Doğal Deniz Deniz Suyu İnokulum ve Kapalı Döngü Respirometre Kullanılarak Malzemelerin Aerobik Biyolojik Bozunma Testi

Özet

Protokol, doğal bir deniz suyu aşısı ve otomatik kapalı döngü respirometri sistemi kullanılarak aerobik koşullar altında hem sentetik hem de doğal olarak biyolojik olarak parçalanabilen potansiyel malzemeleri test etmek için standart işletim prosedürünü açıklamaktadır.

Özet

Biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerin doğru değerlendirilmesi, standart test yöntemlerinin geniş çapta benimsenmesine bağlıdır. Bu tür yöntemler mevcut olmasına rağmen, test kapasitesi sınırlı kalmakta olup, maliyet ve yeni laboratuvarlar kurmak için başlangıç süresi ile sınırlıdır. Bu değiştirilmiş tarama protokolü, ASTM International D6691-24a, Tanımlanmış Bir Mikrobiyal Konsorsiyum veya Doğal Deniz Suyu Aşısı ile Deniz Ortamındaki Plastik Malzemelerin Aerobik Biyolojik Bozunmasının Belirlenmesi için Standart Test Yöntemi'ne dayanmaktadır. Deniz ortamındaki malzemelerin biyolojik bozunmasını değerlendirir, sonuçları pozitif ve negatif kontrollerle karşılaştırır ve besin sınırlamasını önlemek için amonyum ve fosfat ile desteklenmiş doğal bir deniz suyu aşısı kullanır. Malzemeler besin açısından zengin bu deniz suyuna maruz bırakılır ve 30 °C'de inkübe edilir. Bir Micro-Oxymax respirometre, zaman içinde biyogaz (karbondioksit, CO₂) üretimini ölçer. Mineralizasyon derecesi (biyolojik bozunma), biyogaz-karbona dönüştürülen malzeme kaynaklı karbon oranı hesaplanarak belirlenir. Ölçülen veya teorik karbon içeriğinin bir kısmı olarak ifade edilen yüzde CO₂ üretimi, zamanın bir fonksiyonu olarak rapor edilir. Kapalı döngü respirometri sistemi, her malzeme için üç kopya halinde hazırlanmış bir dizi reaktör kabı, bir negatif kontrol (yalnızca deniz suyu aşısı) ve bir pozitif kontrol (ince tabaka kromatografi selülozu) barındırır. Bu yöntem, deniz ortamındaki malzemelerin değerlendirilmesi için önemlidir ve küresel kirliliğin önlenmesine yöneliktir.

Giriş

Plastik atıklar deniz ekosistemleri ve insan sağlığı için tehdit oluşturuyor¹. Okyanustaki herhangi bir malzemeden kaynaklanan deniz çöplerinin yanı sıra plastik kirliliğine ilişkin artan endişe, kullanım ömrü sonu atık yönetiminin iyileştirilmesi ve deniz ortamında biyolojik olarak kolayca parçalanabilen biyolojik olarak parçalanabilen malzemeler gibi sürdürülebilir çözümlere olan ihtiyacın altını çiziyor. Onlarca yıldan yüzyıllara kadar varlığını sürdüren ve besin ağlarında ^2,3,4 biriken mikroplastikler üreten geleneksel sentetik plastiklerin aksine, biyolojik olarak parçalanabilen malzemeler, karbonun organik bileşenleri, CO₂ ve metana (CH₄ ) metabolize edilebilir veya mikrobiyal biyokütleye⁵ asimile edilebilir. Bu nedenle deniz suyundaki malzemelerin biyolojik olarak parçalanmasını anlamak, deniz çöplerinin çevresel etkilerini ölçmek ve azaltmak için çok önemlidir.

Deniz ortamındaki biyolojik bozunma, ışık ve besin mevcudiyeti, basınç, sıcaklık, mikrobiyal tür bileşimi ve polimerin fizikokimyasal doğası ve yapısı dahil olmak üzere uzay-zamansal değişkenlerin etkileşimi ile kontrol edilir ve bunların tümü bozunma hızını, derecesini ve mekanizmasını belirler⁶. Bu değişkenler, deniz ortamlarını simüle eden laboratuvar tabanlı biyolojik bozunma çalışmaları için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Bu standart işletim prosedürü (SOP), aşı olarak doğal deniz suyunu kullanır, mevcut in situ mikrobiyal topluluğu yakalar ve deniz suyunda çözünmüş besinler, partikül karbon ve nitrojen, klorofil, tuzluluk, pH ve sıcaklık dahil olmak üzere ilgili değişkenleri kaydeder. Bu kontrollü laboratuvar tabanlı yaklaşım, mineralizasyonu teşvik etmek için koşulları optimize eder ve yerinde mümkün olmayan doğrudan biyolojik bozunma ölçümlerine izin verir. ASTM International D6691-24a, Tanımlanmış Bir Mikrobiyal Konsorsiyum veya Doğal Deniz Suyu İnokulum ile Deniz Ortamında Plastik Malzemelerin Aerobik Biyolojik Bozunmasının Belirlenmesi için Standart Test Yöntemi (bundan böyle ASTM D6691 olarak anılacaktır) ve bu SÇP, malzemelerin biyolojik olarak parçalanabilirliğini değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir tarama aracı olarak geliştirilmiştir 7,8,9,10.

Doğal polimer biyolojik olarak parçalanabilirliği için bir tarama testi olan ASTM D6691 ile uyumlu olan bu protokol, mineralizasyonu teşvik etmek ve besin sınırlamalarını önlemek için optimum koşullar, 30 °C, öğütülmüş numuneden maksimum yüzey alanı ve fazla inorganik besin maddeleri (azot, 130 mg/L; fosfor, 23 mg/L)⁹ altında malzemelerin biyolojik olarak parçalanmasını değerlendirir. Tarama testleri değerli başlangıç bilgileri sunarken, doğal deniz koşulları altında kapsamlı bir değerlendirme için kilo kaybını zamanın bir fonksiyonu olarak ölçen kıyı ve derin deniz demirlemeleri gibi daha ileri testler gerekli olabilir. Bu kıyı ve derin deniz demirleme testleri, zamanın bir fonksiyonu olarak kilo kaybına dayalı biyolojik bozunmayı tahmin ettiğinden11, araştırmacılar, aynı zamanda daha pahalı olan yerinde bir kıyı ve derin deniz demirleme deneyine gitmeden önce, doğrudan mikrobiyal metabolizmayı ölçen bu tarama testini yapmalıdır.

ASTM D6691 standart test yöntemi, deniz ortamlarında yüzmeyen plastik malzemelerin aerobik biyolojik bozunmasını değerlendirmeye yönelik prosedürleri özetlemektedir. Bu standart, ASTM D7081 (Deniz Ortamında Yüzmeyen Biyobozunur Plastikler için Standart Şartname; sulu bir ortamda biyolojik olarak parçalanabilirliğe odaklanan, şu anda ASTM'den çekilmiş ve yeniden oylanmakta olan) gibi spesifikasyon standartlarıyla birlikte, deneysel polimerlerin denizde biyolojik olarak parçalanabilir ^9,12 olarak sertifikalandırılması için bir çerçeve sağlar. Genel olarak spesifikasyon, ASTM International'ın bir malzemenin, ürünün veya sistemin karşılaması gereken gereksinimleri belirleyen bir fikir birliği standardıdır. Deniz ortamlarında biyolojik olarak parçalanacak şekilde tasarlanan malzemelerin bunu kabul edilebilir zaman dilimleri içinde yapmasını ve boyalar veya plastikleştiriciler gibi potansiyel olarak toksik katkı maddeleri salmamasını sağlar.

ASTM D6691'i temel alan bu protokol, doğal deniz suyundaki malzemelerin (deneysel substrat) aerobik biyolojik bozunma oranını ve derecesini ölçer ve tarihsel olarak^{deniz ortamında biyolojik} olarak parçalanabilir olduğu gösterilen pozitif malzeme kontrollerini (yani selüloz, Kraft kağıdı, kitin/kitosan ^7,9,10) genişletir . Bu yöntemin amacı, malzemelerin deniz ortamında biyolojik olarak parçalanıp parçalanmadığını görmek için malzemeleri optimize edilmiş koşullar altında taramaktır. Aşı, deniz suyunda bulunan ve ASTM'de belirtilen özel yönergelere göre toplanan doğal mikrobiyal topluluktan yararlanır. Bu yönergeler, kanalizasyon, kimyasal boşaltma veya petrol sızıntısı gibi kirletici maddelerden arınmış bir yerden toplanan, tuzluluğu yaklaşık 32 olan deniz suyunun kullanılmasını vurgulamaktadır. Test, her biri 75 mL deniz suyu ve ~20 mg deney veya kontrol substratı⁸ içeren, 30 °C'de tutulan 250 mL'lik reaktör kaplarına sahip otomatik bir kapalı devre respirometre kullanır. Mineralizasyon (biyolojik bozunma), eklenen ilk karbon kütlesine göre üretilen net karbon biyogazının (CO_2-C) yüzdesi olarak ifade edilir. Bu yöntem, mikrobiyal biyokütleye karbon asimilasyonunu hesaba katmaz.

Protokol

1. Deniz suyunun toplanması ve karakterizasyonu

1. Atık su, kimyasallar, petrol tabakaları veya güçlü tatlı su etkisinden etkilenmeyen bir deniz suyu toplama alanı belirleyin.
2. Toplama alanında, kaynağı (konum, enlem ve boylam, toplama derinliği, toplam derinlik ve sıcaklık), numune toplama tarihini ve gözlemlenen su koşullarını kaydedin.
3. Çeşitli mikrobiyal topluluk kompozisyonunu teşvik etmek için birden fazla derinlikten, saha konumlarından ve örnekleme olaylarından deniz suyu örnekleri toplayın ve birleştirin.
4. 20 L asitle süzülmüş bir damacanada, büyük bir Niskin şişesi kullanarak 10 L ila 20 L deniz suyu toplayın ve laboratuvara geri taşıyın.
5. Damacanadan, ilk deniz suyu koşulları için partikül karbon ve nitrojenin laboratuvar analizi için asitle süzülmüş 1 L kehribar yüksek yoğunluklu polietilen (HDPE) şişeye 1 L tam deniz suyu alt numunesi aktarın. 1 L'lik numuneden süzün (0,2 μm; düşük nitrojenli selüloz asetat) ve çözünmüş inorganik ve organik nitrojen (N) ve fosfor (P) bileşenlerinin analizi için asitle süzülmüş bir polietilen şişede 60 mL'lik bir alt numune toplayın.
6. Alt örnekleri proje adı, örnek kimliği ve tarihle etiketleyin. İndofenol yöntemi (4500-NH3)^13,14 ve PO₄^3- seviyelerini tek çözelti yöntemi (4500-P E)^13,15 kullanarak NH 4^{+ konsantrasyonlarını} ölçün. Element analiz yöntemini kullanarak partikül nitrojen ve karbonu ölçün¹⁶. Parsons ve ^ark.17(10150 A, 10150 C)¹³ tarafından özetlenen protokolleri izleyerek klorofil-a konsantrasyonlarını ölçün.
   NOT: Besin ile ilgili su kalitesi analizleri isteğe bağlıdır. Bu protokol, analizlerin harici bir laboratuvar tarafından yürütüldüğünü varsayar.
7. Aerobik koşulları korumak için damacana açıklığını gevşek bir şekilde kapatın ve deniz suyunu karanlıkta 30 °C'de 7 güne kadar saklayın.
   NOT: Deniz suyu ayrıca bir hava pompası ve fıskiye sistemi kullanılarak havalandırılabilir.

2. Deneysel substratın hazırlanması

1. 20 mm'lik bir çelik bilyeli 50 mL'lik paslanmaz çelik bir freze kavanozuna peletler, parçalar ve şekillendirilmiş parçalar şeklinde olabilen 10-15 g deneysel substrat (yani doğal polisakkaritler, ahşap, sunta, polimerler) ekleyin. Testin başlamasından önce deney substratını tek tip bir parçacık boyutuna (0,10-0,25 mm) kadar öğütün.
2. Öğütme kavanozunu sıvı nitrojene batırın ve sıvı nitrojenin kaynaması durana kadar 15 dakika gevrekleştirin.
   DİKKAT: Sıvı nitrojen, yanıklara, yaralanmalara veya donmalara neden olabilecek kriyojenik bir sıvıdır. Kullanmadan önce tüm Güvenlik Bilgi Formlarını okuyun ve uygulayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
3. Freze kavanozunu bilyalı değirmen ataşmanına sabitleyin ve cihaz parametrelerini 30 Hz ve 2:30 dakika olarak ayarlayın ve Başlat'a basın. Denemeler arasında sıvı nitrojende 30 saniye soğutma ile 4x tekrarlayın. Malzeme düşük cam geçiş sıcaklığına sahip bir polimer ise, düzgün bir parçacık boyutu dağılımı elde etmek için gerektiği kadar ek öğütme döngüleri gerçekleştirin.
4. ASTM D1921-96^18'de açıklandığı gibi elek analizi ile boyut homojenliğini doğrulayın ve partikül boyutu dağılımını karakterize edin. Beklenen parçacık boyutu aralığını kapsayan standart elekleri, en küçük gözenek boyutu altta olacak şekilde birleştirin. Öğütülmüş numuneyi üst eleğe yerleştirin ve elek yığınını mekanik bir çalkalayıcıya sabitleyin. Parçacıklar ağdan geçene kadar çalkalayın. Parçacık boyutu dağılımını hesaplamak için her elekten tutulan malzemeyi toplayın ve tartın. Karşılaştırılabilirliği korumak için işlemlerde aynı elek setini kullanın. Dağılımı veri sayfasına kaydedin.
5. Elementel analiz¹⁶ ile öğütülmüş deneysel substratın alt numune kuru ağırlığı başına karbon içeriğini belirleyin.
   NOT: Bu protokol, element analizinin harici bir laboratuvar tarafından yürütüldüğünü varsayar.

3. Deniz suyu için ek besin maddelerinin hazırlanması

1. 2 L veya 4 L'lik bir hacimsel şişeyi yarısına kadar deniz suyuyla doldurun. İhtiyaç duyulan toplam hacim, deneyde kullanılacak reaktör kaplarının sayısına bağlıdır. Her reaktör kabı 75 mL deniz suyu içerecektir. Deniz suyu kaynağı yüksek konsantrasyonlarda partikül organik madde içeriyorsa, büyük partiküllerin neden olduğu heterojen kontaminasyonu ortadan kaldırmak için deniz suyunu 20 μm'lik bir ağdan eleyin.
2. 0,001 g hassasiyete sahip hassas bir terazi kullanarak, bir tartım kefesinin darasını alın ve 2 L veya 4 L deniz suyuna dayalı olarak 0,5 g/L amonyum klorür (NH₄Cl) ve ardından 0,1 g / L potasyum fosfat monobazik (KH₂PO₄ ) tartın.
   DİKKAT: Amonyum klorür göz hasarına veya tahrişe neden olabilir. Kullanmadan önce tüm Güvenlik Bilgi Formlarını okuyun ve uygulayın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
   NOT: Amonyum klorür ve potasyum fosfat monobazik atıklarını kurumsal prosedürlere ve yerel düzenlemelere göre özel tehlikeli atık kaplarına atın. Küçük hacimlerde seyreltik (%<1)_NH4Cl ve KH₂PO₄ çözeltileri, kurum ve yerel atık su otoritesi tarafından izin verilirse, bol su ile seyreltildikten sonra drenaj bertarafı için uygun olabilir.
3. İnorganik besinleri 2 L veya 4 L hacimsel şişeye ekleyin, deniz suyuyla hacim haline getirin, bir karıştırma çubuğu ekleyin ve tüm tuzlar eriyene kadar bir karıştırma plakasında karıştırın. Çözelti, görünür parçacıklar olmadan berrak olmalıdır.
4. pH ve tuzluluk ölçümü için besin takviyeli deniz suyundan 20-30 mL alt numune alın. Adım 1.5'teki standart yöntemleri izleyerek çözünmüş inorganik N ve P analizi için asitle süzülmüş bir polietilen şişeye 0,2 μm'lik düşük nitrojenli selüloz asetat filtreden ilave 60 mL süzün.
5. Üreticinin talimatlarını izleyerek tezgah üstü bir ölçüm cihazında pH ve tuzluluğu ölçün. Besin takviyesinin asitliği nedeniyle tam güçlü deniz suyu için yaklaşık bir birimlik bir pH düşüşü beklenir.

4. Reaktör kabı inkübasyonu için hazırlık

1. Numuneler için 250 mL'lik reaktör kapları ve 75 mL'lik hacimsel pipet dahil olmak üzere tüm cam eşyaları 24 saat boyunca %10 hidroklorik asit (HCl) içinde asitle süzün ve 3 kez deiyonize suyla durulayın.
   DİKKAT: HCl ciddi yanıklara ve göz hasarına neden olabilir. Kullanmadan önce tüm Güvenlik Bilgi Formlarını okuyun ve uygulayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
   NOT: %10 HCl atık, bertaraf edilmeden önce nötr bir çözelti oluşturmak için sodyum bikarbonat ile nötralize edilebilir. Kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine ve geçerli yerel düzenlemelere uygun olarak nötralizasyon gerçekleştirin.
2. Asitle süzülmüş 250 mL boş reaktör kaplarını, portlu kapakları, silikon contalı O-ringleri ve vidalı kapakları deney gününden 15 dakika önce 121 °C'de bir otoklavda otoklavlayın.
3. Numune şişelerini, numune veya kontrol malzemeleri alan kaplara karşılık gelen kanal numarası/kimliği ile etiketleyin.
4. Analitik teraziyi kullanarak, bir şişenin (kapaklı) darasını alın ve deney veya kontrolün 20 mg'ını (± 0,1 mg) tartın ve tam okuma ağırlığını kaydedin ve bir kenara koyun. Tüm deneysel ve kontrol kopyaları için tekrarlayın.
   NOT: Ağırlıkların doğru olduğundan emin olun. Tüm yüzeylerin aynı gün ve aynı kişi tarafından tartılması tavsiye edilir.
5. Kapları eklemeden bir gün önce inkübatörü açın ve sıcaklığı 30 °C'ye ayarlayın. Üretici talimatlarına göre sistem tanılamasını ve sensör kalibrasyonunu çalıştırmadan en az 2 saat önce respirometreyi açın.
   NOT: Reaktör kabı hazırlığı, inkübatör sıcaklığı 30 ± 2 °C'ye ulaştığında ve bu sıcaklığı koruduğunda devam edebilir.
6. Örnek kimlikleri/kopyaları ve ilgili kanal numarasını kaydederek veri sayfasını hazırlayın. Reaktör kaplarını ve kapak tertibatlarını (portlu/O-halkalı kapak) kanal numarası/kimliği sırasına göre düzenleyin (her kabın açıkça etiketlendiğinden emin olun). Temiz, kuru ve sağlam olduklarından emin olmak için O-halkaları ve kapakları/bağlantı noktalarını kontrol edin.

5. Reaktör kaplarının kurulması

1. Her reaktör kabına 75 mL besin takviyeli deniz suyu dağıtmak için asitle süzülmüş 75 mL hacimsel pipet ve motorlu pipet kontrolörü kullanın.
2. Her kaptan bir adet tek kullanımlık pipet değerinde deniz suyunu (~3 mL) çıkarın ve yanındaki temiz bir yüzeye koyun. Bu deniz suyu, öğütülmüş deney ve kontrol substratlarını darası alınmış şişeden durulamak için kullanılacaktır (Şekil 1).
3. Alt tabakaları uygun kaplara aktarın.
4. Reaktör kabının kenarına bir O-halkası yerleştirin, ardından doğrudan O-halkasının üzerine iki bir kapak yerleştirin. O-ringi ve kapağı bir vidalı kapakla yerine sabitleyin.
5. Reaktör kabını karşılık gelen gaz/yoğuşma hatlarıyla eşleştirin. Gaz hatlarını hazne kapağındaki uygun giriş/çıkış portlarına sıkıca yerleştirin.
6. Çalkalayıcı platformunu 0,05 x g'ye (sürekli mod) getirin. Tüm kapların güvende olduğundan emin olmak için görsel bir kontrol yapın, ardından inkübatör kapısını kapatın.
7. Bir barometre kullanarak inkübatör sıcaklığını (okuma ve termistör probu) ve atmosfer basıncını kaydedin.

Şekil 1: Gemi kurulumu ve hazırlığı. (A) Deniz suyunun eklenmesi, (B) numunenin eklenmesi ve (C) O-ringin, metal kapağın ve vidalı kapağın eklenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Respirometri sisteminin başlatılması

1. Bağlı bilgisayarda yazılımı başlatın. Sistemin donanımı RS-232 bağlantısı üzerinden algıladığını doğrulayın. Donanım bulunamazsa, cihazın bağlı olmadığını ve programın yeniden başlatılması gerektiğini belirten bir bildirim olacaktır.
2. Yazılım ana menüsünde Araçlar > Tanılama > Temel İşlemler'i seçin. Günlük dosyasını kaydet'i tıklatın. Valfler ve Sensörler'e tıklayın. Yazılım her test için BAŞARILI veya BAŞARISIZ gösterecektir. CO₂ sensörünün iki noktalı kalibrasyonuna yalnızca her iki test de geçerse devam edin.

7. CO₂ sensörünün kalibre edilmesi

1. Sıfır kalibrasyon için ortam CO_2'yi gidermek için numune pompası arka panelindeki nitrojen portuna bir soda kireç kolonu bağlayın. Soda kirecinin kireçli beyaz göründüğünden ve renginin solmadığından (örn. pembe veya mor) emin olun.
2. Kalibrasyon > Araçlar'ı seçin. Sağ alt köşedeki Kalibrasyonu Başlat'ı tıklayın. İstendiğinde, ön paneldeki numune pompası kontrolünü kullanarak numune akışını 0,5 L/dk'ya ayarlayın. Tamam'ı tıklayın.
3. Zamanlayıcı sıfıra ulaştığında, ekrandaki okumayı 2'e (veya mümkün olduğunca yakın) ayarlamak için CO_0.000 sensöründeki Yukarı ve Aşağı ofset düğmelerine basın. Değerler kabul edilebilir aralıktayken yeşile döner. Sonraki Gaz'ı tıklayın.
4. İstendiğinde, kalibrasyon gazı tüpünü numune pompası arka panelindeki kalibrasyon portuna bağlayın. Kalibrasyon gazı çıkış basıncını 5 PSIG'ye ayarlayın. Tamam'a tıklamadan önce, kullanıcının armatürün yakınındaki gazı duyabileceği ve hissedebileceği T armatüründen fazla gaz akışını sağlayın.
5. Zamanlayıcı sıfıra ulaştığında, ekrandaki okumayı 2'e (veya mümkün olduğunca yakın) ayarlamak için CO 2.700 sensöründeki Yukarı ve Aşağı aralık düğmelerine basın. Değerler kabul edilebilir aralıktayken yeşile döner. Kalibrasyonu tamamlamak için Sonraki Gaz'a tıklayın.
   NOT: Açıklık gazı konsantrasyonları, tedarikçinin analiz sertifikasında belgelendiği gibi, sertifikalı birincil standart gaz karışımı tarafından belirlenir.

8. Yazılımda deney kurulumu

1. Deney > Kurulum'u seçin. Açılan menülerden dolu kanallara göre başlangıç ve bitiş kanal numaralarını girin.
   1. Yenileme Eşiği (%) değerini 0,50, Yenileme aralığı N.A. ve Yenileme Penceresi'ni (sn) Otomatik olarak ayarlayın.
   2. Çeşitli Kurulum altında, Temizleme Sensörleri kutusunu işaretleyin; Otomatik Hacim Ölçümü, O₂ Tüketim Pozitif ve Açık Akış Modunu Etkinleştir'in seçilmediğinden emin olun.
   3. Numune Aralığını (Saat) 8.00 ve Deney Süresini (Saat) NA olarak ayarlayın. Gaz ve zaman birimlerini gerektiği gibi ayarlayın.
   4. İnkübasyon sıcaklığı düzeltmesi için birincil sıcaklık probu kullanılıyorsa, Oda Sıcaklıklarını Manuel Olarak Gir seçeneğinin belirlenmediğinden emin olun. Havalandırma Modu kutusunu işaretleyin ve Boşaltma Modu'nun seçili olmadığından emin olun.
   5. Anaerobik Havalandırma Modunun seçilmediğinden emin olun.
2. Oda Kurulumu'nu seçin. Açıklayıcı kanal etiketleri girin (ör. NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. Yardımcı Programlar'ı tıklayın. Yalnızca dolu kanallar için EN Sütunundaki Hücreler'i tıklatın. Kısıtlama'yı tıklayın. Yazılım her kanal için BAŞARILI veya BAŞARISIZ gösterecektir. Yalnızca tüm kısıtlama testleri başarılı olursa devam edin.
4. Üstbilgi hacimlerini ölçmek için Hacim'e tıklayın.
   NOT: Üst boşluk hacmi, numune reaktör kabı ve kapalı devre boru içindeki havanın hacmine eşittir. Hacimlerin kap boyutu ve boru uzunluğu için makul olduğunu onaylayın.
5. Sızıntı'yı tıklayın. Yazılım, üst boşluk hacmine bağlı olarak her kanal için BAŞARILI veya BAŞARISIZ gösterecektir. Bir kanal başarısız olursa, aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. O-ringin temiz olduğundan, parçacık ve lif içermediğinden ve kap kenarı ile metal kapak arasına düzgün şekilde oturduğundan emin olun.
   2. Vidalı kapağı sıkın. GİRİŞ/ÇIKIŞ portlarındaki ve bağlantı parçalarındaki bağlantıyı ve boruları kontrol edin. Temiz ve düz bir kesim sağlamak için aşınmış veya deforme olmuş boru uçlarını keskin bir bıçakla kesin.
   3. Kanal arızalanmaya devam ederse, O-ringi üretici tarafından belirtilen yeni, uyumlu bir o-ringle değiştirin.
6. Üst boşluk hacimlerini yeniden ölçmek için Hacim'e tıklayın. Çık'ı tıklayın. Hazne Kurulumu sekmesinin Hacim sütununun tüm dolu kanallar için doldurulduğundan emin olun.
7. Ana menüde Araçlar > Servis Menüsü'nü seçin. İnkübatör sıcaklığını ölçen birincil sıcaklık probunun 30 °C ± 2 °C'de ve kararlı olduğunu doğrulayın.
8. Çalıştır'ı tıklayın. Dosyayı, tarihi içeren açıklayıcı bir ad kullanarak kaydedin (örneğin, 030325PositiveControlValidation). Dosya adını veri sayfasına kaydedin.
9. Gerçek zamanlı grafikleri görüntülemek için Deney > Grafik Oluşturma > Görüntüle'yi seçin. Biyogaz üretimi pozitif CO₂ üretim oranları olarak karşımıza çıkmaktadır. Negatif kontroller sıfır civarında dalgalanabilir; ancak ortalama oranları sıfır veya pozitif olmalıdır.
10. Sistem yoğuşmalı hava kurutucuları içeriyorsa, borularda günlük görünür yoğuşma kaydı tutun. Tıkanıklıkları gidermek ve gerekirse drenaja izin vermek için boruları hafifçe çalkalayın.
11. Her örnekleme aralığının sonunda veri dosyalarını (ASCII Metin Dosyaları) güncelleyin. Sıcaklık, gaz yüzdesi (gaz bileşimi), hız ve birikim dahil olmak üzere veriler, deney sırasında veya sonunda çeşitli diğer yazılım paketlerine indirilebilir.
    1. Bir elektronik tablodaki .dat dosyalarını açmak için Excel'i başlatın ve Dosya > Aç'ı seçin. .dat dosyasını içeren klasöre gidin. Dosya türü açılır menüsünde Tüm Dosyalar'ı seçin ve istediğiniz dosyayı seçin.
    2. Metin İçe Aktarma Sihirbazı tarafından istendiğinde, dosya türü olarak Sınırlandırılmış'ı seçin ve İleri'yi tıklatın.
    3. Sınırlayıcılar altında, Virgül kutusunu işaretleyin. Başka sınırlayıcıların seçilmediğinden emin olun. Önizleme penceresinde veriler sütunlara ayrılmış olarak görüntülenmelidir. Verileri e-tabloya yüklemek için Son'u tıklayın.
    4. Daha fazla analiz ve arşivleme için dosyayı .xlsx veya .csv formatında kaydedin.
12. Tedavi tekrarlarının tutarlı olduğundan emin olmak için verileri periyodik olarak analiz edin. Tedavi kopyalarının standart hatası, ortalama kümülatif CO₂ üretiminin %5'inden az olmalıdır. Bu eşiği geçemeyen testleri yineleyin.
13. Kuluçka tamamlandığında Durdur'a tıklayın.
    1. Kuluçkalar 10-90 gün sürebilir. Test malzemeleri biyolojik olarak yüksek oranda parçalanabilirse, kümülatif CO₂ üretimi durağanlaştığında inkübasyonu sonlandırın veya 90 gün sonra herhangi bir bozulma gözlenmezse uzatın.
    2. Hem kontrol hem de test kaplarında en az 5 gün boyunca net gaz üretimi gözlenmediğinde deneyleri sonlandırın. Hiçbir net üretim, 5 gün boyunca biyolojik bozunma yüzdesindeki %1'den az değişiklik olarak tanımlanmaz.
14. Sistemi kapatın veya bir sonraki deneye hazırlanın.

9. Deneyi parçalamak

1. İnkübatör sıcaklığını kaydedin (termistör probu ve inkübatör okuması). Boruyu reaktör kaplarından respirometreden ayırın ve her numune reaktör kabını hassas bir terazi kullanarak tartın. Kuluçka süresi boyunca herhangi bir ağırlık/su kaybı olup olmadığını belirlemek için ağırlıkları kaydedin.
2. pH ve tuzluluğu ölçmek için her reaktör kabından 20-30 mL deniz suyu numunesi alın ve inkübasyon sırasında stabiliteyi doğrulamak için bu değerleri adım 3.4'te kaydedilenlerle karşılaştırın. Adım 1.5'teki standart yöntemleri izleyerek çözünmüş inorganik N ve P analizi için asitle süzülmüş bir polietilen şişeye 0,2 μm düşük nitrojenli selüloz asetat filtreden 60 mL daha süzün.
   NOT: Artık deniz suyu numuneleri, kalan plastikleri uzaklaştırmak için filtrelenebilir, besin konsantrasyonlarını azaltmak için seyreltilebilir ve kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak drenaj deşarjı yoluyla bertaraf edilebilir.
3. Kapları, O-ringleri, metal kapakları ve vidalı kapakları musluk suyuyla durulayın. Züccaciyeleri en az 24 saat boyunca %10 HCl asit banyosuna koyun. Otoklavlayın ve bir sonraki inkübasyon için alüminyum folyo ile kaplanmış olarak saklayın

10. Biyolojik bozunma yüzdesinin hesaplanması

1. Deneysel/kontrol substratındaki toplam karbonu aşağıdaki gibi hesaplayın:
   
   burada % C (karbon içeriği) element analizi yoluyla belirlenir.
   NOT: Deney ve kontrol substratlarındaki toplam karbon, aerobik inkübasyon sırasında aşağıdaki biyokimyasal dönüşüme uğrayabilir:
   C + O₂ → CO₂
   Deneysel/kontrol substratından her mmole (12 mg) organik karbon, 1 mmol gaz halindeki CO_2'ye dönüştürülebilir . Üretilen bir mmole gaz, standart sıcaklık ve basınçta (STP) 22,4 mL yer kaplar.
2. Biyolojik bozunma yüzdesini aşağıdaki gibi hesaplayın:
   
   burada C_g = deneysel/kontrol substratından üretilen gaz halindeki karbon miktarı ve negatif kontrol (yalnızca deniz suyu aşısı), mmoller ve C_i = deneysel substratta eklenen karbon miktarı, mmoller.
3. Biyolojik bozunma yüzdesinin standart hatasını (s_e) aşağıdaki gibi hesaplayın:
   
   burada n1 ve n2 = sırasıyla kopya deneysel/kontrol substratı ve negatif kontrol reaktör kaplarının sayısı ve s = üretilen toplam gaz halindeki karbonun standart sapması.
4. %95 güven sınırlarını (CL) aşağıdaki gibi hesaplayın:
   
   burada t = t-dağılım değeri ile %95 olasılık için (n1 + n2 − 2) serbestlik derecesi, dolayısıyla n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Protokolün sonu

1. Hesaplamaları ve veri analizlerini tamamladıktan sonra, sonuçları nihai raporda derleyin veya proje veya kurumsal veri yönetimi planlarına uygun olarak paylaşılan bir veri tabanına girin. Tüm malzemelerin kurumsal tehlikeli atık yönergelerine göre bertaraf edildiğinden ve tüm ekipmanların temizlenip saklandığından emin olun.

Sonuçlar

Deniz biyolojik bozunma testlerinden elde edilen sonuçlar sunulmaktadır. Biyolojik bozunma, karbondioksite dönüştürülen karbon oranı ölçülerek her numune için değerlendirildi. Kümülatif, oran ve yüzde biyolojik bozunma grafikleri tipik olarak bir gecikme aşaması, ardından bir büyüme aşaması ve sonunda bir plato sergiler. Bu aşamaların zamanlaması ve büyüklüğü numune materyaline, deney koşullarına ve deniz suyu aşısının bileşimine bağlıdır.

Yıl boyunca ılıman b...

Tartışma

Pozitif kontrol performansı test geçerliliğini belirler. Teorik maksimum gaz verimine bağlı olarak, denizde kolayca biyolojik olarak parçalanabilen bir pozitif kontrol substratının (örneğin, analitik dereceli selüloz, Kraft kağıdı, vb.) minimum %70 biyolojik bozunması gereklidir. Bu kıyaslama, inkübasyon sırasında doğal deniz suyundaki uygun koşulları ve yeterli mikrobiyal aktiviteyi doğrular. Bu eşiğin karşılanmaması, kopya hazırlama, deniz suyu aşısının işlenmesi (yani mikrobiyal toplu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.2 & mikro; m, 47 mm selüloz asetat filtre	Geotech Jeofiltr	83100056	Deniz suyu filtresi
100 mL hacimsel pipet	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Class A; Asit süzülüp deionize suyla durulanır
100-600 mL cam bedekler	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Class A; Asit süzülüp deionize suyla durulanır
20 mm frezeleme topları	Retsch	53680062	Paslanmaz çelik. Polimerin kriyojenik öğütülmesi için öğütme kavanozu ile birlikte kullanılır
50 mL öğütme kavanozları	Retsch	14620216	Paslanmaz çelik. Polimerin kriyojenik öğütülmesi için Mikser Frezesi 400 ve 20 mm frezeleme toplarıyla birlikte kullanılır
75 mL hacimsel pipet	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Class A; Asit süzülüp deionize suyla durulanır
Hava pompası ve kabarcık sistemi	Tetra	77846	Kuluçka öncesi denge sırasında deniz suyunu havalandırın
Alüminyum folyo	Fisherbrand	01-213-100	Otoklavlama ve temiz depolama için kapak
Amonyum klorür (NH4Cl)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	Deniz suyu besin artışı
Analitik denge	Mettler	AT201	Deneysel ve kontrol substratlarını tartmak için
Otoklav	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Kapları ve kapak montajlarını steril etmek
Temel Micro-Oxymax 120VAC Tek Kanallı	Columbus Instruments	0135-8000	Pozitif kontroller ve polimer depolamak için kullanılır
Kalibrasyon gazı	Airgas	X03NI92P3000001	birincil standart gaz karışımları; %2,7 Karbondioksit, %4,5 Metan, denge Azot
Bilgisayar Monitörü	Dell	210-BMKK	Dell Pro 24 Plus USB-C Hub Monitor. Micro-Oxymax yazılımını çalıştırmak için bilgisayarla birlikte kullanılır
Kriyojenik Eldivenler	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Cryo Eldivenler	11-394-306	Sıvı azot işlemek için kullanılır
Kadran Termometresi	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	Toplama sırasında deniz suyu sıcaklığı için kalibre edilmiş termometre
Tek kullanımlık pipetler	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Malzeme boşaltmak için kabın yanlarını durulayın
ENC52 Sıcaklık ve Işık Kontrollü Muhafaza	Columbus Instruments	4740-4054	Sıcaklık ve ışık koşullarını korumak
Matşa Maşası	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Sıvı azotta öğütme kavanozlarını işlemek için kullanılır
Şişeler, 250 mL	DWK Yaşam Bilimleri	14395-250	Örnek reaktör kapları
Plug Tarzı Kapaklı Cam Kabuk Şişeler	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Örnek depolama
H22PX Elde Taşınan Derinlik Ölçer	Batı Deniz Piyadesi, Norcross Deniz Piyadeleri	6849368	Deniz suyu toplama alanı derinliğini belirleyin
Elde taşınan GPS 73	Garmin	10-01504-00	Deniz suyu toplama alanının konumunu belirlemek için kullanılır
HDPE Tava	Termo Bilimsel, Nalgene	13-359-26	Cam eşyalarını asitlemek için kullanılır  %10 HCl çözeltisinde
Hidroklorik Asit (asidik su çözeltisi)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	Sertifikalı ACS Plus, %36,5 ile %38,0 oranı arasında. CO2 sensör kontrolü ve asit sızıntısı cam eşyaları
Laminar akış başlığı	Hava Bilimi	FLOW-48-A	Numune hazırlığı sırasında havadaki kirleticileri en aza indirin
Büyük Niskin; Sadece Beta Plus Şişe - 8.2L Yatay, PVC	Önce Bilim	3-1980-H65	İskele veya tekneden deniz suyu toplamak için
Sıvı Azot Tavası	Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Sıvı Azot ve Sıvı Azot Tutun;
Sıvı Azot Transfer Kabı, 10 L	Termo Bilimsel	TY509X2	Sıvı azotu kriyo-değirleme için depolayın ve dağıtın
Sıvı Azot, Endüstriyel Sınıf, 22 PSI	Airgas	NI 180LT22	Polimerleri kırılganlaştırmak ve öğütmek için kullanılır
Mekanik Elekten Çalkalayıcı	Humbolt, Grainger	5DPL6	Parçacık boyutu dağılımı için elek analizi
Micro-Oxymax	Columbus Enstrümanları	7395-113-D64	Silikon kapalı o-halka, metal port ve 3 bağlantı ile GL45 vida kapak & nbsp;
Micro-Oxymax 10 Kanal Genişletme Arayüzü	Columbus Instruments	0135-8101	Respirometri Sistemi Bileşeni
Micro-Oxymax Respirometer (%3 CO2 sensörü)	Columbus Instruments	0135-8403	Saçılmaz-kızılötesi
Mikser Değirmeni 400	Retsch	207450001	Mikser Değirmeni 400. Polimerin kriyojenik öğütülmesi için kullanılır
Motorlu pipet kontrolörü	Eppendorf	4430000018	Deniz suyunu örnekleme reaktör kaplarına aktarın
Dar ağızlı kehribar HDPE laboratuvar kalitesinde şişe, 1 L	Termo Bilimsel, Nalgene	02-923-5	Ayrı bir tam su deniz suyu örneği
Naylon Mesh 20 Mikron	ELKO Filtreleme Şirketi.	41718	Ham deniz suyunu elemek için kullanılır ve daha büyük heterojen partikülleri gidermek için kullanılır
Açık Hava Yörünge Sarsıntısı	Thermo Fisher Scientific	SK4000	İnkubasyon sırasında reaktör kaplarının yörünge hareketini sürdürmek
OptiPlex 5090 Küçük Form Faktörlü Bilgisayar	Dell	C0SL03	Micro-Oxymax yazılımını çalıştırmak için kullanılan Desktom bilgisayarı
pH/Cond Ölçer	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Başlangıç ve son deniz suyu aşısını ölçmek için tezgah üstü pH/iletkenlik ölçer
Polietilen şişe, 60 mL	Qorpak	PLC-03564	Ayrı filtrelenmiş deniz suyu örneği
Potasyum fosfat monobazi (KH2(PO4))	Thermo Fisher Scientific, Fisher Biyoreagentleri	BP362-500	Deniz suyu besin artışı
Hassas denge	Sartorius	Practum2102-1S	Damar tare ve tüm ağırlığını tartmak için
Yuvarlak Carboy, 20 L	Thermo Fisher Scientific	02961A	Deniz suyu depolamak için asit sızıntısı
Güvenlik Gözlükleri	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	Paslanmaz çelik laboratuvar scoopula
Elenekler	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	Paslanmaz çelik elekler. Süzme sayısı ve boyutları test edilen malzemeye bağlı olacaktır.
Sigmacell Selüloza, Tip 101	Sigma-Aldrich	435236-250G	Toz, pozitif kontrol altı
Sodyum Bikarbonat	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	S233-500	CO2 sensör kontrolü
Sodyum sülfit, susuz, %98	Thermo Fisher Bilimsel, Termobilimsel Kimyasallar	AAA1793336	CO2 sensör kontrolü
Termometre/termistör probu	Fisherbrand	15-079-700	İnkuluçka makinesi sıcaklığını doğrulayın
İzlenebilir Hassas Kadran Barometresi	Fisherbrand	14-648-51	Deneyin başında atmosfer basıncını kaydedin
Victor Orta Hizmet Hidrojen, Metan İki Kademeli Regülatör, CGA - 350	AirGas	VIC0781-3559	Kalibrasyon gaz regülatör
Hacimsel şişeler, 2 L	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	Class A; asit sızdırılmış ve deionize suyla durulanmış. Besinli dalgalı deniz suyu hazırlamak için kullanılır.
Tartı tavaları	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	Polietilen