Yöntem makalesi

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

DOI:

10.3791/68939

⸱

21 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyindeki mikrovasküler tıkanıklıklar nispeten yaygındır ancak büyük ölçüde yeterince incelenmemiştir. Olay oranı, uzun vadeli sonuçlar ve potansiyel temizleme mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu olayları incelemek için kullanılan fototromboz ve mikro-emboli enjeksiyonu gibi güncel modellerin her birinin kendine özgü avantajları ve sınırlamaları vardır. Bu çalışma, kronik kranial pencerenin hazırlanmasını ve farelerde intraarteriyal mikrosfer enjeksiyonu yoluyla beyin mikrovasküler embolizmlerinin indüksiyonunu birleştiren ayrıntılı bir protokol geliştirmiştir. Bu düzen, iki foton mikroskopisi kullanılarak mikro-damar ve mikro-tıkanıklıkların uzun süreli in vivo görüntülemesine olanak tanır. Mikrosferler, kalıcı olarak bağlanmış dış karotis arteriye (ECA) yerleştirilen bir kateter aracılığıyla iletilir. Önemli olarak, ortak karotis arter (CCA) ve iç karotis arter (ICA) işlem boyunca ve sonrasında sağlam kalır, böylece beyin kan akışındaki bozulma en aza indirilir. Anında in vivo görüntülemeyi kolaylaştırmak ve mikrosfer kümelenmesini veya pipet uçlarına ile katetere yapışmasını önlemek için, mikroküreler FITC-Dextran ve %0,1 Tween 20 karışımında askıya alınır. Enjeksiyon tekniği, mikrokürelerin dağılımını belirlemek için yerinde 3D görüntüleme kullanılarak doğrulandı. Bu çalışma, in vivo iki foton mikroskopi örneğiyle faydasını daha da göstermektedir. Bu yaklaşım, mikrovasküler embolizmleri indüklemek ve incelemek için tutarlı ve sağlam bir yöntem sunar; yüksek çözünürlüklü in vivo görüntüleme kullanılarak etkilerinin ve temizlik dinamiklerinin araştırılmasını mümkün kılar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük bir beyin arterinin embolizmine bağlı iskemik inme, akut ve çoğu zaman yıkıcı birolaydır 1. Emboli ayrıca daha distal damarlarda da görülebilir. Sonuç olarak, sessiz beyin enfarktları (SBI) gelişebilir; Adından da anlaşılacağı gibi, bunlar semptomatik kalmaya devam eder ve genellikle görüntüleme sırasında alakasız nedenlerle tesadüfenkeşfedilir 2,3. SBI'lar yaygındır ve yaşlı bireylerin otopsilerinde en sık gözlemlenen beyin vasküler hastalıklararasında yer alır 4,5. Epidemiyolojik çalışmalar, felç geçmişi olmayan bireylerde %20 oranında bir yaygınlık göstermiştir. SBI'lar bilişsel işlev bozukluğu ve demansa katkıda bulunur, genel ölüm oranını artırır ve gelecekteki inme için bir riskfaktörüdür 6,7,8. İnfarktlar genellikle sadece birkaç milimetre çapındadır ve yaklaşık 100 μm çapındaki nüfuz eden arterlerin tıkanmasıyla ilişkilidir. Bu penetratörler, geniş bir arteriolar ve kapiller yatağa yol açar. Küçük bir mikrotromb, aşağıdaki mikrosirkülasyonda geçen ve nüfuz eden arterlerden geçen ve yerleşen mikrotromb, anjiografi9'da muhtemelen tespit edilemez kalacaktır. Ancak, birçok mikrotrombi atriyal fibrilasyon, aterosklerotik plaklar ve diğer kaynaklardanda salgılanabilir 10,11,12,13,14. Mikrotrombilerin yanı sıra, yağ parçacıkları, hücresel agregalar ve hatta mikroplastikler gibi diğer mikropartiküller (MP) mikrovasküler embolizmalara neden olabilir. Birçok çalışma, kan ve beyinde 5 μm15,16 kapiller çapından daha büyük plastik MP varlığını göstermektedir.

Mikrovasküler tıkanıklıklar, akut inme ve SBI ile karşılaştırıldığında nispeten az incelenmiştir. Olay oranı, uzun vadeli sonuçlar ve olası temizleme mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Ancak, inmede mekanik trombektominin başarılı klinik uygulamasının ardından ilgi hızla artmaktadır; mikrovasküler embolizmler, büyük suçlu artar17'nin görünüşte başarılı bir şekilde yeniden kanalizasyonu sonrası mikrovasküler reperfuzyona neden olabilir. Ayrıca, mikroplastikler üzerine yapılan araştırmalarda bir artış vardır ve bu araştırmalar kısmen mikrovasküler embolizm yoluyla etkisinigösterebilir 18,19,20.

Fare korteksindeki mikrovasküler tıkanıklıklar, kranial pencere kullanılarak çoklu foton mikroskopi ile incelenebilir. Beyin mikrovasküler tıkanıklıklarını incelemek için en yaygın kullanılan modeller fototrombotik ve mikrosfer modelidir. Fototrombotik model, seçili damarlarda (genellikle kapiler olmayan damarlarda) fotoaktivasyon yoluyla embolizmi indüklemek için fotosensitif boyalar kullanır. Ancak, bu model, embolizmayı çözen fibrinolitik sistemin aktivasyonu nedeniyle embolizmlerin daha uzun süre incelenmesine izinvermez; bu sistem embolizmi çözür 21,22. Ayrıca, ışığa duyarlı boyanın aktivasyonu singlet oksijen türleri üretir ve endotel ve kan-beyin bariyeri (BBB)hasarına neden olur 23. Beyin embolisi sırasında endotel ve BBB fonksiyonları ile beyin dolaşımı ve beyin fonksiyonu üzerindeki uzun vadeli etkiler üzerine yapılan çalışmalar için mikrosfer modeli tercih edilir. Mikrosfer enjeksiyon modeli, beyin dolaşımına enjekte edilen mikrosferler kullanarak 9,24,25,26,27,28,29,30 (9,24,25,26,27,28,29,30 şeklini kapatır. Bu modelin olası dezavantajı, fototrombotikyöntem 31,32'nin aksine, embolizma yerinin önceden belirlenememesidir. Avantajı, iyi tanımlanmış çaplara sahip mikrokürelerin enjekte edilebilmesidir; böylece belirliçaplarda (mikro-) damarlar hedef alınabilir.

Yıllar içinde, kemirgenlerin beyin dolaşımına mikroküre enjekte etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu protokoller, intra-arterial mikrosfer enjeksiyonu için ortak karotis arter (CCA), iç karotis arter (ICA) ve dış karotis arter (ECA) içeren karotis üçgenine erişim konusunda uzlaşı bulur. Arteriyalı mikrosfer enjeksiyonu yöntemi, protokoller arasında çeşitli şekillerde değişiklik gösterir. İlk olarak, çalışmalarda ya 9,26,27,29,33,34 numaralı şırınga ya da 25,28,30,36 numaralı bir kateter kullanılmıştır. İkincisi, enjekte edilen mikrosferlerin sayısı ve boyutunda önemli bir farklılık vardır. Mikrosfer çapları genellikle 10 ile 50 μm arasında değişir ve seçim hedef kap boyutuna bağlıdır. Genel kural olarak, mikroküreler ne kadar büyükse, enjekte edilmesi gereken bir sayı o kadar düşük olur, çünkü arteriol sayısı kapillyarlardandaha az (25,26,30).

Sürekli intra-arterial mikrosfer enjeksiyonu sağlamak hâlâ zordur. Pratikte, çok sayıda mikroküre enjekte edilir, ancak sadece bir kısmı beyin dolaşımına ulaşır. Bu durum, özellikle in vivo iki foton mikroskopi görüntülemeyle yerleşmiş mikrosferlerin etkilerini incelemek için sorunludur; çünkü bu tekniğin başarısı, hazırlanan kranial pencereden görünüş içindeki fare korteksinin dış katmanlarında mikrokürelerin bulunmasına bağlıdır. Mikroküreler için uygun floresan boyaların seçilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü bunları transgenik fare modelleri ve damar içi boyama ile birleştirmek, mikrokürelerin yoğun floresansı ve örtüşen emisyon spektrumları nedeniyle zor olabilir.

Mikrovasküler tıkanıklıklar kemirgen modellerinde incelenmiştir ve çoklu mikrokürelerin sinerjik etkileri daha önce ex vivo kemirgenbeyinlerinde 9 ve bu tür parçacıkların belirgin ekstravazasyonu gösterilmiştir; bu süreç anjiyofaji 33,35,37,38 olarak adlandırılır. Canlı incelemelerini mümkün kılmak için, kranial pencereli farelerde çoklu foton mikroskopisi için yöntemler geliştirilmiştir. Mevcut çalışmanın amacı, farelerde mikrosferlerin beyin dokusu üzerindeki etkilerini optimize eden intraarteriyal enjeksiyon protokolü geliştirmek ve raporlamaktır. Bu protokolün temel avantajı, mikrosfer kaybını en aza indirerek mikrosfer kaybının en aza indirilmesi ve kranial pencere görüntüleme alanındaki orta serebral arter (MCA) bölgesinde bulunma olasılığını artırmasıdır. Optimize edilmiş mikrosfer enjeksiyon protokolü, in vivo iki foton mikroskopi ve postmortem in situ 3D görüntüleme ile özel bir görüntüleme kriyo-mikrotom39 kullanılarak değerlendirilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uyardı. Hollanda Hayvan Deneyleri Merkez Komitesi tam onay verdi (AVD11400202316817).

NOT: 2 ay ile 1 yaş arasındaki erkek ve dişi fareler kullanıldı. Gelişte, hayvanlar herhangi bir deneysel işlemden önce 7 gün boyunca alıştırıldı. Hayvanlar kafeste en fazla 4 kişi olarak barındırıldı, yiyecek ve su ile ve libitum olarak sağlandı ve 12 saatlik ışık-karanlık döngüde tutuldu. NG2-DsRed ve TIE2-GFP fareleri (ayrıntılar için Materyal Tablosu'na bakınız) elde edilip kurum içinde yetiştirildi.

1. Kraniyal pencere implantı

  1. Anestezi ve ameliyat öncesi bakım
    1. Kranial pencere ameliyatının başlamasından 1 gün önce içme suyuna 0.06 mg/mL Karprofen ekleyin.
    2. Ameliyattan 30 dakika önce fareyi tartın ve 5 mg/kg Karprofen ve 2 mg/kg deksametazon deri altına verin.
    3. Cerrahi alanı, stereotaktik çerçeveye geri bildirim sistemli bir ısıtma pedi yerleştirerek steril bir bezle örtüyerek hazırlayın.
    4. Tüm steril cerrahi aletleri ikinci steril bir bezin üzerine yerleştirin.
    5. Fareyi indüksiyon odasında 1 L/dakika hava karışımı (%30 oksijen ve %70 tıbbi hava) ve %3-4 izofluran ile anestezi edin, ardından yüz maskesi ile %1,5-2 isofluran ile anestezi sürdürün.
    6. Fareyi stereotaktik bir çerçeveye sabitleyin ve ısıtma pedinin termometre probunu rektal olarak yağlayıcı kullanarak yerleştirin. Kurumayı önlemek için göz merhemi uygulayın ve ısıtma pedini 37 °C'ye ayarlayın.
    7. Ameliyattan 5 dakika önce cerrahi kesi hattına 1,5 mg/kg ropivakain uygulanır.
    8. Kafatasının üzerindeki deriyi boyundan gözlerin hemen aşağısına kadar pamuklu bir uçla betadin ile temizleyin.
  2. Baş çubuğu ve cam fiksasyonu için cerrahi hazırlık
    1. Steril forseps ve cerrahi makas kullanarak, arka kafatasının üzerinde ciltte ilk kesi yapın. Lambda dikişinden başlayıp orta çizgi boyunca bregmanın hemen önündeki frontal dikişlere doğru kesiyi uzatın (Şekil 1A). Her iki taraftaki temporalis kaslarını tamamen açığa çıkarmak için cildi dikkatlice geri çekin ve çıkarın.
    2. Kanamayı en aza indirmek için yaklaşık 0,1 ml %1 lidokain salın.
    3. Periosteumu çıkarın ve kafatasının başlık çubuğunun sabitleneceği tüm bölgeleri cerrahi bir bıçakla kazıyın. Çizikleri kafatası boyunca dik hale getirerek baş çubuğunun sıkı yapışmasını sağlayın.
    4. Kalan kanı pamuk uçla temizleyin ve kafatasını sıkıştırılmış hava ile kurutun.
  3. Baş çubuğu sabitlenmesi
    1. Soğuk (4 °C) seramik kapta diş yapıştırıcı karışımı hazırlayın; 100 μL monomer ekleyerek 0,1 g polimere karıştırın. Karışıma 1 damla katalizör ekleyerek yapıştırıcının hızlı katılaşmasını başlatın.
    2. Yapıştırıcıyı başlık çubuğunun altına uygulayın. Baş çubuğu sagital sinüsten sol lateral tarafa hafifçe eğip kafatasına bastırın. Tüm açıklıkları kapatmak için başlık çubuğunun kenarlarına ek yapıştırıcı uygulayın. Bu, sağlam yapışma sağlar.
    3. 100 μL diş çimento sıvısını 0,1 g toz ile karıştırarak diş çimento karışımı yapın. Çimentoyu başlık çubuğunun her tarafına uygulayın ve çimentonun delme alanındaki kafatasına akmasını engelleyin. Baş çubuğun üstüne ek bir diş çimento tabakası ekleyerek bir kuyu oluşturularak kranial pencereye sıvı uygulanmasını sağlar (Şekil 1B).
    4. Diş yapıştırıcısı ve çimentoyu en az 10 dakika kurut.
    5. Baş çubuğunun sıkı yapışmasını kafatasına nazikçe baskı uygulayarak doğrulayın; kraniotominin yapılacağı yer. Baş çubuğu, kafatası hareket etmediğinde ve diş çimentosu ile kafatası arasında sıvı belirdiğinde düzgün şekilde yapışır.
  4. Kraniotomi
    1. Kafa çubuğu kullanarak fareyi görüntüleme tutucusuna bağlayın veya kraniotomi sırasında hayvanın başını sıkıca sabitlemek için stereotaktik çerçevede tutun.
    2. Kafatasında 4 mm çapında kraniotomi sondaj hedefini ince uçlu bir işaretleyici ile işaretleyin. MCA'yı kafatasından görünecek şekilde konumlandırarak kranial pencerenin mümkün olduğunca çok MCA'yı kapsaymasını sağlar. Sondaj hedefinin doğru boyutunu ve yerleşimini doğrulamak için, kaplama camını işaretlenmiş alanın üzerinde tutun ve sondaj hedefi boyutunu gerektiği gibi ayarlayın.
    3. Kafatasına baskı uygulamadan işaretlerde daireler çizerek delik yapmaya başlayın, böylece ısı oluşumunu önleyin (Şekil 1C). Kafatasını her 30 saniyede bir salin uygulayarak soğut. Soğuturken, matkap başlığını suya batırarak temizleyin ve soğutun, ardından kağıt havluyla kurutun. Tüm kemik tozunu düzenli olarak sıkıştırılmış hava kullanarak temizleyin. Kraniotomi boyutunu kafatasına örtük camı yerleştirerek ve gerekirse delme ayarını ayarlayarak doğrulayın.
    4. Kemik yeterince incelenene kadar daireler çizerek delmeye devam edin. Kafatası neredeyse delindiğinde delme alanında çatlaklar oluşacaktır. Kemiğin yeterince inceltildiğinden emin olun; inceltilmiş kafatasını yumuşatmak için tuzlu bir serişle ekleyerek ve delme alanındaki kafatasındaki kafatasındaki ortayı nazikçe bastırın. Delme alanı, hafif baskı altında kafatası sondaj alanının her tarafında eşit şekilde aşağı indiğinde yeterince incedir. Bu noktaya ulaşana kadar sondaj yapmaya devam edin. Kafatasını delmeyin; Bu, dura mater ve beyin dokusuna zarar verme riski taşır. Dura mater hasar görürse veya kanama olursa delme alanını aCSF ile ıslatın.
      NOT: Kafatasını çıkarmadan önce, delme alanındaki tüm kemik tozunun temizlendiğinden emin olun. Dura üzerindeki kalıntı kemik parçacıkları, pencerenin altında kemik yeniden büyümesini başlatabilir.
    5. Tüm kemik tozunu aCSF ve sıkıştırılmış hava kullanarak iyice temizleyin. Delme alanına kafatası tamamen suyun altına girene kadar aCSF uygulayın. 27 kalibre (0,4 mm x 16 mm) veya 30 gauge (0,3 mm x 13 mm) iğne kullanarak, inceltilmiş kafatasını yatay (~180°) dikkatlice delin, dura mater ve beyne zarar vermesini önleyin. Kemiği nazikçe yukarı doğru iterek ayrılana kadar minimum kuvvet uygulayın. Kemik kolayca ayrılmazsa, delmeye devam edin. Kopmuş kafatasını forseps ile çıkarın, beyni aCSF altında tutun (Şekil 1D).
    6. Beyni aCSF ile yıkayın, ardından beyne steril, emici bir domuz jelatin hemostatik sünger yerleştirin, aCSF ile ıslatılmış ve yerel kanamayı 2 dakika boyunca kontrol altına alın. Süngeri dikkatlice çıkarın, beyni aCSF içinde tutun. Beyinde kemik tozu veya kan kalmamasını sağlamak için aCSF ile yıkamaya devam edin. Kanama devam ederse, beyne aCSF ile ıslatılmış taze, steril, emici hemostatik sünger yerleştirin.
      NOT: Kemik alınırken hafif kanamalar yaygındır. Camı yerleştirmeden önce kanamanın durduğundan emin olun, çünkü kalan kanama pencere berraklığını azaltabilir.
  5. Kapak camı yerleşimi
    1. Beyni kaplayan aCSF'yi pamuk bir uçla emin, geriye sadece ince bir tabaka kalsın. Kapak camını beyne yerleştirin ve bükülmüş mikroforsepslerle nazikçe kafatası açıklığına bastırın. Kaplama camının kafatası seviyesinin biraz altında olduğundan ve baş çubuğuna paralel konumlandırıldığından emin olun.
      NOT: Cam, beyne sıkıca bastırılmalıdır, böylece çürük oluşumunu önlemez ve pencere kalitesini korumalıdır. Kapak camının baş barına paralel tutulması, onun mikroskop nesnesine dik olmasını sağlar ve görüntü kalitesini artırır.
    2. Kapak camını kafatası ve baş çubuğuna epoksi yapıştırıcı ile takın, camı ise kenarlara uygulayarak cam başlık çubuğuna paralel ve sağlam tutun.
    3. Kapak camının tüm kenarlarını yapıştırıcıyla kapatarak beyin maruziyetini önleyin. Uygulama sırasında beyinde bir damla aCSF bulundurun ki yapıştırıcı pencerenin altına sızmasını veya dura mater'e temas etmesin (Şekil 1E).
    4. Yapıştırıcının 5 dakika sertleşmesine izin verin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Kraniotomi protokolünün genel özeti. Kraniotomi ve başlık yerleştirme ameliyatı sırasında kritik adımların ayrıntılı örnek resimleri ve şematik çizimleri. (A) Derinin çıkarılması (adım 2.2). (B) Başlık çubuğunun takılması (adım 2.3). (C) 4 mm kraniotominin delmesi (adım 2.4.3). (D) Kafatasının alınması (adım 1.4.5). (E) Kapak camının yerleştirilmesi (adım 1.4.7). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Ameliyat sonrası bakım
    1. 5 mg/kg Karprofen deri altına verin.
    2. Hayvanı 30 dakika boyunca 37 °C sıcaklıkta bir kurtarma kafesine götürün. Sonra ameliyattan sonra içme suyunda 0.06 mg/mL Karprofen ile birlikte evine geri döndürün.
    3. Hayvan ameliyat öncesi ağırlığına dönene kadar 0.06 mg/mL Karprofen ile ıslatılmış yemek verin.
    4. Mikrovasküler emboli model ameliyatı yapılmadan önce hayvanın en az 7 gün iyileşmesine izin verin.

2. Mikrovasküler emboli fare modeli

  1. Kateter montajı
    1. 20 cm uzunluğunda bir mikro-kateterin ucunu (ID 0.23114 OD 0.27432 mm) şeffaf bir katetere (ID 0.31 OD 0.64 mm) yerleştirin ve bağlantıyı epoksi yapıştırıcı ve bantla mühürleyin. Kateterin toplam uzunluğunun en az 160 μL tutacak kadar yeterli olduğunu doğrulayın.
    2. Şeffaf kateterin karşı ucuna 27 kalibre luer-lock iğnesini (0.1 mm x 16 mm) yerleştirin. Ucunu epoksi yapıştırıcı ve bantla kapatın.
    3. 1 mL bir şırıngayı salin ile doldurun ve kateter iğnesinin luer kilidine bağlayın. 0.7 mL salin ile yıkayarak sızıntı veya hava kabarcıkları kalmadığından emin olun.
    4. Kateteri 80 μL salin ile doldurun ve kateterde ulaşılan seviyeyi işaretleyin.
  2. Anestezi ve ameliyat öncesi bakım
    1. Mikrovasküler emboli ameliyatından bir gün önce fareye 0,06 mg/mL Karprofen içeren içme suyu verin.
    2. Steril bir bezin altına geri besleme sistemi olan bir ısıtma pedini yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
    3. Tüm steril cerrahi aletleri ikinci steril bir bezin üzerine koyun.
    4. Ameliyattan 30 dakika önce fareyi tartın ve 5 mg/kg Karprofen deri altına verin.
    5. Fareyi, %30 oksijen ve %70 cerrahi hava içeren 1 L/dakika gaz akışına sahip bir indüksiyon odasında %3-4 isofluran kullanarak anestezi edin.
    6. Faresi ameliyat masasına transfer edin ve aesteziyi yüz maskesi ile sürdürün; %1,5-2 isofluran ile dakikada 1 L, %30 oksijen ve %70 hava ile sağlanır.
    7. Yağlanmış rektal sıcaklık probu takın ve kurumayı önlemek için göz merhemi uygulayın.
    8. Ameliyat alanına erişimi kolaylaştırmak için sırtüstü farenin boynunun altına 2 mL'lik bir şırınga yerleştirin.
    9. Ön patileri ameliyat masasına bantla nazikçe sabitleyin.
    10. Ameliyat bölgesini tıraş edin ve ardından lidokain uygulayın.
  3. Kesi
    1. Anestezi derinliğini parmak sıkıştırmasıyla doğrulayın.
    2. Cerrahi makas ve diseksik pensiyle mandibulanın altındaki trakea üzerinde yaklaşık 0,5 cm orta hat kesi yapın.
    3. Servikal fasyaya yüzeysel bağ dokusunu mikro dikiş bağlama pensepsiyle disseksiye ederek alttaki sternohyoid kasları ortaya çıkarın.
    4. Sol ve sağ sternohyoid kasları aralarındaki bağ dokusunu nazikçe yırtarak ayırın. Sağ omohyoid kası doku kancası ile kaudal-lateral olarak geri çekin. CCA, ICA ve ECA dahil olmak üzere doğru karotis üçgeninin net görünür olduğundan emin olun.
  4. CCA, ICA, ECA ve Posterior Parietal Arter (PPA) cerrahi hazırlığı
    NOT: Vagus sinirini tutmaktan veya sıkmaktan kaçının; Hayvanın sağlığına olumsuz etkileri önlemek için sadece hafifçe hareket ettirin. Trakeyaya dokunmayın, çünkü bu solunum sorunlarına yol açabilir. ICA'nın Y-şekilli bifurkasyonu ile ECA'nın kökeni arasında ortada iken ayrılan oksipital arteri (OA) ve ECA'nın medial tarafından ayrılan üst tiroid arteri (TA) tanımlanır. Bu arterler kırılgan ve son derece dikkatli davranılmalıdır.
    1. CCA çevresindeki kalan fasya ve yağ dokusunu çıkarın.
    2. CCA'yı vagus sinirinden dikkatlice ayırın.
    3. CCA'nın etrafına iki adet 4/0 1.5 iplik yerleştirin ve gevşekçe bağlayın. Düğümlerin CCA kan akışını engellemediğinden emin olun.
    4. ICA ve PPA'dan fasya ve yağ dokusunu çıkarın. PPA ve OA dahil tüm ICA yan dallarını, 4/0 1.5 bir iplikle düğüm bağlayarak geçici olarak bağlayın.
    5. ECA ve TA'dan fasya ve yağ dokusunu çıkarın. ECA ve TA'nın etrafına 4/0 1.5 diş kullanarak iki gevşek düğüm yerleştirin. En uzak ipliği Y şeklindeki bifurkasyondan mümkün olduğunca uzak konumlandırın ve ECA ile TA'yı kalıcı olarak bağlamak için kullanın. Proksimal düğümü çözmeden bırakın.
  5. Mikrosfer çözeltisi hazırlığı ve kateter yüklemesi
    NOT: Mikrosferin katetere yapışmasını en aza indirmek için enjeksiyondan kısa bir süre önce FITC-Dextran/mikrosfer çözeltisi hazırlanır.
    1. 10 μm mikroküreleri (7,2 x 106 mikroküre/mL) homojenize edin ve sonikle tek parçacıkların eşit bir askıya alınması elde edin.
    2. %0,1 Tween20 içeren 140 μL 25 mg/mL 70 kDa FITC-Dextran hazırlanır, ardından 20 μL homojenize mikroküre ekleyerek 1,44 ×10,5 mikroküre içeren 160 μL FITC-Dextran/Tween20/mikroküre karışımı elde edilir.
    3. Katetere bağlı şırıngayı kısa bir süreliğine geri çekerek bir hava kilidi oluşturun.
    4. Kateter ucunu hazırlanan FITC-Dextran/Tween20/mikroküre karışımına daldırın ve şırıngayı yavaşça geri çekerek karışım katetere girene kadar devam edin.
    5. Kateterde hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Varsa, karışımı 0.5 mL'lik bir kaba boşaltın ve 2.5.3 ve 2.5.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. Şırıngayı yüklü kateterle birlikte şırınga pompasına yerleştirin. Pompayı 10 μL/da'ya ayarlayın ve kateter ucunda küçük bir mikroküre karışımı damlası oluşana kadar çalıştırın.
  6. Kateter yerleştirme ve mikroküre enjeksiyonu
    NOT: Damar sistemine hava kabarcıkları enjekte etmekten kaçının, çünkü bu ciddi yan etkilere veya ölüme yol açabilir. Hava kabarcıkları, kateter hatalı yüklenmesi veya tüpteki sızıntılardan kaynaklanabilir.
    1. ICA'ya bir damar klipsi yerleştirin ve CCA'nın etrafında önceden hazırlanmış proksimal düğümlerden birini sıkın (bkz. adım 2.4.3).
    2. Mikro-makas kullanarak, ligasyon ipliğine yaklaşık 0,5 mm distal ECA'da küçük çapraz bir kesi yapın. Kesi boyutunun kateter çapından biraz daha küçük olduğundan emin olun.
    3. Kanı steril bir bez veya doku ile emin, ligasyonlar ve damar kliplerinden kanın geçmesinin önüne geçmemesini sağlayın.
      NOT: ECA kesisinden sonra damar üçgeni kandan arınmış kalmalıdır. Kalıntı kan, karotis akışının geri sağlanmasıyla büyük beyin iskemik olaylarına yol açabilecek veya ECA'yı engelleyerek mikroküre enjeksiyonunu engelleyen pıhtı oluşumuna yol açabilir.
    4. Kateter ucunda bir damla mikroküre karışımı oluşturmak için şırınga pompasını kısa süreliğine çalıştırın, böylece kateter ucunda hava kalmadığını doğrulayın.
    5. ECA kesisini açın ve ince mikroforseps kullanarak kateteri takın. Yerleştirme sırasında mikroküre karışımının kaybını veya katetere hava girişini önlemek için diğer yüzeylere dokunmaktan kaçının. Yerleştirme başarısız olursa veya kateter ucu bir yüzeye değerse, tekrar denemeden önce 2.6.4 adımını tekrarlayın.
    6. ECA'da kateteri, ECA etrafındaki proksimal dikişi (bkz. step 2.4.5.) sıkılaştırarak sabitleyin.
    7. Damar içinde kaçak veya hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için şırınga pompasını 10 μL/dakika ile başlatın. Eğer bunlardan biri varsa, kateteri ayırın ve 2.6.4. adıma geri dönün.
    8. Eğer herhangi bir sızıntı veya hava kabarcıkları tespit edilmezse, kateter ve damardaki basıncı kademeli olarak artırmak için 10 μL/dakika ile pompalamaya devam edin ve arter belirgin bir genişleme gözlemlenene kadar. Hayvanın arter basıncına uymak için, ICA ve CCA yeniden açılmadan önce kateter ve damarlarda yeterli basınç oluşturun. CCA ve ICA'da kan akışı yeniden sağlandığında, biraz kan katetere girebilir, ancak daha sonra ICA'ya tekrar enjekte edilir. Mikrosfer karışımının ECA'ya enjekte edildiğini ve basınç birikiminin başarılı olduğunu görsel olarak doğrulamak, yeşil FITC boyasının arterleri doldurduğunu gözlemlemek. Eğer bu gözlemlenmezse, şırınga pompasını durdurun, kateteri çıkarın ve 2.6.4'ten 2.6.8'e kadar olan adımları tekrarlayın.
    9. ICA'dan kap klipsini çıkarın, ardından şırınga pompası akış hızını 20 μL/da'ya çıkarın. PPA bifurkasyonuna karşı ICA'nın FITC boyası ile doldurulduğunu doğrulayarak başarılı mikroküre enjeksiyonunu doğrulayın. Onaylanırsa, 2.6.11 adımına geçin; Eğer yoksa, 2.6.10. adıma geçin.
    10. Şırınga pompasını durdurun ve PPA ligasyonunu gevşedin. PPA ligasyonunu ICA-PPA bifurkasyonundan daha distal olarak yeniden konumlandırın, ardından ligasyonu sıkılaştırın. 2.6.9. adıma geri dön.
    11. Mikrosfer karışımının ICA'ya akmasını sağlamak için CCA'yı bağlayan ipliği çıkarın.
    12. Mikroküre karışımının enjeksiyonu sırasında retrograd akış durumunda sorun giderilmesi:
      1. Mikroküre karışımının CCA'ya retrograd akışı gerçekleşirse, şırınga pompası akışını 10 μL/da'ya düşürün.
      2. Retrograd akış devam ederse, mikroforseps kullanarak ECA, ICA ve CCA'yı nazikçe sıkarak trombus nedeniyle akışta bir tıkanıklık olmadığından emin olun.
      3. Damar içinde hava embolüsü olmadığını görsel olarak doğrulayın. Hava embolusu, damar içinde şeffaf bir kesit olarak tanınabilir.
      4. Hava embolüsü varsa, şırınga pompasını durdurun ve hava embolüsünü mikro forseps ile arterayı nazikçe sıkarak ECA'ya taşıyın. CCA'yı bağlamak ve ECA'ya bir damar klipsi yerleştirmek. Kateter ve hava embolüsünü çıkarın ve 2.6.4. adıma geri dönün.
      5. Eğer herhangi bir engel yoksa ancak retrograd akış devam ediyorsa, CCA'yı bir kap klipsi kullanarak kapatın ve 2.6.10 adımına geri dönün.
        NOT: Mikrosfer karışımının CCA'ya retrograd akışı olmamalıdır; çünkü bu, ICA'nın yetersiz yeniden açılması, hava embolizması veya trombus oluşumu gibi deney sonucunda potansiyel olarak zararlı etkiler gösterebilir.
    13. Kateterdeki karışım 80 μL seviyesine ulaştığında şırınga pompasını kapatarak mikroküre enjeksiyonunu durdurun (bkz. adım 3.1.4). Toplam 80 μL FITC-Dextran/Tween20 ve 7.2 x 104 mikroküre enjekte edilir.
  7. İşlemin tamamlanması
    1. CCA'yı kalan hazırlanmış düğümle (bkz. step 2.4.3) ve ICA'yı kap klipsiyle kapatın.
    2. Kateteri ECA'dan çıkarın ve kateteri ECA'da sabitleyen ipliği aynı pozisyonda tutun.
    3. Kateteri sabitleyen ipliği sıkarek ECA'yı kalıcı olarak bağlayın.
    4. Kan akışını yeniden sağlamak için damar klipsini ve CCA, ICA ve PPA'nın etrafındaki iplikleri çıkarın. Ameliyat bölgesini birkaç damla salin ile nemlendirin.
    5. Deriyi ters kesim 3/8 ölçümde, 12 mm kavisli iğne ve emilmeyen 3-0 (USP) ipek dikiş ile dikin.
  8. Ameliyat sonrası bakım
    1. Deri altı yoluyla 5 mg/kg Karprofen verin.
    2. Hayvanı 30-60 dakika boyunca kurtarma kafesine (~33 °C) transfer edin. Hayvanı tamamen iyileştikten sonra ev kafesine geri gönderin.
    3. İlk 2 gün boyunca chow yemeği 0,06 mg/mL Karprofen ile 10 dakika bekletin ve hayvana verin, içme suyuna 0,06 mg/mL Karprofen ekleyin. Bu dönemden sonra, hayvan ameliyat öncesi ağırlığına dönene kadar Karprofen olmadan ıslatılmış yemek vermeye devam edin.
    4. İlk 2 gün boyunca hayvanı günde birkaç kez, ardından haftada 3 kez izleyin. İnsancıl bir son noktaya ulaşılırsa hayvanı ötenazi yapın.
      NOT: İnsan uç noktaları, Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/EU Direktiki'ne göre tanımlanmıştır. Ayrıca, mikrovasküler emboli modeli büyük bir iskemik olaya neden olmamalı, iskemi belirtileri gösteren herhangi bir hayvanı ötenazi yapın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Mikrovasküler emboli cerrahisi. Mikrovasküler emboli ameliyatı sırasında kritik adımların ayrıntılı örnek resimleri ve şematik çizimleri. (A) CCA (2 kat), ECA (2 kat), TA, OA ve PPA ligasyonlarının hazırlanması (adım 2.4). (B) CCA (1.saniye) ve ECA'nın (Temporal) Bağlanması, ardından OA ve PPA'nın kapatılması ve ICA'nın geçici olarak damar klipsiyle kapatılması, böylece ECA'da kanamadan kesi yapılmasını mümkün kılarak (adım 2.6.2). (C) Kateterlerin disseksiya edilen ECA'ya yerleştirilmesi, bunlar ikinci dikişle birbirine bağlanır (adım 2.6.7). (D) CCA'nın etrafındaki proksimal dikişin açılması ve kan akışını yeniden sağlamak için ICA'dan damar klipsinin çıkarılması, ardından mikroküre karışımının ICA'ya enjekte edilmesi (adım 2.6.10). CCA = Ortak karotis arter; ECA = Dış karotis arter; TA = Tiroid arter; OA = Oksipital arter; PPA = Pterygopalatin arter; ICA = İç karotis arter. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. In vivo görüntüleme

  1. İki foton mikroskopisi
    1. Hayvanı ameliyat sonrası in vivo görüntüleme için mikroskobun iki fotonlu görüntüleme tutucusuna yerleştirin. %30 oksijen ve %70 hava karışımında %1,2 izofluran içeren hafif anestezi sürdürün ve nefes sıklığı ile derinliğini takip edin. Mikroskop kurulum detayları için Ek Tablo 1'e bakınız.
    2. 10x objektif (10x/0.30 DRY) ve cıva lambası aydınlatması ile kranial pencereden yerleşmiş mikroküreleri konumlandırın. Sonra, 25x suya daldırma hedefiyle (25x/0.95 SU) iki fotonlu görüntülemeye geçin. Görüntüleme ayarları için Ek Tablo 2'ye bakınız.
    3. İlgilendiğiniz mikroküre etrafında Z-yığınlarını kaydet.

4. Otopsi sonrası analiz

  1. Yerinde görüntüleme için deneysel son nokta
    1. Deneysel son noktaya ulaşıldığında, hayvanı %4 isofluran altında %30 oksijen ve %70 tıbbi hava karışımında %>4 izofluran altında servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın.
  2. Yerinde beyin görüntüleme
    1. Beyni çıkarın, %3,0 karboksimetilselüloz sodyum çözücüsüne (Sigma) gömülüp, %0,1 siyah mürekkep (VWR) ile karıştırın ve −20 °C'de en az 24 saat dondurun.
    2. Daha önce Juch R.N.S. ve ark.40 tarafından tanımlanan, özel hazırlanmış küçük bir 3D Floresan Görüntüleme Kriyomikrotom Sistemi (küçük-3D-FICS) kullanarak beyni görseller. 40. Sistemi beyni dikey olarak 16 μm kesitlere ayıracak şekilde ayarlayın ve görüntüyü 13,66 × 13,66 μm çözünürlükte ayarlayın. Görüntüleme ayarları ve sistem spesifikasyonları için Ek Tablo 3 ve Ek Tablo 4'e bakınız. Articulusyazılımı 41 kullanarak görüntüleri analiz edin.
  3. Yerinde tüm fare görüntüleme
    1. Hayvanın derisini, dişlerini ve kuyruğunu çıkarın.
      NOT: Kuyruk çıkarımı isteğe bağlıdır ancak görüntüleme hızını artırır.
    2. Hayvanı %3,0 karboksimetilselüloz sodyum çözücüye (Sigma) %0,1 siyah mürekkep (VWR) ile karıştırın ve −20 °C'de en az 24 saat dondurun.
    3. Daha önce tanımlandığı gibi, özel yapımı büyük bir 3D Floresan Görüntüleme Kriyomikrotom Sistemi (büyük-3D-FICS) kullanarak hayvanı görebilirsiniz 42. Sistemi 26.09μm düzlem çözünürlükte 25.9 μm kesitler kesecek şekilde ayarlayın. Görüntüleme ayarları ve sistem özellikleri için Ek Tablo 5 ve Ek Tablo 6'ya bakınız. Articulusyazılımı 41 kullanarak görüntüleri analiz edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ölüm sonrası yerinde görüntüleme

Mikrovasküler embolizm ameliyatının başarısı, mikrovasküler emboli ameliyatından 4 gün sonra tüm vücut ve tam beyin yerinde otopsi görüntüleme ile doğrulandı (Şekil 3A). Bir farenin sagital dilimi, beyinde mikrokürelerin yerleşmesini gösterir. Şekil 3B,C, mikrovasküler emboli sonrası 1 gün sonra çıkarılan fare beynine örnek gösterilmektedir. Mikroküreler ağırlıklı olarak ipsilateral yarımkürede, orta ve ön beyin arterlerinin akış bölgesinde sıkışmıştı. Tween20 karışıma eklendiğinde beyin dilimlerindeki mikrosfer sayısı önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3E). Mikro-embolizm ameliyatı sonrası iyileşme sırasında kilo izlenmesi, farelerin Tween20 içeren bir mikroküre karışımı enjekte edildiğinde daha az kilo verdiğini ve ameliyattan sonra daha hızlı iyileştiğini göstermektedir (Şekil 3F).

figure-results-1
Şekil 3: Mikrovasküler emboli ameliyatı sonrası farede mikrokürelerin dağılımı Farede 10 μm mikrokürelerin yerinde lokalizasyonu, Articulusyazılımı 41 kullanılarak görselleştirildi. (A) Mikrovasküler emboli ameliyatı sonrası büyük-3D-FICS ile görüntülenen bir fare sagittal düzlem örneği. (B-D) Fare beyninin temsil eden eksenel, koronal ve sagital görüntüleri, küçük 3D-FICS kullanılarak görüntülenmiştir. (E) Kontrol ve Tween20 koşulları için yaklaşık bregma ± 0,5 mm bregmada 50 μm koronal beyin kesitlerinde tespit edilen mikroküre sayısının ortalaması. Barlar, ortalama ± standart sapmayı temsil eder. Bireysel ölçümler nokta olarak gösterilir. İstatistiksel karşılaştırma, eşleşmemiş bir t-testi kullanılarak gerçekleştirildi; p-değeri grafikte gösterilmiştir. Dışnamalar, her iki grup için de n = 1 olan çeyreklerarası aralık (IQR) yöntemiyle belirlendi ve çıkarıldı; böylece kontrol için n = 3, Tween20 için ise n = 14 nihai grup büyüklüğü elde edildi. (F) 0 noktasında mikrovasküler emboli ameliyatı sonrası zamanla normalleşmiş kilo değişiklikleri. Ağırlıklar, ameliyatta her hayvanın temel seviyesine göre normalleştirildi. Çizgiler, grup başına ortalama ± SD gösterir (Kontrol, n = 4; Tween20, n = 5) Control mavi, Tween20 ise koyu turuncu renkte. Her zaman noktasında gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılık, eşleşmemiş iki kuyruklu t-testleri kullanılarak değerlendirildi. (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Mikrosfer enjeksiyonu ve in vivo iki foton mikroskopisi

Mikroküre enjeksiyonu sırasında, %5 BSA ile kaplanmış kateterler, kateter yüzeyine birçok mikrosferin yapıştığını ve akan mikrokürelerin sıklıkla kümelenmiş olduğunu, bu da daha büyük tıkanıklıklara neden olabileceğini gösterdi (bkz. Ek Video 1). Ayrıca, yapışma ve kümelenmeyi önlemek için mikrosfer karışımına %5 BSA eklemek, enjeksiyonda olası bir bağışıklık yanıtınedeniyle istenmeyen bir durumdur 43,44. Bunu aşmak için, mikrosfer karışımında %0,1 Tween20 çözümü kullanıldı; bu da kateterden akan mikroküre sayısının belirgin şekilde artmasına ve görüntüleme penceresinde istenen (> 20) mikrosferin oluşmasına yol açtı (Şekil 4 ve Ek Video 2). Şekil 4A,B, mikrovasküler emboli ameliyatından 0,5 saat sonra beyin korteksinin floresan mikroskopik genel görüntüsünü göstermektedir. Her beyaz nokta, beyin mikrodamar sistemindeki bir kapilleri kapatan bir mikroküreyi temsil eder. Şekil 4C,D, örnek olarak iki fotonlu z-yığını görüntüleri olan 2B projeksiyonu gösterir. Mikrosferler, mikrosferin aşağısında intraluminal boya eksikliğiyle belirtildiği ve perfüzyonun bozulmuş serebral mikrovasküler embolizmalarına neden olur (Şekil 4E ve Ek Video 3). Ayrıca, bu embolizmalar FITC-Dextran boyasının ekstravazasyonuyla BBB'nin bozulmasına neden olur (Şekil 4F,G).

Bu sonuçlar, katetere yapışan az sayıda mikrosfer ve mikrosfer-Tween karışımı enjekte edilirken kateterde gözlemlenen minimal mikrosfer kümelenmesiyle uyumludur. Ancak, kateterdeki mikrosfer karışımının son 20 μL'sinde çok sayıda mikroküre bir araya gelmiştir; bu karışım büyük bir enfarktüsün olası oluşmasını önlemek için enjekte edilmemelidir ( bkz. Ek Video 4).

figure-results-2
Şekil 4: Sıkışmış mikrokürelerin iki-foton in vivo mikroskopisi.Fare korteksinde sıkışmış mikrokürelerin in vivo floresan ve iki fotonlu görüntüleri örnekleri. (A) Kulübelerin kafatası penceresinden floresan genel bakış (lodman) mikroküreleri. (B) Seçilen ROI'nin floresan görüntüsü. (C,D) Detaylı görüntüleme için seçilmiş yatırım getirisi ile serebral mikrosirkülasyonda hapsolmuş mikrokürelerin iki foton mikroskopi görüntüleri. Z-yığını görüntüleri, Z-yığını boyunca piksel yoğunluklarının standart sapması hesaplanarak 2B olarak gösterilir. (E-G) Üç beyin mikrovasküler embolizmi gösteren in vivo iki foton mikroskopi görüntüleri. Kırmızı oklar, FITC-Dextran ekstravazasyonu alanlarını vurgular; bu da BBB bozulması ve boya sızıntısını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: İki foton mikroskop sistemi spesifikasyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: FITC-dextran ve mikrosfer görüntüleme için iki foton mikroskop ayarları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: Küçük 3D floresan görüntüleme Mavi mikrokürelerle fare beyin görüntüleme için kriyomikrotom sistem ayarları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: Mavi mikrokürelerle fare beyin görüntülemesi için küçük 3D floresan görüntüleme kriyomikrotom sistemi spesifikasyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 5: Kırmızı mikrokürelerle tüm fare görüntüleme için büyük 3D floresan görüntüleme kriyomikrotom sistemi ayarları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 6: Kırmızı mikrokürelerle tüm fare görüntüleme için büyük 3D floresan görüntüleme kriyomikrotom sistemi spetektifikasyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: %5 BSA kaplı kateter, kateter duvarına mikrosfer yapışması ve enjeksiyon sırasında 25 mg/mL FITC-Dextran mikrosfer karışımında mikrosfer kümelenmesi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: %0,1 Tween20 kaplı kateter, kateter duvarına biraz mikrosfer yapışması ile ancak enjeksiyon sırasında %0,1 Tween20 karışımı ile 25 mg/mL FITC-Dextran ile mikrosfer kümelenmesi olmadan. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 3: Mikrovasküler tıkanıklıkların mikrosferler tarafından 3D segmentasyonu. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 4: Yüksek mikrosfer konsantrasyonu ile 25 mg/ml FITC-Dextran ile %0,1 Tween20 karışımı ile mikrosfer enjeksiyonunun son hacmi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Mikrosferin pipet uçlarına uyum doğrulaması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Mikroembolizm ameliyatından 1, 7 ve 28 gün sonra CD45 kapsamının immünohistokimyasal değerlendirmesi, ipsilateral ve kontralateral yarımkürelerin karşılaştırılması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrovasküler embolizmleri modellemek için, mikrosferlerin fare beyin dolaşımına enjekte edilmesine yönelik bir protokol tanımlanmıştır; bu protokol, in vivo iki foton mikroskopi kullanılarak mikro-embolizmin incelenmesine olanak tanır. Bu yöntem, ipsilateral korteksin ilk 500 μm içinde birden fazla mikrosferin hapsedilmesiyle beyinde mikrosfer tutulmasını optimize etti ve etkili iki fotonlu görüntülemeyi mümkün kılmıştır.

Beynin kortikal bölgesinde yüksek mikroküre sayısı, in vivo iki foton görüntüleme için çok önemlidir. Mikrosfer karışımının hazırlanması sırasında, pipet uçları %5 BSA veya %0,1 Tween20 ile kaplanarak mikrosfer yapışmasını azaltarak mikroküre kaybı en aza indirildi (bkz. Ek Dosya 1). Yapışan mikrokürelerin tam sayısı nicelenemese de, ortalama yoğunluk ölçümleri kaplamaların etkisini gösterdi. Ayrıca, Tween20 kateterde mikrokürelerin kümelenmesini önlemiş gibi görünmüştür; bu da kateterden görsel olarak daha fazla tekil mikroküre akmasına yol açmıştır, ancak bu ölçülmemiştir. Bu, büyük damar tıkanıklığı riskini ve mikrovasküler embolizasyonları modellemek amacıyla istenmeyen büyük iskemik ve hipoksik bölgelerin oluşma riskini azaltır. Ayrıca, fareler düşük Tween20 konsantrasyonları içeren mikroküre karışımı enjekte edildiğinde daha az kilo kaybı göstermiş ve ameliyat öncesi kilolara daha hızlı toparlanmıştır. Tween20 yaygın olarak kullanılan bir dağıtıcımaddedir 45,46,47, bu nedenle bu çalışmada kullanılan düşük konsantrasyonların BBB bütünlüğü üzerinde herhangi bir toksisite veya olumsuz etki yaratması beklenmiyor. Ayrıca, verilerimiz BBB sızıntısının yalnızca mikrosferin yerleştiği yerin yakınında (veya geçtikten sonra) gerçekleştiğini ve sistematik olarak gerçekleşmediğini, toplam lökosit kapsamında önemli bir artışa yol açmadığını göstermektedir (bkz. Ek Dosya 2), %0,1 Tween20 kullanımını desteklemektedir. Genel olarak, Tween20'nin eklenmesi mikrokürelerin kümelenmesini azaltır ve beyin dilimindeki mikrosfer sayısıyla doğrulanan mikroküre ulaşımını artırır; bu da beyin dilimlerindeki mikrosfer sayılarıyla doğrulanır ve iki foton mikroskopisi için yeterli mikroküre görünür hale getirir. Tween20 kullanımı beyinde bulunan mikroküre sayısını artırsa da, mikroküre enjeksiyonundaki değişkenlik devam etmektedir. Bu varyasyonun birkaç nedeni olabilir. İlk olarak, kateter veya damar içinde trombus oluşumu, mikrokürelerin pıhtı tabakasına yapışmasına neden olabilir. İkincisi, hava kabarcıklarının varlığı düzgün teslimatı engelleyebilir. Son olarak, CCA veya ICA'da kan akışının eksik restorasyonu hemodinamiği değiştirebilir ve bu da mikrosferin damar duvarına yapışmasını veya lümen içinde kümelenmesini teşvik edebilir. Ne yazık ki, bu sapmalar enjeksiyon işlemi sırasında tespit edilemiyor.

Polistiren mikroküreler sudan daha yoğundur ve mikrosfer karışımı katetere yüklendiğinde düzensiz dağılıma yol açar. Çoğu mikroküre, daha hızlı merkezi akışa göre sıvı sürtünmesinin hareketini yavaşlattığı kateter duvarına yakın yerleşir. Bu durum sonunda kateterin son 20 μL'sinde mikrokürelerin birikmesine yol açar. Bu yoğun kısmı enjekte etmekten kaçınılmalıdır, çünkü büyük emboli ve iskemik olaylara yol açabilir. Bunu önlemek için, mikrosfer karışımı hacmi hedeflenen enjeksiyon hacminin iki katı olarak hazırlanmalıdır.

Mikrovasküler emboli ameliyatı, kapsamlı eğitim ve hassasiyet gerektirir. Teknik olarak en zor adımlardan biri, mikroküre karışımının Willis ve MCA bölgesine doğru şekilde ulaşmasını sağlamak için PPA, OA ve yan dalların etrafına dikiş yerleştirmektir. Bu adım, vagus sinirinin CCA'ya yakın olması, damarların küçük çapı ve sınırlı cerrahi alan nedeniyle karmaşıktır; bu da dikişlerin sinir hasarı veya damar yaralanması olmadan konumlandırılmasını zorlaştırır.

Damar klipsi, PPA'yı geçici olarak dikiş kullanarak bağlamak yerine alternatif olarak değerlendirilebilir, ancak ek riskler getirir. Klipsler istemeden ayrılabilir ve kapların yeniden açılmasına yol açabilir. Ayrıca, PPA'da mevcut klipsle birlikte ikinci bir klipsin kullanılması, sınırlı alan nedeniyle ICA klipsinin ayrılma olasılığını artırır. Eğer bu olursa, ciddi bir kanamaya yol açar ve hemen müdahale edilmezse, deneyin erken sona ermesine yol açabilir. Bu nedenle, PPA'nın kap klipsi ile kapatılması önerilmez.

Mevcut protokol, mikrosfer enjeksiyonu için bir şırınga33 yerine kateter kullanıyor. Bu yaklaşım, enjeksiyon hızı ve hacmi üzerinde daha iyi kontrol sağlar ve mikrokürelerin daha uzaktan enjeksiyonunu sağlar (örneğin, mikroskop veya MRI tarayıcı gibi görüntüleme modaliteleri içindeyken).

Giriş noktası olarak CCA yerine ECA'nın seçilmesi, enjeksiyon işlemi sırasında CCA'nın tamamen açık kalmasını sağlar ve bu da cerrahi işlem boyunca daha fizyolojik bir beyin perfüzyonu sürdürür. Ayrıca, mikrokürelerin CCA yerine ECA ile enjekte edilmesinin başka avantajlarıda vardır 48: i) reperfüzyon sırasında toplam çalışma süresinin kısaltılması; ii) enjeksiyon sırasında ve ameliyat tamamlandıktan sonra kanama riskinin azalması; iii) CCA giriş yöntemi ile, iğneçıkarıldıktan sonra CCA'da kararsız bir stenoz ve tromboz oluşur 49. Bu durum kan akışının bozulmasına ve mikrotrombi oluşumu riskini artırır; bu riski beyne ulaşabilir. Ayrıca, CCA ile girmek, CCA'nın kalıcı olarak kapanma riskini büyük bir şekilde taşır; bu da ameliyat sonrası hayatta kalma döneminde optimal olmayan beyin reperfüzyona yol açabilir; bu durum, farelerde Willis çemberindeki yüksek varyasyonla daha da kötüleşebilir50,51

Tamamen optimize edilmiş olmasına rağmen, protokolün bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, mikrosferlerin kateter duvarları boyunca daha yavaş hareket ettiği ve enjeksiyon sırasında eşit dağılmadığı gözlemi, ICA'ya beklenenden daha az mikroküre iletildiğini göstermektedir. Tween-20'nin yapışmayı azaltmak için kullanılmasına rağmen, bazı mikroküreler pipet uçlarına, Eppendorf tüpüne ve katetere yapışmaya devam eder. Sonuç olarak, enjekte edilen gerçek mikroküre sayısı, fare başına hesaplanan 7.2 x 104 parçacıktan muhtemelen daha düşüktür. Buna rağmen, iki foton mikroskopiyle görüntüleme yapılabilecek kadar yeterli mikroküre beyin dolaşımına ulaşır. Enjeksiyon protokolü ve karışım bileşimi 10 μm polistiren mikrosferler için optimize edilmiştir. Kullanılan malzemeler (uçlar, tüpler, kateterler) veya mikrokürelerin boyutu değiştirilirse, hem çözelti hem de enjeksiyon prosedürü buna göre yeniden değerlendirilmelidir. İkinci olarak, MCA'nın intraluminal tıkanmasıyla büyük damar tıkanması için en iyi yöntemi araştıran çalışmalar, damar sisteminin ECA'nın kalıcı ligasyonu ile girişinin çişme ve yutma kaslarında iskemiye yolaçtığını göstermiştir 52. Bu durum, farelerde yiyecek alımının azalmasına, dolayısıyla aşırı kilo kaybı, motor fonksiyonun bozulması ve nörolojik eksikliğin artmasına yol açabilir. Ancak bu ifade diğerleri tarafındançelişmiştir 48. Bu çalışmada, kilo izleme ameliyattan sonra beklenen bir düşüş gösterdi ancak birkaç gün içinde ameliyat öncesi ağırlıklara hızlı bir şekilde toparlandığını gösterdi ve bu da farelerin kalıcı ECA ligasyonundan sonra normal şekilde iyileşip yediğini, içtiğini gösteriyor. Hayvanların ağırlığı izlenmiş olsa da, bu sadece hayvanların iyiliğinin dolaylı bir göstergesidir ve lokal çişme veya motor eksiklikler gibi fonksiyonel bozuklukları tamamen dışlamaz. Fonksiyonel iyileşme üzerine doğrudan değerlendirme yapılmamıştır, bu da bu çalışmanın bir sınırlamasıdır. Başka bir çalışmada damar sisteminin CCA veya ECA ile girişini karşılaştırmış ve CCA ile girişin beyin dolaşımında reperfüzyonun bozulabileceğini göstermiş ve ECA giriş yönteminin tercih edildiğisonucuna varmıştır 53. Üçüncüsü, hava kabarcıkları, kan pıhtıları veya sızıntı oluşturmadan, CCA ve ICA'da akışı engellemeden doğru ve güvenli kateter yerleştirmesi önemli bir uygulama gerektirir. Son olarak, Rose-Bengalenjeksiyonu 22 kullanılarak yapılan fototromboz gibi diğer mikro-tıkanma yöntemlerinin aksine, mikrokürelerin dolaşımda nihayetinde nerede yerleşeceği tahmin edilemez.

Mevcut çalışma, negatif (sahte) veya pozitif (fototromboz) kontrol gruplarını kasıtlı olarak dahil etmiyor, çünkü bunlar birincil amaç için ek değer sağlamaz. Bu modelin başarısı, özellikle kraniyal pencere alanında serebral mikrosirkülasyon içinde bulunan mikroküre sayısıyla tanımlanır ve böylece yüksek çözünürlüklü in vivo mikroskopi sağlanır. Sahte bir prosedür, tanım gereği hedef bölgede mikroküre oluşturmaz ve bu nedenle in vivo görüntüleme uç noktası için ilgili bir karşılaştırma sunmaz. Benzer şekilde, fototromboz modelinin dahil edilmesi, temelde farklı bir patofizyolojik mekanizmayı ele alacak ve bu nedenle bu çalışmanın kapsamının dışındadır; bu çalışma, metodolojileri karşılaştırmak yerine mikrovasküler embolizm modelini karakterize etmeye odaklanmaktadır. Embolizmlerin daha geniş histolojik analizleri ve bunların BBB veya yerel nöron dokusu üzerindeki potansiyel etkileri yürütülmedi; çünkü çalışma, doku düzeyinde doğrulama yerine in vivo 3D görselleştirmeyi önceliklendirmek üzere tasarlandı.

Hem kranial pencere hazırlığı hem de mikrovasküler embolizm modeli için ayrıntılı cerrahi protokol, mikrovasküler embolizmle ilişkili mikrovasküler değişikliklerin ve ipsilateral yarımküre boyunca sessiz beyin enfarktlarının görülmesinin güvenilir ve tekrarlanabilir şekilde araştırılmasını destekler. Mikrosfer karışımının optimize edilmiş hazırlanması ve enjeksiyonu, bu deneysel yaklaşımın tutarlılığını ve geçerliliğini daha da artırır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, yerinde 3B görüntü rekonstrüksiyonlarında kullanılan Articulus yazılımını geliştirdiği için Dr. Iwan Dobbe'ye içten teşekkürlerini sunmak isterler. Ayrıca, evde yetiştirme için kullanılan TIE2-GFP farelerini (Jackson Laboratuvarı, Stok No. 003658) sağlayan Prof. Dr. Nikolaus Plesnila'ya teşekkür ederiz.

Bu çalışma, Amsterdam Neuroscience (813294 I.M.), Amsterdam Kardiyovasküler Bilimler (Ekipman çağrısı 2021 ve 2023 to I.M.) ve Dutch Heart Foundation (03-006-2021-T019 to I.M.) tarafından finanse edilmiştir.

Bu araştırma ayrıca Hollanda Kalp Vakfı ve Hollanda Beyin Vakfı tarafından finanse edilmekte olup, Hollanda Kardiyovasküler İttifakı ile iş birliği içinde yürütülmekte ve desteklenmekte, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Ayrıca, bu çalışma kısmen Stryker, Medtronic ve Penumbra tarafından sınırsız finansman yoluyla finanse edilmiştir. Bütçe kaynakları çalışma tasarımı, izleme, veri toplama, istatistiksel analizler, sonuçların yorumlanması veya makale yazımı gibi işlerde yer almamıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
27 kalibre iğne (0.1x16 mm)Terumo-27 kalibre iğne (Adım 2.1.2.)
Articulus yazılımı--3D analiz yazılımı (Adım 4.2.2 & 4.3.3)
Betadin 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadin/iyot (Adım 1.1.8. & 2.2.10.)
C& B monomeriSun Medical7111Süper yapıştırıcının bileşeni (Adım 1.3.1.)
Karbon Çelik Cerrahi Bıçaklar (nr.15)Swann-Morton205Kafatasını tırmalamak için bıçak (Adım 1.2.4.)
Karprofen (50 mg/ml)Zoetis-Ağrı kesici ilaçlar (adımlar 1.1, 1.6, 2.2 ve 2.8)
KatalizörSun Medical7110Süper yapıştırıcının bileşeni (Adım 1.3.1.)
Kateter (ID 0,31 OD 0,64 mm)Freudenberg228-0661Şeffaf kateter (Adım 2.1.1.)
Kostom doku kancası yapıldı--Doku kancası (Adım 2.3.4.)
Pamuk uçları--Pamuk uç (Adım 1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
Kapak camıWarner enstrümanları64-0724Kafatası pencere kapağı camı (Adım 1.4.2.)
Özel yapımı fare kafa çubuğu--Görüntüleme tutucusu için başlık çubuğu (Adım 1.3.2.) 
Özel fare görüntüleme tutucusu --Görüntüleme fare tutucu (Adım 1.4.1. & 3.1.1.)
Özel yapımı stereotaktik çerçeve--Stereotaktik çerçeve (Adım 1.1.7.)
Diş kamenti SıvısıKulzer64707937Diş çimentosunun bileşeni (Adım 1.3.3.)
Diş mezar tozuKulzer64707945Diş çimentosunun bileşeni (Adım 1.3.3.)
Diş matkapı Saeshin  L-206Tatbikat (Adım 1.4.3.)
Deksametazon (4 mg/ml)Centrafarm-Ameliyat öncesi ilaç (Adım 1.1.4.)
Penslerin diseksiyonBraun-AesculapBD023RForseps (Adım 1.2.2. & 2.3.2.)
matkap burr ucu PK/100,5 (0.5mm)Güzel Bilimler19007-05Matkap ucu (Adım 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Göz merhemi (Adım 1.1.8. & 2.2.7.)
Epoksi yapıştırıcı (1g)Pattex9H PSMG3XEpoksi yapıştırıcı (Adım 1.5.2. & 2.1.1.)
İnce mikro forseps DüzGüzel bilim araçlarıDumont #5İnce mikro forseps (Adım 2.6.6.)
FITC-Dextran (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SFITC-Dextran çözümü (Adım 2.5.2.)
İzofluran (1000 mg/g)Laboratorios Karizoo S.A.118938Anestezi (Adım 1.1.6. & 2.2.5.)
büyük 3D Floresan Görüntüleme Kriyomikrotom  Özel yapım-large-3D-FICS (Adım 4.3.3)
Lidokain (100 mg/ml)Aspen-Lokal anestezik (Adım 1.2.3. & 2.2.10)
Mikro makas Vannalar 3-3/8 İnçBraun-AesculapOC498RMikro makas (Adım 2.6.2)
Yuvarlak Saplı Mikro Dikiş Bağlama PensetleriBraun-AesculapFD280RMikroforeceps (Adım 2.3.3.)
Yuvarlak saplı mikro dikiş bağlama pensleriBraun-AesculapFD281RMicroforeceps bükülü (Adım 1.5.1. & 2.3.3.)
Mikro damar klipsiBraun-AesculapFD562RGemi klipsi (Adım 2.6.1.)
Mikro-kateter (ID 0.23114 mm OD 0.27432 mm)MikrolümenMikro-kateter (Adım 2.1.1.)
Fare Isıtma Pedi ve Rektal ProbStoelting53800RIsıtma pedi (Adım 1.1.2. & 2.2.2.)
NG2-DsRed fareleriJackson Laboratuvarı, Bar Harbor, ABD, Stok No. 008241
Polietilen glikol sorbitan monolaratSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Adım 2.5.2.)
Polistiren Flor Küreleri Mavisi (365/415)InvitrogenF8829Mavi mikroküreler (Adım 2.5.1.)
Polistiren FlorKüreler kırmızı (580/605)InvitrogenF8834Kırmızı mikroküre (Adım 2.5.1.)
Kurtarma kafesi--İyileşme kafesi (Adımlar 1.6.2. & 2.8.2.)
3/8 kavisli iğneyi (12mm) ters kesim ve dikişBbraun0762067Dikiş (Adım 2.7.5)
Ropivacaï ne (2 mg/ml)--İlaç & nbsp; (Adım 1.1.5.)
küçük 3D Floresan Görüntüleme Kriyomikrotom    Özel yapımKüçük-3D-FICS (Adım 4.2.2)
SpongostanEtikonMS0005Spongostan (Adım 1.4.6.)
Cerrahi mikroskopEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BCerrahi için mikroskop (Adım 1.2. 2.1.1.)
Cerrahi makasBraun-AesculapBC303RCerrahi makas (Adım 1.2.2. & 2.3.2.)
Şırınga pompası (1 ml şırıngalar için)Havard cihazı70-22081 ml şırınga pompası (Adım 2.5.6.)
İplik, 100 milyon, & nbsp; 4/0 1.5   BbraunF11340354/0.15 iş parçacığı (Adım 2.4.3.)
TIE2-GFP fareleriJackson Laboratuvarı, Bar Harbor, ABD, Stok No. 003658
Ultra saf toz makinesiThorlabsCA6-EUSıkıştırılmış hava (Adım 1.2.5.)
Evrensel Polimer ŞeffafSun MedicalT058ESüper yapıştırıcının bileşeni (Adım 1.3.1.)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
  2. Bernick, C., et al. Silent MRI infarcts and the risk of future stroke: the cardiovascular health study. Neurology. 57 (7), 1222-1229 (2001).
  3. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43 (11), 3102-3104 (2012).
  4. Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11 (3), 272-282 (2012).
  5. Adachi, T., Kobayashi, S., Yamaguchi, S. Frequency and pathogenesis of silent subcortical brain infarction in acute first-ever ischemic stroke. Intern Med. 41 (2), 103-108 (2002).
  6. Bokura, H., et al. Silent brain infarction and subcortical white matter lesions increase the risk of stroke and mortality: a prospective cohort study. J Stroke Cerebrovasc Dis. 15 (2), 57-63 (2006).
  7. Vermeer, S. E., et al. Silent brain infarcts and the risk of dementia and cognitive decline. N Engl J Med. 348 (13), 1215-1222 (2003).
  8. Gupta, A., et al. Silent brain infarction and risk of future stroke: a systematic review and meta-analysis. Stroke. 47 (3), 719-725 (2016).
  9. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E., van Bavel, E. Quantitative 3D analysis of tissue damage in a rat model of microembolization. J Biomech. 128, 110723(2021).
  10. Martinez Bravo, G., et al. Platelets in thrombosis and atherosclerosis: a double-edged sword. Am J Pathol. 194 (9), 1608-1621 (2024).
  11. Kell, D. B., Lip, G. Y. H., Pretorius, E. Fibrinaloid microclots and atrial fibrillation. Biomedicines. 12 (4), 494(2024).
  12. Hubbard, W. B., Dong, J. F., Cruz, M. A., Rumbaut, R. E. Links between thrombosis and inflammation in traumatic brain injury. Thromb Res. 198, 62-71 (2021).
  13. Dupré, N., Drieu, A., Joutel, A. Pathophysiology of cerebral small vessel disease: a journey through recent discoveries. J Clin Invest. 134 (10), e176987(2024).
  14. Idicula, T. T., Naess, H., Thomassen, L. Microemboli-monitoring during the acute phase of ischemic stroke: is it worth the time. BMC Neurol. 10, 79(2010).
  15. Bai, C. L., et al. A review on micro- and nanoplastics in humans: implication for their translocation of barriers and potential health effects. Chemosphere. 361, 142424(2024).
  16. Guan, Q., et al. The landscape of micron-scale particles including microplastics in human enclosed body fluids. J Hazard Mater. 442, 130138(2023).
  17. Alves, H. C., et al. Thrombus migration paradox in patients with acute ischemic stroke. Stroke. 50 (11), 3156-3163 (2019).
  18. Ragusa, A., et al. Plasticenta: first evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  19. Rotchell, J. M., et al. Microplastics in human urine: characterisation using µFTIR and sampling challenges using healthy donors and endometriosis participants. Ecotoxicol Environ Saf. 274, 116208(2024).
  20. Marfella, R., et al. Microplastics and nanoplastics in atheromas and cardiovascular events. N Engl J Med. 390 (10), 900-910 (2024).
  21. Knezic, A., Broughton, B. R. S., Widdop, R. E., McCarthy, C. A. Optimising the photothrombotic model of stroke in the C57Bl/6 and FVB/N strains of mouse. Sci Rep. 12 (1), 7598(2022).
  22. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke. J Vis Exp. (100), e52794(2015).
  23. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72 (4), 315-325 (1987).
  24. Demura, N., Mizukawa, K., Ogawa, N., Yamashita, K., Kanazawa, I. A cerebral ischemia model produced by injection of microspheres via the external carotid artery in freely moving rats. Neurosci Res. 17 (1), 23-30 (1993).
  25. Takeo, S., et al. Sustained damage to energy metabolism of brain regions after microsphere embolism in rats. Stroke. 23 (1), 62-68 (1992).
  26. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E. N. T. P., van Bavel, E. Recovery of hypoxic regions in a rat model of microembolism. J Stroke Cerebrovasc Dis. 30 (6), 105739(2021).
  27. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., van Bavel, E., Bakker, E. Perivascular clearance of blood proteins after blood-brain barrier disruption in a rat model of microinfarcts. Microvasc Res. 148, 104515(2023).
  28. Mayzel-Oreg, O., et al. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med. 51 (6), 1232-1238 (2004).
  29. Silasi, G., She, J., Boyd, J. D., Xue, S., Murphy, T. H. A mouse model of small-vessel disease that produces brain-wide-identified microocclusions and regionally selective neuronal injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 734-738 (2015).
  30. Shen, Y., et al. Histochemistry of microinfarcts in the mouse brain after injection of fluorescent microspheres into the common carotid artery. Neural Regen Res. 17 (4), 832-837 (2022).
  31. Inoue, K., Asaka, M., Lee, S., Ishikawa, K., Yanagihara, D. Gait disorders induced by photothrombotic cerebellar stroke in mice. Sci Rep. 13 (1), 15805(2023).
  32. Nowak, B., et al. Animal models of focal ischemic stroke: brain size matters. Front Stroke. 2, 15(2023).
  33. van der Wijk, A. E., et al. Microembolus clearance through angiophagy is an auxiliary mechanism preserving tissue perfusion in the rat brain. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 195(2020).
  34. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of biodegradable microspheres in the rat brain. Drug Deliv. 30 (1), 2194579(2023).
  35. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of microspheres in a rat model of silent brain infarcts. Stroke. 50 (6), 1590-1594 (2019).
  36. Rapp, J. H., et al. Cerebral ischemia and infarction from atheroemboli <100 µm in size. Stroke. 34 (8), 1976-1980 (2003).
  37. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465 (7297), 478-482 (2010).
  38. Grutzendler, J., et al. Angiophagy prevents early embolus washout but recanalizes microvessels through embolus extravasation. Sci Transl Med. 6 (226), 226ra31(2014).
  39. Spaan, J. A. E., et al. Visualisation of intramural coronary vasculature by an imaging cryomicrotome suggests compartmentalisation of myocardial perfusion areas. Med Biol Eng Comput. 43 (4), 431-435 (2005).
  40. Juch, R. N. S., et al. Home-use hyaluronic acid jet injectors: unreliable and unsafe. Dermatol Surg. 50 (1), 62-68 (2024).
  41. Dobbe, J. G. G., Roo, M. G. A. D., Visschers, J. C., Strackee, S. D., Streekstra, G. J. Evaluation of a quantitative method for carpal motion analysis using clinical 3-D and 4-D CT protocols. IEEE Trans Med Imaging. 38 (4), 1048-1057 (2019).
  42. Demkes, E., et al. Human cardiac microtissues display improved engraftment and survival in a porcine model of myocardial infarction. J Cardiovasc Transl Res. 18 (3), 512-528 (2025).
  43. Lei, H. Y., Lee, S. H., Leir, S. H. Antigen-induced anaphylactic death in mice. Int Arch Allergy Immunol. 109 (4), 407-412 (1996).
  44. Wiedmeier, S. E., Chung, H. T., Cho, B. H., Kim, U. H., Daynes, R. A. Murine responses to immunization with pertussis toxin and bovine serum albumin: I. Mortality observed after bovine albumin challenge is due to an anaphylactic reaction. Pediatr Res. 22 (3), 262-267 (1987).
  45. Weiszhár, Z., et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 45 (4), 492-498 (2012).
  46. Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
  47. Kelava, T., Ćavar, I., Čulo, F. Influence of small doses of various drug vehicles on acetaminophen-induced liver injury. Can J Physiol Pharmacol. 88 (10), 960-967 (2010).
  48. Hu, Y., et al. CCA repair or ECA ligation-which middle cerebral artery occlusion is better in the reperfusion mouse model. iBrain. 9 (3), 258-269 (2023).
  49. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  50. Zhao, L., Mulligan, M. K., Nowak, T. S. Substrain- and sex-dependent differences in stroke vulnerability in C57BL/6 mice. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 426-438 (2019).
  51. Bonnin, P., Mazighi, M., Charriaut-Marlangue, C., Kubis, N. Early collateral recruitment after stroke in infants and adults. Stroke. 50 (9), 2604-2611 (2019).
  52. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  53. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Floresan Mikrok relerKraniyal PencereIn Vivo G r nt lemeSerebral Mikrovask ler Okl zyonK lcal Damar T kanmasKan Beyin BariyeriKarotis Arter EnjeksiyonuFITC Dekstran

İlgili makaleler