Yöntem makalesi

Crohn Hastalığı Benzeri İleit ve Fibrozisin SHIP Eksikliği Olan Fare Modelinde Terapötik Müdahalelerin Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/68928

⸱

14 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Crohn hastalığı (CD) benzeri ileal inflamasyon ve fibrozun Src homoloji 2 alanı içeren 5'-inositol fosfataz (SHIP) eksikliği olan fare modelinin, CD için yeni terapötikleri test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Crohn hastalığı (CH), gastrointestinal sistemin herhangi bir bölümünü etkileyebilen segmental, transmural inflamasyon ile karakterize kronik, tekrarlayan inflamatuar bir durumdur. ÇH'nin ayırt edici özelliği, bozulmuş bağırsak bariyer fonksiyonudur ve bağırsak fibrozu yaygın bir komplikasyondur. SHIP eksikliği olan (SHIP-/-) fareler, CD benzeri ileitin temel özelliklerini özetleyerek kendiliğinden bağırsak bariyeri disfonksiyonu, ileal inflamasyon ve fibrotik patoloji geliştirir. SHIP-/- fareleri, CD'de anti-inflamatuar ve anti-fibrotik tedavileri test etmek için değerli bir model görevi görür.

Burada, etkili bir tedavi örneği olarak deksametazon kullanarak bu modeldeki terapötik müdahaleleri değerlendirme yöntemlerini açıklıyoruz. FITC-dekstran ile ölçülen bağırsak geçirgenliğinin in vivo değerlendirmesinin yanı sıra büyük patolojik inceleme ve ayrıntılı histolojik analizler de dahil olmak üzere, hastalık ve tedavi yanıtını karakterize etmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Histolojik değerlendirmeler, inflamasyon için hematoxylin ve eozin (H&E) boyamasını, fibrozis için Masson's trichrome boyamasını ve goblet hücre hiperplazisi ve hipertrofi için Alcian mavisi/Periyodik Asit-Schiff (PAS) boyamasını içerir. Ek olarak, inflamatuar durumu değerlendirmek için ileal dokudaki sitokinler ve inflamatuar belirteçler ölçülür. Bu yöntemler birlikte, CD benzeri ileitin SHIP-/- fare modelinde tedavi etkinliğini değerlendirmek için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Bu protokol, bağırsak iltihabı, mukozal iyileşme ve bağırsak fibrozu üzerine çalışan araştırmacılar için geniş ölçüde uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) iki ana türü, her ikisi de tekrarlayan-düzelen veya ilerleyici bir seyir izleyebilen kronik gastrointestinal (GI) inflamasyon ile karakterize edilen Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolittir (UC)1. IBD tarihsel olarak Batılılaşmış ulusların bir hastalığı olarak kabul edilse de, Güney Amerika, Asya ve Afrika'daki gelişmekte olan ülkelerde görülme sıklığı hızla artmaktadır2. Eş zamanlı olarak, Kuzey Amerika, Avrupa ve Avustralya'da prevalans artmaya devam ediyor ve 1990 ile 2019 yılları arasında hem insidans hem de prevalansta neredeyse %50'lik bir artış rapor edildi ve bu da IBD 2,3'ün artan küresel sağlık yükünün altını çizdi. Önemli araştırma çabalarına rağmen, IBD'nin altında yatan neden bilinmemektedir. Mevcut kanıtlar, genetik yatkınlık, bağışıklık sistemi işlev bozukluğu ve mikrobiyomdaki değişiklikler de dahil olmak üzere çevresel tetikleyiciler arasında karmaşık bir etkileşim olduğunu göstermektedir 4,5.

CD ve UC arasında önemli farklar vardır. UC'de inflamasyon kolonla sınırlıdır ve mukozal tabaka 6,7 ile sınırlı sürekli tutulum ile karakterizedir. Buna karşılık, ÇH, en yaygın olarak terminal ileum 6,7 olmak üzere GI yolunun herhangi bir bölümünü etkileyebilen süreksiz ve transmural inflamasyon ile karakterizedir. CD'nin ayırt edici bir komplikasyonu, darlıkların oluşumuna ve bağırsak tıkanıklığına katkıda bulunan bağırsak fibrozudur8. Fibrozis, kollajen gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin aşırı birikmesi ve bağırsak kas katmanlarının kalınlaşmasıile tanımlanır 9,10. ÇH'li kişilerin yaklaşık %30'unda tanı konulduktan sonraki 10 yıl içinde daraltıcı hastalık gelişir11. Şu anda, hiçbir tedavi, bu komplikasyonu incelemek için uygun klinik öncesi modeller kullanılarak ele alınabilecek karşılanmamış bir klinik ihtiyaç olan fibrozu doğrudan hedef almamaktadır 9,12.

İBH'nin patogenezini daha iyi anlamak ve yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için çok sayıda fare modeli oluşturulmuştur12. Çok sayıda kolit modeli mevcut olsa da, sadece birkaçı ileal inflamasyonu ve CD ile ilişkili fibrozu özetler12. Bunlar arasında, burada açıklanan Src homoloji 2 alanı içeren 5'-inositol fosfataz eksikliği (SHIP-/-) ve ayrıca SAMP1/YitFc fareleri ve TnfΔARE fareleri bulunur. Bu modeller, her biri farklı hücresel ve moleküler mekanizmalar tarafından yönlendirildiğinden, toplu olarak insan CD'sinin karmaşıklığını yansıtır. SAMP1/YitFc farelerinde hastalık, epitelyal bariyer fonksiyonunu ve immün regülasyonu13,14 etkileyen poligenik bir yatkınlıktan kaynaklanırken, TnfΔARE fareleri, TNF mRNA'da AU açısından zengin elementlerin silinmesini taşır, bu da mRNA stabilitesinin artmasına ve TNF aşırı üretimine15,16 yol açar. Değerli olmasına rağmen bu modellerin sınırlamaları vardır. SAMP1/YitFc modeli, düşük ıslah verimliliğinden muzdariptir ve bu da çalışmalar17 için yeterli kohort boyutlarının oluşturulmasında zorluklar yaratmaktadır. Ek olarak, TnfΔARE modelinin kayda değer fibrotik patoloji geliştirmesi 24 haftaya kadar sürer, bu da müdahale çalışmaları yapmayı pahalı ve zor hale getirir16.

SHIP, fosfatidilinositol-3-kinaz (PI3K) sinyal yolunun negatif düzenleyicisidir ve ağırlıklı olarak hematopoietik hücrelerde eksprese edilir. Fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfattan 5' fosfat grubunu çıkararak işlev görür, böylece aşağı akış PI3K sinyalini18 zayıflatır. SHIP-/- fareleri, klinik öncesi çalışmalar için çeşitli avantajlar sunar. Bu farelerin üremesi nispeten kolaydır ve19 yaşın 8 haftalıkken fibroz belirtileri gösterir. Bu modeldeki hızlandırılmış fibrotik yeniden şekillenme, muhtemelen, bağışıklık hücresi hiperaktivasyonuna ve ardından hızlı doku yeniden şekillenmesine yol açan, düzensiz bir PI3K yolu nedeniyle artan inflamatuar yanıtlardan kaynaklanmaktadır. En önemlisi, biz ve Kerr'in grubu, SHIP-/- farelerinin insan CD19,20'ye çok benzeyen özelliklere sahip ileit geliştirdiğini bağımsız olarak gösterdik. Bu modelin uygunluğunu destekleyen CD'li bireylerin bir alt kümesi, hem ileal biyopsilerde hem de PBMC'lerde SHIP aktivitesini azaltmıştır21. Ayrıca, düşük SHIP aktivitesine sahip olanlar, genellikle birden fazla ameliyat gerektiren daha şiddetli bir hastalık seyri yaşama eğilimindedir22.

SHIP-/- fareler, 4 haftalıkken distal ileuma lokalize spontan, süreksiz bağırsak iltihabı geliştirmeye başlar ve20 yaşın 6. haftasına kadar tüm farelerde iltihaplanma mevcuttur. 8 haftalıkken, fareler, muskularis eksternasının kalınlaşması ve submukozada ve kas katmanları arasında yoğun kollajen birikimi ile karakterize edilen fibrotik patoloji oluşturmuştur19. Bu modeldeki inflamasyon, makrofaj kaynaklı interlökin-1β (IL-1β)21 tarafından yönlendirilir. Hem klostronat içeren lipozomlar kullanılarak makrofajların tükenmesi hem de bir IL-1 reseptör antagonisti (anakinra) ile IL-1 sinyalinin farmakolojik blokajı, SHIP-/- farelerinde bağırsak iltihabını iyileştirdi21. İleite ek olarak, SHIP-/- fareleri, lokalize bağırsak iletimi için tasarlanmış tedavilerin hedef dışı etkilerini değerlendirmek için kullandığımız akciğer iltihabı sergiler23. Diğerleri, Z-IETD-FMK ile kaspaz-8 inhibisyonunun, SHIP-/- farelerinde24 hem ileal hem de akciğer inflamasyonunu önemli ölçüde azalttığını ve sistemik inflamatuar kontrolü değerlendirmek için ek bir özellik olarak akciğer patolojisini daha da desteklediğini bildirmiştir.

Bu metodolojik makale, deksametazon23 ile başarılı tedavi üzerine yakın zamanda yayınlanan çalışmamızı yeniden gözden geçirmekte ve farmakolojik testlerde fare modellerinin kullanımına ilişkin ek hususlarla birlikte temel teknik prosedürlerin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Spesifik olarak, bağırsak geçirgenliği, brüt patoloji, histopatoloji ve proinflamatuar mediatörler ve efektörlerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere IBD modellerinde ilaç etkinliğini değerlendirmek için standart parametreleri vurguluyoruz ve genel terapötik etkinlik hakkında sonuçlar çıkarmak için bu verilerin nasıl entegre edileceğini tartışıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanları içeren çalışmalar, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik protokollere ve Ulusal Araştırma Konseylerinin Hayvan Bakımı Yönergelerine uygun olarak yapılmalıdır. Bu protokoldeki tüm hayvan prosedürleri, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin etik yönergelerini takip etti ve British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (protokol A21-0212) tarafından onaylandı.

NOT: İlacın SHIP-/- farelerinin bağırsak patolojisi üzerindeki terapötik etkisini değerlendirmek için, karşılaştırma için sağlıklı kontroller olarak SHIP +/+'yı dahil edin. Terapötik müdahale için, hastalığın modelde tam olarak yerleştiği 6 haftalıkken tedaviye başlayın. Burada, hem SHIP+/+ hem de SHIP-/- fareleri, 10 μL/g'lik bir hacimde, β 2 hafta boyunca% 0.5-siklodekstrin (araç) veya tek başına araç içinde 3 mg / kg'da günlük oral deksametazon gavajı aldı.

1. Epitel bariyer geçirgenliğini ölçmek için FITC-dekstran testi

  1. Testten önce 4 saat boyunca hızlı fareler.
  2. 4 kDa FITC-dekstranı steril 1x PBS içinde 80 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözün.
  3. Fare başına 150 μL ve standart eğri için ekstra 50 μL için yeterli miktarda hazırlayın.
    NOT: İşlem boyunca FITC-dekstran çözeltisinin ve plazma örneklerinin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.
  4. Her fareyi nazikçe kısıtlayın (tırnağı) ve oral gavaj yoluyla 150 μL FITC-dekstran çözeltisi uygulayın.
    NOT: İlk gavajı uyguladıktan hemen sonra bir zamanlayıcı başlatın. Ötenazi ve aşağı akış prosedürlerinin kademeli bir şekilde gerçekleştirilmesi için yeterli zaman tanımak ve zamanlama farklılıklarından kaynaklanan değişkenliği en aza indirmek için sonraki her fare arasında 10-15 dakika bekleyin.
  5. Fareleri 4 saat boyunca yiyeceksiz tutun.
  6. Farelere% 5 izofluran (1.5 L oksijen / dak ile verilen inhalan anestezik) ve ardından standart kurumsal prosedüre uygun olarak karbondioksit kullanarak ötenazi yapın. 25 G iğneler ve 1 mL şırıngalar ile kardiyak ponksiyon yoluyla kan alın.
  7. Antikoagülan olarak toplanan her 100 μL kana hemen 10 μL asit-sitrat-dekstroz çözeltisi ekleyin. Ters çevirerek iyice karıştırın.
  8. 4 °C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin ve plazmayı (süpernatant) etiketli 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine dikkatlice aktarın. Numuneleri buz üzerinde tutun ve analize kadar ışıktan koruyun.
  9. Her plazma örneğini 1x PBS ile 1:2 ve 1:10 oranında seyreltin.
  10. Her seyreltmeden 100 μL'yi opak 96 oyuklu bir plakaya kopyalar halinde ekleyin.
  11. Aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için 1x PBS kullanarak orijinal 80 mg/mL FITC-dekstran stoğunun 1:2 seri seyreltmelerini gerçekleştirin: 3000, 1500, 750, 375, 187.5, 93.8, 46.9, 23.4 ve 0 ng/mL. Her konsantrasyondan 100 μL'yi 96 oyuklu plakaya iki kez ekleyin.
  12. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresansı 485 nm uyarma ve 535 nm emisyonda ölçün.

2. Brüt patoloji değerlendirmesi

  1. FITC-dekstran testi için kan alındıktan sonra, tüm ince bağırsağı dikkatlice çıkarın.
  2. Yapışan yağ ve bağ dokusunu nazikçe çıkarın.
    NOT: Hastalıklı bölgeler kırılgan ve yırtılmaya eğilimli olabileceğinden, dokuyu tutarken dikkatli olun.
  3. Optimum kontrast için bağırsağı boş beyaz bir kağıda düz bir şekilde yerleştirin. Dokuyu makroskopik hastalık belirtileri açısından görsel olarak inceleyin. Enflamasyon tipik olarak SHIP-/- faresinde ince bağırsağın distal 10 cm'sine lokalizedir.
    NOT: Değerlendirilmesi gereken temel makroskopik özellikler, bitişik normal görünen dokuya göre görünür kızarıklık veya hiperemi gösteren bölgelerle birlikte renk değişikliklerini içerir. Ek olarak, etkilenen bölgeler hafif palpasyonla şişmiş, ödemli veya sert görünebileceğinden doku kalınlaşması olup olmadığını inceleyin. Görünür hemorajik lekeler, koyu kırmızı renk değişikliği veya yapışık kan olarak görünebilen kanın varlığını arayın.
  4. Bağırsağı ölçek için bir cetvelin yanına hizalayın ve büyük patolojik bulguları belgelemek için bir fotoğraf çekin.

3. Histolojik değerlendirme

  1. Bir şırınga kullanarak lümeni 1x PBS ile hafifçe yıkayarak bağırsak içeriğini çıkarın. Villus ve kript mimarisini bozabileceğinden dokuya çok fazla kuvvet uygulamayın.
  2. Brüt patolojiyi en iyi temsil eden distal ileumun yaklaşık 1 cm'sini tanımlayın ve hasat edin. Varsa, görünür etkilenen bölgeleri dahil edin. Karşılaştırmalar için (SHIP+/+ ve SHIP-/-), dokuların eşleşen anatomik konumlardan toplandığından emin olun.
    NOT: Tedavi etkinliğinin ilk değerlendirmesi için ileumun İsviçre rulosu olarak hazırlanması önerilir. Bu yöntem, hastalığın küresel bir görselleştirmesini sağlar ve örnekleme yanlılığını azaltır.
  3. Dokuyu bir histoloji kasetine düz bir şekilde yerleştirin ve katlanmayı önlemek için süngerlerin arasına yerleştirin.
  4. Hematoxylin & eosin (H&E) ve Masson's trichrome boyama için, dokuyu 4 °C'de gece boyunca %10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin, doku hacminin en az 10-20 katını (kaset başına yaklaşık 5 mL) kullanın ve tüm kasetlerin tamamen suya batırıldığından emin olun. Kasetleri saklamak için %70 etanole aktarın ve işlenene kadar tamamen su altında tutun.
    NOT: %3.7 formaldehit içeren bir fiksatif olan %10 formalin, güçlü bir solunum yolu tahriş edici, dermal hassaslaştırıcıdır ve insan kanserojeni olarak sınıflandırılır. Soluma, yutma veya cilt teması akut toksisiteye neden olabilirken, kronik maruziyet kanser riskini artırabilir. Formalin içeren tüm prosedürler, laboratuvar önlüğü, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve göz koruması dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilerek sertifikalı bir kimyasal çeker ocakta gerçekleştirilmelidir. Atıkları, kurumsal tehlikeli atık protokollerine göre uygun şekilde bertaraf edilmek üzere açıkça "Formalin Atık" olarak etiketlenmiş kaplarda toplayın. Formalinle kirlenmiş tüm malzemeler (örn. pipet uçları, kağıt mendiller, eldivenler) kimyasal olarak tehlikeli atık olarak değerlendirilmeli ve yerel Çevre Sağlığı ve Güvenliği (EHS) prosedürlerine göre atılmalıdır.
  5. Alcian mavisi/PAS boyaması için, dokuyu Carnoy solüsyonunda (%60 etanol, %30 kloroform ve %10 buzlu asetik asit) gece boyunca 4 °C'de, kaset başına yaklaşık 5 mL veya doku hacminin 10-20 katı kullanarak sabitleyin. Kasetleri işlenene kadar saklamak için %100 etanole aktarın.
    NOT: Carnoy'un çözeltisi %60 etanol, %30 kloroform ve %10 buzlu asetik asitten oluşur. Bu karışım oldukça uçucu, yanıcı ve zehirlidir. Carnoy'un solüsyonunu yalnızca çeker ocakta kullanın ve sıkıca kapatılmış kaplarda, ısı veya tutuşturucu kaynaklardan uzakta saklayın. Carnoy'un atıkları, karışık organik çözücüler için belirlenmiş kaplarda toplanmalı ve kurumsal tehlikeli atık yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmelidir. Carnoy solüsyonu ile kontamine olmuş tüm malzemeler kimyasal olarak tehlikeli atık olarak değerlendirilmelidir.
  6. Dokuları parafine gömün ve boyama için 5 μm'lik kesitler kesin.
  7. H&E boyalı ileal kesitleri Tablo 1'deki kriterlere göre 16 puanlık bir ölçekte puanlayın. Nihai histolojik hasar skoru, deneysel koşula kör olan 2 gözden geçirenin puanlarının ortalaması alınarak belirlenir.
  8. Masson'un trikrom lekeli kesitlerini Tablo 2'deki kriterlere göre 6 puanlık bir ölçek kullanarak değerlendirin. Nihai fibroz puanı, deneysel koşullara kör olan iki bağımsız hakem tarafından verilen puanların medyanı olarak hesaplanır.

4. Sitokin değerlendirmesi

  1. Diseksiyon ve histoloji örneğinin çıkarılmasının ardından, ileumun distal 10 cm'sinin kalan kısmını toplayın.
  2. Mendili kurulayın ve ağırlığı kaydedin. Sıvı nitrojen içinde şokla dondurun ve ileride işlenmek üzere -80 °C'de saklayın.
  3. İşlemeye hazır olduğunuzda, dokuyu alın ve her zaman buz üzerinde tutun.
  4. Doku örneklerini tartın. 1x PBS'ye proteaz inhibitörleri (her biri 10 μg/mL'de aprotinin ve leupeptin) ekleyerek tüm numuneler için yeterli Homojenizasyon Tamponu hazırlayın. Mg doku başına 10 μL tampon kullanın (örneğin, 100 mg doku 1 mL tampon gerektirir).
    NOT: Proteaz inhibitörlerinin etkili olmasını sağlamak için homojenizasyon tamponu homojenizasyon gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
  5. Bir tezgah üstü homojenizatör kullanarak buz gibi soğuk Homojenizasyon Tamponunda tam kalınlıktaki ileal dokuyu homojenize edin. Homojenatın tekdüze olduğundan ve görünür doku parçaları içermediğinden emin olun. Çapraz kontaminasyonu önlemek için homojenizatör ucunu numuneler arasında PBS ile iyice durulayın.
  6. Doku homojenasyonlarını 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Donma-çözülme döngülerini önlemek için berraklaştırılmış süpernatanları ayırın ve gelecekteki analizler için -80 °C'de saklayın.
  8. Üreticilerin talimatlarına göre, ilgilenilen sitokinleri ölçmek için berraklaştırılmış süpernatanlar üzerinde enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) gerçekleştirin.
    NOT: 450 nm'deki optik yoğunluk, düzeltme için 570 nm referans dalga boyuna sahip Skanlt RE 7.0.2 yazılımına sahip Varioskan LUX mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür. Veri analizi için Microsoft Excel kullanıldı ve sitokin konsantrasyonlarını belirlemek için standart eğrinin doğrusal aralığındaki absorbans değerleri enterpolasyona tabi tutuldu.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6 haftalık SHIP+/+ ve SHIP-/- fareleri, 2 hafta boyunca günde %0.5 β-siklodekstrin (araç kontrolü; n = 6/genotip) veya 3 mg/kg deksametazon (n = 6/genotip) ile ağızdan gavaje edildi. Tedavinin zamanlaması ve süresi modele bağlıdır ve hastalığın başlangıcı ve ilerleme hızının yanı sıra müdahalenin profilaktik mi yoksa terapötik mi olması gerektiği dikkate alınmalıdır. Deneylerde eşit sayıda erkek ve dişi fare kullanılmalıdır. SHIP-/- farelerinde hastalığın doğal seyrinde cinsiyete dayalı farklılıklar tespit etmemiş olsak da, farklı tedavi protokolleri cinsiyete özgü yanıtlar gösterebilir. Bu modelde, inflamasyon ve fibrozun başlamasını önlemek için 4-6 haftalıktan itibaren profilaktik tedavi kullanılabilirken, 6-8, 8-10 veya 6-10 haftalıkken uygulanan terapötik rejimler, yerleşik hastalık için tedavi etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Optimum dozlama ve zamanlama, literatür ve titrasyon çalışmaları tarafından yönlendirilmelidir. Deksametazon için bu doz rejiminin, ileal inflamasyon geliştikten sonra uygulandığında etkili olduğunu daha önce göstermiştik.

Hasat günü için önerilen bir zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. Deksametazon, brüt incelemeye dayalı olarak SHIP+/+ farelerinde herhangi bir bağırsak patolojisine neden olmadı. SHIP-/- fareler, iltihaplanmanın göstergesi olan görünür kızarıklık ve kalınlaşma alanları sergiledi. Bu büyük patolojik özellikler, deksametazon ile tedavi edilen SHIP-/- farelerinde yoktu (Şekil 1B). Bağırsak bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için, oral gavajı takiben FITC-dekstran'ın plazma konsantrasyonları ölçüldü. İstatistiksel olarak anlamlı olmasa da, SHIP-/- fareleri, SHIP+/+ kontrollerine kıyasla yüksek plazma FITC-dekstran konsantrasyonlarına sahipti, bu da bağırsak geçirgenliğinin arttığını düşündürdü. Deksametazon tedavisi, SHIP-/- farelerinde FITC-dekstran konsantrasyonlarını SHIP+/+ farelerde gözlenenlere benzer konsantrasyonlara düşürdü (Şekil 1C).

SHIP-/- farelerinden alınan bağırsak kesitlerinin histolojik incelemesi, bağışıklık hücresi infiltrasyonu, bozulmuş villus-kript mimarisi, goblet hücre hiperplazisi/hipertrofisi ve muskularis tabakasının kalınlaşması dahil olmak üzere ayırt edici patolojik özellikleri ortaya çıkardı (Şekil 2A). Bu özellikler, SHIP+/+ farelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek histolojik hasar skorlarına yansıdı (p = 0.0005, Şekil 2B). Deksametazon ile tedavi edilen SHIP+/+ farelerde histolojik hasar gözlenmedi. Brüt patoloji ve bariyer fonksiyonunda görülen iyileşmelerle tutarlı olarak, deksametazon SHIP-/- farelerinde histopatolojiyi azalttı, ancak etki istatistiksel olarak anlamlı değildi (p = 0.0981, Şekil 2A ve Şekil 2B). Masson'un trikrom boyaması, SHIP+/+ kontrollerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek fibroz skorlarının eşlik ettiği SHIP-/- bağırsak dokularında önemli ölçüde kollajen birikimi olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 2C). Deksametazon, SHIP-/- farelerinde fibrotik özellikleri etkili bir şekilde zayıflattı ve fibroz skorlarını SHIP+/+ kontrollerininkiyle karşılaştırılabilir değerlere düşürdü (Şekil 2C). Ek olarak, Alcian mavisi / PAS boyama, SHIP-/- farelerinde deksametazon ile tedavi üzerine azalan goblet hücresi hiperplazisini / hipertrofisini doğruladı (Şekil 2D).

İnflamatuar sitokin konsantrasyonlarını değerlendirmek için tam kalınlıkta ileal doku homojenatları üzerinde ELİSA'lar yapıldı (Şekil 3A). IL-1β konsantrasyonları, SHIP-/- farelerinde SHIP+/+ kontrollerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti (p = 0.0468), bu modelde IL-1β ekspresyonunu hastalık şiddeti ile ilişkilendiren önceki bulgularla uyumludur. Deksametazon tedavisi, SHIP-/- farelerinde IL-1β konsantrasyonlarını önemli ölçüde azalttı (p = 0.0023). Önceki raporlarla tutarlı olarak, IL-6 veya TNF konsantrasyonları dört deney grubu arasında farklılık göstermedi. Ayrıca, inflamasyonun ek biyokimyasal belirteçleri olarak tam kalınlıkta ileal homojenatlarda nötrofil ile ilişkili proteinler miyeloperoksidaz (MPO) ve lipokalin-2 (LCN-2) konsantrasyonlarını ölçtük (Şekil 3B). Hem MPO hem de LCN-2 konsantrasyonları önemli ölçüde daha yüksekti (p = 0.0031 ve p = 0.0002 sırasıyla) SHIP-/- farelerinde SHIP+/+ kontrollerine kıyasla, ancak LCN-2'deki artış büyük ölçüde 6 farenin 2'sinde ölçülen yüksek konsantrasyonlardan kaynaklandı. Deksametazon ile tedavi MPO'yu azalttı ve LCN-2'yi orta derecede azalttı, farklılıklar anlamlı değildi. Bu veriler, MPO'nun SHIP-/- farelerinde inflamasyonun yararlı bir belirteci olduğunu, LCN-2 konsantrasyonlarının ise tutarlı veya güvenilir olmadığını göstermektedir.

SHIP-/- fare modelinde enflamatuvar ve fibrotik özellikler arasındaki ilişkiyi araştırmak için tam kat ileal dokudan histolojik hasar skorları, fibrozis skorları ve IL-1β konsantrasyonlarını kullanarak Spearman korelasyon analizleri yaptık (Şekil 4). IL-1β konsantrasyonları, histolojik hasar skorları ile pozitif korelasyon gösterdi (r = 0.6813), bu da artan inflamasyonun artan doku hasarı ile ilişkili olduğunu gösterir (Şekil 4A). IL-1β konsantrasyonları ile fibroz skorları arasında da orta derecede bir korelasyon gözlendi (r = 0.4117), bu da inflamatuar sitokin üretimi ile fibrotik yeniden şekillenme arasında bir bağlantı olduğunu düşündürdü (Şekil 4B). Ek olarak, histolojik hasar skorları fibroz skorları ile anlamlı bir korelasyon gösterdi (r = 0.6241), bu da SHIP-/- farelerinde yapısal hasar ve fibrozisin paralel olarak ilerlediğini düşündürdü (Şekil 4C).

figure-results-1
Şekil 1: Deksametazon, SHIP-/- farelerinde kaba bağırsak patolojisini ve geçirgenliğini azaltır. SHIP+/+ ve SHIP-/- fareleri, 6 ila 8 haftalıkken araç kontrolü (VC) olarak %0.5 β-siklodekstrin veya deksametazon (Dex; 3 mg/kg) ile günlük olarak oral olarak gavlandı. (A) Önerilen deneysel zaman çizelgesi. (B) Çekum ve distal ileumun brüt morfolojisi değerlendirildi ve temsili görüntüler gösterildi (n = grup başına 4-6 fare). Yıldız işaretleri, kaba muayenede gözlenen yamalı kızarıklık ve kalınlaşma alanlarını gösterir. Görüntülerin genel patolojiyi temsil eden örnekler olarak hizmet etmesi amaçlanmıştır ve kantitatif analiz amaçlı değildir. (C) Bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için fareler 4 saat aç bırakıldı ve 80 mg/mL FITC-dekstran ile gavaj edildi. 4 saatlik ek açlıktan sonra, kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplandı ve plazma FITC-dekstran konsantrasyonları ölçüldü. Veriler ortalama±SD olarak sunulur. Gri çubuk, gava25'ten dört saat sonra sağlıklı C57BL/6 farelerinde tipik olarak gözlenen plazma FITC-dekstran konsantrasyonlarının aralığını temsil eder. İstatistiksel anlamlılık Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Deksametazon, SHIP-/- farelerinin distal ileumunda histolojik hasar skorlarını, kollajeni, kas kalınlığını ve goblet hücre hiperplazisini ve hipertrofisini azaltır. SHIP+/+ ve SHIP-/- fareleri, 6 ila 8 haftalıkken araç kontrolü (VC) olarak %0.5 β-siklodekstrin veya deksametazon (Dex; 3 mg/kg) ile günlük olarak oral olarak gavlandı. (A) Farelerden alınan H&E boyalı ileal kesitler 10x büyütmede fotoğraflandı; ölçek çubukları = 200 μm. (B) SHIP+/+ ve SHIP-/- fareler için medyan ± IQR olarak ifade edilen histolojik hasar skorları. (C) Sabit ileal kesitler, fibroz için Masson'un trikromu ile boyandı; Kolajen maviye boyanır. Görüntüler 10x büyütmede çekildi; ölçek çubukları = 200 μm. SHIP+/+ ve SHIP-/- fareler için fibroz skorları, medyan ± IQR olarak ifade edilir. (D) Sabit ileal kesitler Alcian mavisi/PAS ile boyandı. Görüntüler ×10 büyütmede fotoğraflandı; ölçek çubukları = 200 μm. Tüm bölümler, grup başına n = 6 fareyi temsil eder (SHIP+/+ Dex ve SHIP-/- Dex, n = 5 hariç). Histolojik hasar skorunun istatistiksel anlamlılığı Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Deksametazon, SHIP-/- farelerinden alınan tam kalınlıkta ileal homojenatlarda IL-1β konsantrasyonlarını azaltır. SHIP+/+ ve SHIP-/- fareleri, 6 ila 8 haftalıkken araç kontrolü (VC) olarak %0.5 β-siklodekstrin veya deksametazon (Dex; 3 mg/kg) ile günlük olarak oral olarak gavlandı. (A) IL-1β, TNF ve IL-6 konsantrasyonları tam kalınlıkta ileal homojenatlarda ölçüldü. (B) Miyeloperoksidaz (MPO) ve lipokalin-2 (LCN-2) konsantrasyonları tam kalınlıkta ileal doku homojenatlarında ölçüldü. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel analizler Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: IL-1β konsantrasyonları, histolojik hasar ve fibroz ile pozitif korelasyon gösterir ve fibroz, SHIP-/- farelerinde histolojik hasar skoru ile ilişkilidir. SHIP-/- farelerinden alınan tam kalınlıkta ileal dokuda histolojik hasar skoru, fibroz skoru ve IL-1β konsantrasyonları arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Spearman korelasyon analizi yapıldı. (A) histolojik hasar skoru ile IL-1β konsantrasyonları (r = 0.6813), (B) fibrozis skoru ve IL-1β konsantrasyonları (r = 0.4117) ve (C) histolojik hasar skoru ile fibrozis skoru (r = 0.6241) arasında anlamlı pozitif korelasyonlar gözlendi. Her veri noktası ayrı bir fareyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hasar bileşeniPuan
Crypt mimarisinin kaybı0 = yok
1 = %<25 kayıp
2 = %25-50 kayıp
3 = %50-75 kayıp
4 = %>75 kayıp
Bağışıklık hücresi infiltrasyonu0 = yok
1 = Lamina propria'da ara sıra bağışıklık hücresi
2 = Lamina propria'da artan bağışıklık hücreleri
3 = lamina propria'da ve gedik açan mukozada birleşik bağışıklık hücreleri
4 = bölüm boyunca bağışıklık hücresi infiltrasyonu
Goblet hücre hiperplazisi & hipertrofi0 = yok
1 = Kadeh hücre sayısında ve boyutunda %<50 artış
2 = Kadeh hücre sayısında ve boyutunda %>50 artış
Ülserasyon0 = yok
1 = ara ülserasyon
2 = önemli ülserasyon
Ödem0 = yok
1 = bölümün %<50'si
2 = Bölümün %>50'si
Kas kalınlaşması0 = yok
1 = ara kalınlaşma
2 = önemli kalınlaşma

Tablo 1: Histolojik hasar skorları. H&E ile boyanmış SHIP+/+ ve SHIP-/- farelerinden alınan ileal kesitlerin histolojik hasarı, SHIP-/- fare modelini karakterize eden ileitisin ana özelliklerine dayanarak skorlanır, bunlar arasında mimari kaybı (0-4), bağışıklık hücresi infiltrasyonu (0-4), goblet hücre hiperplazisi ve hipertrofisi (0-2), ülserasyon (0-2), ödem (0-2) ve kas kalınlaşması (0-2).

Fibrozis BileşeniPuan
Aşırı kolajen0 = Normal mimari; fazla kolajen yok
1 = Kollajende hafif artış; Submukoza veya subseroza ile sınırlıdır
2 = Düzensiz demetlerle birlikte submukoza ve kısmi muskularis propriaya orta derecede kollajen genişlemesi
3 = Submukoza ve muskularis (transmural) içeren normal yapının yerini alan geniş, yoğun kollajen
Submukozanın fibromüsküler hiperplazisi/kaslanması/kas obliterasyonunun0 = Yok, normal kas submukoza içeriği
1 = Kas içeriğinde hafif artış
2 = Submukozada büyük miktarda kas, morfolojiyi etkiler ancak normal yapıyı
3= Kas tüm submukozal boşluğu yok etti

Tablo 2: Fibrozis Puanlaması. Masson trikromu ile boyanmış SHIP+/+ ve SHIP-/- farelerinden alınan ileal kesitlerdeki fibroz, aşırı kollajen birikimi (0-3) ve fibromüsküler hiperplazi veya submukozanın kas obliterasyonunu (0-3) dahil olmak üzere SHIP-/- modelinde gözlenen bağırsak fibrozunun temel özelliklerine göre puanlandı. Kollajen, kapsam ve mimari bozulma açısından değerlendirilirken, kas değişiklikleri, kas infiltrasyonunun derecesine ve submukozal yapının bozulmasına göre değerlendirilir.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, eşlik eden fibrotik patoloji ile CD benzeri bağırsak iltihabının bir fare modeli olan SHIP-/- farelerinde ileit ve bağırsak fibrozunu değerlendirme prosedürlerini özetlemektedir. SHIP-/- fare modeli, bağırsak iltihabının diğer fare modellerinde, özellikle ileal lokalizasyon, yamalı ve transmural inflamasyon ve fibrotik patoloji 19,26'da yaygın olarak görülmeyen CD özelliklerini özetlemektedir. Üreme kolaylığı ve hastalığın ortaya çıkmasına kadar geçen kısa süre ile birleştiğinde, SHIP-/- modeli, CD19'da translasyonel araştırma için güçlü bir araç olarak iyi bir konuma sahiptir.

Bu çalışmada, FITC-dekstran testi ve histolojik skorlama için istatistiksel anlamlılık, Kruskal-Wallis testi kullanılarak değerlendirildi, çünkü bu veri kümeleri tek yönlü bir ANOVA için gereken normallik varsayımlarını karşılamadı ve histolojik puanlar süreksiz, parametrik olmayan değişkenleri temsil etti. Analizlerimiz deksametazon ile tedavi edilen ve araçla tedavi edilen gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermese de, net eğilimler gözlemledik. Deksametazon, SHIP-/- farelerinin bağırsak geçirgenliğini ve histopatolojisini azalttı ve bu etkiler daha büyük örneklem boyutlarında önem kazanmış olabilir.

Bu protokolü gerçekleştirirken çeşitli teknik zorluklar ortaya çıkabilir. Doku işleme ile ilgili olarak, SHIP-/- ilea, yırtılmaya eğilimli oldukları için diseksiyon sırasında nazik manipülasyon gerektirir. Bu, dokuları brüt görüntüleme için hazırlarken özellikle önemlidir. Doku fiksasyonu, histolojik analiz için bir diğer kritik faktördür. Formalinle sabitlenmiş doku, hem H&E hem de Masson'un trikrom boyaması için uygundur ancak Alcian Blue/PAS boyaması ile uyumsuzdur. Buna karşılık, Carnoy's sabit doku H&E ve Alcian Blue/PAS boyama için uygundur ancak Masson's trichrome için uygun değildir. Carnoy'un fiksasyonu, kolajen ve kas tabakası görselleştirmesini gizleyen yoğun ve yaygın koyu mavi lekelenmeye yol açar. Sitokin analizi için, sitokinler bozunmaya karşı oldukça hassas olduğundan numunelerin buz üzerinde işlenmesi önemlidir. İşlemden hemen sonra berraklaştırılmış doku homojenleşmelerini sağlamak çok önemlidir. Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri, sitokin bütünlüğünü önemli ölçüde tehlikeye atabilir ve genotipler ve/veya tedavi grupları arasındaki olası farklılıkları zayıflatabilir. Son olarak, doğru miktar tayini sağlamak için, okumaların testin standart eğrisinin doğrusal aralığına düştüğünü doğrulamak ve karmaşık doku matrisinden kaynaklanan potansiyel etkileşimi en aza indirmek için her numunenin birden fazla seyreltilmesini öneririz. Bu teknik hususların ele alınması, tekrarlanabilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için esastır, ancak SHIP-/- farelerine özgü biyolojik değişkenlik de dikkatli bir şekilde yönetilmelidir.

SHIP-/- farelerinin, tekrarlanabilirliği sağlamak ve kafa karıştırıcı değişkenleri en aza indirmek için dikkate alınması ve dikkatle kontrol edilmesi gereken birkaç kritik yönü vardır. Bağırsak mikrobiyomu, murin IBD modellerinde hastalık gelişimi ve terapötik yanıtlar üzerinde derin bir etkiye sahiptir27,28. Önceki çalışmamız, SHIP-/- farelerinde bağırsak iltihabının mikrobiyotaya bağımlı olduğunu ve antibiyotiklerle iyileştirilebileceğini göstermiştir29. Bu nedenle, mikrobiyom kaynaklı değişkenliği azaltmak için yavru kontrolleri kullanılmalı ve tedavi grupları kafes orijinli30 için dengelenmelidir. Ek olarak, dikkatli cinsiyet eşleştirmesi önemlidir. SHIP-/- farelerinde penetrans veya hastalık şiddetinde cinsiyete dayalı bir farklılık gözlenmemiş olsa da, SAMP1/YitFc gibi diğer ileit modelleri kadınlarda daha erken başlangıç ve artmış hastalık şiddeti sergiler14,31. Seks hormonları ayrıca mikrobiyal bileşimi32 modüle edebildiğinden, tedavi çalışmalarında potansiyel karıştırıcıları en aza indirmek için cinsiyet için eşleştirme kritik öneme sahiptir. Ayrıca, değerlendirilen bireysel tedaviler, erkek ve dişi farelerde farklı etkinliğe sahip olabilir. Mevcut bulgularımız deksametazona hastalık veya terapötik yanıtta cinsiyete bağlı farklılıklar ortaya koymasa da, tüm tedavi çalışmalarında cinsiyet eşleştirmesi yapılmalıdır.

Yukarıda özetlenen mikrobiyom ve cinsiyet hususlarına ek olarak, bağırsak iltihabı yokluğunda aracın ve terapötik ajanların etkilerini değerlendirmek için SHIP+/+ farelerini tedavi çalışmalarına dahil etmek önemlidir. Bu, ne ilacın ne de uygulama yönteminin sağlıklı bağırsakta patolojiye neden olmamasını veya katkıda bulunmamasını sağlar, böylece terapötik etkinlik ve güvenliğin yorumlanmasını iyileştirir.

Tedavi müdahalesinin zamanlaması da önemlidir ve 4, 8 ve 12 haftalık farelerde hem inflamasyon hem de fibrozda önemli farklılıklar olduğundan, deneysel hedeflere göre değiştirilmelidir,19,26. SHIP-/- fareler 4 haftalıkken bağırsak iltihabı geliştirir, tüm fareler 6 haftalıkken iltihaplanma ile ortaya çıkar ve fibrotik patoloji belirteçleri 6 haftalıkken ölçülebilir ve 8 haftalıkken iyi yerleşir19,26. Bu nedenle ileal inflamasyonu hedef alan tedaviler 6 haftalıkken başlamalıdır. Anti-fibrotik girişimler profilaktik olarak 6. haftada veya terapötik olarak 8-10. haftalar arasında başlatılabilir. Bununla birlikte, hastalığın başlangıcı ve şiddeti, tesisler arasında farklılık gösteren mikrobiyal ortama göre değişebilir. Araştırmacılar, tedavi protokollerini uygulamadan önce kolonilerindeki hastalık kinetiğini belirlemelidir. Ek olarak, SHIP-/- fareler 4-5 hafta içinde ağırlıkta %17'ye kadar, 8-10 hafta arasında ise %5'e kadar azalma gösterebilir33. Derin kilo kaybı sergileyen hayvanlar, hastalığın ciddi bir tezahürünü yansıttığı ve bağırsak patolojisi ile ilgili tedavi sonuçlarını zayıflatabileceği için çalışmalardan çıkarılmalıdır.

SHIP-/- modelinde hastalığın ilerlemesini analiz ederken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir husus, uygun inflamatuar belirteçlerin seçimidir. SHIP-/- faresi ile ilgili kapsamlı deneyimimize dayanarak, sitokin profili oluşturma tipik olarak, hastalığın ilerlemesi sırasında yukarı regüle edildiği bilinen IL-1β gibi spesifik aracılara odaklanır. Bununla birlikte, inflamatuar yanıtların ilk karakterizasyonu için veya yeni terapötik stratejileri değerlendirirken, multipleks sitokin analizi tavsiye edilir. Bu tarafsız yaklaşım, inflamatuar ortamın daha geniş bir profilinin çıkarılmasını sağlar ve hastalık patogenezi veya tedavi yanıtı ile ilgili beklenmedik hedefleri ortaya çıkarabilir.

SHIP-/- fare modeli, tekrarlanabilirlik ve verimlilik sağlayan pratik avantajlar sunar. SHIP-/- fareler, eksojen tetikleyicilere ihtiyaç duymadan spontan ve tutarlı ileal inflamasyon ve fibroz geliştirir. Bu, bağırsak iltihabını indüklerken reaktif hazırlama ve standartlaştırılmamış doz protokolleri ile ilişkili değişkenliği ortadan kaldırır. Hastalığın başlangıcı hızlıdır, iltihaplanma 4-6 haftalıkken belirgindir ve fibrozis 8 haftalıkken belirgindir, bu da modeli hem zaman hem de maliyet açısından verimli hale getirir. Ek olarak, SHIP-/- farelerinin üremesi ve bakımı kolaydır, genotipleme basittir ve özel yetiştirme stratejileri gerekmez. Bu, koloni yönetimini basitleştirir, teknik iş yükünü azaltır ve istenmeyen genetik değişkenlik getirme riskini azaltır 19,21,26. Hastalık, FITC-dekstran testi, H&E ve Masson'un trikrom boyaması ve ELISA dahil olmak üzere çoğu araştırma ortamında yaygın olarak bulunan teknikler kullanılarak güvenilir bir şekilde değerlendirilebilir. Bu birleşik özellikler, verimli çalışma tasarımını destekler, finansal ve teknik engelleri azaltır ve laboratuvarlar arasında tutarlı veri üretimini teşvik eder.

SHIP-/- modeli benzersiz avantajlar sunarken, modelin sınırlamaları da vardır. Tüm klinik öncesi modellerde olduğu gibi, genetik, bağışıklık ve çevresel faktörlerden etkilenen insan IBD'nin karmaşık, çok faktörlü doğasını tam olarak kopyalayamaz34. DSS ve TNBS modelleri, basitlikleri ve maliyet etkinlikleri nedeniyle oldukça popüler olmaya devam ediyor. Genetik modifikasyonlarla birleştirildiğinde, bu kimyasal modeller, bariyer fonksiyonuna35 gene özgü katkıları anlamak için etkili araçlar olarak hizmet edebilir. Bununla birlikte, ana faydaları akut epitel hasarının modellenmesinde yatmaktadır; ÇH'yi karakterize eden kronik immün aracılı patolojiyi ve doğrudan klinik ilgisi olmayan kimyasal ajanların neden olduğu epitel hasarı mekanizmalarını yakalamakta yetersiz kalıyorlar36. Tek bir modele özel olarak güvenmek, terapötik potansiyelin eksik ve/veya yanıltıcı bir değerlendirmesine neden olabilir ve tedavi etkinliğinden emin olmak için birden fazla modelin kullanılması önerilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, BC Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü'ndeki Hayvan Bakım tesisi tarafından desteklenmektedir ve Kanada Glikozik Ağı (GlycoNet, A Network of Excellence of Excellence) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (MOP-133607 ila LS) aracılığıyla Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden sağlanmaktadır. K.S. ve W.M. TRIANGLE (TRaIning a New generation of Researcher in Gastroenterology and LivEr programı) Doktora burslarının sahibidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.7mL Snap Cap Microtube DiamedSPE155-N
1x DPBS (kalsiyum klorür yok, magnezyum klorür yok)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” needles BDREFERANS 305122Kalp ponksiyonu için
26G x figure-materials-2” İğnelerBDREF 305110Bağırsak kızarması
Asetik asitSigma-AldrichA6283Histoloji
Asit sitrat dekstroz çözeltisi (38mM sitrik asit, 107 mM sodyum sitrat, 136 mM dekstroz)Millipore SigmaC3821
Hayvan besleme iğnesi, steril olmayan, yeniden kullanılabilir, tip 304SSMillipore Sigma CAD7900 Gavage
Straight
Boyut: 24G,
Lxdiam. 1 girer. x 1.25 mm,
top
AprotininCayman Chemical9087-70-1Homojenleştirme tamponu
BD Luer-Lok Şırınge steril, tek kullanımlık, 5 mLBDREFERANS 309646Bağırsak kızarması
BD OptEIA Fare IL-6 ELISA SetiBD Biosciences555240
BD OptEIA Fare TNF ELISA Set IIBD Biosciences558534
BD® Luer Slip Tip Şırınge steril, tek kullanımlık, 1 mLBDREFERANS 309659
Biyopsi Köpük Pedleri Kare, 30.2 x 25.4 x 2 mm H.Simport ScientificREFERANS M476-1Histoloji
Buffered Formalde-Fresh (Düşük Kokulu %10 Formalin)Fisher ChemicalSF93-4Histoloji
Şeffaf Düz Tabanlı Immuno Steril Olmayan 96 Kuyu PlakalarıTermo Bilimsel439454
Eppendorf 5415R Soğutmalı Santrifüj Marshall ScientificEP-5415R
Etil Alkol AnsumutGreenfield GlobalP016EAANHistoloji
Fisherbrand TRU-FLOW doku kasetiFisher Scientific15-200-403Histoloji
FITC-dekstran, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
CAS Numarası: 60842-46-8
LeupeptinMillipore Sigma103476-89-7Homojenleştirme tamponu
Fare IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& D SistemleriDY401
Çok ekranlı 96 kuyulu, taban katıMillipore SigmaMSSWNFX40Beyaz, steril olmayan, tedavi edilmemiş
OmniPur KloroformMillipore Sigma3150Histoloji
Polytron PT-MR2100 homojenizatörKinematica AG632081
Varioskan Lux Çok Modlu Mikroplaka OkuyucuTermo BilimselVL0L00D0

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SHIP Eksikli i Olan FarelerCrohn Hastal Modelileal nflamasyonBa rsak FibrozisiFITC Dekstran AnaliziDeksametazon TedavisiHistolojik AnalizMasson s Trikrom BoyamaGoblet H cre HiperplazisiSitokin Kantifikasyonu

İlgili makaleler