Yöntem makalesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde fibroblast büyüme faktörü sinyal bozulmasının gerçek zamanlı izlenmesine dayalı gelişimsel toksisite testi

956 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68910

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Engineering, Yokohama National University, 2Division of Cellular & Molecular Toxicology, Center for Biological Safety & Research, National Institute of Health Sciences, 3Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 4Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology (KISTEC)

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, teratojenik kimyasalları tanımlamak için bir in vitro hücre testi sunuyoruz. Fibroblast büyüme faktörü (FGF)/serum yanıt faktörü (SRF) sinyallemesinin dinamikleri, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) raportör hücrelerinde ölçüldü ve teratojenite riski, bu sinyal yolunun kimyasal bozulması ölçülerek değerlendirildi.

Özet

Gelişimsel toksisite (Devtox) tipik olarak hayvan modellerinde değerlendirilir. Ancak türler arası farklılıklar nedeniyle yanlış negatifler ve hayvan refahına ilişkin etik kaygılar gibi doğruluğun sağlanmasında zorluklar vardır. Bu nedenle, insan Devtox'unu değerlendirmek ve bu sorunların ele alınmasına yardımcı olmak için yeni test sistemlerine ihtiyaç vardır. Teratojenlerin, moleküler hedeflerinden bağımsız olarak, morfogenez için gerekli olan Devtox ile ilgili sinyal yollarını bozduğunu varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücreleri kullanan bir fibroblast büyüme faktörü (FGF) raportör sistemi geliştirdik. Bu sistem, kimyasalların neden olduğu sinyal bozulmasının miktarının belirlenmesini sağlayarak bilinen teratojenik ve teratojenik olmayan bileşikler için %83'lük bir doğruluk oranına ulaşır. Devtox sinyal aktivitesi zamanla değiştiğinden, tek bir uç noktada ölçüm yapmak yerine dinamiklerini sürekli olarak yakalamak önemlidir. Gerçek zamanlı lüminesans ölçüm sisteminin kullanılması isteğe bağlıdır, ancak daha az işçilikle zamansal çözünürlüğü artırır. Hücrelerin bir kültür plakasına ekilmesinden lüminesans verilerinin elde edilmesine kadar tüm test 1 hafta içinde tamamlanabilir.

Giriş

Bazı kimyasallar büyüme gecikmeleri, malformasyonlar, fonksiyonel eksiklikler ve ölüm dahil olmak üzere gelişimsel toksisiteye (Devtox) neden olur1. Devtox'un değerlendirilmesi, farmasötiklerin ve pestisitlerin güvenliğini sağlamak için önemlidir2. Mevcut Devtox tahlilleri tipik olarak birden fazla hayvan modeline dayanır. Bununla birlikte, türler arası farklılıklar nedeniyle, hayvan modellerinin, sonuçları insanlara tahmin ederken doğal sınırlamaları vardır3. İyi bilinen bir gelişimsel toksik madde olan talidomid, ilk olarak 1950'lerin sonlarında hamile kadınlara sabah bulantılarını hafifletmek için reçete edildi. Kemirgenlerde teratojenite gözlenmese de, dünya çapında insan yenidoğanlarında ciddi uzuv malformasyonları bildirilmiştir. Bu trajedi, hayvan temelli güvenlik testlerinin sınırlamalarını vurguladı ve Devtox test kılavuzlarını tanıtmak ve revize etmek için uluslararası çabalara yol açtı4. Buna ek olarak, hayvan refahının yanı sıra hayvanlar üzerinde yapılan testler için gereken önemli zaman ve maliyetle ilgili endişeler de var. Bu nedenle, insan Devtox'unu doğru bir şekilde tahmin edebilen alternatif in vitro testlere ihtiyaç vardır5.

Burada, embriyonik gelişim için kritik olan sinyal yollarının bozulmasına dayalı olarak gelişimsel toksik maddeleri değerlendirmek için bir in vitro test öneriyoruz 6,7,8. Test, serum yanıt elemanının (SRE) kontrolü altında, ışıldayan bir raportör gen olan NanoLuc lusiferazı (Nluc) eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanılarak gerçekleştirilir. SRE, fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyal yolundaki bir transkripsiyon faktörü olan serum yanıt faktörü (SRF) için bağlanma bölgesidir. SRF, birden fazla liganddan gelen sinyalleri entegre eder ve embriyonik gelişim9 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde önemli roller oynayan 200'den fazla genin ekspresyonunu düzenler.

Bu tahlilde, raportör hücreler bir test kimyasalına maruz bırakıldı ve sinyalleşmeyi aktive etmek ve kimyasalın herhangi bir girişimini güçlendirmek için FGF ile uyarıldı. Bu testin önemli bir özelliği, lüminesans yoğunluğu değiştikçe sinyal aktivitesinin dinamiklerini yakalamaktır. Sinyal aktivitesi zamanla değiştiğinden, tek bir zaman noktasındaki uç nokta ölçümleri hatalı olabilir10. Gerçekten de, 24 saatlik bir süre boyunca yedi zaman noktasında yapılan ölçümler, 0,837'lik eğri altındaki alan (AUC) değeri ile gelişmiş tahmin doğruluğu gösterdi.

Test kimyasalları, sitotoksisite ve çözünürlüğe bağlı olarak 0,01 ng/mL'den 1000 μg/mL'ye kadar geniş bir konsantrasyon aralığında uygulanabilir. Tek bir 96 oyuklu plakayı tohumlamak için yaklaşık 1,4 × 104 hücre gereklidir. Bu tahlilin bir sınırlaması, teratojenik kimyasalların, farklılaşmamış insan iPS hücrelerinde eksprese edilmeyen hedefler aracılığıyla hareket etmeleri durumunda tespit edilemeyebileceğidir. Ek olarak, bu tahlil teratojenik metabolitleri yakalayamayabilir. Ayrıca, teratojenik toksisitenin altında yatan ayrıntılı mekanizmalar veya spesifik sonuçları hakkında bilgi sağlamaz.

Gerçek zamanlı bir lüminesans izleme sisteminin kullanılması, zaman çözünürlüğünü daha da iyileştirir, sürekli ölçümler için gereken işçiliği azaltır ve kültür plakalarının tekrar tekrar kullanılmasından kaynaklanan artefaktları en aza indirir. Burada, sinyal bozulmasına dayalı Devtox testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tüm prosedür bir hafta içinde tamamlanabilir. Bu yaklaşım otomatikleştirilebilir, böylece kimyasal taramaya uygun hale getirilir ve hayvanlar üzerinde yapılan testlerin azaltılmasına katkıda bulunulur.

Protokol

Bu çalışmada insan iPS hücreleri (201B7) kullanıldı ve bir serum yanıt elemanının (SRE) kontrolü altındaki Nluc geni, CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak Adeno-İlişkili Virüs Entegrasyon Bölgesi 1 (AAVS1) lokusuna vuruldu (Şekil 1A). Raportör hücreler (SRE-Nluc-knocked-in insan iPS hücreleri) için gen düzenlemenin ayrıntıları başka bir yerde rapor edilmiştir6. Protokol temel olarak üç adıma ayrılmıştır: 1) maksimum maruz kalma konsantrasyonunu belirlemek için bir kimyasalın sitotoksisite testi, 2) sinyal bozulma testi ve 3) veri analizi.

Ortam buharlaşmasının etkisini en aza indirmek için, 96 oyuklu bir plakanın merkezi 60 kuyusunu kullanarak tüm hücre kültürü deneylerini gerçekleştirin ve en dıştaki kuyulara ve kuyular arası boşluklara su ekleyin. Buharlaşmayı daha da azaltmak için inkübasyon sırasında plakayı gaz geçirgen bir sızdırmazlık filmi ile örtün.

1. Hücre hazırlığı

  1. Dondurulmuş stoğun çözülmesinden sonra en az 2 hafta boyunca kültür raportör hücreleri. Hücreleri 7 günlük bir tekrar programında tutun ve tahlil için 7. gün hücrelerini kullanın. Geçiş gününde tohumlama yoğunluğunu ~%80 birleşme noktasına optimize edin.
  2. Tek hücreleri, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 2 mL taze bakım ortamı ile ECM kaplı altı oyuklu bir plakada 2.0 ×10 5 hücre/kuyuda tohumlayın.
  3. 24 saat sonra, ortamı 2 mL/kuyu taze bakım ortamıyla değiştirin.
  4. 72 saatte, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için enzim bazlı bir ayrışma reaktifi kullanarak hücreleri toplayın. 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 2 mL taze bakım ortamı ile ECM kaplı altı oyuklu bir plakada 1.0× 10 5 hücre/kuyuda tohumlayın.
  5. 24 saat sonra, ortamı 4 mL/kuyu taze bakım ortamı ile değiştirin.
  6. 96 saat sonra, enzim bazlı bir ayrışma reaktifi kullanarak hücreleri tek hücreli bir süspansiyon olarak toplayın. Raportör tahlili için bu hücreleri kullanın.

2. Sitotoksisite testi

  1. Ön test
    1. Tek hücreleri, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 200 μL taze bakım ortamı ile ECM kaplı 96 oyuklu bir plakada 2.0 × 10 4 hücre/kuyuda tohumlayın. Plakayı gaz geçirgen bir filmle kapatın.
    2. 24 saatte, ortamı 200 μL/kuyu taze bakım ortamıyla değiştirin ve plakayı gaz geçirgen bir filmle yeniden kapatın.
    3. 72 saatte, ortamı 100 μL/kuyu tahlil ortamı ile değiştirin ve plakayı gaz geçirgen bir filmle yeniden kapatın.
    4. 96 saatte, ortamı 100 μL/kuyu tahlil ortamı ile değiştirin.
      NOT: %100 birleşme sağlanamazsa, testi durdurun. Büyüme hızı hücre hattına göre değişebileceğinden, tahlil gününde tam birleşmeyi sağlamak için tohumlama yoğunluğunu optimize edin.
    5. Test kimyasalını tahlil ortamında maksimum çözünürlüğüne kadar çözün.
      NOT: Çözücü olarak dimetil sülfoksit (DMSO) kullanıldığında, nihai DMSO konsantrasyonu %0,1'i geçmemelidir.
    6. Adım 2.1.5'teki çözeltiyi kullanarak test kimyasalının tahlil ortamında beş noktalı, beş kat seri seyreltmesini hazırlayın.
    7. Adım 2.1.6'daki kimyasal çözeltilerden 11 μL/kuyu ekleyin. Araç kontrolü için, aynı DMSO konsantrasyonunu içeren 11 μL/kuyu tahlil ortamı ekleyin.
    8. 48 saat sonra plakaları 25 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    9. 25 °C'de 111 μL/kuyu önceden dengelenmiş ATP bazlı ışıldayan hücre canlılığı test reaktifi ekleyin. Boşluk için, 111 μL tahlil ortamı ve 111 μL reaktif içeren bir kuyu hazırlayın.
    10. Bir mikroplaka çalkalayıcı kullanarak plakayı 300 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    11. Lüminesans ölçümü için karışımın 200 μL'sini siyah bir plakaya aktarın. Plakaları 25 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    12. Hücre sayısını tahmin etmek için lüminesans yoğunluğunu ölçün.
    13. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını hesaplayın:
      Hücre canlılığı (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
      NOT: Hücre canlılığına göre sonraki adımları belirleyin. Test edilen tüm konsantrasyonlarda canlılık %>50 ise, maksimum çözünürlük konsantrasyonuyla Adım 2.2'ye geçin. Canlılık test edilen aralıkta %50'yi geçerse, canlılığı %>50 olan en yüksek konsantrasyonu kullanarak belirleme testine geçin. Tüm konsantrasyonlarda canlılık %<50 ise, daha düşük bir konsantrasyondan başlayarak ön testi tekrarlayın.
  2. Belirleme testi
    1. Tek hücreleri, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 200 μL taze bakım ortamı ile ECM kaplı 96 oyuklu bir plakada 2.0 × 10 4 hücre/kuyuda tohumlayın. Plakayı gaz geçirgen bir filmle kapatın.
    2. 24 saatte, ortamı 200 μL/kuyu taze bakım ortamıyla değiştirin ve plakayı gaz geçirgen bir filmle yeniden kapatın.
    3. 72 saatte, ortamı 100 μL/kuyu tahlil ortamı ile değiştirin ve plakayı gaz geçirgen bir filmle yeniden kapatın.
    4. 96 saatte, ortamı 100 μL/kuyu tahlil ortamı ile değiştirin.
      NOT: %100 birleşme sağlanamazsa, testi durdurun. 4. günde tam birleşmeyi sağlamak için tohumlama yoğunluğunu optimize edin.
    5. Test kimyasalını ön testin sonuçlarına göre tahlil ortamında çözün (Adım 2.1).
    6. Adım 2.2.5'teki çözeltiyi kullanarak test kimyasalının tahlil ortamında dokuz noktalı, iki kat seri seyreltmesini hazırlayın.
    7. Adım 2.2.6'daki kimyasal çözeltilerden 11 μL/kuyu ekleyin. Araç kontrolü için, aynı DMSO konsantrasyonunu içeren 11 μL/kuyu tahlil ortamı ekleyin.
    8. 48 saat sonra plakaları 25 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    9. 25 °C'de 111 μL/kuyu önceden dengelenmiş ATP bazlı ışıldayan hücre canlılığı test reaktifi ekleyin. Boşluk için, 111 μL tahlil ortamı ve 111 μL reaktif içeren bir kuyu hazırlayın.
    10. Bir mikroplaka çalkalayıcı kullanarak plakayı 300 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    11. Lüminesans ölçümü için karışımın 200 μL'sini siyah bir plakaya aktarın. Plakaları 25 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    12. Hücre sayısını tahmin etmek için lüminesans yoğunluğunu ölçün.
    13. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını hesaplayın:
      Hücre canlılığı (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
    14. Dokuz konsantrasyondan elde edilen verileri kullanarak bir doz-yanıt eğrisi oluşturun ve eğriden IC50'yi hesaplayın.

3. Gerçek zamanlı muhabir tahlili (Şekil 1B)

  1. Tek hücreleri, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 200 μL taze bakım ortamı ile ECM kaplı 96 oyuklu bir plakada 2.0 × 10 4 hücre/kuyuda tohumlayın. Plakayı gaz geçirgen bir filmle kapatın.
  2. 24 saatte, ortamı 200 μL/kuyu taze bakım ortamıyla değiştirin ve plakayı gaz geçirgen bir filmle yeniden kapatın.
  3. 72 saatte, ortamı 100 μL/kuyu tahlil ortamı ile değiştirin ve plakayı gaz geçirgen bir filmle yeniden kapatın.
  4. 96 saatte, ortamı% 100 ışıldayan substrat içeren 1 μL / kuyu tahlil ortamı ile değiştirin.
    NOT: %100 birleşme sağlanamazsa, testi durdurun. Büyüme hızı hücre hattına göre değişebileceğinden, 4. günde tam birleşmeyi sağlamak için tohumlama yoğunluğunu optimize edin.
  5. Test kimyasalını tahlil ortamında Bölüm 2'de belirlenen konsantrasyonda çözün.
  6. Adım 3.5'te hazırlanan çözeltiden başlayarak, test kimyasalının tahlil ortamında sekiz noktalı, iki kat seri seyreltmesini hazırlayın.
  7. Adım 3.4'teki ortam değişiminden iki saat sonra, Adım 3.6'daki kimyasal çözeltilerden 11 μL/kuyu ekleyin. Araç kontrolü için, aynı DMSO konsantrasyonunu içeren 11 μL/kuyu tahlil ortamı ekleyin.
  8. Kimyasal maruziyete başladıktan bir saat sonra (Adım 3.7), 2 ng/mL'lik nihai konsantrasyona bFGF içeren 12 μL/kuyu tahlil ortamı ekleyin.
  9. Nemlendirilmiş bir atmosfer altında gerçek zamanlı bir lüminesans ölçüm sistemi kullanarak 48 saat boyunca sürekli olarak lüminesansı ölçün, 37 °C'de %5CO2 .
    NOT: FGF ekleme noktasında 0 zamanını ayarlayın (bkz. Şekil 1B).

4. Veri analizi (Şekil 1C)

  1. Test grubunu araç kontrolüne normalleştirerek lüminesans yoğunluğunun log2 kat değişimini (LogFC) hesaplayın:
    LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle)
  2. Test ve araç kontrol grupları için eğriler (ABC) arasındaki alanı tahmin etmek için LogFC'yi 48 saatlik zaman serisi boyunca entegre edin.
  3. Test kimyasalının neden olduğu sinyal bozulmasının genel boyutunu ölçmek için tüm konsantrasyonlardaki ABC değerlerinin toplamı.
  4. Devtox sınıflandırması eşiğini belirlemek için alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrisi analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Deneyimlerimize göre, hücre morfolojisi, bir testin doğru yapılıp yapılmadığını belirlemek için yararlıdır. Şekil 2A , kimyasal maruziyetten hemen önce ve sonra hücrelerin tipik konfokal mikroskopi görüntülerini göstermektedir. Testin sonunda, kuyucukların neredeyse tüm yüzeyi hücrelerle kaplıdır. Şekil 2B , canlı/ölü hücre boyama görüntülerini göstermektedir. Propidyum iyodür (PI) ile boyanan ölü hücrelerin sayısı, kimyasal maruziyetten sonra artar; bununla birlikte, hücre canlılığı en az P'dir ve hemen hemen tüm hücreler kalsein-ile boyanır.

Tablo 1'de daha önceki çalışmalarımızda kullanılan test kimyasallarılistelenmiştir 7,8. Bu çalışmalar, Devtox kimyasallarının, insan iPS hücrelerinde FGF sinyalinin bozulmasına dayalı olarak gelişmiş doğrulukla ayırt edilebileceğini göstermektedir. Önemli bir bulgu, sinyal aktivitesinin sürekli izlenmesinin kritik olduğudur çünkü zaman içinde dinamik olarak değişir. Gerçek zamanlı lüminesans ölçüm sisteminin kullanılması, daha az ölçüm işçiliği ile önemli ölçüde daha yüksek zaman çözünürlüğü sağlar. Burada, gerçek zamanlı bir izleme sistemi kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Şekil 3A , test kimyasalı olmadan aynı koşullar altında altı kopya kuyuda 48 saat boyunca lüminesans yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir. Altı eğri neredeyse hizalıdır ve kuyudan kuyuya iyi tekrarlanabilirliği gösterir. Önceki çalışmalarımızda 24 saatlik manuel ölçümlerde net olarak tanımlanmamış olsa da, 48 saatlik gerçek zamanlı ölçümlerde iki farklı tepe noktası - FGF ligandı ilavesinden hemen sonra bir ilk tepe noktası ve yaklaşık 24 saatte ikinci bir tepe noktası - ortaya çıkar. Şekil 3B , iyi bilinen bir gelişimsel toksik madde olan valproik aside (VPA) maruz kaldığında lüminesans yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir. VPA, nöral tüpte, kalpte ve uzuvda kusurlara neden olan bir histon deasetilaz inhibitörüdür¹¹. VPA, FGF sinyalini konsantrasyona bağlı bir şekilde bozar. Otomatik gerçek zamanlı ölçüm sistemi, sinyal dinamiklerini manuel ölçümlerden daha doğru bir şekilde yakaladı.

figure-results-1
Şekil 1: FGF/SRF sinyal bozulma testi. (A) FGF/SRF sinyal raportör hücreleri oluşturmak için insan iPS hücrelerinin genetik mühendisliği. İnsan fosfogliserat kinaz promotörünün kontrolü altında serum yanıt elemanının aşağı akışında Nluc, hedeflenen nakavt için homolog kollar ve puromisin direnç geni içeren bir plazmit oluşturuldu. Puromisin seçimini takiben SRE-Nluc raportör hücreleri oluşturuldu. (B) Testin zaman çizelgesi. Raportör hücreler 96 oyuklu bir plakaya ekildi ve tüm yüzeyi kaplayacak şekilde 4 gün boyunca büyütüldü. Lüminesan substrat ve test kimyasalı, ölçüme başlamadan sırasıyla 3 ve 1 saat önce eklendi. FGF ligandı ekleme süresi 0 saat olarak ayarlandı ve lüminesans yoğunluğu takip eden 48 saat boyunca sürekli olarak ölçüldü . Sinyal dinamikleri, test kimyasallarına maruz kalan ve maruz kalmayan hücrelerde kaydedildi ve bir kimyasalın neden olduğu sinyal bozulmasının bir ölçüsü olarak eğriler arasındaki alanı tahmin etmek için araç kontrolüne normalleştirildi. Her kimyasal için farklı konsantrasyonlarda ABC değerleri elde edildi ve toplamları hesaplandı. Alıcı çalışma karakteristik eğrisi analizi, eşiği belirlemek için test edilen bilinen tüm gelişimsel toksik maddeler kullanılarak gerçekleştirildi. Kısaltmalar: iPS = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; RLU = Bağıl Işık Birimi; AUC = Eğrinin altındaki alan; FGF = fibroblast büyüme faktörü; SRF = serum yanıt faktörü; SRE = serum yanıt elemanı; HA = homolog kol; L = sol; R = sağ; PuroR = puromisin direnç geni; hPGK = insan fosfogliserat kinaz; Nluc = NanoLuc lusiferaz; ROC = alıcı çalışma karakteristiği; ABC = eğriler arasındaki alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hücre morfolojisi ve canlı/ölü hücre boyama. (A) Bir test kimyasalına maruz kalmadan önce (4. gün) ve sonra (6. gün) hücrelerin konfokal mikroskobik görüntüleri. Testten sonra kuyuların neredeyse tüm yüzeyini kaplayan kalan hücreler, başarılı bir test çalışmasının göstergesidir. Testin sonunda neredeyse tam kuyu kapsamı, başarılı bir çalışmayı gösterir. (B) Bir test kimyasalına maruz kalmadan önce ve sonra canlı/ölü hücre boyama. Canlı hücreler Calcein-ile yeşile, ölü hücreler propidyum iyodür (PI) ile kırmızıya boyandı. kalsein-(yeşil) ve ölü hücreler propidyum iyodür (PI, kırmızı) ile boyandı. Ölü hücrelerin oranı, toplam hücrelerin < P'sinden az olmalıdır. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Lüminesans yoğunluk dinamiğinin tipik örnekleri. (A) Zaman süreci lüminesansı, gerçek zamanlı bir lüminesans ölçüm sistemi kullanılarak ölçülen FGF ligand stimülasyonundan sonra lüminesansın zaman sürecini değiştirir. Lüminesans yoğunluğu 48 saat boyunca her 22 dakikada bir izlendi. Altı renkli çizgi, farklı kuyulardan gelen sinyalleri temsil eder. (B) Manuel ve gerçek zamanlı lüminesans ölçümlerinin valproik asit ile karşılaştırılması. Her iki ölçüm yönteminde de sinyal bozulması gözlemlenirken, gerçek zamanlı izleme, ikinci tepe noktasındaki gelişmiş sinyali daha net bir şekilde yakaladı. Kısaltmalar: RLU = Bağıl Işık Birimi; VPA = valproik asit; FGF = fibroblast büyüme faktörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Test KimyasalıKısaltmaCas NO.Hayvan çalışması
(önceki çalışma)		In vitro çalışma
(bu çalışma)		ABC değerlerinin toplamıMaksimum Konsantrasyon
(μg/mL)
all-trans-Retinoik asitATRA302-79-4PP65.90.0100
HidroksiüreHU127-07-1PP63.3149
Metoksiasetik asitMEMİŞ625-45-6PP225683
Metil cıva klorürMeHg115-09-3PP77.71.20
Metotreksat hidratMTX133073-73-1PP80.55.00
Sodyum salisilatSA54-21-7PP38.7666
Valproik asitVPA99-66-1PP63.3100
6-Aminonikotinamid6-BİR329-89-5PN24.91.00
Borik asitBA10043-35-3PN24.2250
5-Bromo-2'-deoksiüridinBrdU59-14-3PP83.950.0
5,5-Dimetil-2,4-oksazolidindionDMO695-53-4PP50.3840
Lityum klorürLiCl7447-41-8PN29.8250
5-Florourasil5-FU51-21-8PP92.42.65
Siklofosfamid monohidratEBM6055-19-2PN19.1400
İmatinib mesilatIMA220127-57-1PP42.412.5
LenalidomidLEN191732-72-6PP94.735.0
PomalidomidPOM19171-19-8PP50.92.50
TalidomidTHA50-35-1PP53.312.0
AkrilamidAcA79-06-01NN37.1454
D-KafurCAM464-49-3NN27.550.0
Difenhidramin hidroklorürDHM147-24-0NP68.2262
Dimetil pthalatDMP'nin131-11-3NN24.4100
Penisilin G sodyum tuzuPenG69-57-8NN22.11000
Sodyum sakarinSAC82385-42-0NN34.01000
AsetaminofenORTALAMA103-90-2NN22.320.0
Amoksisilin trihidratAMX61336-70-7NN28.425.0
SimetidinSANTİM51481-61-9NN25.330.0
EritromisinERY114-07-8NN20.015.0
HidroklorotiyazidHCTZ58-93-5NN21.920.0
SülfasalazinSSZ599-79-1NN30.8100
KimyasalAUCEşikDuyarlılıkÖzgüllüğüDoğruluk
30 madde0.81937.90.7780.9170.833

Tablo 1: Hayvan deneylerinde sınıflandırılan Devtox ve Devtox olmayan kimyasallar ve FGF sinyal kesintisi olan ve olmayan sonuçlar tahmin edilmektedir. Kısaltmalar: P = pozitif (Devtox); N = negatif (Devtox olmayan).

Tartışma

Embriyonik-fetal gelişim, sinyal ağları12 tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu ağlar içindeki geri bildirim, iç ve dış gürültüye karşı sağlamlık sağlarken, Devtox kimyasallarının bu tür tamponlamanın ötesinde etkiler gösterebileceğini varsaydık. Burada, FGF/SRF sinyallemesinin aşırı bozulmasına dayalı olarak Devtox kimyasallarını tahmin etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, bir kimyasalın hedef proteinleri gibi Devtox'tan sorumlu moleküler mekanizmalar hakkında herhangi bir bilgi sağlamaz ve yalnızca FGF/SRF sinyallemesine odaklanır. Bununla birlikte, Devtox kimyasallarını %83 doğruluk ve 0,819 AUC ile verimli bir şekilde sınıflandırmak mümkün olmuştur (Tablo 1). Bunun nedeni muhtemelen her bir sinyal yolunun diğerleriyle yakından ilişkili olması ve yoğun sinyal ağları oluşturması ve bu ağlardaki bozulmanın FGF/SRF sinyal bozulmasına neden olmasıdır.

Muhabir hücreleri oluşturulurken çeşitli teknik zorlukların ele alınması gerekir. Nluc, ateşböceklerinden veya Renilla'dan elde edilen geleneksel lusiferazlardan yaklaşık 100 kat daha parlaktır ve sinyal değişikliklerinin sürekli uzun süreli izlenmesine izin verir13. Sinyal aktivitesinin dinamiklerini daha doğru bir şekilde yakalamak için PEST dizisini içeren Nluc kullanıldı. PEST dizisi protein yıkımını teşvik eder. Nluc proteini 6 saatten fazla yarı ömürle stabil iken, PEST etiketi ubikuitin-proteazom yolu yoluyla bozunmayı hızlandırarak yarı ömrünü 10-30 dakikaya düşürür. Ayrıca, raportör gen, ekspresyonun susturulmamasını ve temel genlerin kazara bozulmamasını sağlayan genomik bir "güvenli liman" olan AAVS1 lokusuna düşürüldü14.

Test yöntemlerinin değerlendirilmesinde Devtox ve Devtox olmayan için referans kimyasalların seçilmesi çok önemlidir. ECVAM uluslararası doğrulama çalışmasındaki, ICH S5 kılavuzlarındaki (talidomid dahil) ve hayvan çalışmalarındaki listelerden referans kimyasalları seçtik7. 30 Devtox ve Devtox olmayan kimyasal listeledik, ancak güvenilir kaynaklardan daha fazla kimyasalın eklenmesi ve test edilmesi gerekiyor. Bu nedenle, burada bildirilen ROC eşiği (Toplam ABC = 37.9) ön hazırlık olarak kabul edilmelidir ve istatistiksel sağlamlığı sağlamak için daha büyük, bağımsız bir bileşik seti ile doğrulama gerektirecektir. Siklofosfamid (CPA), yanlış negatif sonuçları olan üç kimyasaldan biriydi. CPA karaciğerde 4-hidroperoksisiklofosfamide hidroksillenir ve CPA ve bozunma ürünleri teratojeniktir15. Yaklaşımımız da dahil olmak üzere in vitro tahliller tipik olarak metabolizmayı dikkate almaz ve metabolizma yoluyla Devtox'u indükleyen kimyasalları tespit edemez. Bu, önerilen yaklaşımın bir sınırlamasıdır. Metabolizmaya bağlı yanlış negatiflere (örneğin, CPA) ek olarak, difenhidramin hidroklorür (DHM) ile de yanlış pozitif gözlemledik. Epidemiyolojik kanıtlar, DHM ile konjenital malformasyonlar arasında nedensel bir ilişkiyi güçlü bir şekilde desteklememektedir, ancak birkaç in vitro çalışma onu gelişimsel bir toksik madde olarak sınıflandırmıştır; bu muhtemelen tahlilimizde yanlış sınıflandırılmasına katkıda bulunmuştur. Tersine, 6-aminonikotinamid (6-AN), FGF/SRF sinyalini bozmadı ve bu nedenle yanlış sınıflandırıldı, bu da gelişimsel toksisite mekanizmasının bu muhabir tarafından yakalanmayan yollardan ilerleyebileceğini düşündürdü. Birlikte, bu örnekler, hem yanlış pozitifleri hem de yanlış negatifleri azaltmak için ek gelişimsel sinyal yollarını içerecek şekilde tahlil panelinin genişletilmesini desteklemektedir.

Bu tahlil üzerinde birkaç faktörün önemli bir etkisi vardır. Böyle bir faktör, testten önce hücre hazırlığıdır. Bunu en aza indirmek için, tahlilde kullanılan hücrelerin aynı büyüme koşulları altında toplanmasını sağlamak için hücreler 7 günlük bir tekrar programında tutuldu. Hücreler Pazartesi günü ekilir, Perşembe günü geçirilir ve bir kısmı tahlil için kullanılır ve bir sonraki geçiş için tohumlanır. Diğer bir faktör, bir test kimyasalına maruz kalma anındaki hücre yoğunluğudur. Test, yalnızca hücreler kimyasala maruz kalma gününde %100 birleşmeye ulaştığında gerçekleştirildi. 96 oyuklu plakalardaki kenar etkileri iyi bilinmektedir. Bu tahlilde, kenar etkilerinden kaçınmak için 96 oyuklu plakanın sadece iç 60 kuyusu kullanıldı. Genel hususlara ek olarak, bir test sırasında teknik değişkenlik meydana gelebilir. Yaygın bir sorun, araç kontrol grubundaki kuyular arasında, eşit olmayan hücre tohumlaması veya optimal olmayan hücre kalitesinden kaynaklanmış olabilecek tutarsız lüminesans yoğunluğuydu. Bu değişkenliği en aza indirmek için hücrelerin yaklaşık %80 birleşme noktasında tutulmasını ve tohumlamadan sonraki gün kuyucuklarda tek tip büyümenin doğrulanmasını öneririz. iPSC tohumlama yoğunluğunun ayarlanması aynı zamanda testin tekrarlanabilirliğini de artırabilir. Ek olarak, aşırı hücre ölümü, deneysel sinyalle ilgisi olmayan spesifik olmayan lüminesans dalgalanmalarına yol açabilir. Bu nedenle, ölçüm sırasında hücrelerin uygun durumda olduğundan emin olmak için testin sonunda hücre morfolojisini değerlendirin. Manuel tahlillerde, plakanın her zaman noktasında inkübatörden çıkarılması, hücreleri sıcaklık ve CO2 seviyelerinde kısa değişikliklere maruz bırakır. Bu çevresel dalgalanmaları sınırlamak için ölçümler hızlı ve tutarlı bir şekilde yapılmalıdır.

Bu tahlil manuel olarak veya gerçek zamanlı bir ölçüm sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Manuel yaklaşım özel ekipman gerektirmez ancak gerçek zamanlı ölçüm sistemi, sinyal dinamiklerinin daha hassas bir şekilde algılanmasını sağlar. Manuel ölçümlerde tanımlanmamış olsa da, gerçek zamanlı ölçüm sistemi lüminesans sinyalinin iki tepe noktasını açıkça yakaladı. Manuel ölçümlerde, gece boyunca veri toplamada 12 saatlik bir boşluk meydana geldi ve bu da ikinci tepe noktasının hafife alınmasına veya kaybolmasına yol açmış olabilir. Bu iki tepe noktası, FGF sinyalinden gelen negatif geri beslemeden ve termal olarak kararlı bir FGF ligandının varlığından kaynaklanabilir. Özellikle, bir kimyasal tarafından FGF sinyal bozulmasının bazen ikinci tepe noktasında birinci tepe noktasından daha büyük olduğu görüldü (Şekil 3B).

Bu protokol, FGF sinyal bozulmasını nicel olarak değerlendirmek için insan iPSC tabanlı bir raportör tahlili kullanan Devtox kimyasal taraması için umut verici bir yaklaşımı temsil etmektedir. Son birkaç on yılda, fare embriyonik kök hücre testi (mEST)16, Hand1 tabanlı embriyonik kök hücre testi (Hand1-EST)17 ve ReProGlo18 dahil olmak üzere gelişimsel toksisite için çeşitli alternatif in vitro testler geliştirilmiştir. Bu geleneksel tahlillerle karşılaştırıldığında, bu yöntem üstün tahmin doğruluğu göstermiştir. Son yıllarda, hayvan dışı test sistemleri kurmaya yönelik uluslararası çabaların bir parçası olarak, insan embriyonik kök hücrelerini veya zebra balığı embriyolarını kullananlar gibi alternatif stratejiler uygulamaya konuldu. Bu yaklaşımlar ayrıca gelişimsel toksisite değerlendirmeleri için yüksek tahmin doğruluğu bildirmiştir. Bu testin performansını daha da iyileştirmek için, embriyonik gelişimde yer alan ek sinyal yollarının dahil edilmesi faydalı olabilir. Gelişimsel morfogenezde Wnt/β-katenin, BMP/SMAD ve Kirpi/GLI sinyallemesi19 gibi başka önemli sinyal yolları da vardır. Bu sinyal yollarını değerlendirmek için kullanılan farklı raportör hücre kombinasyonları, çeşitli kimyasalların daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayabilir. iPS hücrelerinin farklılaşma aşamasının, örneğin üç germ tabakasının oluştuğu en erken aşamanın, bu testin tespit duyarlılığı üzerindeki etkisi, gelecekteki araştırma konumuz olacaktır. Gelecekteki çalışmalar, bu türlerdeki in vivo veri kümeleriyle doğrudan karşılaştırmayı sağlamak için kemirgen veya tavşan kök hücre sistemlerini kullanarak türler arası doğrulamayı da keşfedebilirken, birincil odak noktamız insan alaka düzeyini en üst düzeye çıkarmak için insan iPS hücreleri olmaya devam ediyor.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma JSPS, Japonya [KAKENHI hibe numaraları 23K25021 ve 25K03278] tarafından desteklenmiştir; MHLW, Japonya [program hibe numaraları 23KD1003 ve 24KD1003]; KISTEC, Japonya; ve AMED, Japonya [hibe numaraları JP23mk0101252 ve 25mk0121314].

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Mikrosantrifüj TüpüFastGeneFG-MCT015CTest kimyasal hazırlığı
15mL santrifüj tüpüVIOLAMO1-3500-21Hücre kültürü
8-şeritli PCR TüpWatson137-333CTest kimyasal hazırlığı
96 Kuyu Beyaz/Şeffaf Alt Plaka, TC YüzeyiThermo Fisher Scientific165306Hücre kültürü ve lüminesans ölçümleri
Siyah Mikroplaka Düz Taban 96WellASONE3-3321-04Sitotoksisite testlerinde lüminesans ölçümü için
NEFES ALTOHOBERM-2000Gaz geçirimli sızdırmazlık filmi
CellTiter-Glo Lüminesans Hücre Yaşam TestiPromegaG7572Sitotoksisite testi
Santrifüj 5702 REppendorfSantrifüjleme
ClipTip 300, Filtreli, Steril, RackThermo Fisher Scientific94420513
ClipTip 50, Filtreli, Steril, RackThermo Fisher Scientific94420253
Countess 3 FL Otomatik Hücre SacıInvitrogenHücre sayımı
Kontes Hücresi Sayma Odası SlaytlarıInvitrogenC10312Hücre sayımı
Kültür Elbette DMSO FUJIFILM Wako031-24051Kimyasallar için çözücü
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako036-24023iPSC tohumlaması için ROCK inhibitörü
DMEM/F12 HEPES, fenol kırmızısı yokThermo Fisher Scientific11039-021iPS hücre kültürü için kaplama
F1-ClipTip Çok Kanallı Pipetler, 30'dan 300'e kadar ve mikro; LThermo Fisher Scientific4661180N
F1-ClipTip Çok Kanallı Pipetler, 5'ten 50'ye ve mikro; LThermo Fisher Scientific4661160N
Filtre çipiWatson
Geltrex LDEV-Serbest Azaltılmış Büyüme Faktörü Baz Zar MatrisiThermo Fisher ScientificA1413202iPS hücre kültürü için kaplama
HIENAI Mat 01RCOSMO BIYOGRAFİSİHMAT01RHücre kültürü işlenirken plaka sıcaklığı stabilitesini korumak için
HIENAI Tüp Isıtıcı GX01COSMO BIYOGRAFİSİTWGX013Deneysel taşıma sırasında ortamı sıcak tutmak için
İnsan Isı Stabil bFGF Rekombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0367Raporlayıcı testi için FGF uyarısı
İnsan İndüklenen Pluripotent Kök (iPS) Hücreleri201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)RIKEN BRC Hücre Bankası
Mikroplaka çalkalayıcıTAITEC0089532-000Sitosisite testi için plaka sallanma
Çok plakalı okuyucuPerkinElmerARVO X4Lüminesans ölçümü
Nano-Glo Endurazin Canlı Hücre SubstratıPromegaN2571Lüminesans altlığı
PBS (-) FUJIFILM Wako166-23555Hücre kulüteri
ParafilimBİR OLARAK65-1681-93Kaplama plakası için depolanır
PipettoEppendorf
WSL-1563 KronosHTATTO3510140Gerçek zamanlı lüminesans ölçüm sistemi 
DepoBMBioBM-0850-1
STEMdif APEL2 Medium STEMCELL TeknolojileriST-05275Analiz ortamı
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Bakım ortamı
Steril Su, Endotoksin IçermeyenFUJIFILM Wako196-15645iPS hücre kültürü için nem kontrolü
Doku Kültür Plakası VTC-P6VIOLAMO2-8588-01Hücre kültürü
TrypL Select Enzyme (1X), fenol kırmızısı yokThermo Fisher Scientific12563011Hücre kültürü
Valproik asitFUJIFILM Wako227-01071Test kimyasalı

Kaynaklar

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. DeSesso, J. M. Future of developmental toxicity testing. Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).
  3. Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches. Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).
  4. Vargesson, N. Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms. Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).
  5. van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report. Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).
  6. Kanno, S., et al. Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).
  7. Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).
  8. Kanno, S., et al. Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience. 25 (2), 103770(2022).
  9. Miano, J. M. Role of serum response factor in the pathogenesis of disease. Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).
  10. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  11. Paradis, F. -H., Hales, B. F. Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs. Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).
  12. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).
  13. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  14. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  15. Hales, B. F. Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein. Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).
  16. Genschow, E., et al. The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models. Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).
  17. Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro. Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).
  18. Uibel, F., et al. ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).
  19. Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. Editorial: Signaling pathways in embryonic development. Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lüminesans ÖlçümüHücre Canlılığı AnaliziKimyasal Toksisite TestiSeri DilüsyonFaz Kontrast Görüntüleme
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde fibroblast büyüme faktörü sinyal bozulmasının gerçek zamanlı izlenmesine dayalı gelişimsel toksisite testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.