Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kimerik Antijen Reseptörü T-Hücre Tedavisi Araştırmaları için Dolaşımdaki Glioma Modeli

410 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kimerik antijen reseptörü T hücresi tedavisinin in vivo terapötik etkisini araştırmak için lateral ventrikül enjeksiyonu ile dolaşımdaki bir glioma modeli oluşturur.

Özet

Beyin omurilik sıvısında (BOS) dolaşan tümör hücreleri, gliomada tümör nüksü ve intrakraniyal metastazda önemli bir faktördür. Birçok çalışma, BOS'ta dolaşımdaki tümörü hedeflemek ve ortadan kaldırmak için etkili stratejiler belirlemeye çalışmaktadır. Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi tedavisi, dolaşımdaki çeşitli tümörler için sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, uygun bir dolaşımdaki glioma modelinin olmaması nedeniyle araştırmalar sınırlıdır. Burada dolaşımdaki bir glioma modeli geliştirildi ve CAR T hücresi tedavisi araştırmalarında uygulandı. Bu model, intrakraniyal hastalığın lokal tedavisinde yaygın olarak kullanılan lateral ventrikül enjeksiyonu kullanılarak oluşturulmuştur. Glioma hücreleri, intrakraniyal primer tümörü oluşturmak için lateral ventriküle enjekte edildi. Lateral ventrikülden dökülen tümörler BOS'ta dolaşımdaki tümörü belirtmek için kullanıldı. Modelin oluşturulması kolaydır ve dolaşımdaki gliomanın CAR T hücresi tedavisi üzerine çeşitli çalışmalarda uygulanabilir. Sonuç olarak, dolaşımdaki glioma modeli, dolaşımdaki tümörün etkili CAR T hücresi tedavisi çalışmaları için benzersiz bir glioma metastaz modeli sağlar.

Giriş

Gliom erişkinlerde en sık görülen primer malign beyin tümörüdür 1,2. Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi dahil olmak üzere mevcut tedaviler, sadece 14-15 aylık medyan sağkalım ile sınırlı etkinlik göstermektedir 3,4,5. BOS'ta dolaşan glioma hücreleri, tümör nüksü ve intrakraniyal metastazda çok önemli bir rol oynar 6,7. Bu nedenle, dolaşımdaki glioma hücrelerini ortadan kaldırmak için daha etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.

Glioma ile ilgili son araştırmalar esas olarak intrakraniyal primer tümörlere odaklanmıştır 8,9. Ancak klinikte ele alınması gereken en önemli sorun, dolaşımdaki glioma hücrelerinin nasıl hedef alınacağı ve ortadan kaldırılacağıdır. Bu nedenle ameliyat öncesi veya sonrası dolaşımdaki gliom ile ilgili çalışmalara daha fazla dikkat edilmesi gerekmektedir. Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi tedavisi, dolaşımdaki tümör hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda kullanılan en yaygın stratejidir 10,11. Bununla birlikte, intrakraniyal tümörlerin özel anatomik yapısı nedeniyle, dolaşımdaki gliomun incelenmesi için kritik olan uygun bir dolaşımdaki gliom modeli geliştirmek zordur 12,13,14,15,16.

Bu çalışma, lateral ventrikül enjeksiyonuna dayalı benzersiz bir dolaşımdaki glioma modeli oluşturmuştur. Bu modelde glioma hücreleri lateral ventriküle enjekte edilir ve 10. günde in vivo biyolüminesans görüntüleme ve akım sitometri analizi ile intrakraniyal primer tümör ve BOS'ta dolaşan tümör tespit edilir. CAR-T tedavisi, dolaşımdaki glioma model farelerde tümör yükü yaklaşık 6.5 × 105p/s'ye ulaştığında başlatıldı. CAR-T hücrelerinin terapötik etkisini değerlendirmek için tümör yükü her 5 günde bir izlendi. Bu model, glioma hastalarının tümör hücresi pul pul dökülme durumunu taklit eder ve dolaşımdaki gliom ile ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmadaki hayvan deneylerinin tümü, Kurumsal İnceleme Kurulu ve Nanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi (IACUC-1905048) tarafından onaylanmış ve denetlenmiştir. Bu çalışma için 6-8 haftalık C57BL/6J dişi fareler kullanıldı. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlama

  1. Fareleri bir bariyerde, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde, 24 °C ortam sıcaklığında ve %50 bağıl nemde kafeste barındırın.
  2. Fareleri tartın ve 50 mg / kg pentobarbital sodyum ve 10 mg / kg ksilazin17 intraperitoneal enjeksiyonu ile (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) uyuşturun.
    NOT: Pentobarbital sodyum ve ksilazin kombinasyonu, fare stereotaksik enjeksiyon prosedürlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Uygun anestezitizasyon, ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmemesiyle doğrulandı ve hayvanın ameliyattan önce tamamen bilinçsiz olmasını sağladı. Kornea kuruluğunu ve hasarını önlemek için anestezi sırasında gözlere veteriner oftalmik merhem sürüldü.
  3. Bir laboratuvar hayvanı tıraş makinesi ile bir farenin kafasındaki tüyleri alın ve farenin başını ve uzuvlarını stereotaksik aparata sabitleyin.
  4. İyodofor kullanarak farenin kafasını pamuklu çubukla sterilize edin ve farenin vücudunun geri kalanını steril cerrahi havluyla örtün.
  5. Kafa derisini sağ alnın üst kısmındaki orta hat boyunca yaklaşık 1 cm bir neşter ile kesin.
    NOT: Enfeksiyonu önlemek için tüm cerrahi aletler kullanımdan önce uygun şekilde sterilize edilmelidir. Yaralanmaları önlemek için aletlerin dikkatli kullanılmasına özen gösterilmeli ve tüm prosedürler steril bir ortamda yapılmalıdır.
  6. Lambda sütür ile bregma arasındaki Z ekseninin yükseklik farkının 0,05 mm'ye eşit veya daha az olduğundan emin olarak burun klipsini ve kulak çubuğunu ayarlayın.

2. Dolaşımdaki glioma modelinin oluşturulması

  1. Centiyana menekşesine batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak orta hattın sağ tarafına 1,5 mm ve bregmanın arka tarafına 1,1 mm noktayı işaretleyin (koordinatlar: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm bregmadan).
  2. 0,5 mm çapında minyatür bir kraniyal matkap kullanarak, dura mater'i ortaya çıkarmak için hedef koordinatlarda delikler açın.
  3. Kemik kalıntılarını gidermek için tuzlu su ile durulayın.
  4. Derinlik sınırlayıcı tıpa (GL261-Luc-Gfp, %0.1 BSA içeren PBS'de GL261-Luc-Gfp, 1×105 hücre/μL) bir mikroşırınga kullanarak 5 μL tümör hücresi süspansiyonu çekin.
  5. İğneyi 0,2 mm/s hızında 3,0 mm derinliğe sokun ve iğneyi 0,5 mm geri döndürün, doku basıncını stabilize etmek için 10 saniye duraklayın.
  6. Geri akışı en aza indirmek için enjeksiyon sonrası 10 dakikalık bekleme süresi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon pompası kullanarak hücreleri 1 μL/dak'da enjekte edin.
  7. Mikro şırıngayı yavaşça geri çekin, enjeksiyon bölgesine steril bir pamuklu çubukla 30-60 saniye basınç uygulayın.
  8. Kafa derisini emilebilir cerrahi dikişle (6-0) dikin ve kesiği iyodofor ile yeniden dezenfekte edin.
  9. Yeniden ısıtmak için fareyi hassas kontrollü 37 °C'lik bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve sağlık durumunu izleyin.
  10. Sürekli düzeltme refleksi ve spontan hareket gösterdikten sonra fareyi temiz bir kafese geri koyun.
  11. Tümör taşımadan sonraki 10. günde nakledilen tümörü tespit etmek için fareyi in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi (IVIS Spektrumu) ile görüntüleyin.
  12. Fareye intraperitoneal olarak D-lusiferin potasyum tuzu (150 mg / kg) enjekte edin.
    NOT: D-Luciferin potasyum tuzunu steril D-PBS kullanarak seyreltin.
  13. 10 dakikalık bekleme süresi boyunca 1 L/dakO2'de% 2 izofluran kullanarak% 2 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin.
    NOT: İzofluran, anestezik buharlara maruz kalmayı en aza indirmek için havalandırmalı bir kimyasal başlıkta kullanılmalıdır. Bu, işlem sırasında hem hayvanların hem de araştırmacıların güvenliğini sağlamak içindir.
  14. Burun konisi yoluyla %1.5 izofluranda anesteziyi koruyun.
  15. IVIS Spektrumunu kullanarak biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirin.
  16. Farede serebellomeduller sarnıcı delerek BOS toplama işlemini gerçekleştirin.
    NOT: BOS, izofluran anestezi altında farelerde serebellomeduller sarnıç delinerek toplandı. Anestezi, cerrahi maruziyet ve numune toplama dahil tüm prosedürler, kontaminasyon ve enfeksiyon riskini en aza indirmek için SPF koşulları altında gerçekleştirildi. Fareler stereotaksik bir çerçeve üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirildi ve sarnıç magna, diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice ortaya çıkarıldı. Sarnıcı delmek ve BOS'u serbest el tekniği kullanarak toplamak için 27 G Hamilton şırınga iğnesi kullanıldı. Her fareden yaklaşık 5-10 μL berrak BOS elde edildi. Enfeksiyon riskini daha da azaltmak için, cerrahi bölge ponksiyondan önce Iodophor ile sterilize edildi ve tüm cerrahi aletler otoklavlandı. BOS toplamanın ardından, herhangi bir sıvı sızıntısını durdurmak için delinme bölgesi steril pamukla hafifçe sıkıştırıldı. Fareler daha sonra bir ısıtma pedine yerleştirildi ve anesteziden tamamen iyileşene kadar sürekli olarak izlendi. Rahatsızlığı hafifletmek için ameliyat sonrası analjezikler uygulandı. Nörolojik semptomların veya enfeksiyon belirtilerinin olmadığından emin olmak için hayvanlar en az üç gün boyunca günlük olarak gözlemlendi.
  17. BOS'taki tümör hücrelerini tespit etmek için akış sitometrisi yapın. GFP+ popülasyonu, tümör hücrelerini temsil eder.
    NOT: Murin glioma hücre dizisi GL261, lusiferazı (Luc) taşıyacak şekilde tasarlanmıştır. BOS'ta floresans değeri ~5 × 105p/sand tümör hücresi tespit edildiğinde işlem başarılı olur. Kullanılan görüntüleme yazılımı Living Image 4.5.2 idi ve görüntüleme parametreleri Luminescent olarak ayarlandı.
  18. CAR-T hücresinin terapötik etkinliğini değerlendirmek için başarılı tümör taşıyan fareleri seçin.

3. Dolaşımdaki gliomanın lateral ventriküle CAR-T hücre enjeksiyonu ile tedavisi

  1. Dolaşımdaki glioma model farelerdeki tümör boyutu ~6,5 × 105 p/s olduğunda, CAR-T tedavisi için bu fareleri seçin.
  2. Dolaşımdaki glioma model fareleri tartın ve fareleri 50 mg / kg pentobarbital sodyum ve 50 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
  3. 1.3−1.5 adımlarındaki işlemi tekrarlayın.
  4. Kafa derisini ve kafatasını ayırın ve dolaşımdaki glioma modelinin yapımı sırasında açılan delme deliğini tam olarak belirleyin ve 2.2-2.3 adımlarında belirtilen prosedürü izleyin.
  5. Bir mikro şırınga ile 10 μL CAR-T hücre süspansiyonunu aspire edin, iğneyi dikkatlice farenin lateral ventrikülüne sokun, stereotaktik aparatı kullanarak enjeksiyon derinliğini ayarlayın ve CAR-T hücre solüsyonunu yavaşça uygulayın.
    NOT: GL261 hücrelerinin enjeksiyonu ile tutarlı olarak, CAR-T hücreleri sağ lateral ventriküle enjekte edildi (koordinatlar: AP -1.1 mm, ML -1.5 mm bregma'dan), enjeksiyon derinliği 2.5 mm.Kontrol grubu CAR-T hücreleri yerine PBS ile tedavi edildi.
  6. İğneyi 10 dakika tutun, ardından iğneyi yavaşça çıkarın ve enjeksiyonu tamamladıktan sonra herhangi bir kanamayı önlemek için enjeksiyon noktasına steril gazlı bezle hafifçe bastırın. Kafa derisini emilebilir cerrahi dikişle (6-0) dikin ve kesiği dezenfekte edin.
  7. Yeniden ısıtmak için fareyi hassas kontrollü 37 °C'lik bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve sağlık durumunu izleyin.
  8. Sürekli düzeltme refleksi ve spontan hareket gösterdikten sonra fareyi temiz bir kafese geri koyun.
  9. Farelerde tümörlerin büyümesini izlemek için in vivo biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirin. Optik görüntüleme, CAR-T hücresinin terapötik etkinliğinin değerlendirilmesine olanak tanır.
  10. Fareleri gün aşırı tartın ve terminal son noktaya ulaşılana kadar tümör büyümesini daha doğru bir şekilde izlemek için her 5 günde bir BLI görüntülemesi yapın.
  11. Fareyi ötenazi yapın ve beyin dokusunu 24-48 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
  12. Dokuları parafine gömün ve 5 μm kalınlığında dilimler halinde bölün.
  13. Bölümleri deparafinize edin, dereceli alkollerle yeniden sulandırın, hematoksilin ile boyayın, eozin ile karşı boyama yapın ve bölümleri bir lamel ile monte edin.
    NOT: Bu çalışma için, terminal son nokta 30. gündü ve farelere intraperitoneal enjeksiyon ile aşırı dozda pentobarbital sodyum ile ötenazi yapıldı. Fare leşleri, imha edilmek üzere Nanjing Tıp Üniversitesi Tıbbi Deney Hayvanları Merkezi'ne teslim edildi. Atılan iğneler kesici alet kabına yerleştirildi ve merkezi imha için Nanjing Tıp Üniversitesi Laboratuvar ve Ekipman Yönetimi Departmanına teslim edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CAR-T tedavisi için dolaşımdaki glioma modelinin şematik diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. CAR-T hücreleri, terapötik etkilerini göstermek için bir mikro şırınga kullanılarak lateral ventriküle enjekte edildi. Bu yöntem, dolaşımdaki glioma hücrelerini hedef alarak CAR-T hücrelerinin beyne doğrudan iletilmesini sağlar. Enjeksiyon prosedürü, GL261 hücrelerinin fare lateral ventrikülüne implantasyonunu takiben 11. günde gerçekleştirildi. Çeşitli zaman nokta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada lateral ventrikül enjeksiyonu kullanılarak oluşturulan dolaşımdaki glioma modeli, mevcut modellere göre çeşitli avantajlar sunarak önemli bir ilerleme sağlamaktadır. Lateral ventrikül enjeksiyon tekniği yüksek oranda tekrarlanabilir ve nispeten kısa bir zaman diliminde tutarlı tümör modellemesi sağlar. Bu, onu BOS'a tümör hücresi yayılımını araştırmak ve CAR-T hücreleri gibi tedavilerin etkinliğini değerlendirmek isteyen araştırmacılar için değerli bir araç haline getirir. K...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82230059), Çin'in Jiangsu Eyaleti Anahtar Araştırma Geliştirme Programı (BE2022770) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Emilebilir cerrahi sütürŞangay Pudong Jinhuan Tıbbi Ürünler Co, LtdR611 Serisi
CAR-TYaratıcı Biyolaboratuvarlar
D-Luciferin potasyum tuzuMCEHY-12591B
GL261-Luc-GFP SerisiŞangay Zhong Qiao Xin Zhou Biyoteknoloji Co, Ltd.ZQ0932 Serisi
İn vivo biyolüminesans görüntüleme sistemiTanonTanon ABL X6
Laboratuvar hayvanı tıraş makinesiBeyotime BiyoteknolojiFS600 Serisi
FareNanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Çekirdeği Tesisi
Mikroenjeksiyon pompasıGeri sarR462 Serisi
Mikro şırıngaHamilton87943
Mini kafatası matkabıGeri sar78001
Pentobarbital sodyum Kimya Kaynağı57-33-0
Stereotaksik aparatGeri sar68043
KsilazinKimya Kaynağı7361-61-7

Kaynaklar

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CAR T H cre TedavisiSerebrospinal S v T m rGlioma MetastazLateral Ventrik l Enjeksiyonuntrakraniyal T m rT m r N ksDola mdaki T m r H crelerintrakraniyal Metastaz
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.