Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Prostat Kanseri Organoidlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi: Ayrıntılı Bir Deneysel Protokol

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68912

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

Bu makalede

Özet

Prostat kanseri heterojenliği ve tedavi direnci zorluklar olmaya devam etmektedir. Temel ebeveyn tümör özelliklerini koruyan hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu standartlaştırılmış model, ilaç taramasını ve hassas tıptaki gelişmeleri destekler.

Özet

Prostat kanseri (PCa) oldukça heterojen bir malignitedir ve erkeklerde kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir ve tedavi direnci ve hastalığın ilerlemesini ele almada önemli klinik zorluklarla birliktedir. İki boyutlu (2D) hücre dizileri ve hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX'ler) gibi mevcut klinik öncesi modeller, tümör heterojenliği, androjen reseptörüne (AR) bağlı sinyalleşme ve mikroçevresel etkileşimler dahil olmak üzere PCa'nın karmaşıklığını aslına uygun olarak özetlemede sınırlamalara sahiptir. Bu boşluğu gidermek için bu çalışma, ebeveyn tümörlerinin genetik, fenotipik ve histolojik özelliklerini koruyan Hasta kaynaklı organoidlerin (PDO'lar) oluşturulması için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, hem lokalize hem de gelişmiş PCa'dan organoidlerin kültürlenmesini sağlayarak hastalık mekanizmalarını, ilaç yanıtını ve biyobelirteç keşfini incelemek için biyolojik olarak uygun bir model sağlar. Sonuçlar, protokolün yüksek verimli ilaç taraması ve hassas tıp uygulamalarıyla çeşitli klinik örneklerden organoidler üretme yeteneğini göstermektedir. Temel teknik zorlukları ele alan standartlaştırılmış bir iş akışı sunan bu çalışma, PDO'ların prostat kanseri araştırmalarını ilerletmek ve daha etkili terapötik stratejiler geliştirmek için çok yönlü araçlar olarak önemini vurgulamaktadır.

Giriş

Prostat kanseri (PCa), dünya çapında erkeklerde en sık görülen malignitelerden biri olmaya devam ediyor ve kansere bağlı ölümlerde akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer alıyor. Son epidemiyolojik çalışmalara göre, PCa'nın küresel insidansı istikrarlı bir şekilde artmaktadır ve yıllık yeni prostat kanseri vakalarının sayısının 2020'de 1,4 milyondan 2040'a kadar 2,9 milyona çıkacağı tahmin edilmektedir1. Erken teşhisteki ilerlemelere ve androjen yoksunluğu tedavisi (ADT) ve hedefe yönelik ajanlar dahil olmak üzere yeni tedavilerin geliştirilmesine rağmen, prostat kanseri, heterojen doğası ve özellikle ileri evrelerde tedavi direncinin kaçınılmaz gelişimi nedeniyle önemli bir klinik zorluk olmaya devam etmektedir2. ADT başarısızlığından sonra ortaya çıkan kastrasyona dirençli prostat kanseri (CRPC), kötü sağkalım sonuçları ve sınırlı tedavi seçenekleri ile karakterize hastalığın ölümcül bir formunu temsil eder3. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesini ve direncini yönlendiren moleküler mekanizmaları anlamak, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi ve hasta sonuçlarının iyileştirilmesi için çok önemlidir.

İnsan prostat kanserinin karmaşıklığını doğru bir şekilde taklit eden klinik öncesi modellerin geliştirilmesi, bu alandaki araştırmaları ilerletmek için kritik öneme sahiptir. Geleneksel 2D hücre kültürleri, yaygın olarak kullanılmasına rağmen, in vivo4'te gözlemlenen hücresel heterojenliği, tümör mimarisini ve mikro ortamı özetlemekte başarısız olur. Sonuç olarak, bu modellerin translasyonel faydası, özellikle tümör ilerlemesini, ilaç direncini ve kanser hücreleri ile tümör mikroçevresi arasındaki dinamik etkileşimleri incelemek için sınırlıdır5. Buna karşılık, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX'ler) ve organoid kültürler, geleneksel hücre dizileri ile klinik tümörler arasındaki boşluğu dolduran daha karmaşık araçlar olarak ortaya çıkmıştır 4,5,6.

Organoid kültür sistemleri kanser modellemesinde devrim yarattı. Bu üç boyutlu (3D) yapılar hasta dokularından türetilir ve orijinal tümörünhistolojik, genomik ve fenotipik özelliklerini koruyabilir 7,8,9,10. Daha da önemlisi, prostat kanseri organoidleri, AR sinyali, tedaviye direnç ve genomik kararsızlık dahil olmak üzere hastalık heterojenliğinin kritik özelliklerini korur ve bu da onları translasyonel araştırmalar için ideal araçlar haline getirir11. PDX modelleriyle karşılaştırıldığında organoidler daha uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve genetik manipülasyona uygundur, bu da yüksek verimli ilaç taramasını, biyobelirteç keşfini ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırır. Organoid platformlar, kolorektal, meme ve pankreas kanserleri dahil olmak üzere diğer malignitelerde umut verici sonuçlar göstermiş ve kişiselleştirilmiş onkoloji potansiyellerinin altını çizmiştir 4,12.

Bununla birlikte, prostat kanseri organoidlerinin (PCO'lar) oluşturulması ve sürdürülmesi benzersiz teknik zorluklar sunar. Prostat epiteli doğası gereği androjen sinyaline ve hücre dışı matris (ECM) desteğine bağımlıdır ve özel kültür koşulları gerektirir. Ayrıca, prostat kanseri, lokalize hormona duyarlı tümörlerden oldukça agresif, tedaviye dirençli CRPC'ye kadar çok çeşitli klinik davranışlar sergiler ve bu da tekrarlanabilir organoid sistemlerin gelişimini daha da karmaşık hale getirir11,12. PCO üretimine yönelik başarılı protokoller, doku işleme, enzimatik sindirim, ECM yerleştirme ve kritik büyüme faktörleri, hormonlar ve küçük moleküllerle takviye dahil olmak üzere temel adımları optimize ederek bu biyolojik karmaşıklıkları ele almalıdır. Bu tür protokoller, organoidlerin ebeveyn tümörlerine uygunluğunu sağlamak ve aşağı yönlü analizlerde uygulamalarını kolaylaştırmak için gereklidir.

Bu çalışmada, PDO'ların kurulması ve uzun süreli bakımı için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. İş akışımız, doku alımı ve biyopsi ve cerrahi örneklerin işlenmesinden organoid geçiş, kriyoprezervasyon ve resüsitasyona kadar tüm süreci kapsar (Şekil 1). Bu protokol, prostat kanseri dokularının fenotipik ve genomik bütünlüğünü korumak için optimize edilmiştir ve genomik profil oluşturma, ilaç yanıt testi ve fonksiyonel testler dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için uygun sağlam 3D kültür sistemleri sağlar. Özellikle yöntemimiz, organoid kültürde düşük başarı oranları, optimal olmayan büyüme ve sonraki geçişteki zorluklar gibi yaygın teknik engelleri ele alır ve standartlaştırılmış kılavuzlar sağlayarak laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırır.

Güvenilir prostat kanseri organoid modellerinin geliştirilmesi, hem temel hem de translasyonel araştırmalar için büyük önem taşımaktadır13. Bu sistemler, hastalık mekanizmalarını deşifre etmek, yeni terapötik hedefleri belirlemek ve bireysel hastalara özel hassas tıp yaklaşımlarını geliştirmek için güçlü bir platform sunar. Çalışmamız, mevcut teknik boşlukları ele alarak ve kapsamlı bir protokol sağlayarak, prostat kanseri araştırmalarında organoid teknolojisinin benimsenmesini hızlandırmayı ve bu zorlu hastalıkla mücadeleye yönelik küresel çabaları desteklemeyi amaçlamaktadır14.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma Wuxi No. 2 Halk Hastanesi Tıbbi Etik Kurulu tarafından incelendi ve onaylandı (Onay Numarası: Y-38 (2023)). Tüm katılımcılar yazılı bilgilendirilmiş onam formları sağladı. Etik standartlara uygun olarak mahremiyet korumasını sağlamak için hasta verilerinin kimliği gizlendi.

1. Örnek toplama

  1. Doku edinimi
    1. Numune almadan önce hazırlık
      1. Dahil Edilme Kriterleri: Tüm katılımcıların, patolojik veya görüntüleme muayenesiyle belirlenen, doğrulanmış prostat kanseri tanısına sahip olduğundan emin olun. Cerrahi rezeksiyon, biyopsi veya diğer klinik örneklerden tümör örnekleri elde edin. Prostat kanseri çalışmasında diğer kanserlerden kaynaklanan potansiyel etkileşimi dışlamak için tüm katılımcıların 18 yaşında veya daha büyük olduğundan ve başka herhangi bir malignitesi olmadığından emin olun. Tüm katılımcılardan çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onam alın ve örneklerinin bilimsel araştırma için kullanılmasına izin verin.
      2. Dışlama Kriterleri: Numuneleri kültür veya analiz için yeterli tümör dokusu içermeyen hastaları hariç tutun. Onamını geri çeken veya çalışma sırasında gerekli örnekleri sağlayamayan hastaları hariç tutun.
    2. Prostat çekirdeği iğne biyopsi örnekleri: Prostat dokusundan örnek almak için özel bir iğne kullanın. Dokuyu hemen koruma solüsyonuna (Gelişmiş DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) ortam + kaya önleyici solüsyon (1:2000 seyreltme)) yerleştirin ve 24 saat içinde teslimatı sağlayacak şekilde buz üzerinde laboratuvara taşıyın.
      NOT: Prostat kanseri dokusunu tam olarak hedefleyin ve farklı anatomik bölgelerde çok bölgeli örnekleme yapın. Saha başına 1-2 delik açın, her biri ≥ 1 cm'lik karot numunesi verin.
    3. Radikal prostatektomi numuneleri: Toplandıktan sonra numuneleri hızlı bir şekilde koruma solüsyonuna (adDMEM/F-12 ortamı + kaya inhibitörü solüsyonu (1:2000 seyreltme)) yerleştirin ve buz üzerinde taşıyarak 24 saat içinde laboratuvara teslim edilmesini sağlayın.
      NOT: Radikal prostatektomi15 ile daha fazla doku parçası elde edilebilir.
      Normal doku kontaminasyonunu en aza indirerek 1 g (≈ 5 mm çap) ≥ numuneler toplayın. Aşağıdakileri belirlemek için ameliyat öncesi klinisyenlerle koordinasyon sağlayın: 1) tümör çekirdeği; 2) peri-tümöral doku; 3) Normal kontrol. Gri-sarı renk değişikliği olan sert parçalara öncelik verin. Eğer yoksa, sistematik rastgele örnekleme uygulayın. Örnek toplama bilgileri için Tablo 1'e bakın.
  2. Örnek işleme
    1. Etiketleme ve sınıflandırma: Toplanan doku örneklerini (hasta adı, hastaneye yatış numarası, doku adı, doku bölgesi ve doku tipi dahil) açıkça etiketleyin.
    2. Kriyoprezervasyon: Doku örneklerini hemen işleyin (toplandıktan 12 saat sonra ≤). Numuneleri önceden soğutulmuş (4 °C) koruma solüsyonuna (adDMEM/F-12 ortam + kaya önleyici solüsyon (1:2000 seyreltme)) yerleştirin ve 4 °C'de saklayın. En iyi sonuçları elde etmek için 4-6 saat içinde daha fazla deneysel adıma geçin.
  3. Taşıma ve depolama
    1. Soğuk zincir taşıma: Doku örneklerinin düşük sıcaklık koşullarında laboratuvara nakledilmesi.
    2. Numune kaydı: Laboratuvara vardığınızda, hastanın temel kişisel bilgileri, doku tipi, adı ve numune alma yeri dahil olmak üzere numune bilgilerini ayrıntılı olarak doğrulayın ve kaydedin.
  4. Laboratuvar makbuzu ve denetimi:
    1. Numune incelemesi: Numuneleri bir biyogüvenlik kabininde açın ve herhangi bir kayıp, kontaminasyon veya görünür anormallik olup olmadığını kontrol edin.
    2. Örnek diseksiyon: Örneği çıkarın ve bir kültür kabına yerleştirin. Sonraki deneylerde kullanılmak üzere numuneyi küçük parçalara (yaklaşık 1-3 mm³) bölmek için doku makası veya neşter kullanın.

2. Deneysel prosedürler

  1. Primer doku hücre süspansiyonlarının hazırlanması
    1. Koruma: Toplanan doku bloklarını 50 mL'lik steril konik santrifüj tüplerine yerleştirin ve dokuların türlerine göre kategorize edildiğinden emin olun. Her tüpü uygun şekilde etiketleyin. Doku tamamen suya batana kadar her tüpe koruma solüsyonu (adDMEM/F-12 ortamı + kaya inhibitörü solüsyonu (1:2000 seyreltme)) ekleyin. Numuneleri daha sonraki işlemlere kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Doku tipleri hem tümörlü hem de tümörsüz dokuları içermelidir. Numune etiketleri tipik olarak tıbbi kayıt numarasını içermelidir.
    2. Doku ayırma: Sterilize edilmiş cımbız kullanarak prostat kanseri doku örneklerini orta büyüklükte bir kültür kabına aktarın. Kan ve kalıntıları gidermek için dokuyu 2-3 kez 2 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) ile yıkayın. Yağ dokusunu, kası ve diğer epitelyal olmayan bileşenleri ince uçlu cımbız kullanarak dikkatlice çıkarın ve yalnızca epitel bölgelerini koruyun. Daha sonra temizlenen dokuyu makasla yaklaşık 1-3 mm³ büyüklüğünde küçük parçalara ayırın.
      NOT: Epitelyal olmayan bileşenlerin tamamen çıkarılması, stromal veya yağ dokusunun kontamine edilmesi hücre izolasyonunun etkinliğini ve özgüllüğünü azaltabileceğinden, aşağı akış uygulamaları için kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal kontaminasyon riskini en aza indirmek için prosedür boyunca steril koşulları koruyun.
    3. Doku sindirimi: Hazırlanan doku parçalarını doku işleme tüplerine aktarın. Her tüpe tümör dokusu sindirim solüsyonunu (Tablo 2) ekleyin. Enzimatik-mekanik ayrışma için Orta Sert Doku Ayrışma Programını kullanarak sindirim cihazını (Tek hücreli süspansiyon hazırlama aparatı) etkinleştirin.
      NOT: Sindirim protokolü şu şekildedir: 200 rpm'de 3 sn ileri dönüş, 200 rpm'de 3 sn geri dönüş, 300 rpm'de 4 sn ileri dönüş, 300 rpm'de 4 sn geri dönüş, 600 rpm'de 5 sn ileri dönüş, 600 rpm'de 5 sn ters dönüş, 400 rpm'de 3 sn ileri dönüş, 400 sn boyunca 3 rpm'de ters dönüş. Bu dizi, üç kez tekrarlanması gereken bir döngü oluşturur. İlk iki döngüyü tamamladıktan sonra, yaklaşık 25 dakika boyunca 20 rpm'de yavaş dönüşle devam edin. Süre deneysel koşullara göre ayarlanabilir. Dokuları 37 °C'de 40 dakika ila 1 saat arasında sindirin.
    4. Sindirim sonlandırma: Enzimatik aktiviteyi sonlandırmak için hücre süspansiyonuna eşit veya çift hacimde FBS takviyeli adDMEM/F-12 ortamı ekleyin.
      NOT: Sindirilmemiş kalıntı kalırsa, süpernatanı toplayın, kalıntıya taze sindirim enzimleri ekleyin ve 37 °C'de 15-20 dakika daha sindirime devam edin. Süreci periyodik olarak izleyin ve her iki sindirim adımından hücre süspansiyonlarını birleştirin.
    5. Filtrasyon: 100 μm'lik bir hücre süzgecini 1 mL adDMEM/F-12 ortamıyla önceden ıslatın, ardından hücre süspansiyonunu filtreleyin. Doku işleme tüpünü ve hücre süzgecini kaya inhibitörü çözeltisi (1:2000 seyreltme) ile desteklenmiş 5 mL adDMEM/F-12 ortamı ile iki kez durulayın. Süzüntüyü 50 mL'lik steril konik bir santrifüj tüpüne toplayın. Süspansiyonu 70 μm süzgeçten geçirin ve tüm hücre süspansiyonlarını 50 mL'lik yeni bir tüpte toplayın.
      NOT: Filtrasyon adımlarının sayısı ve süzgeçlerin gözenek boyutu, numune özelliklerine göre ayarlanabilir.
    6. Kırmızı kan hücresi lizisi: Toplanan hücre süspansiyonunu 200 × g'da 5 dakika boyunca 25 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın, ardından hücre peletini 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu buz üzerinde 2-3 dakika inkübe edin.
      NOT: Kırmızı kan hücresi lizizi için inkübasyon süresi, lizisin etkinliğine bağlı olarak ayarlanabilir. Uzun süreli inkübasyon, hücre ölümünün artmasına neden olabilir. Diğer hücre tiplerine aşırı zarar vermeden kırmızı kan hücrelerinin tamamen parçalanmasını sağlamak için numunenin mikroskop altında izlenmesi önerilir.
    7. Lizisi sonlandırın: Hücre süspansiyonuna kaya inhibitörü çözeltisi (1:2000 seyreltme) ile desteklenmiş 6 mL adDMEM/F-12 ortamı ekleyin. Karışımı 15 mL'lik steril konik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 25 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini aynı takviyeli ortamla 1-2 kez yıkayın ve son hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne aktarın.
    8. Canlılık değerlendirmesi: 10 μL hücre süspansiyonunu eşit hacimde tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın ve mikroskop altında hücre canlılığını gözlemleyin.
      NOT: Önemli miktarda ölü hücre veya kalıntı gözlenirse, saymaya devam etmeden önce bunları çıkarmak için 25 °C'de 5 dakika boyunca 50 x g'da düşük hızlı bir santrifüjleme gerçekleştirin.
    9. Hücre sayımı: Peleti 1 mL adDMEM/F-12 ortamında yeniden süspanse edin, süspansiyonu gerektiği gibi seyreltin (tipik olarak 1:20 seyreltmede) ve hücreleri mikroskop altında saymak için seyreltilmiş süspansiyonun 6 μL'sini bir hemositometreye yerleştirin.
    10. Hücre peleti toplama: 200 x g, 25 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Son hücre peletini 1,5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne toplayın.

3. Birincil hücre süspansiyonlarından organoid oluşumu

  1. Tohumlama: Hücre sayısına göre gerekli matris jel hacmini belirleyin. Önceden soğutulmuş pipet uçlarını (-20 °C'de saklanmış) kullanarak, uygun hacimdeki matris jeli dikkatlice hücre peletine aktarın. Hücre-jel karışımını buz üzerinde nazikçe karıştırın, düzgün tohumlama ve optimum matris jel bütünlüğü sağlamak için hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin.
    NOT: Kullanmadan önce matris jeli gece boyunca 4 °C'de çözün. Erken jelleşmeyi önlemek için pipet uçları ve tüpler de dahil olmak üzere tüm taşıma aletlerinin önceden soğutulduğundan emin olun.
  2. Kaplama: Hücre matrisli jel karışımını, damla başına yaklaşık 30 μL uygulayarak, düşük yapışma özelliğine sahip 24 oyuklu bir kültür plakasına dağıtın. Etkili üç boyutlu (3D) yapı oluşumunu desteklemek için her damlanın 10.000'den fazla hücre içerdiğinden emin olun.
    NOT: Matris jelinin aşırı seyreltilmesinden kaçının. Yapısal bütünlüğü korumak ve 3D kültür oluşumunu desteklemek için matris jel, karışımın toplam hacminin %70'inden fazlasını oluşturmalıdır. İnsan biyopsisi ve prostatektomi örneklerinden türetilen organoidler, doğası gereği eşdeğerdir, öncelikle canlı hücre veriminde farklılık gösterir ve bu protokolde aynı tohumlama yoğunlukları uygulanmıştır.
  3. İnkübasyon: Kültür plakasını 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin 2 5 dakika boyunca %5CO2 ile matris jelin ön hazırlığın katılaşmasına izin verin. Plakayı ters çevirin ve matris jeli 3D formda tutmak için 20 dakika bekletin. Her kuyucuğa 800-1000 μL kültür ortamı (Tablo 3) ekleyin. Kültür ortamını 2-3 günde bir değiştirin.
    NOT: 3D yapıyı korumak için ters çevirme adımı sırasında matris jelin bozulmadığından emin olun.

4. Organoid geçiş

  1. Organoid toplama ve hazırlama: Önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak, organoid kümeleri parçalamak için matris jeli mekanik olarak bozun. Her kuyucuğu adDMEM/F-12 ortamı + kaya önleyici solüsyonla (1:2000 seyreltme) 1-2 kez durulayın. Parçalanmış kümeleri kültür ortamıyla birlikte 15 mL'lik steril konik bir santrifüj tüpüne aktarın. 25 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Organoidler 100 μm çapa ulaştığında (tipik olarak kültür günü 14'te). Aşırı orta hacim mekanik bozulmayı engelliyorsa, kümeleri parçalamadan önce ortamın bir kısmını aspire edin. Plaka yüzeyine yapışan artık matris jeli için, bir pipet ucu kullanarak hafifçe kazıyın ve adDMEM/F-12 ortamı + kaya inhibitörü solüsyonu (1:2000 seyreltme) ile 2-3 kez durulayın. Maksimum verim için tüm durulamalar ilk toplama ile bir araya getirilmelidir.
  2. Organoid ayrışma: Elde edilen peleti 2 mL önceden ısıtılmış rekombinant tripsin benzeri enzim çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Ayrışmayı başlatmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından 37 °C'de 15-30 dakika inkübe edin. Küçük hücre kümeleri (küme başına yaklaşık 5-6 hücre) alana hakim olana kadar her 5 dakikada bir mikroskop altında ayrışmayı izleyin, ardından bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Aşırı ayrışmayı önlemek ve hücre canlılığını korumak için sindirimin zamanında sonlandırılması çok önemlidir. Sık mikroskobik gözlem, sindirimin küme oluşumu için en uygun zamanda durdurulmasını sağlar.
  3. Sindirimi sonlandırın: Enzimatik aktiviteyi söndürmek için fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş eşit veya çift hacimde adDMEM/F-12 ortamı ekleyerek sindirimi sonlandırın. 25 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  4. Matris jelinin uzaklaştırılması: Peleti 2 mL hücre geri kazanım solüsyonu içinde yeniden süspanse edin ve artık matris jeli çözmek için 4 °C'de 20-40 dakika inkübe edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve artık matris bileşenlerini ortadan kaldırmak için yıkamayı adDMEM / F-12 ortamı ile iki kez tekrarlayın. Daha sonraki işlemler için son peleti 1,5 mL'lik steril bir Eppendorf tüpüne aktarın.
    NOT: Düşük sıcaklıkta inkübasyon, hücre bütünlüğünü korurken etkili matris jel depolimerizasyonu için kritik öneme sahiptir. Erken yeniden jelleşmeyi önlemek için soğuk ortamın dışında geçirilen süreyi en aza indirin.
  5. Tohumlama ve kültür: Adım 3.1-3.3'te açıklanan prosedürleri izleyerek ayrışmış organoid kümelerinin yeniden tohumlanmasına devam edin. Optimum 3D yapı reformu için uygun hücre yoğunluğunu ve matris jel oranını sağlayın.
    NOT: Organoid kriyoprezervasyon, çözülme, yeniden gömme ve histolojik işleme için ayrıntılı protokoller istek üzerine mevcuttur.

5. Organoid kriyoprezervasyon

  1. Organoid toplama: Kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak organoid hidrojel agregalarını mekanik olarak ayırın. Ayrışmış agregaları kültür ortamı ile birlikte 15 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kuyucukları adDMEM/F-12 ortamıyla 2-3 kez durulayın ve yıkamaları birincil süspansiyonla birleştirin. 25 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Maksimum verimi sağlamak için, organoid agregatları aşırı hasara neden olmadan nazikçe parçalayın. Toplama işlemi sırasında organoid kaybını azaltmak için tüm yıkamalar birincil toplama ile birleştirilmelidir.
  2. Enzimatik ayrışma: Konik bir tüp içindeki organoid pelete 2-4 mL önceden ısıtılmış rekombinant tripsin benzeri enzim çözeltisi ekleyin ve süspansiyonu hafifçe karıştırın. Süspansiyonu 37 °C'de 15-20 dakika inkübe edin. Ayrışma sürecini her 5 dakikada bir mikroskobik olarak izleyin.
    NOT: Gerekirse, daha büyük kümeleri daha küçük agregalara (küme başına yaklaşık 5-6 hücre) ayırmaya yardımcı olmak için hafifçe pipetleyin. Aşırı ayrışmayı ve hücre canlılığının kaybını önlemek amacıyla kriyoprezervasyon için daha kısa sindirim süreleri gereklidir. Sık gözlem, organoid bütünlüğü korumak için sindirimin uygun aşamada sonlandırılmasını sağlar.
  3. Sindirim sonlandırma: Enzimatik aktiviteyi durdurmak için eşit veya daha fazla hacimde FBS takviyeli adDMEM/F-12 ortamı ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Pelet artık matris jeli içermiyorsa, kriyoprezervasyon için adım 5.5'e geçin. Matris jel kontaminasyonu devam ederse, adım 5.4 ile devam edin.
  4. Matris jelinin çıkarılması (isteğe bağlı): Matris jeli çıkarmak için adım 4.4'te özetlenen prosedürü izleyin. Peleti 2 mL hücre geri kazanım solüsyonunda yeniden süspanse edin ve 4 °C'de 20-40 dakika inkübe edin. 4°C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve matris jelinin tamamen çıkarılmasını sağlamak için yıkama işlemini 1-2 kez tekrarlayın.
    NOT: Artık matris jelinin çıkarılması, yalnızca ayrışmış hücrelerin dondurularak saklanmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Jelin eksik çıkarılması, çözüldükten sonra organoidlerin canlılığını ve yapısal bütünlüğünü etkileyebilir.
  5. Kriyoprezervasyon: Eşit süspansiyon sağlamak için hücre peletini 1,5 mL organoid dondurma ortamında hafif pipetleme yoluyla yeniden süspanse edin. Süspansiyonu bir dondurarak saklama makinesine aktarın ve kısa süreli koruma için -80 °C'de saklayın. 24 saat sonra, uzun süreli saklama için şişeleri sıvı nitrojene aktarın.
    NOT: Hücre hasarına yol açabilecek düzensiz donmayı önlemek için kriyoprezervasyon ortamının hücrelerle iyice karıştırıldığından emin olun. Uzun süreli korumayı sağlamak ve hücre bozulmasını önlemek için şişeler kısa süreli saklama süresinden hemen sonra sıvı nitrojene aktarılmalıdır.

6. Organoid kurtarma

  1. Dondurularak saklanan organoidlerin çözülmesi: Organoid içeren dondurarak saklama şişelerini sıvı nitrojenden veya -80 °C'de depolamadan çıkarın. Şişeyi hemen 37 °C'lik bir su banyosuna daldırın ve içindekiler tamamen eriyene kadar hafifçe çalkalayın. Çözülme tamamlanır tamamlanmaz, organoid süspansiyonu önceden soğutulmuş (-20 °C) bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Kriyo kaynaklı hücre hasarını en aza indirmek için hızlı ve düzgün çözülme kritik öneme sahiptir. Transfer sırasında erken ısınmayı ve matris jel oluşumunu önlemek için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın.
  2. Kriyoprotektan çıkarma: Kriyoprotektan maddeyi kademeli olarak seyreltmek için konik tüpün duvarı boyunca dikkatlice 1-2 mL adDMEM/F-12 ortamı ekleyin. Ters çevirerek yavaşça karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Ani ozmotik kaymalar ve mekanik stres organoid canlılığı tehlikeye atabileceğinden, bu aşamada kuvvetli pipetleme veya vortekslemeden kaçının. Yavaş seyreltme yaklaşımı hücresel şoku en aza indirir.
  3. Yıkama ve Yeniden Süspanse Etme: Pelete 1 mL taze adDMEM/F-12 ortamı ekleyin. Erken matris jel yapışmasını önlemek için önceden soğutulmuş (-20 °C) bir pipet ucu kullanarak hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Yıkama sırasında düşük bir sıcaklığın korunması, matris jel bileşenlerinin termal kaynaklı yeniden birleştirilmesini önlemek için gereklidir, bu da sonraki organoid reformasyonunu engelleyebilir.
  4. Toplama: 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Artık kriyoprotektan ve kirletici maddelerin tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için yıkama adımını 2-3 kez tekrarlayın.
  5. Tohumlama ve kültür: Nihai hücre peletini deneysel ihtiyaçlara göre hazırlanan organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin. 3D yapının yeniden kurulmasını desteklemek için uygun matris jel oranını ve hücre yoğunluğunu sağlayarak, 3.1-3.3 adımlarında açıklanan protokolü izleyerek tohumlamaya devam edin.
    NOT: Çözülme sonrası hücre canlılığı ve iyileşmesi büyük ölçüde nazik kullanıma, kriyoprotektanların uygun şekilde seyreltilmesine ve destekleyici bir 3D matris jel ortamının derhal yeniden kurulmasına bağlıdır.

7. Organoid karakterizasyonu için ön analiz işleme

  1. Organoid hasadı: Organoid çapları 70-100 μm'ye ulaştığında agregaları mekanik olarak ayırın ve sonraki kültür için ortam içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kuyucukları adDMEM/F-12 ortamıyla 2-3 kez durulayın ve yıkamaları organoid süspansiyonla birleştirin. 25 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Küçük ölçekli koleksiyonlar için (örn. 1-2 kuyucuk), verimli kullanım sağlamak ve numune kaybını azaltmak için 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın. Ayrışma sırasında organoid yapıları bozmamak için dikkatli olun.
  2. Yeniden süspansiyon: Peleti 1 mL adDMEM/F-12 ortamında yeniden süspanse edin ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 25°C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Topaklanmayı önlemek ve sonraki adımlarda tek tip işlemeyi kolaylaştırmak için santrifüjlemeden önce peletin iyice yeniden süspanse edildiğinden emin olun.
  3. Yıkama ve sabitleme: Pelete 1 mL D-PBS ekleyin ve pipetleme veya ters çevirme yoluyla hafifçe karıştırın. 200 × g'da 5 dakika boyunca 25 °C'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve yıkama adımını 1-2 kez tekrarlayın. Peleti 1-2 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Artık ortamın ve diğer kirleticilerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için yıkama adımlarını dikkatlice gerçekleştirin. Paraformaldehitteki fiksasyon, sonraki analizler için organoid morfolojisini korumak için çok önemlidir.
  4. Fiksasyon Sonrası Yıkama: Numuneleri 200 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Sabit numuneleri 2-3 kez D-PBS ile yıkayın, yıkama tamponunun uygun şekilde dağılmasını sağlamak ve organoid kaybını önlemek için parmak hareketiyle veya hafifçe ters çevirerek hafifçe karıştırın.
    NOT: İmmünohistokimya gibi aşağı akış uygulamalarında fazla paraformaldehiti çıkarmak ve arka plan lekelenmesini azaltmak için fiksasyon sonrası uygun yıkama şarttır.
  5. Etanol Yeniden Fiksasyonu: Peleti 1 mL %70 etanol içinde yeniden süspanse edin, parmaklarınızı hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Bu aşamada etanol fiksasyonu, organoid bütünlüğün korunmasına ve numunelerin gömülmesi veya daha ileri işlemler için hazırlanmasına yardımcı olur. Düzensiz fiksasyonu önlemek için etanol içinde düzgün süspansiyon sağlayın.
  6. Matris jel klirensi (İsteğe bağlı): Pelet içinde artık matris jeli kalırsa, onu çıkarmak için adım 4.4'te açıklanan protokolü izleyin. Bu adım, peletin hücre geri kazanım solüsyonunda yeniden süspanse edilmesini ve 4 derecede 20-40 dakika inkübe edilmesini, ardından jelin tamamen çıkarılmasını sağlamak için santrifüjlemeyi ve çoklu yıkamaları içerir.
    NOT: Matris jelin çıkarılması, aşağı akış histolojik analiz veya görüntüleme için özellikle önemlidir, çünkü artık jel doku kesitleme ve analizine müdahale edebilir.
  7. Agaroz gömme: Organoid etanol fiksasyonu sırasında 96 °C'de eriterek yaklaşık 6 mL %2 agaroz hazırlayın. 100 μL eritilmiş agarozu organoid pelet ile karıştırarak minimum hava kabarcığı oluşumunu sağlayın. Karışımı bir kalıba aktarın, 4°C'de katılaştırın, ardından parafin gömme işlemini gerçekleştirin.
    NOT: Tıkanmayı önlemek için pipet uçlarını (uçları kesilmiş) önceden ısıtın. Agaroz gömme, organoid yapının korunmasını kolaylaştırırken, kolay kullanım ve kesit alma olanağı sağlar. Eşit gömme ve optimum doku kesitini sağlamak için karıştırma sırasında kabarcık oluşumunu önleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hasta kaynaklı prostat kanseri organoidlerinin morfolojik ve dinamik büyüme özellikleri
Hasta kaynaklı prostat kanseri organoidleri, klinik prosedürler sırasında toplanan taze tümör dokularından başarıyla oluşturulmuştur. İlk organoid oluşumu tipik olarak kültürden sonraki 5-7 gün içinde gözlendi (Şekil 2). Parlak alan mikroskobu altında organoidler, kompakt, iyi tanımlanmış sferoidler veya glandüler benzeri yapılar oluşturan farklı morfo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PCa için PDO'ların kurulması, klinik öncesi modellemede kritik bir ilerlemeyi temsil eder ve geleneksel 2D hücre kültürleri ve PDX'lere göre önemli avantajlar sunar16. Bu çalışmada sunulan yöntem, orijinal tümörün histolojik, genetik ve fenotipik özelliklerini aslına uygun olarak özetleyen organoidlerin üretilmesini sağlar. AR sinyali ve hücresel mimari dahil olmak üzere tümör heterojenliğini koruyarak, organoidler prostat kanseri ilerlemesini, tedavi direncini ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (Hibe No. 82172831) ve Jiangsu Eyaleti Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu'nun Temel Araştırma Projesi'nin (Hibe No. X20240121) desteğini minnetle kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Biyogüvenlik kabiniJinan Xinbeixi Biyoteknoloji Şirketi, Ltd
Hücre Kurtarma ÇözümüCorning354253
SantrifüjShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
Santrifüj tüpleriNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü BME, Tip 2R& D3533-005-02
Kültür kapları (24 kuyu düşük yapışma plakaları)termoNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
elektronik dengeNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Fetal Sığır SerumuGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi (37°; C, %5 CO2)Şanghay Hetian Bilimsel Enstrümanlar Şirketi, LtdHY-160SY
buz kutusuNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Orta Boyutlu Kültür Yemekleriabsinabs7005
N21-MAX Medya Takviyesi (50X)R& DAR008
N-AsetilsisteinSigmaA9165-5G
NikotinamidR& D3533-010-02
NorbosinInvivogenANT-NR-2
Pipet-yardımlı pipetleme cihazıNanjing Sıcak Noktası Bilimsel Enstrümanlar Şirketi, Ltd
PipetlerNanjing Sıcak Noktası Bilimsel Enstrümanlar Şirketi, Ltd
PrimocinInvivogenant-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Tek hücreli süspansiyon hazırlama cihazıRWDDSC-400
Mendil makasi/bistüriNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE EkspresiGibco126A04013
Tümör Dissosiyasyon Kiti, İnsanMiltenyi Biotec130-095-929
cımbızNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
su banyosuChangzhou Zhongjie Deneysel Enstrüman Üretim Şirketi, LtdHH-600
Y-27632 dihidroklorürR& D1254/10

Kaynaklar

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hasta Türevli OrganoidlerOrganoid KültürüTümör Dokusu SindirimiMatriks Jel GömmeOrganoid Bakımıİlaç TaramaHassas TıpAndrojen Reseptörü EkspresyonuBiyobelirteç Keşfi
Hasta Kaynaklı Prostat Kanseri Organoidlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi: Ayrıntılı Bir Deneysel Protokol
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.