Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İskelesiz Fare Yumurtalık Folikül Kültürü için Özelleştirilebilir Agaroz Kalıplarının Üretimi ve Kullanımı

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

24 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İn vitro gametogenezi tamamlayan yeni bir iskelesiz agaroz kalıbında yumurtalık foliküllerini kültürleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Özet

Yumurtalık folikülü, kadın üreme fonksiyonunu ve sağlığını sürdürmek için gerekli olan hormonları ve gametleri üreten yumurtalığın fonksiyonel birimidir. Folikülogenezi, yumurtlamayı ve luteinizasyonu in vitro olarak özetleme yeteneği, geniş temel, translasyonel ve klinik faydaya sahiptir. En gelişmiş in vitro folikül büyüme sistemleri, insanlarda mayotik olarak yetkin metafaz II oositlerin gelişimi için çok önemli olan folikülün üç boyutlu (3D) mimarisini korur. Son zamanlarda, fare çok katmanlı ikincil foliküllerinin in vitro folikül büyümesi için iskelesiz bir yöntem geliştirildi ve doğrulandı. Bunun için, foliküllerin hacimsel genişlemesini barındıran mikro kuyucuklarla agarozu mikro modellemek için özel 3D baskılı kalıplar kullanıldı. Bu iskelesiz ortamda yetiştirilen foliküller, iyi kurulmuş aljinat bazlı kapsüllenmiş in vitro folikül büyümesi (eIVFG) sistemlerine göre karşılaştırılabilir hormon üretimi ve canlılığı gösterdi. Daha da önemlisi, agaroz mikro kuyucukları ölçeklenebilir bir yöntemdir, teknik olarak daha az zahmetlidir ve eIVFG'ye göre gelişmiş folikül büyümesi ve yumurtlama oranları gösterir. Bu metodoloji, malzemeye özgü sızıntı sularına ve diğer çevresel kirleticilere karşı oldukça hassas bir hücre olan oosit ile biyolojik olarak uyumlu, özelleştirilebilir kalıplar üretir. Ayrıca, bu sistemdeki foliküller aynı odak düzleminde kültürlenerek gerçek zamanlı timelapse görüntüleme ve analiz sağlar. Bu yeni yaklaşımın erişilebilirliğini artırmak için bu makale, ana kalıpları tasarlamak ve 3D yazdırmak, 24 veya 96 oyuklu plakalar için silikon kalıplar oluşturmak ve agaroz kalıplarında çok katmanlı ikincil yumurtalık foliküllerini kültürlemek için gereken yöntemleri detaylandırmaktadır. Bu kurulum aynı zamanda uygun maliyetli hızlandırılmış görüntüleme sistemiyle de entegre edilebilir ve morfokinetik analize olanak tanır. Ek olarak, küfler, aşağı akış histolojik analizleri için parafine gömülebilir. Genel olarak, bu kullanıcı dostu yöntem, folikül kültürü için çok yönlü bir araçtır ve tam in vitro gametogenezi sürdürmek için folikül bağlamında germ hücrelerinin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını teşvik etmek için daha da özelleştirilebilir.

Giriş

Oosit veya dişi gamet, bir sonraki neslin gelişimi için gerekli olan döllenme sırasında sitoplazmanın büyük bir kısmını ve genetik materyalin yarısını embriyoya katkıda bulunur. Oogenez, embriyonik gelişim sırasında, ilkel germ hücreleri mayoz bölünmeye girdiğinde ve faz I'de durduğunda başlar. Bu oositler, ilkel foliküller içinde bulunur ve aşamalı olarak toplandıkları sonlu ve yenilenemez bir havuz olan yumurtalık rezervini oluşturur. Foliküller, folikülogenez olarak bilinen bir süreçte gelişirve sonuçta 1,2,3,4,5'i dölleyebilen olgun bir gamet üretmek amacıyla gelişir. Folikül gelişimi, folikülün hayatta kalması ve büyümesi için parakrin sinyallemenin gerekli olduğu erken, gonadotropinden bağımsız bir aşama ile başlar. Foliküller ikincil aşamaya olgunlaştıkça gonadotropinlere bağımlı hale gelirler ve bu da endokrin sinyallemeye geçişe işaret eder. İkincil foliküllerin önemli bir özelliği, yeni geliştirilen teka tabakası ile birlikte en az iki tam küboidal granüloza hücresi tabakası ile çevrili bir oosittir. Teka hücreleri, folikülün en dış tabakasını oluşturarak androjenler ve yapısal destek sağlar 6,7. Son olarak, yumurtlama sırasında luteinize edici hormon (LH) dalgalanmasına yanıt olarak sıvı dolu bir antral boşluk oluşur ve yırtılır, Mayoz II 2,8,9'da tutuklanan döllenme yetkin bir gamet salgılar.

Oosit, döllenme için gelişimsel yeterliliğe ve oogenez ve folikülogenez10,11,12 sırasında nükleer ve sitoplazmik olgunlaşma olarak adlandırılan erken preimplantasyon embriyo gelişimini destekleme yeteneğine ulaşır. Sitoplazmik olgunlaşma, oositler folikülogenez boyunca genişledikçe morfolojik olarak belirgindir. Teka, granüloza ve kümülüs hücreleri dahil olmak üzere somatik hücre proliferasyonunun bir sonucu olarak, foliküllerin kendileri önemli hacimsel genişleme yaşarlar. Farelerde, folikülün çapı erken sekonderden yumurtlama öncesi foliküllere kadar beş kat artar. Oosit ve çevresindeki somatik hücreler arasındaki çift yönlü iletişim, oogenez için gereklidir. Birincil foliküllerde, zona pellucida, oosit tarafından salgılanan proteinlerden oluşur ve bu folikül bölmeleri arasındaki iletişime kısmen, bu iki folikül bölmesi13,14 arasında fiziksel temas sağlayan transzonal çıkıntılar aracılık eder. Bu nedenle, foliküler mikro çevre, oosit2,5'in büyümesinin yanı sıra nükleer ve sitoplazmik olgunlaşmasını doğru bir şekilde düzenlemek için hayati önem taşır. Bu süreçleri destekleyen ayrık mekanizmaları daha iyi anlamak için gelişmiş ve fizyolojik olarak ilgili in vitro kültür tekniklerine ihtiyaç vardır. Folikülleri in vitro kültürleme yeteneği, yardımcı üreme teknolojileri ve doğurganlığın korunması 15,16,17,18, türlerin korunması 19,20, ilaç geliştirme21 ve toksikoloji taraması22,23 dahil olmak üzere geniş uygulamalara sahiptir.

İn vitro folikül kültür sistemleri, in vitro gametogenez (IVG)24 olarak da bilinen pluripotent kök hücrelerden gamet üretme yeteneği için de önemli bir ara adımdır. Araştırmacılar, çeşitli türlerde gamet geliştirmek için embriyonik kök hücreleri, mezenkimal kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreleri kullandılar ve genellikle doğal folikül mikro ortamını yeniden oluşturmak için somatik hücrelere güvendiler 25,26,27,28,29,30. Bu yöntemlerle önemli kavram kanıtlama kilometre taşlarına ulaşılmış olsa da, farelerde in vitro fertilizasyonu takiben düşük embriyo gelişimi ve canlı yavru oranlarına yansıyan düşük kaliteli oositlerin hala bir zorluğu vardır31,32. Diğer türlerde henüz canlı doğum elde edilmemiştir, bu da oogenez ve folikülogenezi tam olarak desteklemek için protokollerin sürekli iyileştirilmesi ihtiyacının altını çizmektedir.

Şu anda, folikül kültürü için çeşitli stratejiler kullanılmaktadır. Teknik olarak en az talepkar ve en yüksek verimli yaklaşımlar, foliküllerin plastik bir tabağa veya membran ekineyerleştirildiği iskelesiz yöntemlerdir 33,34. Burada granüloza hücreleri kültür yüzeyine yapışarak oosit33,34 ile temasını kaybeder. Foliküler mimarinin bozulması, bu tekniklerin kullanılabilirliğini ve biyolojik uygunluğunu sınırlar. Bununla birlikte, düşük bağlanma plakalarında veya ters çevrilmiş damlalarda iskelesiz kültür, folikülün birkaç memeli türünde yapısal bütünlüğü korumasına izin verir 35,36,37. Ne yazık ki, bu tekniklerle foliküller arasındaki etkileşimi ve aldıkları mekanik destek miktarını kontrol etmek zordur. Bu nedenle, in vivo fizyolojiyi daha iyi özetlemek için, foliküllerin tanımlanmış, ayarlanabilir kimyasal bileşimlere ve/veya mekanik özelliklere sahip hidrojeller içinde kapsüllendiği kültür yöntemleri geliştirilmiştir 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Örneğin, aljinat kapsüllenmiş in vitro folikül büyüme sistemi, in vivo 21'de gözlemlenen anahtar transkriptomik imzaları özetleyebilir.

Kapsüllenmiş kültür protokollerinin başarısına ve değerine rağmen, birkaç dezavantajı vardır. Teknik olarak zorlayıcı, zahmetli, düşük verimli olabilirler ve otomatik görüntüleme yöntemleriyle uyumlu değildirler. Ayrıca, kapsüllenmiş kültür yöntemleri, folikülün37 daha yüksek hacimsel genişlemesi nedeniyle daha büyük memeli türleri için çok adımlı yaklaşımlara ihtiyaç duyar. Ayrıca, kapsüllenmiş teknikler her yöne eşit destek sağlar ve yumurtlamadan önce foliküllerin hidrojelden salınması gerekir. Bu, folikülün dinamik biyomekanik destek sağlayan çevreleyen yumurtalık mikro çevresi ile etkileşime girdiği in vivo olarak gerçekleşmez54. Örneğin, sert yumurtalık korteksi, ilkel foliküllerin durgunluğunu korurken, büyük büyüyen foliküller tipik olarak daha yumuşak medüller bölmede55,56 bulunur. Yetkili bir oosite sahip bir folikül terminal boyutuna ulaştığında, folikül duvarı ve yumurtalık yüzeyi epitel modifikasyonları yumurtlamaya izin verir. Bu nedenle, foliküllerin çok az dirençle tek bir yönde büyümesine izin verilen kültür teknikleri, in vivo fizyolojiyi daha iyi taklit edebilir.

Yeni bir yaklaşımla, fare çok katmanlı ikincil folikülleri için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir, teknik olarak daha az talepkar ve uygun maliyetli bir kültür yöntemi geliştirilmiştir57. Burada, hassas bir şekilde kontrol edilebilir geometriye (şekil, boyutlar) ve mekansal düzenlemeye (sayı, yakınlık) sahip ultra düşük yapışma özelliğine sahip agaroz mikro kuyular, uygun fiyatlı yöntemler kullanılarak üretilmektedir. Agaroz kalıplarındaki foliküller, bir yönde hariç tüm yönlerde mekanik destek alır ve aynı odak düzleminde kültürlenir, bu da gelişmiş morfokinetik analiz için hızlandırılmış görüntülemeye olanak tanır. Stereolitografi (SLA) 3D baskı, bir ana kalıp üretmek için ulaşılabilir bir yöntem olarak kullanıldı ve ardından agarozu dökmek için sızıntı suyu içermeyen silikon kalıplar oluşturan kalıplama adımları izledi. Genel folikül sağkalımı, olgunlaşması veya luteinizasyonundan ödün vermeden, geleneksel eIVFG'ye kıyasla yeni sistem kullanılarak iyileştirilmiş folikül büyümesi ve yumurtlama sonuçları elde edildi57. Bu protokol belgesi, agaroz kalıplarını özelleştirmek ve üretmek, çok katmanlı ikincil foliküllerin nasıl tohumlanacağı ve kültürleneceği, işlenmesi ve son olarak hızlandırılmış analizin nasıl gerçekleştirileceği için gerekli adımları açıklamaktadır (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolle ilgili tüm hayvan prosedürleri, Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Ana kalıp tasarımını uyarlayın

Bu bölüm, 24 oyuklu ana kalıp tabanı tasarımı (Ek Dosya 1) olarak adlandırılan, 24 oyuklu kültür plakaları için bir ana kalıbın bilgisayar destekli tasarımında (CAD) özel mikro kuyucukların tanıtıldığı Tasarım aşamasında (Şekil 1) gerçekleştirilen ilk adımları açıklamaktadır. Mikro kuyucukların boyutları, destek miktarını ve foliküllerin maksimum büyüme boyutunu belirlerken, kuyucuk sayısı, agaroz küfü başına maksimum folikül sayısını belirler. Uyarlanmış ana kalıp tasarımı daha sonra bir sonraki bölümde agaroz dökümü için biyouyumlu silikon kalıplar oluşturmak üzere kullanılacaktır.

  1. CAD yazılımını kullanarak 24 oyuklu ana kalıp tabanı tasarımı .step dosyasını açın (Şekil 2A).
  2. Nesnenin iç yüzey alanını seçin, ardından Tasarım çalışma alanındaki Katı sekmesine gidin ve istenen mikro kalıp tasarımını eklemek için Çizim Oluştur'u seçin (Şekil 2Bi).
  3. İstenen xy boyutlarını ve mikro kuyu sayısını tanıtın ve araç çubuğunda bitiş çizimini seçin (Şekil 2Bii).
    NOT: Çok katmanlı ikincil foliküller için, daha önce 57 500 x 700 μm'lik bir stadyum geometrik şekli kullanılmıştır. Baskı çözünürlüğü, kullanılan reçinelere ve SLA yazıcılara bağlı olarak değişebilir; mikro kuyucuklar arasında minimum 400 μm boşluk bırakın.
  4. Ekstrüzyon işlevini kullanarak 800 μm derinliğindeki mikro kuyucukları oluşturun (Katı | Oluştur | Ekstrüzyon). Mikro kuyu boşluğunu oluşturarak kesme işlemini seçtiğinizden emin olun (Şekil 2Biii).
  5. 0,100 mm yarıçaplı bir radyus seçin (Tasarım | Katı | Değiştir | Fileto) mikro kuyuların üstü için
    NOT: Yuvarlak tabanlı bir mikro kuyu oluşturmak için, kültür kuyusunun dibi için fileto işlemini tekrar kullanın ve yarıçap değerini mikro kuyu tasarımının yarıçapına eşit tutun. Örneğin, 500 μm x 700 μm kuyular tasarlarken 0.250 mm'lik bir yarıçap değeri seçin (Şekil 2Biv).
  6. Yeni ana kalıp tasarımının bir kopyasını .step formatında dışa aktarın (Dosya | dışa aktar'a tıklayın).

2. Silikon kalıp kapları oluşturma

NOT: 3D baskılı parçalardan sitotoksik bileşiklerin sızmasını önlemek için iki adet biyouyumlu silikon kalıp yapılacaktır. Bu bölümde tasarım aşamasındaki son adımlar açıklanmaktadır (Şekil 1) ve silikon kalıplama için kullanılan iki kap ortaya çıkacaktır. Burada, bölüm 1'den oluşturulan yeni ana kalıp tasarımı ve 24 oyuklu silikon döküm kaplar 1 ve 2 olmak üzere üç farklı CAD dosyası kullanılacaktır (sırasıyla Şekil 2Ci-ii ve Ek Dosya 2, Ek Dosya 3).

  1. 24 oyuklu silikon döküm kabı 1.step dosyasını açın ve yeni ana kalıp tasarımını harici bir bileşen olarak yerleştirin (Katı | Ekle | Bileşen Ekle).
    1. Bileşene sağ tıklayın ve yeni ana kalıp tasarımına bağlı referansı kaldırmak için Bağlantıyı Kes'i seçin.
  2. Yeni ana kalıp tasarımını 24 oyuklu silikon döküm kap 1 yüzeyiyle ortalayın ve içe baktığından emin olun.
    1. Tarayıcıda yeni ana kalıp tasarım nesnesine sağ tıklayın ve taşı/kopyala seçeneğini belirleyin.
    2. Hareket Tipi bölümünde Serbest Taşıma işlemini seçin ve gerekirse nesneyi x ekseni üzerinde 180° döndürün.
    3. Başlangıç noktası olarak yeni ana kalıp tasarım nesnesinin ortası ve hedef noktası olarak 24 kuyucuklu silikon döküm kabı 1 yüzeyinin merkezi ile Taşıma Türü bölümünde Noktadan Noktaya işlemini seçin.
    4. Nesneleri hizalamak için Tamam'ı seçin.
  3. Hedef gövde olarak kap ve takım gövdesi tasarımı olarak ana kalıp ile kesme işlemini seçin (Şekil 2Ciii). Bu, silikon kalıplamanın ilk adımı için kabı oluşturur (Şekil 2Civ).
    NOT: İlk bölümde tasarlanan mikro kuyular artık bölüm 3'te açıklandığı gibi 3D olarak basılacak mikro sütunlardır. SLA baskı, eklemeli bir üretim yöntemidir; dolayısıyla mikro sütunların basılması, mikro kuyuların basılmasına kıyasla baskı çözünürlüğünü artırır.
  4. Ortaya çıkan yeni 24 oyuklu silikon kalıp 1'i .stl ve .step dosyası olarak kaydedin ve dışa aktarın.

Silikon kapların 3. 3D baskısı

NOT: Bu bölümde, istenen mikro kuyu tasarım özelliklerine sahip yeni CAD tasarımlarının 3D olarak basıldığı Üretim aşamasında (Şekil 1) gerçekleştirilen ilk adımlar açıklanmaktadır.

  1. Yeni 24 oyuklu silikon kalıp 1 ve 24 oyuklu silikon döküm kap 2'nin .stl dosyalarını 3D baskı hazırlama yazılımıyla açın.
  2. Baskıyı mikro sütunlar yukarı bakacak şekilde yönlendirin ve 1 mm genişliğinde bir açıklık oluşturmak için delik açma işlevini kullanın (Şekil 2D). Bu kanalın baskının yan tarafında açık olduğundan emin olun.
    NOT: Baskı sırasında çukurlaşma etkisini önleyen ve baskıdan sonra doldurulabilen delik veya ilk silikon kalıplamadan sonra fazla silikon malzeme çıkarılabilir.
  3. İki kap tasarımını 25 μm katman kalınlığında yazdırın (Şekil 3A).
    NOT: İşleme sırasında baskı kusurlarını veya hasarları hesaba katmak için her modeli üç kopya halinde yazdırın.
  4. Kalıpları baskı platformundan çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre %95 izopropanol ile yıkayın. Mikro sütun bölümüne yoğun bir şekilde %95 izopropanol püskürtün (Şekil 3B). Kalan etanolü basınçlı hava ile çıkarın.
  5. Kalan etanolün en az 30 dakika buharlaşmasına izin verin.
    NOT: Bu aşamada 1 mm genişliğindeki matkap kanalı kapatılabilir. Bu, baskının dışına p200 pipet ucuyla küçük bir damla polimerize olmayan reçine uygulanarak yapılabilir. Kılcal kuvvetler kanalı dolduracaktır.
  6. 3D baskıları 60 °C'de ultraviyole ışıkla 15 dakika kürleyin.
  7. Her baskıyı bir stereomikroskop kullanarak inceleyin ve kusurlu 3D baskıları atın (Şekil 3C-F). Her baskıyı görsel olarak iyice inceleyin, tüm mikro sütunların ayrıldığından ve boyut ve görünüm açısından aynı olduğundan emin olun (Şekil 3D). Birleştirilmiş mikro sütunlara sahip kusurlu ana kalıpları atın (Şekil 3E).
    NOT: Yaygın sorunlar, kalan yıkanmamış reçineden kaynaklanan hasarlı mikro sütunlar veya köprülerdir (Şekil 3Fi,ii).
  8. Matkap kanalı doldurulmamışsa baskının dışını parafilm ile örtün ve bir sonraki kullanıma kadar saklayın.

4. Silikon kalıp imalatı

NOT: Bu bölümde, iki silikon kalıplama adımının gerçekleşeceği üretim aşamasının son adımları açıklanmaktadır (Şekil 1). Bu, 3D baskılı parçalar tarafından toksik sızıntı sularının salınmasını önlemek için gereklidir.

  1. Silikonu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın, özetle:
    1. Kısım A ve B kaplarının içindekileri iyice karıştırın, bir teraziye bir beher yerleştirin ve ağırlıkça 1A:1B oranında kaba dökün. Fazla malzemeye sahip olduğunuzdan emin olun.
    2. 3 dakika boyunca iyice karıştırın, kenarlarını ve altını kazıdığınızdan emin olun.
    3. Malzemeyi vakumlu bir desikatöre yerleştirin ve sıkışan hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için 5 dakika bekletin. Hava kabarcıkları kalırsa gaz gidermeyi 2 kata kadar tekrarlayın.
  2. Karışımı homojen bir akışla silikon kalıp kabına 1 dökün. Silikon kalıbın düzlüğünü sağlamak için karışım seviyesinin 3D baskı ile aynı seviyede veya biraz altında olduğundan emin olun (Şekil 4Ai,ii).
    1. Bir p200 pipet ucu kullanarak sıkışan havayı çıkarın ve gerekirse vakumlu gaz giderme kullanın.
  3. Silikonu kalıptan çıkarmadan önce oda sıcaklığında en az 5 saat ve tercihen gece boyunca kürleyin.
  4. Silikonu 3D baskılı kalıptan çıkarın ve bir stereomikroskop kullanarak mikro kalıpların bütünlüğünü görsel olarak onaylayın (Şekil 4Aiii,B). Gerekirse matkap kanalındaki fazla malzemeyi çıkarın (Şekil 4Aiv). Köprüleme veya tehlikeye atılmış mikro kuyucuklara sahip kalıpları atın (Şekil 4C).
  5. İkinci silikon kalıplama adımı için silikon kalıbı silikon kalıp kabına 2 yerleştirin (Şekil 4Av). Silikon kap 2'nin yan duvarında, silikon kalıp yerleştirildikten sonra kapatılacak olan 1 mm'lik bir açıklık vardır.
  6. Silikon kalıba embriyo açısından güvenli mineral yağ püskürtün ve mikro kuyucuklardaki fazla yağı çıkarın. Bu, kürlendikten sonra her iki silikon parçayı ayırmak için bir ayırıcı madde görevi görecektir.
  7. Adım 4.1'de açıklanan karıştırma adımlarını tekrarlayın ve karışımı silikon kalıp kabına 2 dökün. Silikon kalıbın düzlüğünü sağlamak için karışım seviyesinin 3D baskının altında veya aynı yükseklikte olduğundan emin olun (Şekil 4Avi).
  8. Kalıptan çıkarmadan önce silikonun oda sıcaklığında en az 5 saat, tercihen gece boyunca kurumasını bekleyin.
  9. Silikonu 3D baskılı kalıptan çıkarın ve silikon kalıp 1 ve 2'yi birbirinden ayırın (Şekil 4Avii). Bir stereomikroskop kullanarak mikro sütunların bütünlüğünü görsel olarak onaylayın (Şekil 4D). Mikro kuyucuklarda kabarcıklar veya fazla yağ varsa kalıbı atın (Şekil 4E).
  10. Silikon kalıbı %70 etanol ile yıkayın ve laminer akışlı bir başlıkta 30 dakika kurumaya bırakın.
  11. Bir sterilizasyon poşetine yerleştirin ve sterilize etmek için kuru bir döngü kullanarak otoklavlayın (Ceket basıncı: 20 psi, Oda sıcaklığı: 250 °F, Sterilizasyon süresi: 15 dakika).

5. Kültür ortamının hazırlanması

NOT: Foliküllerin izolasyonu ve kültürü için yumurtalık dokusunun sindirimi, oositlerin in vitro olgunlaşması ve luteinizasyon altı tip ortam gerektirir: Diseksiyon Ortamı (DM), Enzimatik Ortam (EM), Bakım Ortamı (MM), Büyüme Ortamı (GM), Olgunlaşma Ortamı (IVM) ve Luteinizasyon Ortamı (LM). Bu besiyerlerinin hazırlanması, daha önce Converse ve ark.38 tarafından Simon ve ark.33 tarafından analiz edilen farklı besiyeri bileşenlerinin önemine ilişkin bir açıklama ile tanımlandığı gibi bulunabilir ve amaçlarından Tablo 1'de kısaca bahsedilmiştir.

  1. Ortamı 1 hafta öncesine kadar hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.

6. Özel agaroz küf ve folikül kültürünün dökümü ve depolanması

NOT: Bu bölümde, bölüm 4'te oluşturulan silikon kalıplardan folikül kültürü için özel agaroz kalıplarının nasıl döküleceği açıklanmaktadır. Agaroz kalıpları yapılabilir ve folikül kültüründen 2 hafta öncesine kadar 4 °C'de saklanabilir.

  1. Kalıpları bir sterilizasyon poşetine yerleştirin ve bölüm 4.11'de açıklandığı gibi kuru bir döngü kullanarak otoklavlayın. Kullanmadan önce kalıpların soğumasını bekleyin.
  2. Steril %1,5 agaroz (a/h) çözeltisini Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde bir mikrodalga veya sıcak plakada çözerek agaroz çözeltisi yapın. Agarozun daha eşit şekilde ısınmasını sağlamak ve sıvı agaroz çözeltisinin katılaşmasını yavaşlatmak için su dolu bir behere yerleştirilmiş steril bir konik tüp kullanın.
  3. Steril agaroz çözeltisini laminer bir akış başlığında silikon kalıplara pipetleyin. Kabarcıkların oluşmasını en aza indirmek için yavaş ve düzgün bir şekilde pipetleyin ve kalıbın üst kısmının düz olduğundan ve dışbükey veya içbükey olmadığından emin olun. Döküm sırasında üst kısım, kültürleme sırasında kalıbın alt kısmı olacaktır ve düz durmalıdır. 24 oyuklu bir plaka mikro kalıbı için yaklaşık 600 μL agaroz ve 96 oyuklu bir plakaya uyan bir mikro kalıp için 85 μL agaroz kullanın.
  4. Mikro kalıpları katılaşana kadar ~3 dakika soğumaya bırakın. Mikro kalıpları 100 mm'lik bir Petri kabına atmak için silikon dökümü ters çevirin.
  5. Mikro kalıpları, çatlaklar, mikro kuyucukların birleşmesi veya eksik kenarlıklar dahil olmak üzere herhangi bir deformasyon açısından mikroskop altında değerlendirin. Mikro kalıpları steril PBS + %1 Penisilin-Streptomisin içine yerleştirin ve kullanmadan önce 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Plakalar arasında aktarım yaparken zamanla bozulmayı veya mikro kalıpların hasar görmesini hesaba katmak için gerekenden daha fazla kalıp yapın.
  6. Folikül izolasyonu gününde mikro kalıpları 750 μL Bakım Ortamı 2x içinde en az 1 saat (toplam iki inkübasyon) dengeleyin.
  7. Tüm bakım ortamını çıkarın, 750 μL Büyüme Ortamı ekleyin ve 1 saat inkübatöre koyun.
  8. Tohumlamadan önce taze ve dengelenmiş Büyüme Ortamı ile değiştirin.

7. Geç sekonder foliküllerin izolasyonu ve kültürü

NOT: Bu bölüm, folikül kültürü için agaroz mikro kalıplarında foliküllerin nasıl izole edileceğini ve tohumlanacağını açıklamaktadır. Çok katmanlı sekonderler 8 gün boyunca kültürlenir, %80'in üzerinde canlılığa sahip olmalı ve olgun oositler üretmelidir. İkincil foliküllerin izolasyonu ve kültürü başka bir yerde önemli ölçüde ayrıntılı olarak açıklanmıştır38. Yerleşik aljinat kapsülleme ve agaroz kalıplarında tohumlama için foliküllerin izolasyonu ve seçimi tutarlıdır.

  1. Yumurtalıkları farelerden ayırın ve periovaryan yağ dokusundan ve bursadan çıkarın. Yumurtalıkları 2.5 mL Enzimatik Ortama yerleştirin ve daha önce tarif edildiği gibi 20 dakika boyunca 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin57.
  2. Bir IVF kabına 2 mL Bakım Ortamı pipetleyin ve folikül izolasyonundan önce bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin.
  3. 250 μL FBS ile reaksiyonu söndürün. Enzimatik izolasyondan sonra geç ikincil folikülleri seçin ve bunları DM'li bir IVF kabına aktarın.
  4. Folikülleri önceden dengelenmiş bakım ortamına sahip bir IVF kabına aktarın ve 1 saat boyunca bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin.
    NOT: Geç sekonder foliküllerin başlangıç boyutu 150-180 μm'dir ve ikiden fazla granüloza hücresi tabakası mevcuttur.
  5. Agaroz mikro kalıplarına 750 μL taze GM ekleyin ve tohumlamaya hazırlanmak için inkübatörde saklayın. Kültürü korumak ve kültür dönemi boyunca ortamın buharlaşmasını en aza indirmek için agaroz mikro kalıplarını çevreleyen bitişik kuyucuklara steril PBS ekleyin.
  6. Tohum folikülleri, önceden dengelenmiş ve GM'ye batırılmış agaroz kalıplarına aktarın. Yüksek kaliteli çok katmanlı ikincil folikülleri, 200 μm'lik bir sıyırıcı ucu kullanarak mikroskop altında agaroz mikro kalıplara aktarın. 24 oyuklu bir plakadaki her bir mikro kalıba 10 folikülün aktarıldığından ve her folikülün ayrı fakat bitişik bir mikro kuyuda olduğundan emin olun.
    1. Foliküllerin daha hassas manipülasyonuna ve mikro kuyucuklara aktarılmasına izin vermek için sıyırıcı ucunu bükün.
    2. MM ve GM CO2 tamponlu olduğundan sıcaklık ve pH değişikliklerini en aza indirmek için folikülleri hızlı bir şekilde aktarın.
    3. 10 folikülün tamamı transfer edildikten sonra bir mikro kalıp içindeki foliküllerin benzer başlangıç boyutunda olduğundan emin olun.
  7. Görüntülemeden önce foliküllerin iyileşmesini sağlamak için tohumlanmış mikro kalıpları en az 1 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
  8. Folikül sağkalımını ve büyüme sonuçlarını ölçmek için folikülleri gün aşırı 4x ve 10x büyütmede görüntüleyin.
    NOT: Timelapse görüntüleme, morfokinetik ölçümler yapmak için de ayarlanabilir ve bölüm 9'da daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
  9. Kültür medyasının %50'sini gün aşırı değiştirin.
  10. Kullanılmış medyayı kuru buzla dondurun ve ardından -80 °C'de saklayın. Estradiol ELISA'lar yoluyla hormon üretimini değerlendirmek için bu şartlandırılmış ortamı kullanın.
    NOT: GM tohumlama gününde (kültür döneminin başlangıcında) yapılırsa, ortam 4 °C'de saklanabilir ve tüm kültür dönemi boyunca kullanılabilir.
  11. Kültürün 8. gününde tüm büyüme ortamlarını (750 μL) çıkarın ve dondurun.
  12. İn vitro yumurtlamaya izin vermek için büyüme ortamını IVM ortamıyla değiştirin.
    NOT: Yumurtlama, zamanlama ve yırtılma özelliklerini değerlendirmek için timelapse görüntüleme altında da gerçekleşebilir.
  13. IVM ortamı eklendikten 14-16 saat sonra kümülüs-oosit komplekslerini (COC'ler) çıkarın ve olgunlaşma durumunu puanlayın.
    1. Olgunlaşma durumunu şu şekilde tanımlayın: MII'yi ilk kutup gövdesinin ekstrüzyonu (sağlıklı oositler için beklenen sonuç), GVBD/MI'yı polar gövde veya germinal vezikül eksikliği (gecikmiş olgunlaşma), GV'yi oositin merkezinde görünen küresel çekirdek (mayotik ilerleme eksikliği) veya dejenere-düzleştirilmiş ve/veya koyulaşmış oosit.
  14. İsteğe bağlı: Kromozomal hizalama, şekil ve hacim dahil olmak üzere MII oositlerinin iğ parametreleri, oosit kalitesi ve embriyo sonuçları58,59 ile sıkı bir şekilde ilişkili olduğundan, bunları in vitro oogenezin başarısını değerlendirmek için kullanın. İğ morfolojisini değerlendirmek için, MII yumurtalarını tam montajlı immünositokimya yoluyla sabitleyin ve boyayın.
    1. Fiksasyon: Yumurtaları 37 °C'de 20 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 ile %3,8 PFA'ya sabitleyin. Yumurtaları bloke edici tamponda 3 kez yıkayın (kalsiyum ve magnezyumlu PBS (PBS +/+)% 10 Tween-20 ve% 0.3 BSA ile).
    2. Mil boyama:
      1. Yumurtaları geçirgenleştirme tamponunda (PBS +/+% 0.1 Triton X-100 ve% 0.3 BSA ile) oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin
      2. Engelleme tamponunda 2 kez durulayın.
      3. Yumurtaları Alexa Fluor 488-konjuge anti-alfa-tübülin içinde 1 μg/mL konsantrasyonda folyoya sarılmış bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
      4. DAPI içeren montaj ortamı ile mikroskop lamlarına monte etmeden önce yumurtaları bloke tamponda 3 x 20 dakika yıkayın.
      5. Oosit hücre iskeletini gözlemlemek için, boyama sırasında 1:50 rodamin phalloidin ekleyin.
    3. Tüm iş mili boyunca 1,0 μm genişliğinde bir z-yığınına sahip 63x objektif kullanılarak konfokal mikroskopta görüntü örnekleri.

8. Özel agaroz kalıplarının sonraki uygulamaları

NOT: Agaroz mikro kalıpları, histolojik analiz için kullanılabilir ve ilgilenilen farklı genlerin veya proteinlerin nicelleştirilmesine ve lokalizasyonuna izin verir. Mikro kalıplar, birden fazla folikülün paralel olarak boyanmasına izin veren bir folikül mikrodizisi oluşturur. Optik koherens tomografi (OCT) de folikül transferine gerek kalmadan yapılabilir (Şekil 1, Uygulama). Optik Koherens Tomografi, numunelerin 3D rekonstrüksiyonuna izin veren ve konfokal mikroskopiye kıyasla daha yüksek penetrasyon derinliği ve çözünürlüğüne sahip olan ve in vitro60 kültürlenmiş foliküller gibi 3D numunelerin daha iyi görüntülenmesine olanak tanıyan bir görüntüleme tekniğidir.

  1. Histoloji uygulamaları için, adım 6.2'de açıklandığı gibi bir agaroz çözeltisi (%1.5 a/h) yapın.
    1. Kuyudaki agaroz mikro kalıplarını çevreleyen tüm ortamları çıkarın ve boşluğun köşelerinde bir p200 pipet kullanarak mikro kalıp boşluğundaki ortamı dikkatlice çıkarın.
    2. Folikülleri çalkalamadan mikro kuyucukları ve boşluğu doldurmak ve kapatmak için 100 μL sıvı agaroz çözeltisini dikkatlice pipetleyin; Üst kısmın düz olduğundan emin olun. Steril bir P10 pipet ucuyla kabarcıkları çıkarın.
    3. Agarozun oda sıcaklığında 2 dakika katılaşmasına izin verin. Mikroskop altında mikro kalıbın tamamen kapatıldığından emin olun.
    4. Mikro kalıpları gece boyunca 4 °C'de 750 μL fiksatif (Modifiye Davidson Solüsyonu veya %3.8 paraformaldehit) içinde hafifçe sallayarak sabitleyin.
    5. Fiksatifi aspire edin ve kapalı mikro kalıpları, %50 ve son olarak %70 EtOH ile başlayarak artan etanol konsantrasyonlarında yıkayın.
    6. Standart işleme protokollerini (Tablo 2) kullanan otomatik bir doku işlemcisi kullanarak işleyin ve parafin mumuna gömün. Yerleştirirken mikro kalıpların yönüne dikkat edin. Kesit alma sırasında doku kaybını en aza indirmek için gömme işlemi sırasında numuneden önce ve sonra balmumu olduğundan emin olun.
    7. Gömülü numuneleri 5 μm kalınlığında seri olarak kesit edin ve yüklü mikroskop lamlarına yerleştirin.
    8. H&E boyama işlemini otomatik bir boyama aracı ile gerçekleştirin ve görüntüleme öncesi montaj ortamı ile mühürleyin.
  2. OCT yaparken, foliküllü mikro kalıbı IVM ortamı içeren 50 mm'lik bir kaba yerleştirin.
    1. Temsili OCT görüntülerini oluşturmak için kullanılan prosedürü takip etmek için, 1.3 μm eksenel çözünürlük ve 9.4 μm yanal çözünürlük ile görünür ışık spektral aralığında çalışan özel yapım bir OCT sistemi kullanılarak görüntü61,62.
    2. Folikülleri, 1.58 A çizgisi ve 1,58 B taramasından oluşan 2 x 512 mm512 görüş alanında, B taraması başına 2 kez ve hacim başına 3 kez tarayın.
    3. Foliküllerin 3 boyutlu yapısını görselleştirmek ve hacimleri ölçmek için ImageJ'yi kullanarak OCT görüntülerini işleyin.
      1. Dosyaları açık uygulamaya sürükleyerek görüntüleri ImageJ'ye Z-yığını olarak yükleyin.
      2. Eklentiler|3D|Hacim Görüntüleyici. Farklı zaman noktalarında farklı açıları görüntülemek için 3D görüntüyü döndürün.
      3. Dosya| Farklı Kaydet |Tiff görüntüyü istenen konuma kaydetmek için.

9. Folikül kültürünün hızlandırılmış analizi

NOT: İskelesiz kültür sisteminde yetiştirilen foliküller aynı odak düzleminde bulunur ve inkübatörde timelapse görüntüleme ile uyumludur. Adım 7.7'de foliküller tohumlandıktan sonra timelapse görüntülemeye başlanabilir (Şekil 1, Uygulama).

Zaman atlaması boyunca tüm değişikliklerin doğru olduğundan emin olun. Bu nedenle, ölçümlerde herhangi bir tutarsızlık olmadığından emin olmak için her adımdan sonra tüm yığını gözden geçirin.

  1. Hızlandırılmış kurulum:
    1. El mikroskobuna bir Işık odaklayıcı/yoğunlaştırıcı kapağı yerleştirin.
    2. Montaj tutuculu el mikroskobunu inkübatöre yerleştirin ve yazılımın yüklü olduğu bir dizüstü bilgisayara bağlayın.
    3. Kültürü mikroskop altına iyice yerleştirin ve hizalayın ve mikroskobun yüksekliğini ve odağını tüm foliküller odakta olacak şekilde ayarlayın. Otomatik Beyaz Dengesi'ni (AWB) kullanarak, LED Kontrolü'nü kullanarak en uygun aydınlatma koşullarını seçin, Otomatik Pozlama'yı (AE) kapatın ve en uygun pozlama süresini seçin.
      NOT: Her ortam değişiminden önce ve sonra kalıbın hizalamasının aynı olduğundan emin olun; aksi takdirde her 2 günlük kültür için ayrı ayrı analiz yapılması gerekecektir.
    4. 8 günlük bir süre ve 30 dakikalık bir aralık seçerek hızlandırılmış görüntülemeyi başlatın. Fotoğraf seçin ve Fotoğraf çekmediğinizde LED'i kapatın.
  2. ImageJ analizinden önce ölçümleri ayarla iletişim kutusunda hangi ölçümlerin kaydedileceğini belirtin ( Analiz Et | ölçümleri ayarla'yı tıklatın).
    NOT: ImageJ yazılımına dahil edilen olası ölçümler hakkında daha fazla bilgi için kullanıcı kılavuzu alt bölüm 30.763'e bakın.
  3. Analizi başlatmak için tüm görüntüleri ayrı bir analiz klasörüne yerleştirin.
  4. Timelapse'ı yığın olarak açmak için analiz klasörünü ImageJ yazılımına sürükleyip bırakın. Sayısal olarak sıralama adlarının seçildiğinden emin olun ve görüntü dizileri bilgisayarın RAM'ine sığmıyorsa sanal yığın'ı seçin.
  5. Hızlandırılmış çekim boyunca tüm foliküllerin bulunduğu bir alanı seçmek için dikdörtgen seçim aracını kullanın. Bunun için önce son resmi kullanın ve foliküllerin hiçbirinin kesilmeyeceğinden emin olmak için yığın boyunca ilerleyin. Ardından, seçimi kırpın (Görüntü | Kırp veya Ctrl+Shift+X, Şekil 5Ai,ii).
  6. Timelapse yığını için ölçek çubuğunu ayarlama (Analiz | Ölçeği Ayarla). Görüntüleyici ile yapılan 0. gün görüntüsünü kullanın ve foliküller veya mikro kuyucuklar gibi tanımlanabilir üç özelliği ölçün. Hızlandırılmış yığından aynı gün 0 görüntüsünü kullanın ve ölçümlerden biri için ölçeği tanımlayın; Doğru ölçeğin ayarlandığını doğrulamak için diğer iki ölçümü kullanın.
  7. SIFT eklentisini kullanarak tüm görüntüleri hizalayın (Eklentiler | Kayıt | SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalaması, (Şekil 5Bi,ii). Duruma göre ayarlanabilen aşağıdaki standart ayarları kullanın: SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalaması, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 en yakın/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation=Sert enterpolasyon.
  8. Yığını 8 bit gri tonlamaya dönüştürün (Görüntü | Tür | 8 bit).
  9. Yuvarlanan Top Arka Plan Çıkarma özelliğini kullanarak arka planı kaldırın (İşlem | Arka Planı Çıkar, Şekil 5Ci,ii) duruma göre ayarlanabilen aşağıdaki ayarları kullanarak: Yuvarlanan top yarıçapı=70.0 piksel; Yumuşatmayı devre dışı bırak'ı seçin.
  10. Görüntüyü eşikleyin ( Görüntü | Ayarla | Threshold) aşağıdaki ayarları kullanarak timelapse görüntüleri iki piksel sınıfına bölmek için: setThreshold(35, 255, "raw"); run("LUT uygula", "yığın"); setOption("BlackBackground", true); run("Maskeye Dönüştür", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Dikdörtgen seçimini kullanarak her bir folikülü ayrı ayrı ölçün, ardından partikül analizi işlevini seçin (Analiz Et | Parçacıkları Analiz Edin). Aşağıdaki ayarları kullanın: Parçacıkları Analiz Et...", "size= 8000-Infinity ekran hariç tut dahil et özet yer paylaşımı ekle bileşik yığın ekle (Şekil 5Di,ii).
    1. Sonuçları kaydetmeden önce, her görüntü için yatırım getirisinin doğru olduğunu onaylayın (Şekil 5Ei,ii). Özeti ve sonuçları . CSV biçiminde olmalıdır.
    2. Bunu diğer tüm foliküller için tekrarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol bölüm 7'de açıklandığı gibi bu yeni teknoloji kullanılarak folikül sağkalımının ve büyümesinin desteklenip desteklenmediğini belirlemek için, aynı farelerden alınan foliküller izole edildi ve agaroz mikro kalıplarında paralel olarak kültürlendi veya% 0.5 aljinat içinde kapsüllendi. Kültürün her iki gününden elde edilen foliküllerin temsili görüntüleri, kültür periyodu boyunca normal gelişim, büyüme ve antral boşluk oluşumunu göstermiştir (Şekil 6A)....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İn vitro gametogenez ve olgunlaşma, yardımcı üreme teknolojisi, doğurganlığın korunması ve türlerin korunmasında potansiyel uygulamalarla oosit biyolojisinin temel anlaşılması için anahtar teknolojilerdir. IVG'yi destekleme yöntemleri, yeniden yapılandırılmış yumurtalıklar oluşturmak için genellikle somatik hücrelerle birlikte kültüre dayanır30. Bu destek hücrelerinin önemi, foliküler somatik mikro çevrenin sağlıklı oosit büyümesi ve gelişimi için kritik ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüleri (R01HD105752 F.E.D'ye ve T32HD094699 E.J.Z'ye) ve NIH Ortak Fonu'nun SenNet programı (U54AG075932 ve UH3CA268105 F.E.D.) ve Bill & Melinda Gates Vakfı Hibe (INV-003385'ten F.E.D.'ye) tarafından finanse edilmiştir. Bill & Melinda Gates Vakfı'nın hibe koşulları altında, bu gönderimden doğabilecek Yazar Kabul Edilen El Yazması versiyonuna Creative Commons Atıf 4.0 Genel Lisansı zaten atanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemeler ve Kimyasallar
  50 mL polistiren santrifüj tüpleriGlobe Scientific941-11017-CS
1.5 mL Mikrosantrifüj TüpleriFisher ScientificMCT-150Snap dondurma ve medya depolamak için
100 mm çanak, işlememişFisher Scientific08-757-100D Agaroz mikro kalıpları yapmak ve saklamak için
%100 etanolMercedes Scientific1200Doku İşleme
1000 µ L  Pipet Uçları, Düşük TutmaMIDSCIPR-1000BKKültür ipuçları ve nbsp;
200 µ L  Pipet Uçları, Düşük TutmaMIDSCIPR-200BKKültür ipuçları ve nbsp;
24 kuyuklu plakaCorning353047Kültür
35 mm antenlarFalcon351008Yumurtalıkları izole etmek ve enyzmatik ortamda kuluçka yapmak
%95 etanolMercedes Scientific1210Doku İşleme
AgaroseHoeferGR140Mikro kalıplar
BioXtra Mineral Yağı, Hafif Yağ, Fare embriyo hücre kültürü için uygunSigma-AldrichM5310-500MLBiyouyumlu bir kalıp giderme ajanı olarak kullanılır
Sığır Serumu Albümini MP Biyomedikal103700Büyüme Medyası
Temizlik Toz Makineleri, 10 Oz., 6 Tane PaketOffice Depot 110284Sıkıştırılmış hava
Clear V4 Reçine 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-043D baskı reçinesi
Corning Yeniden Kullanılabilir Plastik Düşük Form 100 mL Beaker, Polipropilen, DereceliCorning1000P-100Silikon bileşenleri karıştırmak için beaker & nbsp;
DNAse IQiagen79254Enzimatik Medya
Ecoflex 00-45 Neredeyse TemizSmooth-On, Inc.B09M8Y9PTVSilikon malzeme
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Büyüme Medyası
Fetal Sığır FetuiniSigmaF-3385Büyüme Medyası
Fetal Sığır Serumu (FBS)Zirve SerumuPS-FB2Diseksiyon Medyası, Enzimatik Medya,   Bakım Medya & Olgunlaşma Medyası
Fisherbrand  Sterilizasyon KeseleriFisher Scientific01-812-50 Sterilizasyon Keseleri
Folikül uyarıcı hormon (FSH)EMD Serono, Inc.Sadece Gonal-F reçetesi Büyüme Medyası & Olgunlaşma Medyası
Gibco  DPBS, kalsiyum, magnezyumFisher Scientific14-040-182 Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu
İnsan korionik gonadotropini (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLOlgunlaşma Medyası
İnsülin-transferrin-selenyum (ITS)ThermoFisher41400045Büyüme Medyası
Invitrogen Moleküler Probları Rodamin FalloidinFisher ScientificR415Yumurta Sitoskeleti Lekesi
IVF YemekleriTermo Bilimsel150260Folikülleri izole etmek, seçmek ve önceden dengelemek için
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Dissection Media & Enzimatik Medya
LiberaseSigma Aldrich5401119001Enzimatik Medya
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Bakım Medyası,  Büyüme Medyası & Olgunlaşma Medyası
Fare epidermal büyüme faktörü (EGF)BD Biosciences354010Olgunlaşma Medyası
Nalgene Şeffaf Polikarbonat Klasik Tasarım KurutucuTermo Bilimsel5311-0250Vakum Kurutucu 
ParafinFisher Scientific83-30Doku İşleme & Gömülme
Penisillin-streptomisinGibco15140-122Diseksiyon Medyası, Enzimatik Medya & Bakım Medyası
Soyucu uçlarıOrigioMXL3-200Kültür
VECTASHIELD PLUS DAPI ile Antifade Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-2000Yumurta çekirdeği boyama
KsilenMercedes Scientific9840Doku İşleme
α-Tubulin (11H10) Tavşan mAb (Alexa Fluor 488 Konjugate)Hücre Sinyal Teknolojisi5063SYumurta Tubulin lekesi
Ekipman
Platform 2'yi Inşa EtFormlabs, IncBP-F3-02-01 3D yazıcı bileşeni
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLTimelapse kurulumu için görüntüleyici
Form 3 Reçine Tank V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-013D yazıcı bileşeni
Form 3B+ 3D YazıcıFormlabs, IncF3B-P-PRINTERFormlabs'ın stereolitografi (SLA) 3D yazıcısı
Form kürleme Formlabs, IncFH-CU-01Kürleme platformu 
Form yıkamaFormlabs, IncFH-WA-01Yıkama platformu
Pompa buharlaştırıcılı sprey şişesiVWR0309-3005Demolding maddesi uygulamak için
Edge serisi için ışık odaklayıcı/konsantrasyon kapağı (T5, T8 modelleri hariç)Dino-LiteN3C-RTimelapse kurulumu için görüntüleyici bileşeni
RK-10 rack ve RK-10-EX Arm Extension'u birleştiren Mount Holder paketiDino-LiteRK-10ATimelapse kurulumu için görüntüleyici bileşeni
Doku GömücüLeicaHistoCore ArcadiaMikro kalıpları gömmek için
Doku İşlemciLeicaTP1020Mikro kalıpları işlemek için
211DS Sallama Kuluçka Makinesi (Yörünge Sarsıcı)Labnet InternationalI-5211-DSFoliküllerin salınması için yumurtalıkları enzimatik ortamda kuluçka altına almak
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncBilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı. Autodesk, Autodesk Education programı aracılığıyla ücretsiz eğitim erişimi sunmaktadır.
DinoCapture 3.0 sürüm 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJUlusal Sağlık EnstitüleriOCT görüntülerini analiz etmek ve folikülleri ölçmek
Ön FormFormlabs, IncFormlabs'ın stereolitografi (SLA) yazıcılarıyla çalışmak üzere tasarlanmış ücretsiz baskı hazırlama yazılımı. 

Kaynaklar

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Agaroz Mikrokal plarskele siz K lt rOver Folik lleri3B Yazd r lm Kal plarZaman Atlamal G r nt lemeok Katmanl Sekonder Folik llerSilikon Kal p retimiIn Vitro Folik logenezOptik Koherens Tomografisi
İskelesiz Fare Yumurtalık Folikül Kültürü için Özelleştirilebilir Agaroz Kalıplarının Üretimi ve Kullanımı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.