Bu çalışma, izole edilmiş sıçan makrofajları tarafından ksenojenik (insan) ve allojenik (sıçan) kırmızı kan hücrelerinin fagositoz oranlarını ölçmek ve karşılaştırmak için standartlaştırılmış bir in vitro protokolü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Allojenik ve Ksenojenik Eritrositlerin Sıçan Makrofajları ile Fagositozunun İn Vitro Kantitatif Bir Değerlendirmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Ksenojenik hücre nakli, immün yetmezliği olan hayvan modellerinde bile sıklıkla önemli immün reddi ile karşı karşıyadır. Kalıntı bağışıklık bileşenleri arasında, makrofajlar nakledilen insan hücrelerini aktif olarak fagositoz edebilir ve bu da uzun süreli aşılama için bir zorluk oluşturur. Bunu ele almak için, insan ve sıçan kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozunu ölçmek için standartlaştırılmış bir in vitro test geliştirdik. Sıçan peritoneal makrofajları izole edildi, kültürlendi ve insan veya sıçan RBC'lerine maruz bırakıldı. İnsan RBC'leri CD235a kullanılarak tanımlanırken, sıçan RBC'leri DeepRed ile önceden etiketlendi. Canlı hücreleri geçit etmek için makrofajları ve propidyum iyot (PI) dışlanmasını belirlemek için CD163 kullanılarak akış sitometrisi analizi yapıldı. Sonuçlar fagositik aktivitede önemli bir fark gösterdi: makrofajların %5.08'i insan RBC'lerini yutarken, sadece %1.59'u sıçan RBC'lerini fagosite etti ve 3.21'lik bir nispi fagositoz indeksi verdi. Bu protokol, immün uyumluluğun kantitatif değerlendirmesine izin verir ve ksenotransplantasyonda doğuştan gelen immün yanıtları değerlendirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunar. Translasyonel araştırmalarda donör-alıcı seçimini iyileştirme ve immünosüpresif stratejilere rehberlik etme potansiyeline sahiptir.
Giriş
Ksenojenik hücre transplantasyonunun kullanımı, özellikle insan hücrelerinin hayvan modellerine aşılanması, biyomedikal araştırmalarda önemli bir stratejidir1. Kontrollü bir in vivo ortamda hücre sağkalımı, aşılama ve bağışıklık tepkilerinin değerlendirilmesine izin verir. Fare modelleri, iyi karakterize edilmiş genetikleri ve manipülasyon kolaylıkları nedeniyle tarihsel olarak bu alana hakim olsa da, küçük boyutları, büyük kan hacimleri veya yüksek hücre verimi gerektiren çalışmalarda önemli bir sınırlama getirmektedir. Buna karşılık, sıçanlar, daha fazla vücut kütlesi, insan sistemlerine daha iyi fizyolojik ilgi ve kan veya peritoneal makrofajlar gibi daha yüksek biyolojik örnek verimi dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar2. Sonuç olarak, sıçan modelleri hematopoetik ve bağışıklık sistemi araştırmalarını içeren çalışmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır3.
Ksenojenik transplantasyondaki en büyük zorluklardan biri immün rejeksiyondur. T hücreleri, B hücreleri veya NK hücrelerinin genetik olarak ablasyon yaptığı immün yetmezlik modellerinde bile, kalıntı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, özellikle makrofajlar fonksiyonel olarak aktif kalır4. Makrofajlar, konakçı bağışıklık sisteminin birinci basamak savunucuları olarak görev yapar ve fagositoz yoluyla yabancı hücreleri tanır ve ortadan kaldırır5. Bu süreç kısmen, makrofajlar üzerindeki sinyal düzenleyici protein alfa (SIRPα) ile çoğu hücre tipinde ifade edilen bir "beni yeme" sinyali olan CD47 arasındaki etkileşim tarafından düzenlenir. İnsan hücrelerinden gelen CD47, kemirgen SIRPα tarafından tanınmadığında, bu uyumsuzluk fagositozun artmasına neden olabilir. Bu izin verilen immün yetmezliği olan hayvanlarda bile, bu fenomen de mevcuttur 6,7.
Bu bağlamda makrofaj aracılı fagositozun ölçülmesi, hücre sağkalım olasılığını değerlendirmek ve transplantasyon stratejilerini optimize etmek için kritik öneme sahiptir8. İmmün rejeksiyonu değerlendirmek için çeşitli in vivo ve ex vivo yöntemler geliştirilmiş olsa da, makrofaj fagositozu için standardize edilmiş in vitro testler sınırlı kalmaktadır. Geleneksel mikroskopi tabanlı yöntemler genellikle emek yoğundur ve nicel titizlikten yoksundur. Akış sitometrisi, aksine, hücre tiplerini doğru bir şekilde ayırt edebilen ve yüzey işaretleyici tespiti yoluyla fagositik alımı ölçebilen tek hücre tabanlı bir test ve kantitatif bir platform sunar.
Bu makalede, sıçan peritoneal makrofajları ile insan ve sıçan eritrositlerinin diferansiyel fagositozunu değerlendirmek için standardize edilmiş bir in vitro test geliştirildi. RBC'ler, makrofaj aracılı klerensi inhibe etmek için "kendi" bir sinyal görevi gören CD47'nin basit yapıları ve ekspresyonu nedeniyle fagositoz testleri için ideal bir model görevi görür9. Bu protokolde, sıçan peritoneal makrofajları peritoneal lavaj yoluyla hasat edilir, in vitro kültürlenir ve DeepRed ile etiketlenmiş insan RBC'lerine veya allojenik sıçan RBC'lerine maruz bırakılır. Ko-inkübasyondan sonra, RBC'lerin makrofajlar tarafından içselleştirilmesini değerlendirmek için akış sitometrisi kullanılır. Makrofajlar CD163 ekspresyonu ile, insan RBC'leri CD235a ile ve sıçan RBC'leri DeepRed floresan ile tanımlanır. Ölü hücreler PI boyama yoluyla dışlanır ve sadece canlı makrofajların analiz edilmesini sağlar.
Bu yaklaşım, allojenik ve ksenojenik RBC'lerin fagositik aktivitesinin in vitro olarak doğru, kantitatif bir şekilde değerlendirilmesini sağlar ve makrofaj aracılı immün klerensin kapsamı hakkında fikir verir. Deneylerimizde, sıçan makrofajları, sıçan eritrositlerine (%1,59) kıyasla insan eritrositlerinin (%5,08) fagositozunu anlamlı derecede yüksek gösterdi ve nispi fagositoz indeksi 3,21 olarak ortaya çıktı. Bu sonuçlar, ksenojenik ortamlarda doğuştan gelen bağışıklık mekanizmalarının önemini vurgulamakta ve bu testin klinik öncesi model validasyonundaki değerini vurgulamaktadır.
Sonuç olarak, burada sunulan protokol, in vitro makrofaj fagositozunu ölçmek için tekrarlanabilir ve verimli bir yöntem sunmaktadır. Özellikle ksenotransplantasyon, hematopoietik kök hücre araştırmaları ve immünolojik uyumluluk testi alanlarında çalışan araştırmacılar için yararlıdır. Fagositoz ölçümü için standartlaştırılmış bir çerçeve sağlayarak, bu tahlil, türler arası transplantasyon modellerinde deneysel tekrarlanabilirliğin iyileştirilmesine ve doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları içeren tüm deneyler, Jiangsu Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (UJS-IACUC) tarafından onaylanan etik politika ve prosedürlere göre yapılmıştır (Onay no. UJS-IACUC-2021090102). Bu çalışma, Jiangsu Üniversitesi Bağlı Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm örnekler bilgilendirilmiş onam veren hastalardan toplandı. Çıkarılan süpernatant, özel bir atık sıvı tankına yerleştirilmeli ve hastanenin bulaşıcı hastalık bölümüne teslim edilmelidir.
1. Makrofaj izolasyonu
- Hazırlık: Deney fareleri, anestezi kapları, beherler ve anestezik olarak izofluran dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve santrifüjü 4 °C'de önceden soğutun.
- Sıçanların uyuşturulması ve kurban edilmesi: Kurumsal hayvan bakımı yönergelerine uyarak, aşırı izofluran anestezisini soluduktan sonra sıçanlara ötenazi yapın.
- Alkol dezenfeksiyonu: Kurban edilen fareyi bir behere koyun ve fareyi tamamen kaplamak için yeterli miktarda% 75 etanol ekleyin. 10 dakika bekletin.
- Karın sıvısının enjeksiyonu ve karıştırılması: Sıçanın karnını dezenfekte edin ve bir şırınga kullanarak orta hat boyunca karın boşluğuna 50 mL buz gibi steril PBS enjekte edin.
- Fareyi hafifçe sallayın ve karın boşluğundaki sıvının iyice karışmasını sağlamak için karın duvarına parmaklarınızla masaj yapın. 2-3 dakika masaj yapın.
- Karın sıvısının toplanması: Sıçanın karın duvarında küçük bir kesi yapın, vücudu hafifçe eğin ve karın sıvısını bir şırınga ile aspire edin.
- Santrifüjleme: Toplanan sıvıyı 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- RBC Parçalanması: RBC lizis tamponunun hücre pelet hacminin 3-5 katını ekleyin ve 1-2 dakika hafifçe karıştırın.
NOT: Örneğin, hücre pelet hacmi 1 mL ise, 3-5 mL lizis tamponu ekleyin. Bu adım, oda sıcaklığında veya 4 °C'de gerçekleştirilebilir, ardından 5 dakika boyunca 400-500 x g'da santrifüjleme yapılabilir. 4 °C'de santrifüjleme daha etkilidir. Ozmotik basınç nedeniyle, eritrositler parçalanacak ve çözelti kırmızıya dönecektir. Santrifüjlemeden sonra kırmızı süpernatanı çıkarın.- Kırmızı Kan Hücresi (RBC) lizis tamponu tarifi: 8.3 g NH4Cl, 1.0 g KHCO3 ve 1.8 mL% 5 EDTA'yı 800 mL damıtılmış H2O içinde çözün ve 0.2 μm'lik bir filtreden sterilize edin, damıtılmış H2O ile qs ila 1000 mL ve pH 7.2 ~ 7.4'ü ayarlayın. Kırmızı çökelti hala görünüyorsa, çözelti berrak ve şeffaf hale gelene kadar bu adımı tekrarlayın. Tipik olarak, az miktarda kalıntı RBC, sonraki tahlilleri etkilemez (pelette az sayıda RBC varsa, bu adım atlanabilir).
- Hücre Yıkama: Hücreleri yaklaşık 10 mL önceden soğutulmuş RPMI 1640 ortamı ile iki kez yıkayın. Her seferinde 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre yeniden süspansiyonu ve sayma: RPMI 1640 +% 1 FBS +% 1 PS'den oluşan önceden soğutulmuş ortamda hücreleri yeniden süspanse edin, Tripan Mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın ve hücre canlılığını değerlendirin.
- Hücre kültürü: Kültür gerekiyorsa, hücreleri 24 oyuklu bir kültür plakasında 1 × 106 / mL yoğunlukta, oyuk başına 1 mL RPMI 1640-10% FBS-1% PS ortamı ile tohumlayın. 2 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı değiştirin ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için kuyuları 1-2 kez RPMI 1640 ortamı ile yıkayın.
NOT: Yapışık hücreler tek bir makrofaj tabakası oluşturacaktır. RNA ekstraksiyonu gerekiyorsa, hücre peletine 1 mL Trizol ekleyin, hücreleri bozmak için birden çok kez pipetleyin ve karışımı anında RNA ekstraksiyonu için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın veya -80 °C'de saklayın. FACS analizi için hücre sayısını tüp başına 1 × 106 olarak ayarlayın, 20 μL FACS tamponu ekleyin ve FACS boyamaya devam edin. FACS tamponu: DPBS +% 2 FBS, filtre 0,22 μm'lik bir filtreden sterilize edilir, 4 ° C'de saklanır).
2. Sıçan veya insan RBC'lerinin toplanması
- Hazırlık: 15 mL santrifüj tüplerini ve 10 mL şırıngaları heparinle önceden durulayın.
- Sıçan kalbi kanının toplanması: Sıçanı uyuşturduktan ve kurban ettikten sonra, sıçanın kuyruğunun küçük bir bölümünü makasla dikkatlice kesin ve kuyruk damarından kan toplayın.
- İnsan kanının toplanması: Damar delme tekniğini kullanarak insan kanı toplayın.
- Kan örneklerinin karıştırılması: 1 mL PBS'yi 1 mL insan venöz kanı veya sıçan kanı ile karıştırın.
- Ficoll yoğunluk gradyan ayrımı: İnsan periferik kanı için 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1.077 yoğunluğa sahip 1.5 mL Ficoll çözeltisi ekleyin; sıçan kanı için 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1.084 yoğunluğa sahip 1.5 mL Ficoll çözeltisi ekleyin.
- Kan örneklerinin katmanlanması: Seyreltilmiş kan örneklerini santrifüj tüpünün duvarı boyunca karşılık gelen yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine yavaşça katmanlayın.
- Santrifüjleme: 18-20 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Plazma ve lenfosit tabakalarının çıkarılması: Üst plazma tabakasını, lenfosit tabakasını ve Ficoll solüsyon tabakasını çıkarın, sadece alt kırmızı kan hücresi tabakasını bırakın.
- Kırmızı kan hücresi yıkama: RBC'leri 10 mL PBS ile bir kez yıkayın.
- Süpernatantın santrifüjlenmesi ve uzaklaştırılması: 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre yeniden süspansiyonu ve sayımı: 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL RPMI 1640 ortamı ekleyin, uygun miktarda kırmızı kan hücresi peleti ile karıştırın ve hücre sayımı yapın.
3. İn vitro fagositoz testi
- Makrofaj izolasyonu ve kültürü: Makrofajları izole edin ve 12 oyuklu bir kültür plakasında 1 ×10 6 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2 saat inkübe edin.
- Yapışmayan hücrelerin çıkarılması: 2 saatlik inkübasyondan sonra, yapışmayan hücreleri dikkatlice çıkarın ve RPMI 1640 ortamı ile nazikçe yıkayın.
- Devam eden kültür: Kültür plakasının dibine tam yapışmayı sağlamak için yapışan makrofajları 2 saate kadar kültürlemeye devam edin.
- Açlık tedavisi: 2 saat sonra, ortamı serumsuz RPMI 1640 ile değiştirin ve makrofaj fagositik aktivitesini arttırmak için 2 saat açlık koşulları altında inkübe edin.
- İnsan hücrelerinin eklenmesi: DeepRed ile önceden boyanmış insan hücrelerini kültür plakasına ekleyin ve makrofajların insan hücrelerini fagositoz etmesine izin vermek için 2 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Sonuç ve analiz: Fagositoz testinden sonra, mikroskop altında fagositik aktiviteyi gözlemleyin veya akış sitometrisi (FACS) kullanarak nicelleştirin.
4. Akış sitometrisi
- Hücre hazırlığı: Hücreleri %0.05 Tripsin-EDTA ile sindirin ve %10 FBS içeren RPMI 1640 ortamı kullanarak sindirimi durdurun. Hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı atın, hücreleri FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve sayın. İki tüpte tüp başına 1 × 106 hücre hazırlayın. Ek olarak, bir tüp insan RBC'si ve bir tüp sıçan RBC'si hazırlayın.
- Tek lekeli tüp hazırlığı: Bir numune tüpüne fare-anti-sıçan CD163 antikoru, insan kırmızı kan hücresi tüpüne fare anti-insan CD235a antikoru ve sıçan kırmızı kan hücresi tüpüne DeepRed ekleyin.
- Bu tüpleri ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve her 10 dakikada bir karıştırın. Bağlanmamış antikorları, santrifüjü yıkamak için 1 mL FACS tamponu ekleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
- Numune hazırlama: Numune tüplerine fare-sıçan önleyici CD163, fare anti-insan CD235a antikorları ve DeepRed ekleyin. Işıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve her 10 dakikada bir karıştırın. Bağlanmamış antikorları, santrifüjü yıkamak ve süpernatanı çıkarmak için her numune tüpüne 1 mL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
- Analiz: FSC-H'ye karşı FSC-A'ya karşı geçit yaparak hücre yapışmasını dışlayın. Numuneleri analiz etmeden önce uygun voltaj ve kompanzasyon ayarlarını yapmak için tek lekeli tüpleri kullanın (Şekil 1). FlowJo v10.8.1 yazılımını kullanarak verileri analiz edin.
NOT: Kompanzasyonu ayarlamak için CD163-FITC ve PI tek lekeli kontroller kullanılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Akış sitometrisi analizi yoluyla, sıçan makrofajlarının insan RBC'lerine ve sıçan RBC'lerine doğru fagositoz oranını çıkarabiliriz. Ölü hücreler ilk olarak PI kullanılarak dışlanır. CD235a-pozitif eksprese eden CD163-pozitif makrofajlar, insan RBC'lerinin fagositozunu gösterir. Fagositozlu hRBC'lere sahip makrofajların oranı, sıçan makrofajlarının insan RBC'lerine karşı fagositoz oranı olarak tanımlanır. Sıçan eritrositlerinin fagositoz oranı da benzer şekilde hesaplandı. CD235a ve Koyu ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, hem ksenojenik hem de allojenik RBC'lerin makrofaj aracılı fagositozunu değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir in vitro test oluşturmuştur. Bu çalışmada, insan RBC'leri CD235a-BV421 ile etiketlenirken, sıçan RBC'leri DeepRed boyası ile boyandı. Makrofajlar etiketli RBC'leri fagositoz ettiğinde, konjuge antikorlar (CD235a-BV421) veya boya (DeepRed) birlikte içselleştirilir. Sonuç olarak, makrofajların kendileri karşılık gelen floresan sergiler. Bu koşullar ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
JYG, Prometheus RegMed Tech Ltd.'nin bilimsel danışmanıdır. Soldaki yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması beyan etmiyorlar.
Teşekkürler
Bayan Mei Fang, Bayan Min Ma, Bayan Yu-Tong Meng ve Bay Quan-Kai Lei'ye ilk katkıları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82270697), Çin'in Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Planlama Projesi (2021B1212040016), Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515012574), Jiangsu İli Tıbbi Anahtar Disiplini Yetiştirme Birimi (JSDW202229) ve Haihe Hücre Ekosistemi İnovasyon Fonu Laboratuvarı (HH24KYZX0008), Çin Gençlik Girişimciliği ve İstihdam Vakfı -Incaier Kamu Refahı Fon (HH25KYHX0003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsin-EDTA | ThermoFisher | 25300062 | |
| Derin Kırmızı Hücre İzleyicisi | ThermoFisher | C34565 | Toz (15 μ g) DMSO'da feshedildi (20 & mu; L) |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Dulbecco'nun Fosfat-Tamponlu Tuzlu Sözü (DPBS) | ThermoFisher | C10010500BT | |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva | 17144002 | |
| Ficoll-Paque PREMIUM | Cytiva | 17544602 | |
| Fare Anti-İnsan CD235a BV421 Antikor | BD Biosciences | 562938 | |
| Fare Anti-Fare CD163 FITC Antikoru | BIO-RAD | MCA342F | |
| Protein K | Sigma | P2308 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875093 |
Kaynaklar
- Ito, M., et al. NOD/SCID/GAMMAC(null) mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Szpirer, C. Rat models of human diseases and related phenotypes: A novel inventory of causative genes. Mamm Genome. 33 (1), 88-90 (2022).
- Zhang, L., et al. Survival-assured liver injury preconditioning (SALIC) enables robust expansion of human hepatocytes in Fah Rag2(-/-) IL2rg(-/-) rats. Adv Sci (Weinh). 8 (19), e2101188(2021).
- Rongvaux, A., et al. Corrigendum: Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 35 (12), 1211(2017).
- Furuya, K., et al. The evidence of a macrophage barrier in the xenotransplantation of human hematopoietic stem cells to severely immunodeficient rats. Xenotransplantation. 28 (4), e12702(2021).
- Barclay, A. N., Van den Berg, T. K. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: Structure, function, and therapeutic target. Annu Rev Immunol. 32, 25-50 (2014).
- Ide, K., et al. Role for CD47-SIRPalpha signaling in xenograft rejection by macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5062-5066 (2007).
- Matlung, H. L., et al. The CD47-SIRPα signaling axis as an innate immune checkpoint in cancer. Immunol Rev. 276 (1), 145-164 (2017).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Cytometry A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Joffe, A. M., Bakalar, M. H., Fletcher, D. A. Macrophage phagocytosis assay with reconstituted target particles. Nat Protoc. 15 (7), 2230-2246 (2020).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
