Yöntem makalesi

Fare arterlerinde hemostaz için basit ve etkili prosedür

390 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

28 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, fare arterlerinde hemostaz sağlamak için etkili bir yöntem geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Özet

Farelerde arteriyal ponksiyon veya kanülasyon sırasında, iğne çekilmesinden sonra hemostaza ulaşma zorlukları nedeniyle arterin kalıcı bağlanması genellikle gereklidir. Bu, verilen doku bölgesinde kalıcı iskemik hasara yol açar. Böyle lokal iskemi sıklıkla ikincil komplikasyonlara yol açar ve hayvan modellerinde deneysel sonuçları tehlikeye atar. Mevcut yöntem, prosedür sonrası ponksiyon bölgesini kapatarak normal kan akışını korumayı ve böylece ameliyat sonrası iskemiyi önlemeyi amaçlamaktadır. Bu yöntem, deneysel hayvanın kendisinden bir yağ dokusu parçasının alınmasını, standart tekniklerle arterial ponksiyon yapılmasını ve ardından delme bölgesinin yağ pediyle sarılmasını içerir; böylece kan akışını koruyarak hemostaz sağlanır. Bu çalışmada, farelerde çift taraflı ortak karotis arter ponksiyonu yapıldı, ardından yağ sarma tekniğiyle hemostaz yapıldı. Lazer benekli kontrast görüntüleme (LSCI), sahte ve ameliyat edilen fare grupları arasında beyin kan akışı değişikliklerinde fark göstermedi ve ameliyat grubunda ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası beyin kan akışı ölçümlerinde anlamlı değişiklikler gözlemlenmedi. Ameliyattan 7, 14 ve 28 gün sonra yapılan histolojik değerlendirme, (1) beyin mimarisini (H&E boyama) korumak, (2) dejeneratif değişiklikler (Nissl boyama) olmadan nöronal morfolojiyi sağlam tuttuğu ve (3) beyin kesitlerinde patolojik değişikliklerin olmadığı ortaya çıktı. Bu arteriyel hemostaz tekniği, yağ dokusunun esnek doğası ve fizyolojik pıhtılaşma mekanizmalarından faydalanır. İşlem şunları içerir: (1) otolog yağın delme bölgesinin etrafına sarılması, (2) arteriyal adventisiyle optimal temas sağlamak için dikişlerle sabitlenmesi ve (3) kaçın kanın pıhtılaşma geçirdiği yağ-arter arayüzüne girmesine izin vermek. Bu üçlü etkili mekanizma, patteral açıklığı korur ve ameliyat sonrası iskemik komplikasyonları önlerken güvenilir hemostaz sağlar. Yöntem, belirgin prosedürel basitlik, klinik etkinlik ve mükemmel translasyon potansiyeli göstermektedir.

Giriş

Hayvan modellerinde, arter yaralanması oluşturmak, beyin iskemi-reperfüzyon modelleri, karotis (CCA) veya aort (AO) ateroskleroz modelleri ve omurilik iskemisi modelleri dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumların modellenmesinde yaygın olarak kullanılan deneysel bir yaklaşımdır.

Fare serebral iskemi-reperfüzyon (MCAO) modelini örnek alarak, mevcut standart modelleme yaklaşımı 1,2,3 şunları içerir: dış karotis arteri (ECA) izole etmek, distal ucunu bağlamak, proksimal ECA'yı arterial klipsle sıkıştırmak ve bir stay dizimine yerleştirmek, bu noktalar arasında bir delme deliği açmak, filamentin CCA boyunca geriye doğru yerleştirilmesi, damar ve filamenti stay dikülü ile sabitlemek, ECA'yı ponkin bölgesi ile distal ligasyon arasında kesmek, arterial klipi serbest bırakmak, filamenti iç karotis arteriye (ICA) yönlendirmek için orta beyin arterini kapatmak ve filament çekildiğinde proksimal ECA'yı bağlamak.

Bu işlem reperfüzyon sağlarken, sadece ortak ve ICA arasındaki kan akışını yeniden sağlar ve ECA'yı kalıcı olarak kopmuş bırakır. Bu ECA transeksiyonu, ipsilateral yüz bölgelerinde iskemik hasara yol açar; bu istenmeyen bir yaralanma sadece cerrahi işlemi karmaşıklaştırmakla kalmaz, aynı zamanda deneysel hayvanlarda kafa karıştırıcı travma getirerek çalışma sonuçlarını potansiyel olarak tehlikeye atabilir. Daha endişe verici olanı, bazı deneyselprotokoller 4,5'te araştırmacılar doğrudan CCA ponksiyonu yapar, MCAO oluşturmak için dikiş yerleştirilir ve hemen çıkarılır, ardından hemostaz için delin noktasının her iki ucunda kalıcı ligasyon uygulanır. Ancak bu yöntem doğrudan damar basıncını artırır, böylece kalp sonrası yükü yükseltir ve potansiyel olarak kalpyetmezliğine yol açar6.

Aterosklerozu oluşturmak için fare CCA veya AO endotel yaralanma modeli ve yüksek yağlı diyet kullanıldığında, gelenekselyöntem 7,8,9,10 CCA, abdominal aort (AA) veya femoral arter (CFA) bölgelerinde arterial ponksiyon yapılmasını, endotel denudasyonu tetiklemek için balon kateter yerleştirilmesini ve delin noktasının her iki ucunu kalıcı olarak bağlanarak hemostaz sağlanmasını içerir. Bu standart yaklaşım birkaç kritik sınırlama getirir: zorunlu ligasyon, tıkanma bölgesinin distal lokalize iskemi oluşturur. Daha zararlı olarak, ligasyon bölgelerinde lipid birikimi meydana gelir. Komprovizasyon modelinin geçerliliği, hedeflenen lezyonlara ilaç teslimatını engelleyen ve farmakolojik değerlendirme sonuçlarını çarpıtacak yerel hemodinamikleri etkileyerek değiştirilir.

Sürün omurilik işemisi modelinde, prosedür arterial ponksiyon (CCA, AA veya CFA erişimi aracılığıyla ) ve ardından hedeflenen noktalarda iskemi indüklemek için balon kateter yerleştirilmesiniiçerir 11. Balon çekilmesinden sonra, konvansiyonel hemostaz, delme bölgesinin iki taraflı olarak kalıcı olarak bağlanmasıyla sağlanır.

Bahsedilen üç modelde de, ponksiyon sonrası hemostaz iki taraflı bağlanma yoluyla eşit şekilde sağlanır. Kanama kontrolünde etkili olmasına rağmen, bu yaklaşım kaçınılmaz olarak lokal iskemiyi indükler ve bu da nihayetinde model geçerliliğini tehlikeye atan ikincil komplikasyonlara yol açar. Bu nedenle, hemostatik işlemler sırasında damar açıklığının korunması fizyolojik ve deneysel olarak kritiktir. Bu nedenle, bu makale fare deneyleri için yenilikçi, basit ve etkili bir arter hemostaz yöntemi tanıtmaktadır. İşlem, önce delme bölgesinin her iki ucunun arteriyal damar klipsleriyle sıkıştırılmasını, ardından arteri 3 mm × 3 mm × 1 mm yağ pediyle sararak delintiyi kapatmayı içerir. Yağ ped, arterin etrafında bir bağlama dikişiyle sabitlenir. Arteriyel klipsler kademeli olarak serbest bırakılır ve ligatürün sıkılığı kanamaya göre ayarlanır ve tam hemostaz sağlanana kadar. Bu yaklaşım kan akışını yeniden sağlar, normal hemodinamiği korur ve kalıcı damar ligasyonu nedeniyle çevredeki dokularda iskemik hasarı önler. Fare durumlarının uzun vadeli modelleme sonrası gözlemi ve farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesi için özellikle avantajlıdır; böylece preklinik çalışmaların deneysel titizliğini önemli ölçüde artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel işlemler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzları'na (Protokol Onay No. SNLL25040501; Hayvan Kullanım Lisansı No. SYXK(Liao)2021 - 0010) Shenyang Tarım Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından kurulmuştur. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Deneysel hazırlık

  1. Hayvan detayları ve dokümantasyonu: Tüm hayvan araştırma verilerini ARRIVE yönergelerine (Hayvan Araştırması: In Vivo Deneylerin raporlanması) uygun şekilde belgeleyin. 6-8 haftalık erkek Balb/C fareleri kullanın, ağırlığı 22 g ± 4 g ağırlığında. 12 saatlik ışık/karanlık döngüde 24 ± 2 °C sıcaklıkta, %55 ± %5 göreceli nemle konut koşullarını koruyun.
  2. Hayvan hazırlığı
    1. Fareleri izofloran buharlaştırıcı ile anestezi yapın (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak). Anestezi %4 izofluran ile indük edin, ardından %2 isofluran ile devam edin.
    2. Anesteziden sonra, servikal ve kranial bölgeleri depilasyon yapın ve açıkta kalan cildi povidon-iyot ile dezenfekte edin, ardından kalıntıyı çıkarmak için %75 etanol uygulanır.
    3. Fareleri sonraki tüm deneysel işlemler için 37 °C'lik bir ısıtma pedine yerleştirin.
  3. Farelerde başlangıç beyin kan akışının ölçülmesi
    1. Fareleri yatağa pozisyon edin. Orta hat saç derisi kesisi yapın, parietal kemikleri ortaya çıkarın. Üzerine kurulu fasyal tabakayı dikkatlice kesip kafatası yüzeyinden çıkarın.
    2. LSCI sistemini açıkta kalan fare parietal kemiğini 10x büyütmede taramak için ayarlayın ve başlangıç beyin kan akışı verilerini kaydedin.
  4. Yağ pedini topla ve arterial ponksiyon yap
    1. Fareleri sırtüstü pozisyona getirin. Orta çizgide bir servikal kesi yapın. Daha sonra kullanmak üzere 3 mm × 3 mm × 1 mm deri altı yağ dokusu grefti alın.
    2. Submandibular bez, sternohyoid kas ve sternocleidomastoid kas kesimi yapılabilir. Her iki CCA'yı da açığa çıkar.
    3. CCA'yı ICA ve ECA'yı açığa çıkarmaya serbest bırakın.
    4. CCA'nın distal ucuna vasküler kelepçe 1 uygulanır ve damar kelepçesi 2'yi proksimal ucuna yerleştirin.
    5. İki kelepçe arasındaki CCA'yı 23 G'lik bir iğne ile delin.
  5. Yağ pedini uygulamak
    1. İğne çıkardıktan sonra, CCA'yı delik noktasına yağ pedinin kesilen yüzeyiyle (seroza olmayan tarafı) sarın.
    2. Yağ sarılmış alanın altına 4-0 bir dikiş yerleştirin; sonra yağ yüzeyine nazikçe tek bir atış bağlayarak yağ pediyle damar duvarı arasında güvenli temas için basınç uygulayın; Son olarak, hemostaz için basınç dengesini sağlamak amacıyla ligatürü kademeli olarak ayarlayın.
    3. Distal CCA'yı nemli pamuklu çubukla yükseltin. Vasküler kelepçe 1'i serbest bırakın ve sürüntü yavaşça çekerek kan akışının delme noktasına doğru yavaş yavaş ilerlemesini sağlayın.
    4. Kan akışını kontrol et; aktif kanama gözlemlendiyse, distal CCA damar kelepçesi 1 ile yeniden çekilin.
    5. 1 dakika bekleyin, sonra yavaşça damar kelepçesini 1 açın; Eğer kanama olursa, yağ pedini yeniden konumlandırın veya basıncı artırmak için ligatürün tek atışını hafifçe sıkılaştırın; Bu ayarlamalar tam hemostaz sağlanana kadar devam ettirin.
    6. Proksimal CCA'yı nemli pamuklu çubukla yükseltin. Vasküler kelepçe 2'yi serbest bırakın ve sürüntü kademeli olarak çekerek kontrollü kan akışı için delme bölgesine doğru ilerleyin.
    7. Kanama olursa, distal CCA'yı damar kelepçesi 2 ile geri çekin.
    8. Dişimenin tek atışını hafifçe sıkıştırarak basıncı artırın; 1 dakika bekle, sonra proksimal CCA'yı yükseltin ve vasküler klemp 2'yi serbest bırakın; nemli pamuk çubuğunu yavaşça delme noktasına doğru yuvarladı.
    9. Kanama devam ederse, tam hemostaza ulaşana kadar önceki iki adımı tekrarlayın.
    10. Dikişle birlikte ek bir atış yapın, böylece başlangıçtaki çift düğüm oluşturun; böylece yağ yastığı damar duvarına daha iyi sabitlenir ve dengeli intravasküler ve dış basınçlarla hemostaz sağlanır.
    11. Yağ yastığının her iki tarafındaki ortak karotis arterlerinin dolu olduğunu ve damar çapının tutarlı olduğunu doğrulamak; Bunu başarılı bir kan akışı restorasyonu ve hemostaz olarak değerlendirin.
    12. Aynı işlemi tekrarlayarak kontralateral ortak karotis arterine ponksiyon hemostazı yapılabilir.
    13. Sahte farelerde arterial ponksiyon veya yağ pedleri sarma yapmadan, diğer tüm işlemler ameliyat edilen grupla aynı şekilde korunurken sahte farelerde çift taraflı ortak karotis arterleri açığa çıkarmak.
    14. Servikal cerrahi kesiyi dikin ve antiseptik uygulayın.
  6. Ameliyat sonrası beyin kan akışı değerlendirmesi
    1. Farelerde çift taraflı CCA ponksiyon hemostazı tamamlandıktan sonra, LSCI sistemini açıkta kalan parietal kemiği taramak ve 10 kat büyütülmüş görüntüler elde etmek için ayarlayın; sonra beyin kan akışı değişikliklerini kaydedin.
    2. Saç derisi kesisini dikin ve antiseptik uygulayın, farelerin iyileşmesini 37 °C ısıtma pedinde bırakın, ardından bakım için kafese geri götürülür.
  7. Ameliyat sonrası izleme ve doku toplama
    1. Ameliyat sonrası dönemde farelerin servicomandibular bölgesinde hayatta kalma durumu, motor aktivite ve kanama belirtilerini günlük olarak takip edin ve kaydedin.
    2. Ameliyat sonrası 7, 14 ve 28. günlerde, fareleri karbondioksitle ötanazi edin (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak) ve beyin dokularını %4 paraformaldehit ile düzeltin.

2. Patolojik muayene

  1. 24 saat fiksasyondan sonra, beyin dokularını etanol gradyanı ile kurutun, ksilenle temizleyin ve parafine yerleştirin.
  2. Hipokampal kesitlerde H&E boyama işlemi yapın ve beyin dokusu morfolojisini mikroskop altında inceleyin.
  3. Hipokampal kesitlerde Nissl boyama işlemi yapın ve nöron mimarisini mikroskop altında inceleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ameliyat öncesi ve sonrası lazer lek kontrast görüntüleme verileri ve hem ameliyat hem de ameliyat gruplarında yapılan göreceli perfüzyon ölçümlerinin analizi, bu arter hemostaz tekniğinin ortak karotis arter ponksiyon bölgesini beyin kan akışını tehlikeye atmadan başarıyla kapattığını göstermiştir (Şekil 1).

Operasyon yapılan gruptaki fareler ameliyattan sonra 28 gün boyunca sürekli izlendi ve ölüm tespit edilmedi. Motor aktivite...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MCAO modellerinde, ECA'nın korunması, ECA ligasyonu ve transeksiyonuyla ilişkili yüz iskemik hasarını önleyerek klinik patolojiyi daha iyi özetlemektedir. CCA ponksiyonu ile filament yerleştirme yöntemi teknik olarak basit olsa da, delin bölgesinin çift taraflı ligasyonunu gerektirir; bu da gerçek inme patofizyolojisinin optimal olmayan bir temsili olan Willis Çemberi kollateral dolaşımına bağlı beyin perfüzyonu oluşturur. Bu çalışmada sunulan yağ pedleri hemostaz tekniği, dikiş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Bu çalışma, Gümrük Genel İdaresi Bilimsel Araştırma Projesi (Hibe No. 2005HK006) tarafından "Kuzey Çin'in Sınır Bölgelerinde Vektör - Yoluyla Yayılan Bulaşıcı Hastalıklar için Çoklu Patojen Tespit Teknolojisinin Araştırma ve Geliştirilmesi ve Uygulanması" başlığı kapsamında desteklenmiştir. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (Hibe No. 2022YFC2302700) ve Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'nın Uluslararası Bilim ve Teknoloji İşbirliği Programı (Hibe No. KY201901014). Bu arteriyel hemostaz yönteminin başarılı gelişimi, Profesör Perry'ye (The Perry Manual of Mouse Experiments'in Genel Yayın Yönetmeni) uzman rehberliği için ve lazer benekli kontrast görüntüleme sistemini sağladığı RWD Life Science Co., Ltd. (Shenzhen) için derin minnettarlık borçludur. Kıçilmez destekleri için mentorumuz Profesör Han Xiaohu ve Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd.'ye içten teşekkürlerimizi iletiyoruz. Bu araştırmayı mümkün kılan tüm katkıda bulunanlara da içten minnettarlığımızı ifade ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İplik dikiş iğnesi ile 4-0Şanghay Pudong Jinhuan Tıbbi Malzemeler A., Ltd
Balb/C farePekin Huafukang Biyoteknoloji Şirketi, Ltd6-8 yaş, erkek
DHG Serisi Isıtma ve Kurutma FırınıŞanghay Yiheng Teknoloji A.Ş., LtdDHG-9123A
Hematoksilin ve Eosin (H& E) Yüksek Çözünürlüklü Boyama KitiServicebioG1076-500ML
İzofluranShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR510-22
Lazer spikle analizörüShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdRFLSI ZW
Nissl boya çözeltisiServicebioG1036-100ML
Organizasyonel gömüleme makinesiLeicaHistoCore Arcadia H
Slayt taramalı görüntüleme sistemiShenzhen Shengqiang Teknoloji A.Ş., LtdSQS-40R
Küçük hayvan anestezi makinesiShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR500
Doku kurutucuLeicaHistoCore incisi
Ultrasaf Su SistemiTermo50132370
Ultra-İnce Yarı Otomatik MikrotomLeicaHistoCore MULTICUT

Kaynaklar

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Arteryel HemostazYa la SarmaFare Arter PonksiyonuOrtak Karotis ArterOtolog Ya GreftiKan Ak n n KorunmasLazer Spekle G r nt lemeSerebral Kan Akskemi nlemeHistolojik De erlendirme

İlgili makaleler