İlaca dirençli hücre hatları, tedavi direnç mekanizmalarının anlaşılmasını ve yeni bileşiklerin, yeniden tasarlanmış ilaçların ve kombinasyon tedavilerinin klinik olmayan değerlendirmesini sağlar. Bu makale, ana hücre hatlarını hedef ilacın konsantrasyonunda kademeli artışlara maruz bırakarak dirençli hücre hatları oluşturmak için bir protokol sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Deneysel Prosedürler için İlaca Dirençli Hücre Hatlarının Geliştirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İlaca dirençli hücre hatlarının geliştirilmesi, ilaç direnç mekanizmalarını anlamak ve kanser tedavisinde tedavi başarısızlığının üstesinden gelmek için stratejilerin belirlenmesi için gereklidir. Direnç modelleri, yeni bileşiklerin, yeniden tasarlanmış ilaçların ve kombinasyon tedavilerinin klinik öncesi değerlendirmesini sağlar. Dirençli hücreler oluşturmak için, ebeveyn kanseri hücre hatları, birkaç hafta boyunca hedef ilacın kademeli olarak artan konsantrasyonlarına tekrar tekrar maruz bırakılır. Her aşamada hayatta kalan ve çoğalan hücreler seçilir, genişletilir ve daha yüksek ilaç dozlarına maruz bırakılır. Direnç gelişimi, hücre canlılığı deneyleri ve doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak ebeveyn ve dirençli hücreler arasındaki yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) değerlerinin ölçülmesi ve karşılaştırılmasıyla doğrulanır. Önemli ölçüde artan IC50 değerleri, ilaç baskısına başarılı adaptasyonu ve direnç gelişimini gösterir. Bu ilaca dirençli hücre hatları, mikrodizi ve tek hücre dizilimi gibi kapsamlı analizlerin yanı sıra çeşitli in vitro veya in vivo deneyler için kullanılabilir. Bu modeller, ilaç direncinin üstesinden gelmek için potansiyel terapötik stratejileri araştırmak için değerli araçlar sağlar.
Giriş
Cerrahi veya radyasyon tedavisine uygun olmayan lokal kanserler veya metastatik kanserler için kemoterapi en sık kullanılan tedavi seçeneğidir. Moleküler hedefe yönelik ilaçlar ve kemoterapi birçok malignite için birinci basamak tedavi olarak kullanılmaktadır ve etkinlikleri yaygın olarak kabul edilmektedir. Bazı kanserler, tedavinin başlangıcından itibaren bazı ilaçlara direnç gösterir ve bu da tedaviyi etkisiz hale getirir. Bununla birlikte, daha yaygın vakalarda, başlangıçta etkili olan tedavi, ilaç direncinin gelişmesi nedeniyle etkisiz hale gelir ve kanserin ilerlemesine yol açar.
İlaç direnci, ilaçlardan kaçan veya hücre büyümesine yardımcı olan gen ürünlerinin ekspresyonunu indükleyen kanser hücrelerinde hem genetik mutasyonlardan hem de epigenetik yanıttan kaynaklanır 1,2. Ayrıca, birçok durumda, bu direnç, kanser hücresinin birden fazla ilaca dirençli hale geldiği çoklu ilaç direncine dönüşür 3,4. Bu nedenle, ilaç direncinin mekanizmalarının belirlenmesi ve üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesi kanser tedavisinin ilerlemesi için son derece önemlidir.
İlaca dirençli hücre hatları, terapötik direnç mekanizmalarını incelemek için sıklıkla kullanılan modellerdir ve hem in vitro hem de in vivo deneylerde önemli bir rol oynar5. Bu modeller, ilaç etki yollarının daha derin bir şekilde anlaşılması, terapötik etkinliği etkileyen biyobelirteçlerin belirlenmesi ve ilaç direnci oluşumunu engellemek için terapötik stratejiler bulunması için gerekli araçlardır. İlaca dirençli bir hücre hattı oluşturmanın temel süreci, bir hücre hattını hedef ilacın 3,6 artan seviyelerine maruz bırakarak direnci indüklemektir.
Kullanılan konsantrasyon ve ilaca maruz kalma süresi bu işlemin kritik bileşenleridir. Her konsantrasyon seviyesinde, hayatta kalan hücrelerin alt kümesi amplifiye edilir ve daha sonra tekrarlayan bir şekilde bir sonraki ilaç konsantrasyonuna maruz bırakılır. Sonuç olarak, ebeveyn hücre hattına kıyasla ilaç için artmış yarı maksimal inhibitör konsantrasyona (IC50) sahip ilaca dirençli bir hücre hattı türetilir. Bu rapor, aralıklı ilaç maruziyetleri ile aşamalı bir yöntem kullanarak, insan prostat kanseri hücre hattı DU145'ten paklitakse dirençli bir hücre hattı (DU145-TxR) oluşturma prosedürünü detaylandırmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre kültürü ve hücre canlılığı deneyleri
NOT: Paklitaksel bir antikanser ilacıdır ve sitotoksiktir. Tutarken bir önlük, gözlük ve eldiven giyin ve vücuda solunmasını önlemek için bir güvenlik kabini içinde çalışın. DMSO yüksek derecede sitotoksik değildir, ancak cilt veya mukoza zarlarıyla temas ettiğinde çözünmüş ilaçların geçirgenliği artar, bu nedenle onu kullanırken bir önlük, gözlük ve eldiven giyin.
- DU-145 hücrelerini, 37 ° C'lik bir inkübatörde% 5 CO2'de % 80 birleşene kadar tam ortam (RPMI-1640 +% 1 penisilin-streptomisin [pen-strep] +% 10 fetal sığır serumu [FBS]) kullanarak 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında kültürleyin.
- Kültür ortamını aspire edin, DPBS ile yıkayın,% 0.05 tripsin ekleyin ve inkübatörde 5 dakika bekletin.
- Hücrelerin plakadan ayrıldığını ve yüzdüğünü mikroskopi ile dokunduktan ve onayladıktan sonra, tripsinin etkisini durdurmak için 1 mL tam ortam ekleyin.
- Hücrelerin sayısını sayın ve bunları 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda tam ortamda kuyu başına 1.0 × 104/99 μL yoğunlukta tohumlayın. Hücrelerin plakanın dibine yapışmasını sağlamak için 2 saat inkübe edin. Hücreler, her test grubu için üç veya dört kopya halinde kaplanmalıdır.
- Her bir kuyucuğa eklenecek paklitaksel ve DMSO'yu ayarlayın. Her bir oyuğa eklenen DMSO miktarının aynı olduğundan ve nihai DMSO konsantrasyonunun% 1'den fazla olmadığından emin olun.
- Bunu gerçekleştirmek ve protokolümüzü takip etmek için, DMSO'da 10 mM paklitaksel ile başlayın ve 1.280 μM'de 100 μL paklitaksel elde etmek için bir tüpte bu ilacın 12.8 μL'sine 87.2 μL DMSO ekleyin.
- Bu çözeltinin 50 μL'sini başka bir tüpe aktarın ve 50 μL DMSO (640 μM) ile yarı kuvvete seyreltin.
- Seri seyreltme gerçekleştirmek ve 0 (yalnızca DMSO), 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 ve 1.280 μM konsantrasyonlarda paklitaksel çözeltileri hazırlamak için bu prosedürü tekrarlayın.
NOT: DMSO ile seyreltilmiş paklitaksel, sonraki deneylerde yeniden kullanılmak üzere donmuş olarak saklanmalıdır (donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için alikotlarda saklayın).
- Daha önce hazırlanan paklitaksel çözeltisinin 1 μL'sini ayrı bir tüpte 9 μL tam ortam ile seyreltin ve hücrelerin tohumlanmasından 2 saat sonra her bir oyuğa 1 μL ekleyin. Her bir kuyucuktaki paklitaksel konsantrasyonları 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 ve 1.280 nM olacak ve her kuyucuk 100 μL ortam içerecektir.
NOT: Hücre canlılığı deneylerinde kullanılan ilaçların konsantrasyonunu ayarlarken, önceki makalelerde yayınlanan IC50 değerlerini kontrol edin ve konsantrasyonun3 aralığına düştüğünden emin olun. Her bir oyuktaki DMSO konsantrasyonu boyunca% 0.1 idi (% 1'den azı arzu edilir). - 48 saat kuluçkaya yatırın. Her oyuğa (100 μL kültür ortamı) 10 μL Hücre Proliferasyon Reaktifi WST-1 ekleyin ve 0.5 ila 4.0 saat daha inkübe edin.
NOT: Optimum inkübasyon süresi, hücre hattına ve hücre yoğunluğuna bağlıdır. Bu çalışmada hücreleri yaklaşık 1,5 saat kültüre ettik. Kuluçka süresi çok kısa veya çok uzunsa, bir sonraki adımda her bir oyuğun emiciliği çok düşük veya çok yüksek olacaktır. Sonuç olarak, hücre canlılığındaki farkı doğrulamak mümkün olmayacaktır. Bu nedenle, ilk test için, uygun inkübasyon süresini doğrulamak için birkaç inkübasyon süresi test edilmelidir. - Bir mikroplaka okuyucu kullanarak WST-1 absorbansını ölçün.
NOT: Hedef emilim 450 nm'dir (420-480 nm önerilir) ve arka plan emilimi 650 nm'dir (600 nm veya daha yüksek önerilir).
2. Hücre canlılığı ve yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) değerinin hesaplanması
- Absorbanstan hücre canlılığını hesaplayın. Absorbans (A450nm-A650nm).
Hücre canlılığı (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
Gibi: numune absorbansı (ilaçla tedavi edilen hücreler)
Ab: boş absorbans (yalnızca orta, hücre yok)
Ac: kontrol absorbansı (ilaçla tedavi edilmemiş hücreler) - Bir elektronik tablo yazılımında önceki bölümde hesaplanan hücre canlılığını özetleyin.
- Doğrusal olmayan regresyon analizi ile ebeveyn hücreleri için IC50'yi hesaplayın ve kaydedin.
NOT: Dört parametreli lojistik model (4PL) genellikle uygun bir hesaplama yöntemidir. Çevrimiçi IC50 hesaplama araçları mevcuttur7. Bununla birlikte, bileşiğin etkinliği konsantrasyon aralığının dışında olduğunda ve veriler sigmoid eğrisinin alt ve üst asimptotlarını tam olarak temsil edemediğinde 4PL modeli kullanılmamalıdır.- Böyle bir artışı önlemek için, hücre canlılığını mümkün olduğu kadar çok konsantrasyon noktasında ölçün. Bir sigmoid eğrisi elde edilemiyorsa, sabit minimum ve maksimum değerlere sahip iki veya üç parametreli bir mod kullanın7.
- Web'de bulunanlar da dahil olmak üzere hesaplama yazılımı veya istatistiksel yazılım kullanmıyorsanız, aşağıdaki formülü kullanın:
IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
A: %≤50'lik bir hücre canlılığı ile ölçülen ilaç konsantrasyonları arasındaki en düşük değer
B: %>50'lik bir hücre canlılığı ile ölçülen ilaç konsantrasyonları arasında en yüksek değer
C: B'de hücre canlılığı
D: A'da hücre canlılığı
NOT: Bu formül, IC50 değerini sandviçleyen iki nokta arasındaki grafiğin düz bir çizgi olduğunu varsayar.
3. İlaca maruz kalma
NOT: Bu bölümde açıklanan prosedürlere genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
- Hücre kültürü plakalarında tohum ebeveyn hücreleri (100 mm'lik tabaklar için 2.0 ×10 6 hücre/tabak).
- Ortama ~% 10-20'lik bir hücre canlılığı inhibitör konsantrasyonunda (bu durumda IC10-20, ~ 0.5 nM) paklitaksel ekleyin ve 2 gün boyunca bir inkübatörde kültürleyin.
- Paklitaksel içermeyen besiyeri ile değiştirin ve birkaç gün inkübe edin.
- Hücreler büyüdüğünde ve% 80 birleştiğinde, onları yeni bir hücre kültürü plakasına geçirin. Kalan hücreleri kriyoprezervasyon.
- Geçirilen hücrelere ~ 1.5-2.0 kat konsantrasyonda başlangıç konsantrasyonu (0.75-1 nM) ekleyin. 2 gün boyunca bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Paklitaksel içermeyen besiyeri ile değiştirin ve birkaç gün inkübe edin.
- Hücreler benzer şekilde büyürse, paklitaksel maruziyetinin konsantrasyonunu adım adım artırarak 3.4-3.6 adımlarını tekrarlayın.
NOT: İlaç konsantrasyonundaki artış (1.5-2.0 kat) deneyci tarafından serbestçe ayarlanabilir ve deney bu konsantrasyonda tekrarlanmalıdır. İlaç konsantrasyonu her arttığında hücrelerin dondurulmasını ve saklanmasını öneririz. Paklitaksel konsantrasyonu daha da artmaya devam ederse, hücre proliferasyonu düzelmeyebilir ve hücreler ölebilir. Bu gibi durumlarda, ölümden önceki konsantrasyonda çoğalan hücreleri çözün, paklitaksel artışını 1.1-1.5 kata düşürün (1.2 kat önerilir) ve kültürü tekrarlayın. - Hücre hattının ilaca karşı direncini kademeli olarak artırın ve ardından WST-1 ve Bölüm 2'de açıklandığı gibi yazılım kullanarak IC50'yi hesaplayın ve kaydedin.
NOT: IC50'de en az 3-5 kat artış gözlenirse, suşun ilaca dirençli bir hücre hattı olduğu belirlenebilir.
4. İlaç direncinin korunması
- İlaca dirençli hücre hattının dirençli fenotipini korumak için, IC10-20'lik bir ilaç konsantrasyonu ile inkübe edin.
NOT: İlaç direnci değişebileceğinden, bir hücre sağkalım testindeki IC50'nin periyodik olarak ölçülmesi önerilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yöntemi kullanarak, daha önce paklitaksele dirençli DU145 hücrelerini (DU145-TxR) başarıyla kurmak için 9 ay harcadık. Hücre canlılığı testinin sonuçları, DU145 ana hücre hattı için paklitakselin IC50 değerinin 1.1 nM olduğunu, DU145-TxR için IC50 değerinin ise ana hücre hattınınkinden 149.6 kat daha yüksek olduğunu gösterdi (IC50: 164.6 nM) (Tablo 1 ve Şekil 2). Bu sonuç, DU145-TxR'nin çok yüksek ilaç direnci kazandığını göstermektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İlaca dirençli kanser hücre hatlarının geliştirilmesi, ilaç toksisitesini ve direnç mekanizmalarını araştırmak için yerleşik bir yöntemdir, ancak araştırmacıların karşılaştığı ilk zorluk, direnci ifade etmek için uygun bir model seçmektir. İlaca dirençli hücre hatları oluşturmak için yaygın bir yöntem in vitro olarak, hücre hattını hedef ilaca maruz bırakmaktır, ancak maruziyet konsantrasyonunun nasıl ayarlanacağını (kademeli olarak veya bir kerede) ve ilaçsız bir periyodun ayarlanıp aya...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P01 CA093900 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.05 Tripsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 10 mL Tek kullanımlık serolojik pipet | Fisher scientific | 13-678-11E | |
| 100 mm çanak | Corning | 353003 | |
| 15 mL konik tüp | Corning | 352097 | |
| 2.0 mL Kriyojenik Şişeler | Corning | 431386 | |
| 96 kuyulu hücre kültürü plakası | Corning | 353072 | |
| Hücre sayma odası slaydı | Invitrogen | C10228 | |
| Hücre Proliferasyon Reaktifi WST-1 | Sigma | 5015944001 | |
| Santrifüj 5702 R | eppendorf | ||
| sayısız II | Invitrogen | Hücre sayacı | |
| Dimetil sülfoksit ve nbsp; | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 | Prostat kanseri hücre hattı |
| EVOS FLc | Thermo Fisher Scientific | Dijital Ters Mikroskop | |
| FBS | Gibco | A5670701 | |
| Paklitaksel | Selleck | S1150 | |
| Penisilin ve ndash; streptomisin | İnvitrojen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | Mikroplaka | |
| Okuyucu Tripan Mavisi çözeltisi% 0.4 | İnvitrojen | 15250061 |
Kaynaklar
- Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Fron Pharmacol. 4, 28(2013).
- Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
- Takeda, M. The establishment of two paclitaxel-resistant prostate cancer cell lines and the mechanisms of paclitaxel resistance with two cell lines. Prostate. 67 (9), 955-967 (2007).
- Abelman, R. O., et al. TOP1 mutations and cross-resistance to antibody-drug conjugates in patients with metastatic breast cancer. Cli Cancer Res. 31 (10), 1966-1974 (2025).
- McDermott, M. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: a practical guide with case studies. Fron Oncol. 4, 40(2014).
- Breen, L., Murphy, L., Keenan, J., Clynes, M. Development of taxane resistance in a panel of human lung cancer cell lines. Toxico In Vitro. 22 (5), 1234-1241 (2008).
- Bioquest, A. A. IC50 calculator. , AA Bioquest. https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator (2025).
- Kawai, H. Characterization of non small-cell lung cancer cell lines established before and after chemotherapy. Lun Cancer. 35 (3), 305-314 (2002).
- Berendsen, H. H., et al. Characterization of three small cell lung cancer cell lines established from one patient during longitudinal follow-up. Cance Res. 48 (23), 6891-6899 (1988).
- Sakai, W. Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma. Cance Res. 69 (16), 6381-6386 (2009).
- Schnepp, P. M., et al. Single-cell transcriptomics analysis identifies nuclear protein 1 as a regulator of docetaxel resistance in prostate cancer cells. Mo Cancer Res. 18 (9), 1290-1301 (2020).
- Grigoreva, T., Sagaidak, A., Novikova, D., Tribulovich, V. New insights into chemoresistance mediated by Mdm2 inhibitors: the benefits of targeted therapy over common cytostatics. Biomedicines. 12 (3), 547(2024).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
