Yöntem makalesi

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

DOI:

10.3791/68941

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Medical Faculty, Department of Pathophysiology, University of Belgrade, 2Faculty of Electronic Engineering, University of Nis

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio), insanlara genetik benzerlikleri, erken gelişim sırasında optik şeffaflıkları ve in vivo görüntülemeye uygunlukları nedeniyle kardiyovasküler araştırmalarda omurgalı modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak döllenmeden 96 saat sonra (hpf) zebra balığı embriyolarında kardiyak morfoloji ve fonksiyonun değerlendirilmesi için standartlaştırılmış, erişilebilir bir protokol sunmaktadır. Yöntem, embriyo toplama, morfolojik tarama, agarozda immobilizasyon, atan kalbin video kaydı ve ventriküler boyutlar, atım hacmi, kalp hızı, ejeksiyon fraksiyonu ve kalp debisi gibi kardiyak parametrelerin görüntü tabanlı analizini içerir. Hesaplamalar, açık kaynaklı yazılım (örneğin, ImageJ, Zembryo Analyzer) kullanılarak ventrikülün geometrik yaklaşımlarına dayanmaktadır. Protokol, yaygın olarak bulunan ekipman kullanılarak kardiyak performansın nicel olarak değerlendirilmesini sağlayarak, sınırlı kaynaklara ve yüksek verimli taramalara sahip laboratuvarlar için uygun hale getirir. Bu çalışmada 96 hpf zebra balığı larvası, atan kalbin ışık mikroskobu altında kaydedilmesiyle analiz edilmiştir. Ölçülen temel kardiyak parametreler, dakikadaki atım sayısı ile belirlenen atım hacmini ve kalp atış hızını hesaplamak için kullanılan ventriküler boyutları içeriyordu. Bunlardan, genel kardiyak performansı değerlendirmek için ejeksiyon fraksiyonu ve kardiyak debi türetilmiştir. Sağlıklı embriyolardan elde edilen temsili sonuçlar, tutarlı ventriküler kasılma ve sağlam fonksiyonel indeksler gösterirken, kadmiyuma maruz kalan embriyolar, bozulmuş kardiyak morfoloji ve önemli ölçüde azalmış kardiyak debi gösterdi. Genel olarak, yöntem gelişimsel kardiyotoksisiteyi tespit etmek için önemlidir ve erken zebra balığı gelişimi sırasında kardiyak fonksiyonu in vivo olarak değerlendirmek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio), insanlarla genetik homolojileri, dış döllenmeleri, embriyoların optik şeffaflığı ve hızlı gelişimleri nedeniyle kardiyovasküler araştırmalarda öne çıkan bir omurgalı model organizma olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Bu özellikler, maliyet etkinliği ve ölçeklenebilirlik ile birleştiğinde, zebra balığını özellikle erken kardiyak morfogenez, konjenital kalp kusurları ve gelişimsel kardiyotoksisite çalışmaları için uygun hale getirir3. Alaka düzeyleri, omurgalı türleri arasında kalp gelişimini düzenleyen genlerin ve sinyal yollarının yüksek düzeyde korunmasıyla daha da güçlendirilmiştir4. Özellikle, zebra balığı modelleri, hem normal hem de patolojik koşullar altında kalp oluşumunun, yeniden şekillenmesinin ve işlevinin genetik ve fizyolojik temelinin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur 5,6.

Yapısal olarak, zebra balığı kalbi, memeli dört odacıklı kalbine özgü bölmeden yoksun, doğrusal bir şekilde bağlanmış tek bir atriyum ve tek bir ventrikülden oluşur. Buna rağmen, zebra balığı kalbi, endokardiyal ve miyokardiyal tabakaların varlığı, kardiyak iletim sistemi, ritmik kasılma aktivitesi ve nörohormonal faktörlertarafından düzenleme dahil olmak üzere insan kalp fizyolojisinin temel yönlerini özetlemektedir 7,8. Daha da önemlisi, zebra balığı kalbi, kalp tüpünün sağa doğru dönmesi ve ardından kalp odacıklarının genişlemesi ve tanımlanması dahil olmak üzere, insan embriyonik gelişimindekilere benzer şekilde önemli morfogenetik olaylar sergiler9. Ayrıca, zebra balığı kalbi, aksiyon potansiyeli yayılımı, kasılma modülasyonu ve kalsiyum döngüsü dinamikleri7 dahil olmak üzere yüksek omurgalılarda görülen elektrofizyolojik ve hemodinamik özelliklerin çoğunu korur.

Bu benzerlikler göz önüne alındığında, zebra balığı toksikolojide, özellikle kimyasal maruziyetlerin kalp gelişimini ve işlevini nasıl etkilediğini değerlendirmek için çok önemli bir model olarak ortaya çıkmıştır10. Bununla birlikte, bu alandaki en büyük sınırlamalardan biri, teknik olarak zorlu görüntüleme tekniklerine güvenmeye devam etmektedir. Konfokal veya ışık tabakası mikroskobu veya floresan kardiyak belirteçleri eksprese eden transgenik çizgiler gibi geleneksel yüksek çözünürlüklü yöntemler güçlü olmakla birlikte maliyetlidir ve önemli teknik altyapı gerektirir11. Bu kısıtlamalar, zebra balığı bazlı kardiyak fenotiplemenin daha geniş bir şekilde uygulanmasını, özellikle kısıtlı kaynaklara sahip ortamlarda veya yüksek verimli tarama gerektiren uygulamalar için sınırlamaktadır12.

Bu nedenle, yaygın olarak bulunan enstrümantasyon kullanılarak kardiyak fonksiyonun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine izin veren metodolojik yaklaşımlara artan bir ihtiyaç vardır. Mevcut literatür, manuel veya yarı otomatik ölçümlerle birleştirilmiş parlak alan veya ışık mikroskobu tabanlı görüntüleme dahil olmak üzere bu tür basitleştirilmiş yöntemlerin örneklerini içermektedir13,14. Bununla birlikte, bu teknikler her zaman standartlaştırılmamıştır ve genellikle protokol, zamanlama ve görüntü analizi parametreleri açısından araştırma grupları arasında farklılık gösterir. Bu değişkenlik, özellikle kantitatif kardiyovasküler son noktaların gelişimsel güvenliğin göstergeleri olarak giderek daha fazla kullanıldığı embriyotoksikoloji, farmakoloji veya ekotoksikoloji gibi alanlarda, tekrarlanabilirliği engeller ve çalışmalar arasında karşılaştırmalı değeri sınırlar15.

Bu bağlamda zebra balığı, gelişimsel kardiyotoksisitenin in vivo olarak taranması için değerli bir model sunmaktadır. Düzenleyici kurumlar ve bilimsel konsorsiyumlar, özellikle yapısal malformasyonlardan veya ölümcüllükten önce gelebilecek kalp fonksiyonundaki ince değişiklikleri tespit etme kapasiteleri göz önüne alındığında, zebra balığının bu alandaki önemini giderek daha fazla kabul etmektedir14. Şeffaf embriyo, atan kalbin doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyarak, invaziv prosedürlere gerek kalmadan kalp performansının zamanla çözülmüş, canlı olarak değerlendirilmesine olanak tanır. Ayrıca, zebra balığı kardiyak anatomisinin basitliği, temel görüntüleme teknikleri15 kullanılarak oda boyutları ve inme parametreleri dahil olmak üzere atriyal ve ventriküler dinamiklerin ölçülmesini kolaylaştırır.

Bu makalede açıklanan yöntemin genel amacı, standart ışık mikroskobu kullanılarak zebra balığı embriyonik kardiyak performansının morfofonksiyonel değerlendirmesi için erişilebilir, tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlamaktır. Basit video edinimi ve post hoc görüntü analizine odaklanan teknik, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile nitel gözlemsel puanlama arasındaki metodolojik boşluğu doldurmayı amaçlamaktadır. Bu protokol, çeşitli laboratuvar ortamlarına ve kaynak seviyelerine uyarlanabilir ve özellikle kardiyak fonksiyon değerlendirmesine odaklanan toksikolojik, farmakolojik veya genetik çalışmalara uygulanabilir.

Pratik avantajlarına ek olarak protokol, yaygın olarak kullanılan teknikleri tek, tekrarlanabilir bir boru hattında birleştiren konsolide, adım adım bir iş akışı sunarak alana katkıda bulunur. Literatürde benzer yaklaşımlar mevcut olsa da, çok azı görsel dokümantasyonla bu düzeyde entegrasyon sağlar ve bu da daha geniş çapta benimsenmeyi ve standardizasyonu destekleyebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı embriyolarını içeren tüm prosedürler, yerel etik kurul tarafından onaylanan kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo manipülasyonu, bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Zebra balığı bakımı ve embriyo toplama

  1. Yetişkin zebra balığını (Danio rerio) devridaim yapan bir akvaryum sisteminde 28 °C± 1 °C'de 14 saat ışık/10 saat karanlık döngüsü altında tutun.
  2. Balıkları günde üç kez zebra balığı için uygun yüksek proteinli ticari pul veya granül yemle besleyin.
  3. Öğleden sonra geç saatlerde, yetişkin zebra balıklarını, balıkları tank tabanından ayırmak için şeffaf bir ağ ile donatılmış üreme tanklarına aktarın. Çıkarılabilir bir bölücü ile gece boyunca ayrılmış 2:3'lük bir erkek-kadın oranı kullanın.
  4. Ertesi sabah, ayırıcıyı çıkarın ve yumurtlamayı tetiklemek için 50-100 mL soğuk akvaryum suyu ekleyin.
  5. Döllenmeden sonra (30-60 dakika içinde), embriyoların avlanmasını önlemek için yetişkin balıkları üreme tankından çıkarın.
  6. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak embriyoları toplayın ve E3 embriyo ortamıyla doldurulmuş steril Petri kaplarına aktarın.
    NOT: E3 embriyo ortamı, zebra balığı hücre dışı sıvısının iyonik bileşimini taklit eden tamponlu bir tuz çözeltisidir. 580 mg NaCl, 27 mg KCl, 97 mg CaCl2·2H2O ve 163 mg MgCl2·6H2O'yu yaklaşık 800 mL ultra saf damıtılmış suda çözerek E3 ortamını hazırlayın. 1 N NaOH veya HCl kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın. pH ayarlandıktan ve stabil hale getirildikten sonra, damıtılmış su ile toplam hacmi 1.000 mL'ye getirin. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir membran filtreden geçirerek sterilize edin. Mantar oluşumunu önlemek için litre başına 100 μL %1 metilen mavisi ekleyin. Hazırlanan E3 ortamını kullanmadan önce 4 °C'de ve oda sıcaklığına kadar ısıtın.
  7. Embriyoları kontrollü bir aydınlık/karanlık döngüsüne (14 saat/10 saat) sahip bir inkübatörde 28.5 °C'de inkübe edin.
    NOT: Hipoksiye ve gelişimsel kusurlara neden olabilecek aşırı kalabalığı önlemek için Petri kabı başına embriyo sayısını sınırlayın (örneğin, 100 mm'lik kap başına 50).
  8. Optimum gelişim koşullarını korumak için E3 ortamını günlük olarak değiştirin.

2. Morfolojik olarak normal embriyoların seçimi

  1. Döllenmeden yaklaşık 6 saat sonra (hpf; döllenmeden bu yana geçen süre), döllenmiş embriyoları taze E3 ortamı içeren temiz bir Petri kabına aktarın.
  2. Embriyoları stereomikroskop altında 40x büyütmede inceleyin.
  3. Aşağıdakiler de dahil olmak üzere gelişimsel anormallik belirtileri gösteren embriyoları atın:
    1. Pıhtılaşmış embriyolar: Opak veya beyaz görünümleri, granüler dokuları ve ayırt edilebilir iç yapılarının bulunmaması ile tanımlanır. Pıhtılaşma, yaşayamazlığın bir işaretidir ve tipik olarak döllenmeden sonraki ilk birkaç saat içinde ortaya çıkar.
    2. Gecikmiş gelişim: Beklenen morfolojik aşamaya ilerlememiş embriyoları hariç tutun (örneğin, epibolik eksikliği veya düzensiz hücresel düzenleme), bu da canlılığın bozulduğunu düşündürür.
    3. Yolk kesesi anormallikleri: Kusurlu gelişimi veya ozmotik dengesizliği gösterebilecek yırtılmış, düzensiz veya asimetrik yolk keseleri arayın.
    4. Dış malformasyonlar: Bükülmüş vücut eksenleri, düzensiz hücre kütlesi dağılımı veya anormal koryon şekilleri olan embriyoları hariç tutun.
    5. Zayıf koryon bütünlüğü: Mekanik veya ozmotik strese maruz kalabilecekleri için embriyoları çökmüş, buruşmuş veya yırtılmış koryonlarla kullanmaktan kaçının.
  4. Yalnızca aşağıdaki kriterlerin tümünü karşılayan embriyoları saklayın: (1) Şeffaf ve simetrik vücut şekli, (2) Pürüzsüz hücresel katmanlama ile tek tip epiboli ilerleme, (3) Açıkça görülebilen blastoderm ve bozulmamış küresel koryon.
    NOT: 6 hpf'de, morfolojik olarak normal bir zebra balığı embriyosu, yumurta sarısının üstünü saran açıkça tanımlanmış bir blastoderm ile kubbe şeklindedir. Sitoplazma, granüler beneklenme olmadan ve parçalanma veya topaklanma belirtileri olmadan eşit olarak dağıtılmalıdır.

3. Işık mikroskobu kullanarak kardiyak görüntüleme

  1. 96 hpf'de, embriyoları E3 ortamı ile doldurulmuş 35 mm cam tabanlı Petri kaplarına tek tek monte edin.
  2. E3 ortamında %1,2 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve 37-38 °C'ye ısıtın. Bir ısı bloğu veya su banyosu kullanarak sıcaklığı koruyun.
  3. Her embriyoyu agaroza gömün ve agaroz katılaşmadan önce ince forseps kullanarak nazikçe yanal olarak yönlendirin.
    NOT: Kalbin açıkça görülebildiğinden ve hem atriyum hem de ventrikül aynı odak düzleminde olacak şekilde yanal olarak baktığından emin olun.
  4. Özellikle zebra balığı embriyolarının kalp bölgesine odaklanan 30 saniyelik yüksek çözünürlüklü videoları kaydetmek için dijital kamerayla donatılmış ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın. Kardiyak yapıların ve kalp atışlarının net bir şekilde görselleştirilmesini sağlamak için ××40 veya 100 büyütmede videolar çekin.
    1. Görüntü kalitesini korumak ve kardiyak hareket dinamiklerinin doğru analizine olanak sağlamak için videoları sıkıştırılmamış veya minimum düzeyde sıkıştırılmış formatlarda (ör. AVI veya MOV) saniyede 30 kare (fps) kare hızında kaydedin. Bu kurulum, kalp atış hızı, kasılma ritmi ve oda morfolojisi gibi fonksiyonel parametrelerin ayrıntılı değerlendirmesini sağlar.

4. Görüntü analizi ve kardiyak fonksiyonun ölçümü

  1. ImageJ'de manuel ölçümler
    1. Videoları İçe Aktarın. AVI > Dosya > İçe Aktar'ı kullanarak videoları ImageJ'de açın. Gerekirse, videoyu Image > Stacks > Convert Images to Stack aracılığıyla bir görüntü yığınına dönüştürün.
    2. Ölçüm ölçeğini kalibre edin. Analiz Et > Ayarla Ölçeğini kullanın, bilinen alan çapını girin (örneğin, 10 × objektif için 4 mm) ve ölçeği tüm ölçümlere uygulamak için Global seçeneğini etkinleştirin.
    3. İlgi Alanlarını (ROI) tanımlayın. Sistol sonu ve diyastol sonu sırasında uzun ve kısa ventriküler eksenleri işaretlemek için ROI araçlarını (çizgi, çokgen, dikdörtgen) kullanın (Şekil 1). ROI'leri Analyze > Tools > ROI Manager aracılığıyla yönetin.
  2. Fonksiyonel parametreleri hesaplamak için çapları ve alanları ölçün (Ek Dosya 1)
    1. Denklem 1'i kullanarak Ventriküler yüzey alanını (elips yaklaşımını kullanarak) belirleyin:
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      Burada DL = uzun çap, DS = kısa çap.
    2. Elipsoid hacim formülünü kullanarak ED ve ES'deki ventriküler hacmi tahmin edin (Denklem 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
    3. Denklem 3 ve Denklem 4'ü kullanarak kesirli alan değişimini (FAC) ve kesirli kısalmayı (FS) hesaplayın:
      FAC (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      Burada VAD = ED'de ventriküler alan; VAS = ES'de ventriküler alan; DDL = ED'de uzun eksen; DSS = ES'de kısa eksen.
    4. Denklem 5'i kullanarak vuruş hacmini (SV) belirleyin:
      SV = VVD - VVS (5)
    5. Denklem 6'yı kullanarak ejeksiyon fraksiyonunu (EF) hesaplayın:
      EF (%) = (SV / VVD) × 100 (6)
  3. ZembryoAnalyzer'da otomatik analiz
    1. Yakalanan videoyu başlatın ve yükleyin. ZembryoAnalyzer'ı açın (şu adresten ulaşılabilir: https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser) ve istediğiniz videoyu içe aktarmak için Dosya > Video Aç'ı kullanın.
    2. Otomatik Kalp Bölgesi algılamasını gerçekleştirin. Tıkla Kalbi Algıla Yazılımın video karelerindeki parlaklık dalgalanmalarına dayalı olarak ilgilenilen bölgeyi (ROI) otomatik olarak bulmasını sağlamak için düğmesine basın. Gerekirse dikdörtgen, elips veya çokgen araçlarını kullanarak yatırım getirisini manuel olarak ayarlayın.
    3. Otomatik Kalp Atış Hızı tahminini gerçekleştirin. Yazılımın, tespit edilen yatırım getirisi içindeki parlaklık değişikliklerini analiz etmesine izin verin. Kalp atış hızı, yoğunluktaki periyodik tepe noktaları belirlenerek hesaplanır. Algoritma, gürültüyü ve yanlış pozitifleri ortadan kaldırmak için eşik filtreleme uygulayarak doğru vuruş tespiti sağlar.
    4. Sonuçları dışa aktarın. Kalp atış hızı verilerini ve karşılık gelen yoğunluk grafiklerini PDF > Dışa Aktar veya Excel > Dışa Aktar'ı kullanarak dışa aktarın. İsteğe bağlı olarak, aşağı akış istatistiksel işleme için ham verileri CSV veya JSON formatında kaydedin.
  4. Denklem 7'yi kullanarak kalp debisini (CO) hesaplayın:
    CO = SV × HR (7)

5. Toksik maddeler kullanılarak yapılan kardiyotoksisite testlerinde protokolün uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi

  1. Kadmiyum klorürü tartın ve doğrudan E3 ortamında 3 mg/L'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözerek bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
  2. Embriyoları döllenmeden 24 saat sonra (hpf) kadmiyum solüsyonu içeren Petri kaplarına aktarın.
  3. Embriyoları kadmiyum çözeltisinde 28 °C± 1 °C'de 96 hpf'ye kadar 14 saatlik aydınlık/10 saatlik karanlık döngü ile inkübe edin.
  4. Tutarlı maruziyeti sürdürmek için kadmiyum çözeltisini günlük olarak değiştirin.
  5. 96 hpf'de, kardiyak fonksiyon parametrelerinin daha sonra ölçümü ve analizi için embriyoların daha önce açıklandığı gibi yüksek çözünürlüklü kardiyak videolarını kaydedin.
    NOT: Önceki bir çalışmada16 açıklandığı gibi, zebra balığı embriyolarında gelişimsel kardiyak toksisiteyi simüle etmek için bu kadmiyuma maruz kalma protokolünü kullanın.

6. Veri yönetimi ve çoğaltmalar

  1. Tüm ölçümleri yapılandırılmış elektronik tablolara kaydedin. Embriyo kimliğini, tedavi grubunu ve hesaplanan tüm parametreleri ekleyin.
  2. Grup başına en az 20-30 embriyonun istatistiksel güvenilirlik açısından analiz edildiğinden emin olun.
    NOT: Kardiyak bölgenin video kayıtları, morfometrik veya fonksiyonel ölçümlerin doğruluğundan ödün vermeden daha sonraki bir zaman noktasında saklanabilir ve analiz edilebilir. Dahili karşılaştırmalarımızda, anlık ve gecikmeli analizlerden elde edilen sonuçlar, temel kardiyak parametreler arasında tutarlıydı ve bu da gecikmiş video tabanlı değerlendirmenin tekrarlanabilirliğini destekledi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ventrikül boyutu, kasılma, atım hacmi ve ejeksiyon fraksiyonu gibi yapısal ve fonksiyonel parametreler dahil olmak üzere, döllenmeden 96 saat sonra (hpf) zebra balığı kardiyak gelişiminin kantitatif analizine izin verir.

Şekil 2 , zebra balığı ventrikülünün diyastol sonu (ED) ve sistol sonu (ES) üzerindeki temsili parlak alan görüntülerini, ortalama ventriküler alan (VA) ve hacim (VV) ölçümlerini gösteren karşılık gel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki önemli adımlardan biri, döllenmeden 6 saat sonra (hpf) morfolojik olarak normal embriyoların doğru tanımlanması ve seçilmesidir. Pıhtılaşma, gelişimsel gecikme veya yapısal anomali belirtileri gösteren embriyolar, kardiyovasküler ölçümlerin tutarlılığını ve yorumlanabilirliğini önemli ölçüde tehlikeye atabilir. Cansız veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoların erken çıkarılması, kalp gelişimini ve fonksiyonunu değerlendirmek için güvenilir bir temel sağlar. Görüntüleme sır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Sırbistan Cumhuriyeti Bilim, Teknolojik Gelişme ve Yenilik Bakanlığı tarafından, 2025 yılında araştırma faaliyetlerinin uygulanması ve finansmanı için Belgrad Üniversitesi Tıp Fakültesi ile yapılan kurumsal finansman anlaşması yoluyla finanse edildi. 2025 yılında kurumsal finansman için sözleşme kayıt numarası 451-03-137/2025-03/200110'dur. Bu sayının onaylanan alt projelerden kaynaklanan tüm yayınların teşekkür künyelerinde yer almasını rica ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 & mikro; m Membran FiltresiMilliporeSLGP033RS0.22 & mikro; m Membran Filtresi
1 N HCl çözümüSigma-Aldrich320331pH ayarlaması için hidroklorik asit çözeltisi
1 N NaOH çözümüSigma-Aldrich72068pH ayarlaması için sodyum hidroksit çözeltisi
Yetişkin zebra balığı (Danio rerio)Yerel yetiştirme tesisiYokModel organizma
Ağ özellikli üreme tankları//Yetişkinlerin yumurtlama için ayrılması
CaCl?· 2H mi? OSigma-AldrichC5670Kalsiyum klorür dihidrat, reaktif kalitesinde
Kadmiyum klorürSigma-Aldrich2029083 mg/L maruziyet için kullanılan toksikan
Ticari zebrafish yemiMini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac/Zebrafish için uygun yüksek proteinli pul pulu veya granül yem
Dijital Kamera (mikroskop)Hamamatsu FotonikleriORCA-Flash4.0 V330 fps'de video kaydı için kamera
Isı bloğuEppendorf5382000010Sıcaklık kontrollü ısıtma cihazı
ImageJ YazılımıNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/Açık kaynak görüntü işleme yazılımı
Ters Işık MikroskobuNikonTi2-EDijital kameralı mikroskop, 40 kez; ve 100& kez; Amaçlar
KClSigma-AldrichP3911Potasyum klorür, reaktif kalitesi
Düşük erime noktasına sahip agaroz (%1,2)Thermo Fisher Scientific16520050Embriyoların gömülü için
Metilen Mavisi (%1)Sigma-AldrichM9140E3 ortamına eklenen antifungal ajan
MgCl?· 6H mi? OSigma-AldrichM9272Magnezyum klorür heksahidrat, reaktif kalitesinde
NaClSigma-AldrichS9888Sodyum klorür, reaktif kalitesi
Steril Petri Kabları (100 mm)Corning430167Embriyo kültürü için plastik Petri kapları
Steril Petri Kabları (35 mm)MatTek ŞirketiP35G-1.5-14-CEmbriyoları monte etmek için cam tabanlı Petri kapları
Ultrasaf damıtılmış suMilliporeMilli-Q ReferansıÇözelti hazırlığı için su
ZembryoAnalyzer SoftwareGitHub (Darko Puflovic)https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyserKardiyak fonksiyon analiz yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat RevDrug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  2. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14129(2023).
  3. Narumanchi, S., et al. Zebrafish heart failure models. Front Cell Dev Biol. 9, 662583(2021).
  4. Clément, Y., Torbey, P., Gilardi-Hebenstreit, P., Crollius, H. R. Enhancer-gene maps in the human and zebrafish genomes using evolutionary linkage conservation. Nucleic Acids Res. 48 (5), 2357-2371 (2020).
  5. Kemmler, C. L., Riemslagh, F. W., Moran, H. R., Mosimann, C. From stripes to a beating heart: Early cardiac development in zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 8 (2), 17(2021).
  6. Bowley, G., et al. Zebrafish as a tractable model of human cardiovascular disease. Br J Pharmacol. 179 (5), 900-917 (2022).
  7. Echeazarra, L., Hortigón-Vinagre, M. P., Casis, O., Gallego, M. Adult and developing zebrafish as suitable models for cardiac electrophysiology and pathology in research and industry. Front. Physiol. 11, 607860(2021).
  8. Foo, Y. Y., et al. Effects of extended pharmacological disruption of zebrafish embryonic heart biomechanical environment on cardiac function, morphology, and gene expression. Dev Dyn. 250 (12), 1759-1777 (2021).
  9. M Männer, J. The functional significance of cardiac looping: comparative embryology, anatomy, and physiology of the looped design of vertebrate hearts. J Cardiovasc Dev Dis. 11 (8), 252(2024).
  10. Park, H., Yun, B. H., Lim, W., Song, G. Dinitramine induces cardiotoxicity and morphological alterations on zebrafish embryo development. AquatToxicol. 240, 105982(2021).
  11. Schlaeppi, A., Graves, A., Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy of fast cardiac dynamics in zebrafish embryos. J Vis Exp. 174, e62741(2021).
  12. Motta, E. R. Development of microscopy strategies for rapid imaging of zebrafish heart development. Doctoral dissertation. , Université de Strasbourg. https://theses.fr/2020STRAJ043 (2020).
  13. Spomer, W., Pfriem, A., Alshut, R., Just, S., Pylatiuk, C. High-throughput screening of zebrafish embryos using automated heart detection and imaging. J Lab Autom. 17 (6), 435-442 (2012).
  14. Santoso, F., et al. An overview of methods for cardiac rhythm detection in zebrafish. Biomed. 8 (9), 329(2020).
  15. Teixidó, E., et al. Automated morphological feature assessment for zebrafish embryo developmental toxicity screens. Toxicol Sci. 167 (2), 438-449 (2019).
  16. Mitovic, N., et al. Cadmium significantly changes major morphometrical points and cardiovascular functional parameters during early development of zebrafish. Environ Toxicol. Pharmacol. 87, 103723(2021).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Spomer, W., Pfriem, A., Alshut, R., Just, S., Pylatiuk, C. High-throughput screening of zebrafish embryos using automated heart detection and imaging. J Lab Autom. 17 (6), 435-442 (2012).
  19. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Front Physiol. 5, 344(2014).
  20. Liebling, M., et al. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos viapostacquisition synchronization of nongated slice sequences. J Biomed Opt. 10 (5), 054001(2005).
  21. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  22. Sargazi, S., et al. Fluorescent-based nanosensors for selective detection of a wide range of biological macromolecules: A comprehensive review. Int J Biol Macromol. 206, 115-147 (2022).
  23. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  24. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  25. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  26. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68941

Etiketler

Zebrafish Cardiac ImagingCardiac Function AnalysisBrightfield MicroscopyVideo AnalysisVentricular DimensionsStroke VolumeHeart RateEjection FractionCardiac OutputEmbryonic Cardiotoxicity

İlgili makaleler