Yöntem makalesi

SASP Faktörlerinin Kanser Hücrelerinin Proliferasyonu Üzerindeki Etkisinin Üç Farklı Metodolojinin Karşılaştırmalı Analizi Kullanılarak Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/68883

⸱

19 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, gerçek zamanlı izleme ile üç in vitro model kullanarak, yaşlanan HeLa hücrelerinden yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) faktörlerinin yaşlanmayan HeLa hücreleri üzerindeki proliferatif etkilerini değerlendirmektedir. Kanserde hücre-hücre etkileşimlerini daha iyi anlamak için her yöntemin avantajları ve sınırlamaları sistematik olarak karşılaştırıldı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemoterapiye bağlı yaşlanan kanser hücreleri, hücre dışı mikro çevrelerini düzenlemek için yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi adı verilen çeşitli faktörler de salgılar. Önceki çalışmalar, bu SASP faktörlerinin, proliferasyonu, epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT), anjiyogenezi ve göçü teşvik etmek dahil olmak üzere çevredeki hücreler üzerinde zararlı parakrin etkiler gösterdiğini bildirmiştir. Aynı ve farklı hücre tiplerini bir arada kültürleyerek etkileşimden kaynaklanan hücresel süreçleri anlamak için çeşitli in vitro ko-kültür teknikleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yaşlanan HeLa hücreleri tarafından salgılanan SASP faktörlerinin yaşlanmayan HeLa hücreleri üzerindeki potansiyel proliferatif etkileri, üç tamamlayıcı in vitro yaklaşım kullanılarak araştırıldı. İlk yaklaşım, SASP'nin aracılık ettiği parakrin sinyalleşmeyi araştırmak için yaşlanan ve yaşlanmayan hücrelerin birlikte kültürlenmesini içeriyordu. İkinci yaklaşımda, yaşlanan kanser hücrelerinden toplanan şartlandırılmış medya konsantre edildi ve daha sonra proliferasyonun gerçek zamanlı izlenmesi ile şartlandırılmış medyanın etkisini incelemek için kullanıldı. Üçüncü yöntemde, doğrudan hücreden hücreye temas yoluyla SASP'nin yan yana etkilerini değerlendirmek için yaşlanan ve yaşlanmayan hücreler yan yana kültürlendi. Her üç deneysel model de tutarlı bir şekilde SASP faktörlerinin yaşlanmayan kanser hücrelerinin çoğalmasını önemli ölçüde arttırdığını göstermiştir. Özellikle, yaşlanan hücre ko-kültürü, proliferasyon oranını %64.6 oranında artırdı ve 3x konsantre SASP koşullu ortam, kontrollere kıyasla proliferasyonu %50'nin üzerinde artırdı. Floresan bazlı görüntüleme, jukstakrin koşullar altında GFP-pozitif hücre sayılarında %49.3'lük bir artış gösterdi. Bu yöntemler toplu olarak SASP'nin neden olduğu proliferatif değişikliklerin nicel ve nitel değerlendirmesini mümkün kıldı. Bu yaklaşımların karşılaştırmalı analizi, yaşlanan hücrelerin parakrin etkilerine ilişkin değerli bilgiler sağlayarak, bunların güçlü yönlerini ve sınırlamalarını vurgulamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli organizmalarda hücreler, mikro çevreleriyle mesaj alışverişinde bulunarak parakrin ve jukstakrin sinyalleşme yoluyla iletişim kurar ve böylece birbirlerinin davranışlarını etkiler. Bu iletişim, doğrudan nanotüplerin tünellenmesi ve boşluk bağlantıları yoluyla veya dolaylı olarak sitokinler, büyüme faktörleri ve kemokinler gibi çözünür kimyasal moleküllerin hücre dışı matrise salgılanması yoluyla gerçekleşebilir. Bu sinyal mekanizmaları, doku gelişimi ve bağışıklık hücresi tepkileri dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerin düzenlenmesinde önemli roller oynar ve ayrıca kanser, HIV, hipertansiyon ve Alzheimer gibi çok sayıda hastalığın patogenezinde rol oynar1.

1960'larda Leonard Hayflick, normal insan fibroblastlarının in vitro2'yi kopyalama konusunda sınırlı bir yeteneğe sahip olduğunu keşfetti. Telomeraz kısalmasına bağlı olarak gelişen bu sınırlı hücre çoğalması durumuna replikatif yaşlanma denir. Daha sonraki çalışmalar, çeşitli hücresel stres biçimlerinin de hücresel yaşlanmayı tetikleyebileceğini ortaya çıkardı. Kemoterapi ve radyoterapi gibi yaygın kanser tedavilerinin de hem kanser hem de stromal hücrelerde tedaviye bağlı yaşlanma olarak adlandırılan hücresel yaşlanmayı indüklediği belirlenmiştir 3,4. Hücresel yaşlanma ve yaşlanma hiyerarşik olarak ilişkili süreçlerdir; farklı biyolojik süreçleri temsil ederler. Organizmada yaşlanan hücrelerin birikmesi, iltihaplanmayı, doku fonksiyon bozukluğunu ve yaşa bağlı hastalıkların gelişimini teşvik ederek yaşlanmaya katkıda bulunur. Bununla birlikte, yaşlanma, yaşlanmaya kıyasla çok daha geniş bir sistemik olay ve mekanizma yelpazesini kapsar5.

Yaşlanan hücreler, genişlemiş sitoplazmalarının normal hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha büyük olması ve düzleştirilmiş bir morfolojiye sahip olması ile karakterize edilir6. Bu yaşlanan hücreler lizozomal aktiviteyi arttırmıştır ve asidik pH 6.0'da bile aktif kalan bir lizozomal enzim olan yaşlanmayla ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesi için pozitiftir. SA-β-gal boyama, yaşlanan hücreleri saptamak için en yaygın kullanılan biyobelirteçtir7. Çekirdeklerin genişlemesi ve düzensiz morfolojisi, yaşlanma geçiren hücrelerde yaygın olarak gözlenir. Ek olarak, bu hücreler, geri dönüşü olmayan hücre döngüsü durmasına aracılık eden yaşlanmayla ilişkili heterokromatik odaklar (SAHF) adı verilen benzersiz kromatin yeniden düzenlemeleri ile karakterize edilir 8,9.

Yaşlanan kanser hücreleri nihayetinde çoğalma yeteneklerini kaybetseler de, canlı ve metabolik olarak aktif kaldılar. Yaşlanan hücrelerin, yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) olarak adlandırılan hücre dışı tümör mikroçevresini düzenlemek için çeşitli faktörler salgıladıkları da bilinmektedir10,11. Bu SASP faktörleri, çözünür sinyal faktörlerini (interlökinler, kemokinler ve büyüme faktörleri), salgılanan proteazları ve salgılanan çözünmeyen proteinleri/hücre dışı matris (ECM) bileşenlerini içerir. Toplu olarak, bu faktörler, kanser hücresi proliferasyonunu, göçünü, istilasını ve epitelyal-mezenkimal geçişin (EMT) indüklenmesini teşvik etmek dahil olmak üzere zararlı parakrin etkiler gösterir 4,12. Ek olarak, kemoterapinin neden olduğu yan etkiler kısmen yaşlanan hücrelerin birikmesine bağlanmıştır13. Bu nedenle, yaşlanan ve yaşlanmayan hücreler arasındaki etkileşimin araştırılması, kanser tedavisi bağlamında önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Özellikle SASP faktörlerinin, özellikle bileşimlerinin ve kanser mikroçevresi üzerindeki etkilerinin analizi, kanser tedavisi için yeni hedef moleküllerin belirlenmesi ve bu moleküller için yeni ilaçların keşfedilmesi için umut verici bir strateji olarak kabul edilmektedir.

İn vitro ko-kültür teknikleri, hücreden hücreye etkileşimlerin anlaşılmasını incelemek için uzun süredir kullanılmaktadır14. Bu metodolojik makalede amaç, yaşlanan hücrelerden salgılanan faktörlerin yaşlanmayan kanser hücreleri üzerindeki olası proliferatif aktivitesinin üç farklı yöntem kullanılarak değerlendirilmesidir. Ayrıca, üç farklı yöntemden elde edilen sonuçlar karşılaştırılmış ve her yaklaşımın avantaj ve dezavantajları eleştirel olarak değerlendirilmiştir.

İlk olarak, gerçek zamanlı hücre analiz sistemi12 kullanılarak kanser hücresi proliferasyonundaki olası değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için yaşlanan HeLa ve yaşlanmayan HeLa hücreleri arasında bir ko-kültür modeli kuruldu. Bu sistem, hücre-hücre etkileşimlerini değerlendirmek için iki plakadan oluşur. Alt katmanı oluşturan e-plaka görünümü, plakanın alt kısmında konumlandırılan mikroelektrotlar ile hedef hücrelerin tohumlandığı bir yüzeye sahiptir. Hedef hücrelerin bu yüzeye yapışması ile oluşan elektrik direnci, ölçülebilir parametre Hücre İndeksi (CI) ile ifade edilir. CI değeri, hücre sayısı ve yüzeye yapışma derecesi ile orantılıdır15. Ek olarak, e-plaka görünümü, hücrelerin bir faz kontrast mikroskobu altında morfolojik olarak incelenmesine izin verir. Üst tabakayı oluşturan e-plaka eki, efektör hücrelerin tohumlandığı alandır. Bu plakanın tabanı 0,4 μm gözenek boyutunda yarı geçirgen bir zar ile kaplıdır. Efektör hücrelerden salgılanan faktörler membrandan geçerek e-plaka görünümünde hedef hücreleri etkileyebilir. Bu etkileşim hücre çoğalmasını uyarırsa, bu CI değerinde bir artış olarak gözlenir. Böylece hücreler arasındaki etkileşimler nicel olarak değerlendirilebilir.

İkinci yöntemde, yaşlanan HeLa hücrelerinden toplanan şartlandırılmış ortam konsantre edildi ve yaşlanmayan HeLa hücrelerine eklendi. Bu hücreler üzerindeki potansiyel proliferatif etki, gerçek zamanlı hücre analiz sistemi kullanılarak izlendi.

Üçüncü yöntemde, yaşlanan HeLa hücreleri ile yaşlanmayan GFP-HeLa hücrelerinin doğrudan 2 boyutlu olarak birlikte kültürlenmesi ve kanser hücrelerindeki olası proliferatif değişikliklerin mikroskop altında gerçek zamanlı olarak izlenmesi planlandı.

Bu deneyin amacı, yaşlanan HeLa ve yaşlanmayan HeLa hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek ve kanser hücresi proliferasyonundaki olası değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için üç model oluşturmaktır. Böylece yaşlanan kanser hücrelerinin salgıladığı SASP faktörlerinin diğer kanser hücreleri üzerindeki etkisi kolaylıkla araştırılabilmektedir. Buna göre, üç yaklaşımın avantajları ve sınırlamaları sistematik olarak değerlendirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm hücre kültürü prosedürleri, sertifikalı bir güvenlik kabini içinde biyogüvenlik seviyesi II+ (BSL2+) koşulları altında gerçekleştirilmiştir. Doksorubisin tehlikeli bir kemoterapötik ajandır. Tüm prosedürler, laboratuvar önlükleri ve eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılarak sertifikalı bir biyogüvenlik seviyesi II+ (BSL2+) kabininde gerçekleştirilmelidir. Ortam ve fiksatifler de dahil olmak üzere doksorubisin içeren tüm atıklar, belirlenmiş ve açıkça etiketlenmiş tehlikeli atık kaplarında toplanmalı ve kurumsal tehlikeli atık yönetim sistemi aracılığıyla bertaraf edilmelidir.

1. Model 1: Gerçek zamanlı hücre analiz sistemini kullanarak birlikte kültürleme

  1. Hücrelerin kültürlenmesi ve yaşlanmanın indüksiyonu (1-2.
    1. 8 x 105 HeLa hücresini, %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içeren bir T25 kültür şişesine tohumlayın ve hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 ile inkübe edin.
    2. Ertesi gün, hücrelerin ortamını 5 mL taze tam ortam ile değiştirin. Hücresel yaşlanmayı indüklemek için ortama ekleyerek hücreleri doğrudan 300 nM doksorubisin ile tedavi edin. T25 şişesini %5CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de 72 saat tutun.
  2. Yaşlanmayan hücre tohumlaması (4.
    1. %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL DMEM'de yeni bir T25 şişesinde 8 x 105 işlenmemiş HeLa hücresi (yaşlanmayan kontrol) tohumlayın ve %5 CO2 ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
  3. Yaşlanmanın indüksiyonunun doğrulanması (5.
    1. 72 saatlik doksorubisin tedavisinin yaşlanmaya neden olup olmadığını belirlemek için SA-β-gal boyamayapın 6. Bu tahlili, ana deneylerde kullanılmayan ayrı bir hücre kümesi üzerinde gerçekleştirin. Elde edilen sonuçlar için Şekil 1A,B'ye bakınız.
    2. Salgı aktivitelerini değerlendirmek için yaşlanan kanser HeLa hücrelerinin şartlandırılmış ortamında IL-6'yı ölçün. Hücreleri 72 saat boyunca doksorubisin ile tedavi edin, ardından 2 gün daha serumsuz ve fenol kırmızısı içermeyen ortamda inkübasyon yapın. Toplanan koşullandırılmış ortamı hücre numarasına normalleştirin ve IL-6 seviyelerini ölçün.
      NOT: IL-6, SASP12'nin ayırt edici bir sitokindir. IL-6 ölçümünün sonuçları Şekil 1C'de sunulmuştur.
  4. Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi kurulumu (5.
    1. Hücre tohumlamadan önce gerçek zamanlı hücre analiz sistemini açın. RTCA yazılımı 2.0'ı başlatın. Exp Notes düğmesine (Şekil 2) tıklayın ve deneysel ayrıntıları girin.
    2. Planla düğmesini tıklayın ve iki adım ekleyin. İlk adım arka plan içindir. İkinci adım, 72 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre proliferasyonunu izlemektir.
    3. Seç İlk Adım ve tıklayın OYNA e-plaka görünümünün her bir kuyucuğuna 50 μL tam ortam ekleyerek arka plan empedansını kaydetmek için.
  5. Hücreleri e-plaka görünümüne ekme (5.
    1. Hücreleri tohumlamadan önce hem doksorubisin ile tedavi edilmiş (yaşlanan) hem de tedavi edilmemiş (yaşlanmayan) HeLa hücrelerini 10x büyütme kullanarak bir faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin. Mikroskop altında, yaşlanan hücreler normal hücrelerden çok daha genişlemiş bir morfolojiye sahiptir.
    2. Hem yaşlanan hem de yaşlanmayan HeLa hücrelerini 5 mL steril önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın, ardından aspire edin.
    3. 1 mL önceden ısıtılmış %0.05 tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için şişeleri 2 dakika boyunca 37 °C'de tutun. Tripsini, %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL tam DMEM ile nötralize edin.
    4. Hücreleri oda sıcaklığında 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletlerini% 10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ile desteklenmiş 5 mL tam DMEM içinde yeniden süspanse edin.
    5. Bir hemositometre kullanarak tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
    6. Yaşlanmayan HeLa hücrelerini, %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş tam 100 μL DMEM'de bir e-plaka görünümünün her bir kuyucuğunda 5 x 103 hücre/ kuyu yoğunluğunda tohumlayın.
    7. Hücrelerin inkübatördeki plaka yüzeyine bağlanmasını sağlamak için e-plaka görünümünü gerçek zamanlı hücre analiz sisteminin beşiğine yerleştirin.
    8. Program düğmesinde İkinci Adımı seçin ve 2.0 saat boyunca RTCA yazılımı 72'ı kullanarak empedans ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın (Şekil 2).
  6. Hücrelerin e-plaka ekine ekilmesi
    1. Bir e-plakasındaki tohum hücreleri, %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 60 μL tam DMEM'de kuyucuklar açar.
    2. Üç farklı deney düzeneği altında e-plaka ekine tohum hücreleri: Grup 1 (Negatif Kontrol): Tohumlanmış hücre yok (yalnızca ortam)
      Grup 2: 2 × 104 yaşlanmayan HeLa hücresi
      Grup 3: 1 × 105 yaşlanan HeLa hücresi
    3. E-plaka ekini, bağlantı için 6 saat boyunca %5CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de tutun.
  7. Birlikte kültürlenen hücreler
    1. 6 saatlik hücre tohumlamadan sonra duraklat'a tıklayın. Serumu ve yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kültür ortamını e-plaka görünümünün her bir kuyucuğundan nazikçe aspire edin.
    2. Kuyucukları 37 °C'de önceden ısıtılmış PBS ile 2 kez yıkayın.E-plaka görünümünün her bir kuyucuğuna 140 μL serumsuz DMEM ekleyin.
    3. E-plaka ekini alın ve kültür ortamını aspire edin. Kuyucukları 37 °C'de 2x PBS ile nazikçe yıkayın ve 60 μL serumsuz DMEM ekleyin.
    4. E-plaka ek parçasını e-plaka görünümüne yerleştirin ve ek parça kuyuya tam olarak oturana kadar hafifçe aşağı doğru bastırın.
    5. Birleştirilmiş plakayı gerçek zamanlı hücre analiz sistemine yerleştirin ve yazılımı kullanarak hücre indeksi değerlerinin 15 dakikalık aralıklarla gerçek zamanlı izlenmesine devam etmek için Oynat'a tıklayın (Şekil 2).
    6. Deney süresi bittiğinde gerçek zamanlı hücre analiz sistemini kapatın (Şekil 3A).
  8. E-plaka ekindeki görüntüleme hücreleri
    NOT: E-plaka ekleme kuyusunda bir zar bulunduğundan, buraya ekilen hücreler faz kontrast mikroskobu kullanılarak zar üzerinde görselleştirilemez. Bu nedenle, hücrelerin deney sonuna kadar canlılığını koruyup korumadığını ve yaşlanan hücrelerin yapısal bütünlüklerini koruyup korumadıklarını test etmek için DAPI ile boyandılar (Şekil 3B).
    1. E-plaka ekini e-plaka görünümünden çıkarın. E-plaka ekindeki hücreleri DAPI ile boyayın ve floresan mikroskop16 altında hücrelerin varlığını kontrol edin. Yaşlanan hücrelerin çekirdeklerinin normal hücrelerden daha büyük olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, DAPI ile boyanan hücrelerin nükleer boyutlarına dayanarak, hangi kuyucuğun yaşlanmayan ve hangisinin yaşlanan hücrelerle tohumlandığını belirleyin.
  9. E-plaka görünümünde hücrelerin görüntülenmesi
    1. 10x büyütme kullanarak faz kontrast mikroskobu altında e-plaka görünümünü doğrudan inceleyin (Şekil 3B). E-plaka görünümünde her bir kuyucuğun merkezinden dört sıra mikroelektrot sensörü çıkarıldığından, mikroskopi ile hücre izlemeyi sağlamak için boşluk 6 oluşturuldu.
  10. Veri analizi
    1. E-plaka görünümü ve e-plaka ekinin birleştirildiği ve gerçek zamanlı hücre analiz sistemine eklendiği zaman noktasında CI değerlerini normalleştirin.
    2. Gerçek zamanlı hücre analiz sisteminden elde edilen maksimum hücre indeksi ve eğim verilerini kullanarak çoğalma hızını ve miktarını hesaplamak için Veri Analizi düğmesine tıklayın (Şekil 2). Ardından, uygun bir istatistiksel program kullanarak verileri analiz edin (Şekil 3C,D).

2. Model 2: Gerçek zamanlı hücre analiz sistemini kullanarak şartlandırılmış ortam işleme testi

  1. Hücrelerin kültürlenmesi ve yaşlanmanın indüksiyonu (1-2.
    1. % 10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ile desteklenmiş 2.5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içeren 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 35 x 104 HeLa hücresi tohumlayın ve hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Ertesi gün, hücre ortamını 2,5 mL taze tam ortam ile değiştirin. Hücresel yaşlanmayı indüklemek için hücrelere doğrudan ortama ekleyerek 300 nM doksorubisin uygulayın. 6 oyuklu plakayı %5CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de 72 saat tutun.
  2. Yaşlanmayan hücre tohumlaması (4.
    1. % 10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ile desteklenmiş 2.5 mL DMEM içinde yeni bir 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 35 x 104 işlenmemiş HeLa hücresi (yaşlanmayan kontrol) tohumlayın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
  3. Adım 1.3'te açıklandığı gibi yaşlanma indüksiyonunun onayını gerçekleştirin.
  4. Yaşlanan ve yaşlanmayan HeLa hücrelerinden şartlandırılmış besiyerinin hazırlanması
    1. Hem doksorubisin ile tedavi edilmiş hücreleri (yaşlanan hücreler) hem de tedavi edilmemiş HeLa hücrelerini (yaşlanmayan hücreler) faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin. Mikroskop altında, yaşlanan hücreler normal hücrelerden çok daha genişlemiş bir morfolojiye sahiptir.
    2. Kültür ortamını her iki 6 kuyucuklu plakadan (yaşlanan ve yaşlanmayan HeLa hücreleri) aspire edin. Artık serum ve hücre kalıntılarını gidermek için hücreleri 2 kez önceden ısıtılmış PBS ile 37 °C'de yıkayın.
    3. Her kuyucuğa penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0,1 μg/mL) ile desteklenmiş 2 mL serumsuz DMEM ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de %5CO2 ile 48 saat inkübe edin.
  5. Koşullandırılmış medyanın toplanması ve konsantre edilmesi (7.
    1. Her kuyucuktan şartlandırılmış ortamı laminer bir güvenlik kabininde steril tüplere toplayın.
    2. Koşulları hücre sayılarına normalleştirmek için bir hemositometre kullanarak tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak hücreleri tripsinize edin ve hücreleri sayın.
    3. Hücre numarasına göre normalize edilmiş şartlandırılmış ortamı, steril 2 mL'lik tüplerde penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ile desteklenmiş serumsuz DMEM ile 2 mL'lik bir son hacme ayarlayın.
    4. Hücre kalıntılarını gidermek için toplanan şartlandırılmış ortamı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin, ardından berraklaştırılmış süpernatanı elde etmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
    5. Konsantre etmek için şartlandırılmış ortamı 2 mL ultra santrifüj filtre üniteleri kullanarak 4 °C'de 60 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Bu prosedür, 2 mL'lik şartlandırılmış ortamı, konsantre 400 μL'lik şartlandırılmış ortamın 5 katına konsantre eder.
    6. Laminer bir güvenlik kabininde steril tüplerde 1x, 2x ve 3x konsantre şartlandırılmış ortam hazırlamak için elde edilen 40 μL şartlandırılmış ortamı taze serumsuz ortamla seyreltin.
      NOT: Hücrelerde 48 saat kalan ortam hücresel tüketim nedeniyle tükendiğinden, toplanan ve konsantre edilmiş ortam daha sonra yeni ortam ile seyreltilir.
  6. Hücreleri e-plaka görünümüne ekme
    1. Gerçek zamanlı hücre analiz sistemini adım 1.1-1.4'te açıklandığı gibi kurun.Yaşlanmayan HeLa hücrelerini önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın, ardından aspire edin.
    2. 1 mL önceden ısıtılmış %0.05 tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için şişeleri 2 dakika boyunca 37 °C'de tutun. Tripsini, %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL tam DMEM ile nötralize edin.
    3. Hücreleri oda sıcaklığında 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletlerini% 10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ile desteklenmiş 5 mL tam DMEM içinde yeniden süspanse edin.
    4. Bir hemositometre kullanarak tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
    5. Yaşlanmayan HeLa hücrelerini, %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 200 μL tam DMEM'de bir e-plaka görünümünün her bir kuyucuğunda 5 x 103 hücre/ kuyu yoğunluğunda tohumlayın.
    6. Hücrelerin inkübatördeki plaka yüzeyine bağlanmasını sağlamak için e-plaka görünümünü gerçek zamanlı hücre analiz sisteminin beşiğine yerleştirin.
    7. Program düğmesinde ikinci adımı seçin ve RTCA yazılımı 2.0'ı kullanarak empedans ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın (Şekil 2). Yaşlanmayan HeLa hücrelerinin kaplanmasından 6 saat sonra yazılımdaki Duraklat düğmesine tıklayın (Şekil 2).
    8. Serumu ve yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kültür ortamını e-plaka görünümünün her bir kuyucuğundan nazikçe aspire edin. Kuyucukları önceden ısıtılmış PBS ile 37 °C'de 2 kez yıkayın.
    9. 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış şartlandırılmış ortamı uygun gruplara ekleyin:
      Grup 1: Taze medya
      Grup 2: 1x yaşlanmayan HeLa hücresi şartlandırılmış besiyeri
      Grup 3: 2x yaşlanmayan HeLa hücre şartlandırılmış besiyeri
      Grup 4: 3x yaşlanmayan HeLa hücresi şartlandırılmış besiyeri
      Grup 5: 1x yaşlanan HeLa hücresi şartlandırılmış ortam
      Grup 6: 2x yaşlanan HeLa hücresi şartlandırılmış ortam
      Grup 7: 3x yaşlanan HeLa hücresi şartlandırılmış ortam
    10. E-plaka görünümünü gerçek zamanlı hücre analiz sistemine yerleştirin ve 15 saat boyunca 48 dakikalık aralıklarla hücre indeksi değerlerinin gerçek zamanlı izlenmesine devam etmek için Oynat'a tıklayın (Şekil 2).
    11. Deney süresi bittiğinde gerçek zamanlı hücre analiz sistemini kapatın (Şekil 4A).
  7. E-plaka görünümünde hücrelerin görüntülenmesi
    1. E-plaka görünümünü faz kontrast mikroskobu altında 10x büyütmede doğrudan inceleyin (Şekil 4B). E-plaka görünümünde her bir kuyucuğun merkezinden dört sıra mikroelektrot sensörü çıkarıldığından, mikrozopi ile hücre izlemeyi sağlamak için alan yaratıldı.
  8. Veri analizi
    1. Konsantre şartlandırılmış ortamın yaşlanmayan HeLa hücrelerine uygulandığı zaman noktasında CI değerlerini normalleştirin.
    2. Gerçek zamanlı hücre analiz sisteminden elde edilen maksimum hücre indeksi ve eğim verilerini kullanarak proliferasyon hızını ve miktarını hesaplamak için Veri analizi düğmesine tıklayın (Şekil 2). Ardından, uygun bir istatistiksel program kullanarak verileri analiz edin (Şekil 4C,D).

3. Model 3: Hücre-hücre etkileşiminin gerçek zamanlı izlenmesi

  1. Hücrelerin kültürlenmesi ve yaşlanmanın indüksiyonu (1-2.
    1. 8 x 105 HeLa hücresini, %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içeren bir T25 kültür şişesine tohumlayın ve hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 ile inkübe edin.
    2. Ertesi gün, hücrelerin ortamını 5 mL taze tam ortam ile değiştirin. Hücresel yaşlanmayı indüklemek için ortama ekleyerek hücreleri doğrudan 300 nM doksorubisin ile tedavi edin. T25 şişesini %5CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de 72 saat tutun.
  2. Yaşlanmayan hücre tohumlaması (4.
    1. %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL DMEM'de yeni bir T25 şişesinde 8 x 105 GFP-HeLa hücresi (yaşlanmayan kontrol) tohumlayın ve %5 CO2 ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
    2. %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL DMEM içinde yeni bir T25 şişesinde 8 x 105 HeLa hücresi (yaşlanmayan kontrol) tohumlayın ve %5 CO2 ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
  3. Adım 1.3'te (5. gün) açıklandığı gibi yaşlanma indüksiyonunun onayını gerçekleştirin.
  4. Birlikte kültürlenen hücreler
    1. Hücreleri tohumlamadan önce doksorubisin ile tedavi edilmiş hücreleri, işlenmemiş GFP-HeLa'yı ve işlenmemiş HeLa hücrelerini faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin. Mikroskop altında, yaşlanan hücreler normal hücrelerden çok daha genişlemiş bir morfolojiye sahiptir.
    2. Üç T25 şişesini de 5 mL steril önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın, ardından aspire edin. 1 mL önceden ısıtılmış %0.05 tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için şişeleri 2 dakika boyunca 37 °C'de tutun.
    3. Tripsini, %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 5 mL tam DMEM ile nötralize edin.
    4. Hücreleri oda sıcaklığında 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletlerini% 10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ile desteklenmiş 5 mL tam DMEM içinde yeniden süspanse edin.
    5. Bir hemositometre kullanarak tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın. %10 fetal sığır serumu, penisilin (100 U/ml) ve streptomisin (0.1 μg/mL) ile desteklenmiş 200 μL tam DMEM'deki tohum hücreleri.
    6. Tohum hücreleri, üç farklı deney düzeneği altında μ slaytlı 8 kuyu yüksekliğine yerleştirin:
      Grup 1: 7 x 103 GFP-HeLa hücresi
      Grup 2: 18 x 103 yaşlanmayan HeLa hücresi + 7 x 103 GFP-HeLa hücresi
      Grup 3: 18 x 103 yaşlanan HeLa hücresi + 7 x 103 GFP-HeLa hücresi
    7. %5CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de tutturmak için μ-slaytı 8 saat tutun. 8 saat sonra, serumun hücreler üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak için hücreleri önceden ısıtılmış PBS (37 °C) ile 2 kez yıkayın.
    8. Her kuyucuğa penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (0,1 μg/mL) içeren 200 μL serumsuz DMEM ekleyin.
  5. Mikroskop kurulumu
    1. Sıcaklık kontrol cihazını ve CO 2-Controller'ı açın ve s'nin tage üstü inkübasyon sisteminin 30 dakika stabilize olmasına izin verin.
    2. CO2 konsantrasyonunu ve sıcaklık ayarlarını manuel olarak kontrol edin ve fizyolojik koşullara (%5CO2, 37 °C) ulaşıldığından emin olun.
    3. Ters çevrilmiş floresan mikroskobunu açın ve sistemin kendi kendine kalibrasyonu tamamlamasına izin verin. Floresan ışık kaynağını açın. Görüntüleme parametrelerini ve görüntü alımını kontrol etmek için görüntüleme ve analiz yazılımını başlatın.
  6. Hızlandırılmış görüntüleme
    1. Slaytı, yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera ile ters çevrilmiş floresan mikroskobunun sahne üstü inkübasyon odasına yerleştirin. Yazılımı açın ve Bölüm X, Y, Z ve T Modlarını seçin ve edinim ayarlarında deneyleri hazırlayın (Şekil 5A).
    2. Floresan ve faz kontrast görüntüleme için yüksek kontrastlı bir 20x objektif seçin (Şekil 5A). Her iki modda da görüntülemeyi etkinleştirmek için faz kontrastı ve floresan (FITC filtresi) kanallarını ekleyin (Şekil 5A).
    3. Canlı hücre görüntülemeyi başlatmak için Canlı düğmesine tıklayın, ardından hücreleri faz kontrastı altında odağa getirin (Şekil 5A). Z-yığını penceresini açın ve ilgilenilen hücrelerin konumunu işaretleyin (hem yaşlanan/yaşlanmayan HeLa hücrelerini hem de GFP HeLa hücrelerini içerir). Otomatik sahne denetleyicisini kullanarak kuyular arasında sahnede gezinin ve konum işaretlemesi için seçilen alanların tam olarak konumlandırılmasını sağlayın (Şekil 5A).
      NOT: Bu sayede bir slaytın aynı kuyucuğunda birden fazla alan seçilebilir.
    4. Floresan görüntülemeye başlamak için kanalı floresan kanalına geçirin. Uygun pozlama (89.506 ms), kazanç (10) ve yoğunluk (136) ayarlarını yapın (Şekil 5A).
      NOT: Bu parametreler, floresan proteini eksprese eden hücrelerin floresan yoğunluğuna bağlı olarak değişir.
    5. Bir μm z-yığını aralığı seçin, üst ve alt konumları ayarlayın ve faz kontrastı altında z-yığınını yapılandırın (Şekil 5A). Canlı seçeneğini kapatmak için Durdur'a tıklayın.
    6. Hızlandırılmış görüntüleme için Süre ve Zaman Aralığı alanlarını kullanarak süreyi (48 saat) ve zaman aralığını (30 dakika) ayarlayın.
    7. 48 saat boyunca görüntülemeye başlamak için Başlat'a tıklayın (Şekil 5A). 48 saat sonra projeyi kaydedin (Şekil 5A).
    8. Her zaman noktasında (0 saat ve 48 saat), z yığınından en iyi kareyi seçin ve görüntüyü dışa aktarın (Şekil 5A).
    9. GFP-pozitif hücreleri 0 saat ve 48 saatte sayın, GFP-pozitif hücrelerdeki artış yüzdesini hesaplayın ve uygun bir yazılım programı kullanarak verileri analiz edin (Şekil 1D,E).
  7. Film oluşturma
    1. Yakalanan tüm görüntüleri zaman noktalarına ve z yığını katmanlarına göre düzenlenmiş olarak görüntülemek için Galeriyi Göster'i tıklatın (Şekil 5B) .
    2. Her zaman noktası için, ilgili z-yığınından En İyi Odaklanmış Görüntü'ye sağ tıklayın ve Satırdaki Başparmakları Seç'i seçin. Seçili kareleri kaydedin (Şekil 5B).
    3. Bu işlemi her pozisyon için ayrı ayrı tekrarlayın. En çok odaklanan görüntülerin seçilmesine yardımcı olması için En İyi Odaklanmış Kareleri Bul işlevini kullanın. Seçilen görüntüleri Seçilen Kareleri Kaydet seçeneğiyle kaydedin. Kaydedilen görüntüler otomatik olarak Proje Aç bölümüne yüklenir.
    4. Filme sağ tıklayın ve görüntü dizileri tamamen yüklendikten sonra Görüntüyü Dışa Aktar'ı seçin.
    5. Dışa aktarma penceresindeki Film sekmesine gidin, istediğiniz kare hızını (saniyedeki kare sayısı) ayarlayın, gerekirse ölçek çubuğu, zaman damgası vb. gibi ek seçenekleri belirleyin ve Gözat seçeneğini kullanarak bir hedef seçerek dışa aktarmayı sonlandırın (Şekil 5B, Video 1, Video 2 ve Video 3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu temsili deney seti, yaşlanan kanser hücrelerinden türetilen yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipinin diğer kanser hücreleri üzerindeki potansiyel etkilerini araştırdı. Bu nedenle, ilk olarak 72 saat boyunca doksorubisin tedavisinin SA-β-Gal boyama kullanılarak HeLa hücrelerinde yaşlanmayı indükleyip tetikleyemeyeceği doğrulandı. Yaşlanan hücrelerde, lizozomal enzim β-galaktosidaz, düşük pH'ta bile aktif kalır ve kromojenik substrat X-gal'i parçalayarak mavi bir çökelti17 oluşturur. Bu nedenle, ma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser hücrelerinin mikro çevrelerindeki dinamik etkileşimleri, metastazın indüklenmesini ve ikincil bir tümörün gelişimini etkileyen tümör ilerlemesi için çok önemlidir. Ayrıca yaşlanan kanser ve stromal hücrelerin, yaşlanan hücrelerden salgılanan faktörler aracılığıyla tümör mikroçevrelerini düzenlediği bildirilmektedir4. Bu faktörler hücre proliferasyonunu, göçünü, istilasını, farklılaşmasını uyarır ve çoklu ilaç direncini arttırır ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Gazi Üniversitesi Bilimsel Proje Birimi (Hibe kodu: TOA-2021-7321) ve TÜBİTAK (Hibe kodu: 122S564 ve 223S969) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
µ-Slide 8 Kuyu yüksekfigure-materials-1bidi80806
0,05 % Tripsin-EDTA (1X)Gibco25300-054
Amicon Ultra santrifüj filtre üniteleri (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
CO2 kuluçka makinesi (37 derece ve derece; C, %5 CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoxorubicinTocris2252
E-plaka INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plaka VIEW 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
HeLa Hücrelerifigure-materials-2AP Enstitüsü, Ankara, TürkiyeHÜ KÜ K No: 90061901 
Leica DMi8 ters floresan mikroskobu Leica
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)Gibco70011-044
Yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidase (SA-β-gal) boyama kit Hücre Sinyalizasyonu9860'LAR
Aşama üstü kuluçka sistemiPecon 
Temp-controller 2002-2 Pecon 
Trypan Mavi BoyasıSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kanser H cre ProliferasyonuSenesent H crelerParakrin SinyalizasyonJukstakrin EtkilerKondisyonlu MedyaKo K lt r TeknikleriGer ek Zamanl H cre AnaliziCanl H cre G r nt lemeHeLa H creleri

İlgili makaleler