolunu ek parçanın apikal bölmesine yerleştirin. Ölçümü kaydedin.
      NOT: TEER ölçümleri de ilgilenilen bir son noktaysa, arka plan olarak hücresiz kolajen kaplı bir ekin direnç ölçümlerini de yapın. Daha sonra TEER, (direnç - arka plan kesici uç direnci) x kesici ucun yüzey alanı olarak hesaplanır. Bu protokoldeki ekin yüzey alanı 0,33cm2'dir. Bu hesaplama TEER'i ohm·cmcinsinden verecektir.2. Malzeme Tablosunda listelenenden farklı bir epitel volt/ohm metre kullanıyorsanız, direnci ölçmek için üreticinin ölçüm cihazının kullanım talimatlarını kullanın.
    2. Ölçümler plato olana kadar her gün tekrarlayın.
      NOT: Plato tipik olarak 200 ohm·cm2'den büyük TEER ile 2 ila 3 hafta sonra ortaya çıkar, ancak kolonoid çizgisine ve büyüme koşullarına göre değişir.
  2. Direnç plato haline geldiğinde, gövde ortamını farklılaşma ortamıyla değiştirerek organoid olgunlaşmasını başlatın (adım 1.2'den itibaren).
  3. Günlük TEER ölçümlerine devam edin. TEER'de bir artış ve ikinci bir plato bekliyoruz.
    NOT: İkinci plato tipik olarak 1500-2500 ohm·cm2 TEER ile yaklaşık 7 gün içinde meydana gelir, ancak bu kolonoid çizgisine ve büyüme koşullarına göre değişir.
  4. TEER ölçümleri ikinci kez durağanlaştıktan sonra 5. adıma geçin.

5. FITC-dekstran akı testi

NOT: Bu protokol FITC-dekstran 4 kDa (Stokes yarıçapı 14 Å) kullanır. Bununla birlikte, deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, farklı boyutlarda, yüklerde ve floroforlarda floresan izleyiciler kullanılabilir22. Aynı anda birden fazla izleyici de kullanılabilir, bu durumda örtüşmeyen uyarma ve emisyon floresan spektrumları doğrulanmalıdır. Adım 5.1-5.3'ün 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma kabininde (nemlendirilmemiş, CO2 olmayan inkübatör) gerçekleştirilmesi önerilir. Bu mevcut değilse, reaktifler kullanımdan önce 37 °C'ye ısıtılmalı ve hücreler, tamponlar ve toplanan numuneler inkübasyon süreleri boyunca 37 °C'de tutulmalıdır.

  1. Reaktif hazırlama
    1. Hank'in tamponlu salin solüsyonunu (HBSS) 10 mM HEPES ile hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. 37 °C'ye kadar ısıtın.
      NOT: Gerekirse, HBSS+HEPES'i ilgilendiğiniz tedavilerle hazırlayın. Apikal odada 80 μL/kuyu ve bazolateral kamarada 1 mL/kuyu için yeterli miktarda hazırlayın.
    2. Ek parçaları durulamak için yaklaşık 50 mL ılık HBSS+HEPES'i küçük bir behere dökün. Sıvı atıklar için yakınınızda daha büyük bir beher bulundurun.
    3. FITC-dextran 4 kDa'yı tamamen çözün. HBSS'de HEPES ile 1.25 mg/mL'lik bir çözelti hazırlayın. Kuyu başına 80 μL ve standart eğri için 1 μL tahsis etmek için yeterli miktarda FITC-dekstran çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Başlangıç konsantrasyonu, izleyicinin boyutuna ve beklenen geçirgenliğine göre ayarlanabilir. Örneğin, reaktifleri korumak için daha düşük bir konsantrasyonda daha küçük veya daha fazla kalıcı izleyiciler eklenebilir. Apikal odaya tedavi uygulanması gerekiyorsa, uygun şekilde tedavi edilmiş HBSS+HEPES içinde FITC-dekstran solüsyonu hazırlayın.
  2. FITC-dekstran'ın tek katmanlara uygulanması
    1. Uygun kuyucuklara 1 mL HBSS+HEPES (istenirse arıtmayla birlikte) ekleyerek 24 oyuklu taze bir plaka hazırlayın.
    2. Organoid tek tabakaları, ek parçayı forseps ile kavrayarak, kuyudan çıkararak, apikal odayı doldurmak için ılık HBSS+HEPES içeren behere (adım 5.1.2'den itibaren) daldırarak ve ardından yıkama solüsyonunu boşaltmak için atık beherin üzerine ters çevirerek yıkayın.
    3. Bu yıkamayı 2 kez daha tekrarlayın.
    4. Ek parçayı, adım 5.2.1'de hazırlanan taze plakanın uygun kuyucuğuna yerleştirin.
    5. Apikal odaya 80 μL FITC-dekstran çözeltisini yavaşça pipetleyin. Tek tabakayı bozmamak için ek parçanın yan tarafına pipet takın.
    6. Tüm tek katmanlar için adım 5.2.5'i tekrarlayın.
    7. Nemi korumak için boş kuyucuklara HBSS veya PBS ekleyin.
  3. Akı örneklerinin toplanması
    1. Adım 5.2.7'den hemen sonra, her bir kuyucuğun bazolateral odasından 70 μL'yi düz, şeffaf tabanlı siyah 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna toplayın ve 37 °C'de ışıktan koruyun. Bu, 0 zaman noktası olacaktır.
    2. Plakayı ışıktan koruyarak 37 °C'de inkübe edin.
    3. 2 saat boyunca her 30 dakikada bir, tamponu bazolateral kuyucukta karıştırın, ardından adım 5.3.1'den itibaren şeffaf tabanlı 96 oyuklu plakanın boş kuyucuklarına 70 μL daha toplayın.
  4. Standart eğrinin hazırlanması
    1. 999 μL HBSS+HEPES'e 1 μL ayrılmış FITC-dekstran çözeltisi (1.25 mg/mL; adım 5.1.3) ekleyin. Bu, standart eğri için 1:1000 veya 1,25 μg/mL seyreltme olacaktır.
    2. Bu çözeltiyi 150 μL çözelti alarak ve 150 μL HBSS+HEPES'e ekleyerek seri olarak 1:1 seyreltin, ardından iyice karıştırın. Toplam 12 adımlı bir seyreltme için bunu seri olarak on kez daha tekrarlayın.
      NOT: Bu, 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 ve 0.61 ng/mL'lik standart bir eğri oluşturacaktır. Hücre hatlarının geçirgenliğine bağlı olarak, standart eğrinin az ya da çok konsantre olması gerekebilir. Deney ilk kez çalıştırıldığında, standart eğrinin farklı bir konsantrasyonda yeniden yapılması gerekmesi ihtimaline karşı ek bir FITC-dekstran 1.25 mg/mL çözeltisi ayırın.
    3. Standart eğrinin her seyreltmesinin 70 μL'sini, 5.3.1 ve 5.3.3 adımlarından 96 oyuklu şeffaf alt plakanın boş kuyucuklarına pipetleyin. İkinci çoğaltma için tekrarlayın.
  5. Floresan plaka okuyucusunda floresansı aşağıdaki ayarlarla ölçün: 490 nm uyarma, 520 nm'ye emisyon, plakanın altından okuma, 100 kazanç ve 7 mm okuma yüksekliği.
    NOT: Uyarma/emisyon dalga boylarını tercih edilen florofor için uygun şekilde ayarlayın.
  6. Veri analizi
    1. Standart eğriyi x ekseninde konsantrasyon ve y ekseninde floresans ile çizin. Doğrusal regresyon denklemini belirlemek için bunu kullanın.
    2. Her numune için her zaman noktasında FITC-dekstran konsantrasyonunu hesaplamak için bu doğrusal regresyon denklemini ve numunelerin floresan okumalarını kullanın.
    3. Her numune için zaman içindeki konsantrasyonu çizin ve mikrogram/dak'yı (μg/dak) temsil eden doğrusal bir regresyon denkleminin eğimini hesaplayın. Akış hızını santimetre kare başına dakikada mikrogram (μg/dak/cm2) olarak belirlemek için bunu hücre kültürü ekinin yüzey alanına (0,33 cm) bölün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, sağlıklı insan kolonoidlerinin inflamatuar sinyallemenin varlığında ve yokluğunda geçirgenliği analiz edildi. IFNy, TNFa ve IL-1β (her biri 10 ng/ml'de) içeren sitomiks olarak adlandırılan bir inflamatuar sitokin karışımının eklenmesinin, bağırsak epitel hücre modellerindeTEER ile ölçüldüğü gibi bağırsak bariyeri disfonksiyonunu indüklediği daha önce gösterilmiştir 20,27. Bu bariyer disfonksiyonunun, tarif edilen FITC-dekstran akı testi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu, insan kolonoid tek tabakalarının fizyolojik olarak temsili modelinde bağırsak bariyerini değerlendirmek için bir protokoldür. Burada açıklanan floresan izleyici akı testi, TEER, Ussing odası ölçümleri veya sıkı bağlantı protein ekspresyonunun değerlendirilmesi gibi diğer bariyer testleri ile toplananların ötesinde bariyerin fonksiyonel bütünlüğü hakkında bilgi sağlar. Ek olarak, hastadan türetilen bağırsak organoid modellerinin kullanımı, transforme edilmemiş hücre metabolizması ve k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir açıklama veya çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Dr. Sean Colgan, NIH hibeleri DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 ve VA Merit BX002182 tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL konik santrifüj tüpleriHücre tedavisi229411
2 mL İçten Dişli Kriyojenik Şişe Corning430488
50 mL konik santrifüj tüpleriHücre tedavisi229421
6 oyuklu plaka, doku kültürü ile işlenmişHücre tedavisi229106
70 μ M hücre süzgeciDoğan352350
96 oyuklu siyah/şeffaf alt plakaTermo Bilimsel165305
A83-01 R& D2939
BioTek Synergy plaka okuyucuGilentSinerji H1
Selometre Otomatik T4 Brightfield hücre sayacıNexcelcomCMT-AT4P
Selometre hücre sayma odalarıNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Kollajen kaplama solüsyonu Hücre Uygulamaları125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSO'nunSigma-AldrichD2650-100ML
Etanol %100Fisher BilimselA4094 Serisi
Stx2 Elektrotlu EVOM2 Voltohm MetreDünya Hassas AletlerNC9792051
Fetal Sığır Serumu (FBS)CytivaSH30396.03MERHABA
Filtre pipeti uçlarıFisher Bilimsel02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrin I (İnsan)R& D3006
GlutaMAX Fisher Bilimsel35050061200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptit
Hanks tamponlu salin solüsyonu 10xTermo Bilimsel14065056
HEPES 1MTermo Bilimsel15630080
İnterferon gama rekombinant insanBiyolojik Efsane575308
İnterlökin 1 beta rekombinant insanTermo bilimsel200-01B-500UG
IntestiCult Bağırsak Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)STEMCELL Teknolojileri06010 Ticari bağırsak organoid ortamı
Canlı ters mikroskopOlympusIX85
MatrisCorning354234Hücre dışı matris (ECM)
Mikrobiyolojik inkübatörFisher Bilimsel151030515
Süspansiyon kültürü için çok kuyulu plaka, 24 kuyucukluGreiner Biyo-on662102
NikotinamidR& D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BSızdırmazlık filmi
Pasteur pipetler (borosilikat cam)Fisher Bilimsel13-678-20B
PBS Gibco10010-023
Penisilin Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140122
Rekombinant moouse epidermal büyüme faktörüR& D2028-EG
Soğutmalı santrifüjBeckman CoulterBE-AX15R Serisi
SB202190 R& D1264
TiazovivinR& D3845
ThinCert hücre kültürü ekleme 24 kuyucuklu plaka, 0.4 μ mGreiner Biyo-on662641
Tripsin-EDTA (%0,25)Fisher Bilimsel25200114
Tümör nekroz faktörü alfa rekombinant insanR& D10291-TA-100
Y-27632 dihidroklorür Tocris HakkındaTB1254-GMP

Kaynaklar

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ba rsak OrganoidleriFITC DekstranTransepitelyal Ge irgenlikEpitelyal BariyerBariyer B t nlOrganoid Modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.