Yöntem makalesi

Çok noktalı tioflavin t floresansı kullanılarak mutant P53 V157F meme kanseri hücrelerinde agregasyona meyilli davranışın tespiti

DOI:

10.3791/68921

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p53 V157F mutasyonunu taşıyan Hs578T meme kanseri hücreleri, MCF7 hücrelerine kıyasla anlamlı şekilde daha yüksek Thioflavin T floresansı gösterir ve bu da protein toplanması artışını gösterir. Çok noktalı floresans ölçümleri, β tabaka açısından zengin agregaların tespit doğruluğunu ve güvenilirliğini artırır; bu da kanser araştırmalarında ve terapötik stratejilerin geliştirilmesinde toplamaya yatkın p53 mutasyonlarının önemini vurgular.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TP53 geni tarafından kodlanan tümör baskılayıcı p53, genomik stabilitenin korunmasında merkezi bir rol oynar. TP53 mutasyonları, özellikle sıcak nokta varyantları, insan kanserlerinin yaklaşık %50'sinde bulunur ve tümör baskılayıcı fonksiyonların kaybına veya fonksiyon kazanımı özelliklerinin kazanılmasına, prion benzeri yapılara birleşmeye yol açabilir.

Bu çalışmada, Hs578T meme kanseri hücrelerindeki p53 V157F mutasyonunun toplama eğilimini, vahşi tip p53 eksprese eden MCF7 hücrelerine kıyasla değerlendirdik. Protein agregasyonu, Thioflavin T (ThT) boyama ile değerlendirildi ve ardından 96 kuyu plaka testlerinde floresans nicelenmesi yapıldı. Hücreler ThT/Hoechst çözeltisi ile boyanmış, yıkanmış ve belirli uyarılma/emisyon parametreleri altında mikroplaka okuyucu kullanılarak analiz edilmiştir. Hem tek noktalı hem de dört noktalı floresans ölçümleri kullanılarak yapılan nicel analizler, Hs578T hücrelerinin MCF7'ye göre ThT floresans yoğunluğunda 3,20 ila 4,26 kat artış gösterdiğini, β tabaka açısından zengin veya amiloid benzeri agregaların önemli ölçüde yüksek olduğunu göstermektedir. Çok noktalı ölçümler, protein agregalarının kuyu yüzeyinde yaygın ve tutarlı olduğunu doğruladı. Bu bulgular, hücre tabanlı testlerde protein agregasyonunu doğru şekilde tespit etmek için çok noktalı plaka okumasının kullanılmasını desteklemektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör baskılayıcı protein p53'ü kodlayan TP53 geni, insan kanserlerinin yaklaşık %50'sindemutasyona uğramıştır 1,2. Bu tür mutasyonlar sadece p53'ün tümör baskılayıcı işlevlerini ortadan kaldırmakla kalmaz, aynı zamanda bazı hotspot varyantlarında prion benzeriagregaların oluşumunu da teşvik eder 3,4. Bu birleşmiş mutant p53 formları sıklıkla fonksiyon kazanımı özellikleri kazanır; bunlar arasında antikanser tedavilerine karşı dirençartışı da vardır 5,6. Bu nedenle, hangi p53 hotspot mutasyonlarının toplanmaya yatkın olduğunu belirlemek, p53-mutant kanserlerde etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesiniyönlendirmek için kritik öneme sahiptir 7,8.

Önceki çalışmalarımızda, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu (HNSCC) ve meme kanseri hücre hatlarındaki spesifik p53 mutasyonlarının güçlü Thioflavin T (ThT) boyama sinyalleri gösterdiğini, bu da toplamış proteinlerin varlığını gösterdiğini gözlemledik. ThT, β tabaka açısından zengin amiloid yapılara özel olarak bağlanan ve bağlandığında artmış floresans üreten bir benzotiazolboyasıdır 9. Örneğin, p53 R175H mutasyonunu taşıyan Detroit 562 HNSCC hücre hattı güçlü ThT floresanssinyalleri 10 gösterdi. Benzer şekilde, p53 R280T mutasyonunu taşıyan iki diğer HNSCC hücre hattı TW01 ve HONE-1 de belirgin ThTboyama 11 gösterdi. Bu durumlarda, ThT sinyalleri p53 ile kolokalize olmuş ve toplamlanmış p53 10,11'in varlığını destekler.

Meme kanseri hücrelerinde MDA-MB-231 (p53 R280K mutasyonu) ve T47D (p53 L194F mutasyonu) da güçlü ThT boyama ile net p53/ThT ko-lokalizasyonu12 gösterdi. Buna karşılık, vahşi tip p53 ifade eden MCF7 hücreleri ve MDA-MB-468 hücreleri (p53 R273H mutasyonu) sadece zayıf ThTsinyalleri 12 gösterdi. Benzer şekilde, p53 V173L mutasyonuna sahip OECM-1 HNSCC hücrelerinde ThTboyama 10 seviyeleri düşük oldu.

Filtre tuzak testleri, iletim elektron mikroskopisi (TEM) veya agregat spesifik antikorlarla immünboyama gibi diğer protein toplama tespit yöntemleriyle karşılaştırıldığında, ThT floresans analizi çeşitli avantajlar sunar. Yıkıcı değildir, hızlıdır ve hem canlı hem sabit hücreler için kapsamlı işleme olmadan uygulanabilir. Filtre kapanı testleri çözünmeyen agregaları etkili bir şekilde yakalarken, sert denatürasyon gerektirir ve canlı hücre kullanımı için uygundeğildir 13. TEM, fibril morfolojinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar ancak emek yoğun ve düşükverimlilikte 14. Agregasyona özgü immünboyama, konformasyona bağlı antikorlar kullanılarak yerinde tespiti sağlar, ancak antikor bulunabilirliği ve özgüllüğü sınırlayıcıolabilir 15. Buna karşılık, ThT floresansı özellikle çok noktalı plaka okuma ile birleştiğinde β tabaka açısından zengin veya amiloid benzeri yapıları tespit etmek için basit, nicel ve mekansal olarak güvenilir bir yaklaşım sunar.

Tekrarlanabilirlik için pratik hususlar da çok önemlidir. ThT floresansı, geniş bir konsantrasyon aralığında (0,2-500 μM) amiloid konsantrasyonu ile doğrusal olarak korelasyon gösterir ve zirve sinyal genellikle proteine bağlı olarak 20-50 μM'de elde edilir; ancak ThT kendi floresansı ≥5 μM'de ortaya çıkabilir ve daha yüksek konsantrasyonlar toplama kinetiklerinietkileyebilir 16. Bu nedenle, hassasiyeti dengelemek ve toplama süreçleri üzerindeki potansiyel etkileri en aza indirmek için genellikle 10-20 μM civarında çalışan bir ThT konsantrasyonu önerilir16. Protokolümüzde, 1.000x ThT stok (12 mM) 1:1.000 oranında seyreltilerek yaklaşık 12 çalışma konsantrasyonu elde edilir. μM, bu önerilen aralık dahilindedir.

ThT, amiloid fibrillere özgü β tabaka açısından zengin amiloid yapılara tercihen bağlanır. Bu özgüllük, boyanın amiloid fibrillerin çapraz β mimarisiyle etkileşiminden kaynaklanır; burada β ipliklerin oluşturduğu yüzeyler ThT için bağlanma noktaları sağlar. Sonuç olarak, ThT bu β tabaka açısından zengin yapıyı göstermeyen diğer yanlış katlanmış veya amiloid olmayan agregaları etkili şekilde tespitedemeyebilir. Bu nedenle, ThT amiloid fibrilleri tanımlamak için değerli bir araç olsa da, tespit edilen agregaların kimliğini ve özelliğini doğrulamak için p53 immünoflüoresans ile ortak lokalizasyon veya biyofiziksel yaklaşımlar gibi tamamlayıcı doğrulama yöntemlerinin kullanılmasıtavsiye edilir 10,18.

Yapısal tahmin çalışmaları, p53 V157F mutasyonunun vahşi tip protein19'a göre daha agregasyona yatkın bir konformasyon benimsediğini göstermektedir. Bu çalışmada, agregasyona yatkın p53 V157F mutasyonunu taşıyan Hs578T meme kanseri hücreleri ile vahşi tip p53 ifade eden MCF7 meme kanseri hücreleri arasındaki ThT floresans sinyallerini karşılaştırdık. Çok noktalı plaka okuyucu tabanlı ThT boyama testi kullanarak, p53 V157F'nin vahşi tip p53'e göre toplanma eğilimini değerlendirmeye çalıştık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre tohumlama

  1. Hücre canlılığını değerlendirmek için, 10 μL Trypan Blue ile 10 μL yeniden süspansiyon hücreleri 1x Dulbecco'nun Fosfat-Tamponlu Salini (DPBS) mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve iyice karıştırın.
  2. Karışımdan 10 μL bir saygıcı slayta yükleyin, ardından otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın.
  3. Yaşamlılık sayısına göre, her kuyu başına 30.000 canlı hücre tohumlanarak 96 kuyu kapasiteli bir kültür plakasına yerleştirilir; bunlardan biri boyanmamış kontrol olarak belirlenirken, kalan üç kuyu boyama için kullanılır.

2. Kuluçka

  1. Kültür plakasını birCO2 kuluçka makinesine yerleştirin ve 37 °C'de 12 saat kuluçka yapın.

3. Taze ThT boyama stokunun hazırlanması (1.000x)

  1. 0,02 g (20 mg) ThT tozu tartın ve 5,0 mL deiyonize suda çözürün. Toz tamamen çözülene kadar iyice karıştırın.
    NOT: Bu preparat, son konsantrasyonu 4 mg/mL olan 1.000x ThT stok çözeltisi elde eder, bu da 12,5 mM eşdeğerdir (ThT'nin moleküler ağırlığı ~318,85 g/mol'dur. 4 mg/mL çözeltisi 4 g/L'ye eşittir. 4 g/L'yi 318,85 g/mol'e bölersek, 0,0125 mol/L veya ~12,5 mM elde eder.

4. Nükleer karşı boyama ile ThT boyama tamponunun hazırlanması

  1. Boyama çözeltisini 1 mL 1x DPBS ekleyerek hazırlayın ve homojenliği sağlamak için nazikçe karıştırın.
    1. 1 μL taze hazırlanmış 1.000x ThT stok ekleyin, böylece nihai ThT konsantrasyonu 12,5 μM (1x) olur.
    2. 1 μL 1 mg/mL Hoechst 33342 stok çözeltisi ekleyin, böylece nihai konsantrasyon ~1 μg/mL (=1,6 μM) olur.

5. Boyama

  1. Her kuyunun kültür ortamını çıkarın. Her boyama kuyusuna hazırlanan ThT/Hoechst boyama tamponundan 100 μL ekleyin. Lekesiz kontrole 100 μL 1x DPBS ekleyin.

6. Kuluçka

  1. Tabağı oda sıcaklığında (25 °C) koyu bir yere 30 dakika koyun.

7. Yıkama

  1. Her kuyunun boyama çözeltisini dikkatlice aspire edin veya atın, hücre monotabakasını rahatsız etmemeye özen gösterin.
  2. Her kuyuya 100 μL 1× DPBS ekleyin ve isteğe bağlı olarak 30 saniyelik nazik bir bekletme imkanı verin.
  3. DPBS yıkama çözeltisini dikkatlice aspire edin veya atın.
  4. Her kuyuya 100 μL taze 1x DPBS ekleyerek yıkamayı tekrarlayın, yine isteğe bağlı olarak 30 saniyelik nazik bekletme imkanı verirsiniz, ardından DPBS yıkama çözeltisini atabilirsiniz.
  5. İkinci yıkamadan sonra, her kuyuya 100 μL taze 1x DPBS ekleyin.

8. Floresans ölçümü

  1. Floresan sinyalini okumadan önce, 96 kuyu plakasından kapağı çıkarın. Flüoresansı iki yöntemden biriyle ölçin: tek noktalı okuma veya dört noktalı okuma.
  2. 96 kuyruklu plakayı mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve floresansı aşağıdaki ayarlarla ölçün: ThT floresans: 450 nm'de uyarılma, 490 nm'de emisyon; Hoechst 33342 floresansı: 360 nm'de uyarılma, 460 nm'de emisyon; okuyucu ayarları: Titreme: Okumadan 5 saniye; Oku yönü: En iyi okunma; Entegrasyon süresi: 140 ms; Okuma yüksekliği: 1.00 mm; Wel başına puanl: 1 (uç nokta) veya 4 (kuyu taraması); Kuyu tarama ayarı: (Yoğunluk ayarı: 2; Puan aralığı: 2.5).

9. Veri analizi

  1. Protein agregasyonunu aşağıdaki şekilde hesaplayın:
    figure-protocol-1
  2. MCF7 hücrelerinde oranı 1 olarak ayarlayarak ThT floresans yoğunluğunu normalize edin (başlangıç kontrolü).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme kanseri hücrelerinde β tabaka açısından zengin protein agregalarının varlığını araştırmak için, MCF7 ve Hs578T hücre hatları ThT boyama ile uygulandı ve ardından floresans nicelenmesi yapıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hücreler 96 kuyuyla bir plakanın dört kuyusuna tohumlanmış, bir kuyu ise lekelenmemiş kontrol olarak adlandırılmıştır. Kalan üç kuyu standart protokole göre ThT ile boyandı. Flüoresans iki yaklaşımla ölçüldü: (1) her kuyunun merkezind...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreleri 96 kuyu ölçülü plakalara tohumlarken, kuyu yüzeyinde eşit dağılımın sağlanması genellikle zordur; plakayı hafifçe sallamak veya tıklayarak hücreleri yaymak her zaman mümkün değildir. Bu düzensiz dağılım, kuyu boyunca sinyal yoğunluğunda değişkenlik yaratabilir. Çok noktalı floresans ölçümü, aynı kuyu içindeki farklı bölgeler arasında önemli farklılıklar ortaya koymuş, bu yanlılığı ve yalnızca tek bir nokta ölçüldüğünde yanıltıcı sonuçlar doğurma potansiyelini ortaya koymuştur. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, I-Shou Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Temel Tıbbi Çekirdek Laboratuvarı'nın teknik desteğini minnettarlıkla takdir etmektedir. Bu çalışma, E-DA Hastanesi [EDAHJ114001-C.-C.C.] ve Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden [NSTC 112-2813-C-214-032-B'den B.-H.-e] alınan hibelerle desteklenmiştir. C]

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 kuyu kültür plakasıBasitçePC396-0100
Karşı KaydırmaInvitrogenC10228
Countess II FL Otomatik Hücre SacıThermo Fisher Scientific AMQAF1000
dPBSBasitçeCC704-0500
Eppendorf tüpüBasitçePC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Moleküler Cihazlar735-0391 
Thioflavin TSigma-AldrichT3516
Trypan MavisiInvitrogenT10282

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

P53 AgregasyonuThioflavin T BoyamasProtein Agregasyonunun Tespitiok Noktal FloresansTP53 MutasyonuAmiloid AgregatlarMikroplaka OkuyucuHs578T H creleriFloresans Kantifikasyonu

İlgili makaleler