Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Özet

Bu protokol, aksonal yaralanma sonrası nöronal metabolik dinamikleri modelleyen, görüntüleme, çoklu omik analiz ve içsel metabolik yeniden şekillenmenin mekanik çalışmalarını mümkün kılan bir mikroakışkan sistemi tanımlar.

Özet

Nöronlar, dendritler ve aksonlar oluşturmak için polarize olur ve hücreler arası iletişimi sağlar. Aksonal hasar bu bağlantıları bozar ve hasar sinyallerini somaya ileterek sıklıkla nöronal dejenerasyona yol açar. Bu nedenle, aksonal homeostazın sürdürülmesi, lokal akson rejenerasyonunu teşvik etmek ve nörodejenerasyona karşı koruma sağlamak için gereklidir. Bu süreç, enerji ve biyosentetik öncülleri sağlamak için hücresel metabolizmaya dayanır ve metabolik dengeyi düzenleyen ve yan ürünleri ortadan kaldıran mekanizmalar tarafından sürdürülür. Bununla birlikte, nöronal metabolizma soma ve akson arasında bölümlere ayrılır ve astrosit kaynaklı metabolik aktivite (örneğin, astrosit-nöron laktat mekiği) gibi çevredeki mikro ortamdan in vivo olarak daha fazla etkilenir. Bu faktörler, nöronların içsel metabolik mekanizmalarının araştırılmasını zorlaştırmaktadır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, burada, fizyolojik glikolitik akış ve mitokondriyal solunum dahil olmak üzere in vivo olarak gözlemlenen temel metabolik özellikleri koruyan, birincil kortikal nöronların in vitro kültürlenmesi için mikroakışkan bir platform geliştirdik. Bu sistem, aksonal yaralanmadan sonra nöronlarda içsel metabolik yeniden şekillenmeyi araştırmak için basitleştirilmiş bir model sağlar. Konvansiyonel mikroakışkan çipler in vitro aksonal yaralanma modellerini destekler ve canlı hücre görüntüleme, immünofloresan boyama ve hipoksi tedavisi ile uyumludur. Milyonlarca hücreyi içeren büyük ölçekli transkriptomik ve metabolomik analizlere uyum sağlamak için, optimize edilmiş operasyonel protokollere sahip yüksek verimli mikroakışkan çipler tasarladık ve ürettik. Cihaz, mikrokanallarla birbirine bağlanan dönüşümlü olarak düzenlenmiş soma ve akson odalarına sahiptir ve aksonal yaralanma, akson bölmesinden sıvının vakumla aspirasyonu ile indüklenir. Bu platform, metabolit ve enzim dinamiklerinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak çoklu omik araştırmaların doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini artırır.

Giriş

Nöronlar, gelişim ^1,2 sırasında polarizasyon yoluyla aksonlar ve dendritler olmak üzere özel işlevlere sahip iki farklı çıkıntı türü oluşturur. Sinir rejenerasyonu, merkezi sinir sistemi (CNS) onarımına odaklanan bir araştırma ile nöral yaralanma^3'ten sonra aksonal yeniden büyüme sürecini ifade eder. Periferik sinir sisteminden farklı olarak, CNS sınırlı rejeneratif kapasiteye sahiptir ^4,5,6, bu da genellikle omurilik yaralanmaları veya travmatik beyin yaralanmaları ^7,8 olan hastalarda kalıcı fonksiyonel bozukluklara veya kalıcı sakatlıklara neden olur. Bu nedenle, CNS onarımını geliştirmek için stratejiler geliştirmek ve aksonal rejenerasyonun altında yatan mekanizmaları aydınlatmak çok önemlidir.

Entegre, uygun maliyetli ve yüksek verimli in vitro kültür sistemleri olarak işlev gören mikroakışkan cihazlar, son yıllarda hücre ve nöron araştırmalarında dikkate değer avantajlar sergilemiştir ^9,10. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, mikroakışkan teknolojisi, sıvı kesme geriliminin, konsantrasyon gradyanlarının ve uzamsal yapıların hassas bir şekilde düzenlenmesini sağlar, böylece hücre büyümesini, göçünü, farklılaşmasını ve etkileşimlerini teşvik etmek için otantik fizyolojik ve patolojik mikro ortamları yakından simüle eder 11,12,13,14. Mikroakışkan tabanlı in vitro aksonal yaralanma modelleri, uzamsal polarizasyon yoluyla nöronal hücre gövdelerinin ve süreçlerinin bölümlere ayrılmış kültürünü mümkün kılarak, nöronların içsel rejeneratif kapasitesini ve yaralanma^{15,1 6,17,18} sonrası metabolik adaptasyonlarını keşfetmek için vazgeçilmez bir araç sağlar. Nöronların yaralanmaya nasıl tepki verdiğine, metabolik süreçleri nasıl düzenlediğine¹⁹ ve aksonal rejenerasyonu²⁰ nasıl desteklediğine dair kritik bir pencere sağlar. Bununla birlikte, aksonal yaralanma ve metabolik araştırmalara yönelik mevcut mikroakışkan platformlar, düşük nöronal hücre verimi, metabolik ölçümlerde doğruluğun azalması ve standartlaştırılmış operasyonel prosedürlerin eksikliği gibi zorluklarla hâlâ karşı karşıyadır.

Bu sınırlamalara yanıt olarak, bu çalışma, aksonal hasarın standartlaştırılmış, yüksek verimli indüksiyonunu sağlayan ve bölümlere ayrılmış multi-omik analizler için yeterli hücre materyali sağlayan yeni bir büyük ölçekli mikroakışkan platform geliştirdi. Bu entegre tasarım, nöral yaralanma araştırmalarında karşılanmamış kritik ihtiyaçla doğrudan yüzleşmektedir. Spesifik olarak, tasarladığımız mikroakışkan çip, kontrollü vakum aspirasyonu yoluyla aksonal transeksiyon ile mikro oluklarla birbirine bağlanan somal ve aksonal odaların alternatif bir düzenlemesine sahiptir. Bu yaklaşım, aksonal rejenerasyonun altında yatan metabolik mekanizmaların araştırılması gibi tekrarlanabilir, yüksek verimli aksonal yaralanma modelleri ve hassas metabolik profilleme gerektiren çalışmalar için idealdir. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında bu teknik, daha yüksek verim, daha fazla metabolik hassasiyet ve standartlaştırılmış yaralanma modelleri oluşturma yeteneği sunar. Örneğin, önceki çalışmalar aksonal rejenerasyonda mitokondriyal taşımanın önemini göstermiştir 20,21,22,23, oysa platformumuz yaralanma sonrası aksonal rejenerasyonda glikoz metabolizmasının rolünü daha da ortaya koymaktadır. Bu protokol, büyük ölçekli aksotomi ve metabolik analiz için hem görsel olarak doğrulanabilir hem de operasyonel olarak standartlaştırılmış teknik bir sistem kurar.

Protokol

Tüm deneyler Beihang Üniversitesi Etik Kurulu'nun yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve komite tarafından onaylandı (onay kodu: BM20210060). Şekil 1 , deneysel zaman çizelgesini özetlemektedir.

1. Geleneksel ve büyük ölçekli mikroakışkan cihazın tasarımı

1. İki boyutlu (2D) şemalar ve üç boyutlu (3D) yapısal modeller oluşturmak için AutoCAD kullanarak mikroakışkan cihazı tasarlayın.
2. SU-8 negatif fotolitografi ile silikon levha üzerinde bir ana kalıp üretmek için bu tasarımları kullanın.
3. Polidimetilsiloksan (PDMS) dökerek ana kalıbı çoğaltın, böylece yüksek hassasiyetli, işlevsel bir mikroakışkan çip elde edin.
4. Her bir mikrokanalı 5 μm yüksekliğinde olacak şekilde tasarlayın, somaları bloke ederken sadece aksonların geçmesine izin verin.
5. Aksonal kapasiteyi artırmak için mikro kanalları 10 μm genişliğinde yapın.
6. Odaları 120 μm yüksekliğinde ve 220 μm genişliğinde olacak şekilde tasarlayın ve nöronal soma için yeterli alan sağlayın.
7. Sıvı akışını ve nöron yerleşimini kontrol ederek in vivo aksonal hasarı simüle etmek için bu mikroakışkan platformu kullanın.
8. Yüksek hassasiyetli hücre manipülasyonu için cihazı kullanarak metabolomik ve transkriptomik numuneler hazırlayın ve numune doğruluğunu ve biyolojik geçerliliği iyileştirmek için yüksek verimli işlemeyi etkinleştirin.

2. Geleneksel ve büyük ölçekli mikroakışkan cihazların imalatı

1. PDMS bazını ve kürleme maddesini 10:1 (a/a) oranında tartın ve bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
2. PDMS karışımını içeren santrifüj tüpünü santrifüjlü bir karıştırıcı karıştırıcıya yerleştirin. Karıştırmak için 2000 × g'da 4 dakika santrifüjleyin, ardından gazdan arındırmak için 2000 × g'da 4 dakika tekrar santrifüjleyin.
3. Gazdan arındırılmış PDMS'nin 13-15 g'ını mikroakışkan kalıba dökün ve kalıbın tabanının tamamen kaplandığından emin olun.
4. Kalıbı vakumlu kurutucuya yerleştirin. PDMS'deki kabarcıkları tamamen gidermek için havayı 5-10 dakika boşaltmak için bir vakum pompası kullanın.
5. Kalan yüzey kabarcıklarını kırmak için PDMS'nin yüzeyine hafifçe vurmak için lastik bir ampul kullanın.
6. Kalıbı konveksiyonlu bir fırına yerleştirin ve PDMS'yi sertleştirmek için 80 °C'de 100 dakika pişirin.
7. PDMS tamamen sertleştikten sonra, dikkatlice kaldırmak ve kalıptan ayırmak için bir neşterin ucunu PDMS'nin kenarının altına hafifçe kaydırın.
8. Kültür ortamı infüzyonu ve hücre yüklemesi için PDMS'de delikler oluşturmak için 2.0-2.5 mm çapında bir biyopsi zımbası kullanın.
9. Yapışkan bant kullanarak PDMS'deki yüzey kirlerini temizleyin, ardından temiz bir cam kaba koyun ve saklamak için alüminyum folyo ile sarın.
10. (İsteğe bağlı) PDMS yüzeyine oksijen plazması (30 W, 20 s) uygulayın ve ardından geri dönüşü olmayan yapışma için başka bir yüzeye bastırın.
11. Deneyden önce, steriliteyi sağlamak için mikroakışkan cihazı 121 °C ve 101 kPa'da 5 dakika otoklavlayın.

3. Kortikal nöronların hazırlanması

1. 3 doğum sonrası Sprague-Dawley (SD) sıçanını (doğumdan sonraki 12 saat içinde) 5 dakika boyunca buza koyarak uyuşturun, ardından hızla başını kesin.
2. Serebral korteksin motor alanını inceleyin ve dokuyu önceden soğutulmuş diseksiyon tamponuna yerleştirin (ör., kalsiyum ve magnezyum içermeyen 2 mL HBSS).
   NOT: Tüm doku diseksiyon prosedürlerini önceden soğutulmuş solüsyonlar kullanarak buz üzerinde gerçekleştirin.
3. Steril makas kullanarak dokuyu yaklaşık 1 mm³ parçaya bölün ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
4. 5 dakika bekletin ve ardından kalan kanı ve tamponu çıkarmak için süpernatanı dikkatlice aspire edin.
5. 37 °C'ye ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içeren 5 mL HBSS'ye önceden ısıtılmış papain solüsyonunu (1 mg/mL) ekleyin.
6. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöründe 40 dakika inkübe edin, tüpü her 10 dakikada bir 3 kez hafifçe ters çevirin.
7. Sindirimden sonra, süspansiyonu 200 μL'lik bir pipet kullanarak 100 kez hafifçe öğütün.
   NOT: Hücre stresini önlemek için hava kabarcıkları vermekten kaçının.
8. 300 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
9. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mg/mL proteaz inhibitörü içeren bir sonlandırma solüsyonu ekleyin (örneğin, kalsiyum ve magnezyum içeren 5 mL HBSS içinde 600 μL papain ayrışma sistemi kiti inhibitör şişesi).
10. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve süzüntüyü yeni bir santrifüj tüpünde toplayın.
11. Süzüntüyü 200 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
12. Peleti, %2 B27 ve %1 GlutaMAX içeren 500 μL tam nöronal kültür ortamında yeniden süspanse edin.
13. Hücreleri sayın (yaklaşık 3 milyon/sıçan) ve sonraki kullanım için yoğunluğu 1 × 10⁶ hücre/mL'ye ayarlayın.

4. Kaplama

NOT: Nöron yapışmasını iyileştirmek ve nöronal büyüme için en uygun ortamı yaratmak için lameller veya kültür kaplarına poli-D-lizin (PDL) çözeltisi uygulayın.

1. Lamellerin kaplanması
   1. Geleneksel mikroakışkan cihazlar için tasarlanmış bir lamel (Φ25 mm, kalınlık 0.17 mm) 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve 2 mL 0.1 mg / mL PDL çözeltisi ekleyin.
   2. 37 °C'de 6 saat veya gece boyunca inkübe edin.
   3. İnkübasyondan sonra, yeniden kullanım veya uygun şekilde imha etmek için PDL solüsyonunu dikkatlice alın.
   4. Kaba 2 mL steril ultra saf su ekleyin ve saat yönünde 50 kez, ardından saat yönünün tersine 50 kez döndürün (birden fazla tabak için, bunları aynı anda daha büyük bir kapta döndürün).
   5. Steril bir pipet ucuna bağlı bir vakum pompası kullanarak suyu aspire edin ve atıkları sıvı atık kabında toplayın.
   6. Yıkama prosedürünü (adım 4.1.4-4.1.5) toplamda üç kez tekrarlayın.
   7. Kullanmadan önce lamellerin bir biyogüvenlik kabininde doğal olarak kurumasını bekleyin.
2. Kültür kabı kaplaması
   1. Kültür kabına veya kuyucuk plakasına uygun miktarda 0,1 mg/mL PDL çözeltisi ekleyin (örneğin, geleneksel mikroakışkanlar için 35 mm'lik bir kaba 2 mL ve büyük ölçekli mikroakışkanlar için 10 cm'lik bir kaba 5 mL ekleyin).
      NOT: Kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kabininin steril hava akışıyla düzgün çalıştığından emin olun.
   2. Çözeltinin tabanı tamamen kapladığından emin olun ve 37 °C'de 6 saat veya gece boyunca inkübe edin.
   3. PDL çözeltisini geri kazandıktan sonra, kültür kabını adım 4.1.4'te açıklandığı gibi uygun miktarda steril ultra saf su ile üç kez yıkayın.
   4. Kalan ultra saf suyu çıkarın ve kültür kabını daha sonra kullanmak üzere laminer akışlı bir başlıkta havayla kurutun.

5. Nöronal ortamın hazırlanması

1. Rutin nöron kültürü için tüm ortamı hazırlayın.
   1. Pistonu tek kullanımlık 50 mL'lik bir şırıngadan çıkarın. Şırıngayı lastik başlığı yukarı bakacak şekilde biyogüvenlik kabini içindeki temiz bir tezgahın üzerine yerleştirin.
   2. Şırıngaya sırayla 500 μL penisilin streptomisin (PS), 1 mL B27, 125 μL GlutaMAX ve 500 μL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her bileşen için pipet ucunu değiştirin.
      NOT: Tutarlılığı korumak için her bileşeni belirtilen sırayla ekleyin.
   3. Yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpü alın. "Nörobazal-A (NBA) + %2 B27 + %0.25 GlutaMAX + %1 FBS + %1 PS" olarak etiketleyin.
      NOT: Embriyonik nöronlar değilse NBA kullanın; embriyonik nöronlar için nörobazal (NB) kullanın.
   4. Şırınganın ucuna 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi takın.
      NOT: Sızıntıyı önlemek için filtrenin şırıngaya sıkıca bağlandığından emin olun.
   5. Şırıngayı katkı maddelerinin hacmi de dahil olmak üzere 50 mL'ye kadar sıvıyla doldurmak için NBA'yı kullanın. Pistonu yeniden takın.
   6. Sıvıyı etiketli santrifüj tüpüne filtrelemek için pistonu yaklaşık 2 mL/s hızla yavaşça itin.
   7. Santrifüj tüpünün kapağını sıkın. Ortamı karıştırmak için tüpü 3-5 kez ters çevirin.
2. [^U-13C₆]-glikoz içeren tam ortam (metabolik akış analizi için): Hasarlı nöronlarda glikoz metabolizmasının metabolik akış analizi için, [^U-13C₆]-glikoz içeren tam bir ortam hazırlamak için şekersiz NBA kullanın.
   1. Baz çözelti olarak glikoz içermeyen NBA kullanın ve filtrasyondan önce 25 mM'lik bir son konsantrasyona [U-13 _C 6]-glikoz ekleyin ([^U-13C₆]-glikoz katı ise, önceden hesaplayın ve tartın). Bölüm 5.1'de açıklandığı gibi filtreleme ve karıştırma adımlarının yanı sıra diğer bileşenleri eklemek için aynı sırayı izleyin.

6. Hücre sayımı

1. Hemositometreyi %75 etanol ile iyice silin. Devam etmeden önce tüm yüzeylerin tamamen kuru olduğundan emin olun.
2. 1,5 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne 90 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ekleyin.
3. Toplanan nöronal hücre süspansiyonunu, iyice karışmasını sağlamak için 3-5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça yeniden süspanse edin.
4. 10 μL'lik bir pipet kullanarak, 10 μL karışık hücre süspansiyonunu 90 μL PBS (1:10 seyreltme) içeren santrifüj tüpüne aktarın.
5. Çözeltiyi 10 kez hafifçe karıştırmak için 200 μL'lik bir pipet kullanın ve kabarcık oluşmadığından emin olun.
6. Pipet ucunu yeni bir 10 μL uçla değiştirin. Karışımdan 10 μL çekin ve hemositometrenin numune odasına ekleyin.
7. Hemositometreyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve 20x objektifi kullanarak odaklanın. Merkezi 4 × 4 ızgarayı bulun ve standart hemositometre kurallarına göre 16 karenin tamamındaki hücreleri sayın.
8. 16 karenin tamamından toplam hücre sayılarını kaydedin. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın: (Toplam sayı 10×) × 10⁴ hücre/mL.
   NOT: Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir biyogüvenlik kabininde çalışın.

7. Konvansiyonel veya büyük ölçekli mikroakışkan cihazlarda kortikal nöronların in vitro kültürü

1. Protokol A (Konvansiyonel mikroakışkan cihazlar).
   1. 35 mm'lik kültür kabındaki cam yüzeyin tamamen kuru olduğunu doğrulayın.
   2. Steril ince uçlu forseps kullanarak, otoklavlanmış mikroakışkan çipi, mikro kanallar aşağı bakacak şekilde cam yüzeyin ortasına yerleştirin.
   3. Tam yapışmayı sağlamak için çipi 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak cam yüzeye hafifçe bastırın.
   4. Soma bölmesini belirtmek için kalıcı bir işaretleyici kullanarak sol bölmeyi bir nokta (·) ile işaretleyin.
   5. 10 μL'lik bir pipet kullanarak 10 μL nöronal süspansiyonu (10 milyon hücre/mL) aspire edin.
   6. Süspansiyonu işaretli soma bölmesinin üzerindeki yükleme portuna yavaşça dağıtın.
   7. Sol bölmenin alt rezervuarına uygun sıvı akışını onaylayın.
   8. Kültür kabını 20 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO₂) aktarın.
   9. Kültür kabını inkübatörden çıkarın.
   10. 20 × faz kontrastlı bir mikroskop kullanarak, mikrokanallar aracılığıyla soma bölmesinden aksonal bölmeye ortam perfüzyonunu doğrulayın.
   11. Aksonal bölmenin (sağ oda) üst portuna 150 μL nöronal bazal ortam ekleyin ve alt rezervuara yerçekimi kaynaklı akışa izin verin.
   12. Benzer şekilde, soma bölmesinin (sol oda) üst portuna 15 μL tam nöronal ortam ekleyin.
       NOT: Bu aşamada, nöronlar gözle görülür şekilde yapışmalı ve çoğu hücre kalıntısı alt kuyuya atılmalıdır. Kültür sırasında ortamı değiştirmeyin; Adım 5.1.3'te açıklandığı gibi tek bir tam nöronal ortam ilavesi kullanın.
   13. Bir nem odası oluşturmak için 150 mm'lik bir kültür kabına 20 mL ultra saf su dökün. 35 mm'lik kültür kabını büyük kabın içine yerleştirin.
   14. Tüm kültür sistemini inkübatöre aktarın ve gerekli süre boyunca (örn. 7 gün) muhafaza edin.
       NOT: Tüm hücre kültürü prosedürlerini bir biyogüvenlik kabininde steril koşullar altında gerçekleştirin. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü ve eldiven) kullanın. Prosedürlerden önce ve sonra çalışma yüzeylerini dekontamine edin.
2. Protokol B (Büyük ölçekli mikroakışkan çipler).
   NOT: Geleneksel spesifikasyonların standart protokolü iki değişiklikle takip edildi.
   1. Cihaz yerleşimi için 10 cm'lik bir Petri kabı kullanın.
   2. Her yöntem farklı aksonal yaralanma protokolleri gerektirdiğinden, deneysel ihtiyaçlara göre tam kanal veya aralıklı kanal tohumlamayı seçin.
   3. Tohumlama tamamlandıktan sonra, nöron büyümesini sürdürmek için 10 cm'lik Petri kabına 5 mL tam nöron kültürü ortamı ekleyin.
   4. Bir nem odası oluşturmak için 150 mm büyüklüğünde bir kaba 20 mL ultra saf su ekleyin. Ardından 10 cm'lik tabağı büyük tabağın içine yerleştirin.
   5. Adım 7.1.14 ile aynı.

8. Konvansiyonel mikroakışkan cihazlarda in vitro aksonal yaralanma modelinin oluşturulması

1. Mikroakışkan cihazın sol tarafını somal bölme ("·" işaretiyle gösterildiği gibi) ve sağ tarafını aksonal terminal bölmesi olarak işaretleyin.
2. Kortikal nöronları somal bölmeye tohumlayın.
3. Nöronları in vitro olarak 7. güne (DIV7) kadar kültürleyin ve aksonların mikrokanallardan aksonal terminal bölmesine uzanmasına izin verin.
4. DIV7'de, bir in vitro aksonal yaralanma modeli oluşturmak için aksonal terminal bölmesinde aksonal yaralanma prosedürleri gerçekleştirin.
5. Uygun miktarda NBA ortamı alın ve daha sonra kullanmak üzere 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
6. Belirtilen süre boyunca mikroakışkan cihazdaki kortikal nöronları kültürleyin. Ardından cihazı temiz bir tezgaha aktarın.
7. 35 mm'lik kültür kabının altını kurutmak için tüy bırakmayan kağıt kullanın. Ortamı mikroakışkan cihazın sağ tarafındaki iki delikten aspire etmek için 200 μL'lik bir pipet kullanın.
8. Vakum pompası hortumunu steril, filtresiz 200 μL'lik bir pipet ucuna bağlayın, vakum pompasını açın (emme hızı 60 L/dak) ve ucu akson terminal odasının alt deliği ile eski ortamı aspire etmek için hazne arasındaki bağlantı noktasına doğrultun (bu noktada, aksonlar negatif basınç nedeniyle kırılır).
9. 200 μL'lik pipet ucunu yerine takın ve 150 μL NBA çekin, sağ haznenin alt deliğinden yavaşça ekleyin.
   NOT: Sıvı akışı çok yavaşsa ve kabarcıklar oluşuyorsa, hazneyi hızla doldurmak için sıvıyı uçtan hızla dışarı atın.
10. Sıvı ilavesi için sağ taraftaki iki deliği dönüşümlü olarak kullanın: her NBA ilavesinden sonra, aksonları kesmek için diğer delikten sıvıyı aspire etmek için hemen vakum pompasını kullanın. Bu işlemi 4 kez tekrarlayın ve son aspirasyondan sonra taze tam nöronal ortamla değiştirin.
11. Eski ortamı hücre gövdesi yan deliğinden aspire edin ve ilaç içeren taze tam nöronal ortam ekleyin (gerekirse).
12. Mikroakışkan cihazı kültür kabı ile birlikte 150 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve belirtilen süre boyunca (örn. 24 saat) kültürlemeye devam edin.
    NOT: Akson hasarı operasyonu NBA ortamı gerektirir, çünkü nöronal tam ortam ayırma etkisini etkileyen kabarcıklar üretecektir.

9. Büyük ölçekli mikroakışkan cihaz aksonal yaralanması

1. Yöntem 1: Manuel aksonal yaralanma.
   1. Nöronları mikroakışkan cihazın tüm odalarına tohumlayın.
   2. Cihazı 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %5_CO2 ile üç gün inkübe edin, ardından tüm mikroakışkan cihazı çıkarın.
      NOT: Mikrokanallara büyüyen aksonların mekanik stresini veya yırtılmasını önlemek için, mikroakışkan cihazı DIV7 yerine DIV3'te çıkarın. Bu, deneysel tasarım hasarsız bir kontrol grubu içeriyorsa özellikle önemlidir.
   3. DIV7'de, mikroakışkan cihazı içeren kültür kabını inkübatörden çıkarın ve steril bir sahneye yerleştirin.
   4. 20x büyütmeli bir mikroskop hazırlayın ve çalışma alanını %75 etanol ile sterilize edin.
   5. 10 μL'lik steril filtrelenmiş bir pipet ucu tutun ve mikroskop rehberliğinde orijinal mikro kanallardaki akson demetlerini tanımlayın.
   6. Pipet ucunu kullanarak her akson demeti boyunca uzunlamasına çizikler yapın.
   7. Çizdikten sonra akson kırılmasını mikroskop altında gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.
      NOT: Canlı nöronları tutarken nitril eldiven giyin ve UV ile sterilize edilmiş bir laboratuvar ortamında çalışın
2. Yöntem 2: Vakum yardımlı aksonal yaralanma.
   1. Kortikal nöronları geniş formatlı mikroakışkan cihazda dönüşümlü olarak tohumlayın.
   2. Vakum pompasını açın ve 60 L/dk'ya ayarlayın.
   3. Vakum pompası tüpünün ucunu steril bir pipet ucu kullanarak akson odası portuna bağlayın.
   4. Geleneksel mikroakışkan protokoller aracılığıyla vakum basıncı uygulayarak akson kopmasını tamamlayın.
   5. (İsteğe bağlı) Yaralı aksonları spesifik olarak toplamak için, aksotomiden sonra belirli bir zaman noktasında, hücre gövdelerini çıkarmak için bir vakum pompası (60 L/dak emme hızıyla) kullanarak hücre gövdesi bölmesinin içeriğini hızla aspire edin, böylece mikrokanallar içinde sadece aksonları bırakın.

10. Konvansiyonel veya büyük ölçekli mikroakışkan cihazların hipoksik tedavisi

1. Mikroakışkan cihazda birincil nöronları tohumlayın ve normoksik koşullar altında (37 °C,% 5 CO₂) DIV7'ye kadar kültürleyin.
2. Mikroakışkan cihazı bir hipoksi inkübatör odasına yerleştirin ve %1 O₂ , % 5 CO₂ ve dengeli N₂ 'den oluşan bir gaz karışımı sağlayın .
3. Gaz akış hızını kontrol etmek için bir rotametre kullanın ve 25 L/dk'ya ayarlayın.
4. Havanın yerini değiştirmek için hazneyi 5 dakika yıkayın.
5. Hipoksik odanın girişini sıkıştırırken, çıkış basıncı düşürme valfini kapatın.
6. Hipoksik odanın çıkış borusunu kelepçeleyin ve son olarak gaz tüpü valfini sıkıca kapatın.
7. Mikroakışkan cihazı hipoksik odada 3 °C'de 1 saat inkübe edin.

11. Omik analiz için büyük ölçekli mikroakışkan cihazlar kullanılarak in vitro kültürlenmiş nöronların numune hazırlanması

1. Transkriptomik için örnek.
   1. Aksonal yaralanma tamamlandıktan 6 saat sonra hasarlı aksonlarla birlikte mikroakışkan cihazı laminer bir akış başlığına aktarın.
   2. Eski ortamı attıktan sonra, nöronal hücreleri steril PBS ile 2-3 kez yıkayın.
   3. RNA'yı üreticinin talimatlarına göre izole etmek ve saflaştırmak için standart bir RNA ekstraksiyon kiti kullanın.
   4. RNA dizilimi gerçekleştirin. Elde edilen dizileme verileri üzerinde takip biyoinformatik analizi yapın.
2. Metabolik akış analizi için numune.
   NOT: Büyük ölçekli bir mikroakışkan cihaz kullanarak yaralanmadan sonra nöronlardaki glikoz metabolik akışındaki değişiklikleri izlemek için [^U-13C₆]-glikoz izleme metabolik akış analizi²⁴ kullandık. LC-MS analizi için numune hazırlama protokolü aşağıdaki gibidir:
   1. Deneyler için P0 SD sıçan yavrularını kullanın. Kortikal nöronları inceleyin ve kısa süreli (DIV5-DIV7) veya uzun süreli (DIV15-DIV30) in vitro olarak kültürleyin.
   2. Hem genç (DIV5-DIV7) hem de olgun (DIV15-DIV30) nöronlar için yaralanma grupları ve yaralanmamış kontrol grupları oluşturun.
   3. Ortamı 25 mM [^U-13C₆]-glikoz (glikozsuz Nörobazal-A, %1 FBS, %2 B27, 25 mM [^U-13C₆]-glikoz) içeren bir ortamla değiştirin ve 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
      NOT: Ortam değişimi sırasında ozmotik veya pH değişikliklerinin neden olduğu nöronal stres ve apoptozu önlemek için, tohumlama sırasında 25 mM [^U-13C₆]-glikoz içeren ortamda kültürlenmiş ek nöronlar hazırlayın ve bu ortamı değişim için kullanın.
   4. 5 mL önceden ısıtılmış HBSS (kalsiyum ve magnezyum içeren) ile iki kez nazikçe duruladıktan sonra, numuneleri sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: Sıvı nitrojenle çalışırken nitril eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.

12. Geleneksel ve büyük ölçekli mikroakışkan cihazlara dayalı nöronal immünofloresan boyama

NOT: Mikroakışkan cihazlar kullanılarak in vitro nöronlar kültürlenirken, canlı hücre fiksasyonu için bu cihazların sökülmesi sırasında meydana gelebilecek mikrokanallar içindeki nöronal aksonlarda meydana gelebilecek potansiyel hasar göz önünde bulundurulmalıdır.

1. Kültür ortamını mikroakışkan cihazın dört kuyucuğundan çıkarmak için bir mikro atık vakum pompası kullanın.
   NOT: İmmünofloresan boyama işlemi boyunca sıvıyı iki odada tutun. Nöronal hücre gövdelerine ve aksonlara zarar vermemek veya aspire etmemek için emme parametreleri çok yüksek olmamalıdır (2,5 L/dak optimaldir).
2. Mikroakışkan cihazın iki üst kuyusunun her birine 100 μL 1x PBS ekleyin (PBS doğal olarak alt kuyucuklara akacaktır).
3. Vakum pompasının ucundaki filtresiz ucu değiştirin, PBS'yi alt kuyucuklardan aspire edin ve işlemi üç kez tekrarlayın. Son yinelemede, tüm PBS'yi dört kuyudan aspire edin.
4. Üstteki iki kuyucuğun her birine 150 μL %4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 10-15 dakika sabitleyin.
   NOT: Nöronal yapısal bütünlüğü korumak için canlı hücre fiksasyonu sırasında cihazın sökülmesinden kaçının. Bu yaklaşım, nöronal somaların ve aksonların yerlerini daha net bir şekilde ayırt etmeye yardımcı olur.
5. 1x PBS ile üç kez yıkayın, ardından nöronları %5 keçi serumu, 0.3 M glisin, %2 sığır serum albümini (BSA), PBS ve %0.1 (veya %0.5) Triton X-100 içeren bloke edici tamponla 1 saat inkübe edin.
6. Birincil antikoru (örneğin, βIII-tübülin, fare, 1:2000) bloke edici tamponda seyreltin, sol üst kuyuya 100 μL ve sağ üst kuyuya 50 μL ekleyin ve nöronlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
7. Birincil antikoru aspire ettikten sonra, 12.2-12.3 adımlarında açıklandığı gibi 1x PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra bloke edici tampon ile hazırlanan ikincil antikoru adım 12.6'da açıklandığı gibi mikroakışkan cihazın üst kuyucuklarına ekleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin (gerekirse alüminyum folyo ile örtün).
8. 1x PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, bir kez ultra saf su ile durulayın. Cihazı mikroakışkan kurulumun sağ üst köşesinden kavramak ve çıkarmak için kavisli cımbızları dikkatlice kullanın.
9. Büyük lamel tabaktan ayırmak için kültür kabına 1 mL PBS ekleyin.
10. 15 μL montaj ortamı çekmek için bir pipet kullanın ve lameller için belirlenen yerde lamel üzerine bırakın.
11. Hücre tarafını yavaşça montaj ortamına indirin, lamel yerleştirin ve fazla sıvıyı çıkarın.
12. Montaj ortamının oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin.
13. Montaj ortamı oda sıcaklığında kuruduktan sonra, görüntüleme yapmak için dönen diskli konfokal mikroskop kullanın.
14. 20x hava hedefi seçin, pozlama süresini kare başına 100-200 ms'ye ayarlayın ve Yeşil Floresan Proteini (GFP) için 488 nm uyarımı ve/veya Kırmızı Floresan Proteini (RFP) için 561 nm uyarımla lazer gücünü maksimumun %5-10'una ayarlayın.

13. Konvansiyonel mikroakışkan cihazlarda canlı hücre görüntüleme

1. DIV7'ye kadar mikroakışkan cihazda kortikal nöronları kültürleyin.
2. Üreticinin talimatlarına göre canlı hücre boyası (örneğin, mitokondriyal membran potansiyeli için bir prob) hazırlayın.
3. Boyayı önceden ısıtılmış (37 °C) nöronal bakım ortamında seyreltin.
4. Boya çözeltisini mikroakışkan cihazın somatik bölmesine yükleyin.
5. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöründe 30 dakika inkübe edin.
6. Bölmeleri 3 mL önceden ısıtılmış (37 °C) kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS ile 3 kez nazikçe yıkayın.
7. Mikroakışkan çipe fenol kırmızısı içermeyen canlı hücre görüntüleme solüsyonu ekleyin.
8. (İsteğe bağlı) Uzun süreli görüntüleme için GlutaMAX (%0,25) ve B27'yi (%2) dahil edin.
9. Mikroakışkan çipi, somatik oda solda ve aksonal terminal odası sağda olacak şekilde mikroskop aşamasına yerleştirin.
10. Objektif merceğine bir damla daldırma yağı ekleyin ve yağın çipin altındaki lamel ile temas etmesini sağlayın.
11. Görüntüleme için 150 ms pozlama ve %10-15 maksimum lazer gücü ile 40x objektif kullanın.
    NOT: Bu parametreleri boya fotostabilitesine göre ayarlayın.

14. Veri analizi

1. Mikroskopi görüntülerini analiz etmek için ImageJ yazılımını kullanın. Bir biyoanalizör ile RNA kalitesini değerlendirin. Uygun bir platform kullanarak RNA-seq gerçekleştirin ve analiz edin.
2. Metabolomik çalışmalar için, MRMPROBS programını (sürüm 2.60) kullanarak ham kütle spektrometrisi verilerini çıkarın ve izotopik ayrıntılar ve pik alanları dahil olmak üzere tanımlanmış metabolitler hakkında bilgi toplayın.
3. Tüm istatistiksel analizler için GraphPad Prism (sürüm 8.4.3) kullanın. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun. Grup karşılaştırmaları için eşleştirilmemiş iki kuyruklu t-testleri veya Mann-Whitney testleri kullanın ve gruplar içindeki birden fazla zaman noktası arasındaki karşılaştırmalar için iki yönlü ANOVA uygulayın (Anlamlılık: ns, anlamlı değil; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).

Sonuçlar

Kortikal nöronlardaki metabolik düzenleme mekanizmalarını incelemek için kapsamlı bir araştırma platformu oluşturmak için, önce kortikal nöronları geleneksel bir mikroakışkan cihazda kültürledik ve mikrokanallar boyunca akson büyümesini hassas bir şekilde kontrol ettik (Şekil 2A). Uygun bir tasarımla, mikrokanallar düşük yükseklik (5 μm) ve daha büyük genişlik (10 μm) ile inşa edildi ve her kanalın hücre gövdelerinin girmesine izin vermeden daha fazla akson b...

Tartışma

Aksonal yaralanma ve rejenerasyonu incelemek için gelişmiş in vitro modellerin oluşturulması, nöronal onarımda yer alan moleküler ve metabolik mekanizmaları ortaya çıkarmak için gereklidir^16,19. Bu çalışmada, mikroakışkan cihazları, büyük ölçekli nöronal kültürleri ve hassas aksonal yaralanma protokollerini entegre eden ve yaralı kortikal nöronların sağlam multi-omik analizini mümkün kılan standartlaştırılmış bir iş akış...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nörobazal-A Ortamı	Gibco	10888022	Kültür ortamı
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare	Davetli	A-21042	İmmünofloresan
Analitik terazi	Şangay Shunyu Hengping Bilimsel Enstrüman Co., Ltd.	FA1004 Serisi	Reaktiflerin/numunelerin hassas tartımı
B27 (50x)	Gibco	17504044	Kültür ortamı
BCA protein testi	Boster	AR1189 Serisi	Protein konsantrasyonları
Biyoanalizör	Gilent	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Sığır serum albümini	Gen görünümü	FA016 Serisi	İmmünofloresan
Santrifüjlü karıştırıcı karıştırıcı	DÜŞÜNMEK	ARE-310	PDMS ve gazdan arındırmayı karıştırın
CLARIOstarPlus-ACU analizörü	BMG LABORATUVAR TEKNOLOJİSİ	CLARIOstar Artı	Protein konsantrasyonları
CO2 inkübatör	Thermo Fisher Bilimsel (Asheville) LLC	3111	37 °'de hücre kültürü inkübasyonu; C, %5 CO?
Korozyona dayanıklı Diyaframlı Vakum Pompası	Şangay Liken Bangxi Enstrüman Teknolojisi Co., Ltd.	LC-85DLC Serisi	Atık sıvıyı aspire edin ve aksotomi için emme sağlayın
D-GLİKOZ (U-13C6, %99)	Cambridge İzotop Laboratuvarları	CLM-1396 Serisi	Metabolik akış
DNase I	Roche	11284932001	Nöronal kültür
Dr.TOM2 platformu	BGI Genomik		RNA-seq 'yi gerçekleştirin ve analiz edin;
Elektrikli sıcak hava kurutma fırını	BIOM Huahong Bonn / Huaying Bosi	DHG-9070A	PDMS'nin kürlenmesi
Elektronik Terazi	Şangay Huachao Sanayi A.Ş.	HC313 Serisi	Malzemelerin rutin tartımı
Floromount Sulu Montaj Ortamı	Sigma-Aldrich	F4680 Serisi	İmmünofloresan
GlutaMAX	Gibco	35050061	Kültür ortamı
Glisin	Güneş Enerjisi	G8200 Serisi	İmmünofloresan
HBSS'nin	Gibco	14025092	Nöronal kültür
HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco	14175095	Nöronal kültür
Yüksek basınçlı buhar sterilizatörü	STIK Enstrüman (Şanghay) Co., Ltd.	HMJ-54A Uçağı	Laboratuvar ekipmanlarının ve ortamlarının sterilizasyonu
Hipoksik oda	STEMCELL Teknolojileri	27310	Hipoksik tedavi
ResimJ	NIH		Mikroskopi görüntülerini analiz etmek için kullanılır
Leica Mikroskop	Leica Microsystems CMS GmbH	DMIL LED Fluo	Canlı ve floresan gözlem
Canlı hücre görüntüleme çözümü	Davetli	A14291DJ	Canlı hücre görüntüleme
Tıbbi düşük sıcaklık depolama kutusu (-80 ° C)	Qingdao Haier Biyomedikal Co., Ltd.	DW-86L388J Serisi	-80 °'de uzun süreli örnek depolama; C
Mini masaüstü vakum pompası	Haimen Qilin-Bell Enstrüman İmalat A.Ş.	GL-805 Serisi	Küçük ölçekli vakum uygulamaları
MitoTracker Turuncu CMTMRos	Davetli	M7510 Serisi	Mitokondriyal membran potansiyel boyama
MRMPROBS programı		Sürüm 2.60	Ham kütle spektrometrisi verilerini çıkarmak için
Nörobazal Ortam	Gibco	21103049	Kültür ortamı
Glikoz içermeyen nörobazal-A	Gibco	A2477501	Kültür ortamı
Papain	Worthington	LS003127	Nöronal kültür
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148	Hücre fiksasyonu
PDMS	Dow Corning	DC184 Serisi	Cihaz imalatı
PDS Kiti İnhibitör Şişesi	Worthington	LK003182	Nöronal kültür
Penisilin Streptomisin	Gibco	15140122	Kültür ortamı
Fosfat Tamponlu Salin	Biyokeskin	BL302A	Maddeleri seyreltin ve hücre kaplarını temizleyin
Plazma temizleyici	Harrick Plazma	ODC-32G-2 Serisi	Etkinleştirme
Poli-D-lizin	Sigma-Aldrich	P6407	Nöronal kültür
Prizma	Grafik Pedi	Sürüm 8.4.3	İstatistiksel analizler
Soğutmalı santrifüj	Eppendorf AG (Almanya)	5430R Serisi	Kontrollü sıcaklıklarda numune ayırma
RNArep Saf Hücre/Bakteriyel Toplam RNA Ekstraksiyon Kiti	Tiangen	DP430	Transkriptomik
Rotametre	Dwyer	RMA-23-SSV	Düşük oksijen akışını kontrol edin
Stereo mikroskop	Olympus Şirketi	SZ2-ILST	Örnek gözlem ve diseksiyon
Stuart Yörünge Çalkalayıcı	Kylin-Çan	TS-200 Gemisi	Hücre kültürlerinin/çözeltilerinin ayarlanabilir hızlarda karıştırılması
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	İmmünofloresan
ULVAC Döner Kanatlı Vakum Pompası	ULVAC (Ningbo) Co., Ltd.	GLD-N202 Serisi	Filtrasyon/kurutma için vakum oluşturma
β III-tübülin	Promega	G7121 Serisi	İmmünofloresan