Bu protokol, BAC16'dan türetilmiş viryonları kullanarak Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsünün de novo litik enfeksiyonunu modellemek için bir in vitro sistemi tanımlar. Yöntem, erken viral replikasyon ve yayılımının araştırılmasını sağlar. Enfeksiyöz virüs üretimi, GFP tabanlı enfeksiyöz birim testleri ve kapsüllenmiş viral genomların gerçek zamanlı PCR'si ile ölçülür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresiz Kaposi Sarkomu ile İlişkili Herpes Virüsü ile De Novo Litik Enfeksiyonun Kurulması ve Miktarının Belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Birden fazla insan malignitesinde rol oynayan bir gamaherpes virüsü olan Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsü (KSHV), viral yayılmaya, immün kaçınmaya ve hastalık patogenezine katkıda bulunan bir süreç olan primer enfeksiyon sırasında litik replikasyona uğrayabilir. Bununla birlikte, de novo litik enfeksiyon için sağlam in vitro sistemlerin olmaması, erken enfeksiyon olaylarına ilişkin sınırlı bilgilere sahiptir. Burada, KSHV bakteriyel yapay kromozom 16 (BAC16) ile yeniden aktive edilen iSLK üretici hücrelerinden türetilen hücresiz viryonlarla enfeksiyon için hedef olarak insan kolorektal kanseri HCT 116 hücrelerini kullanan izlenebilir bir protokol sunuyoruz. Bu model, viral giriş, genom iletimi, litik gen ekspresyonu ve döl üretimi dahil olmak üzere birincil enfeksiyondaki temel adımları özetlemektedir. Enfeksiyon spinokülasyon yoluyla senkronize edilir ve zamansal olarak izlenir. Virüs üretimi, yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı enfeksiyöz birim (IU) tahlilleri ve kapsüllenmiş viral DNA'nın qPCR'sini içeren ikili bir okuma sistemi kullanılarak ölçülür. Bu yaklaşımlar, viral replikasyon kinetiğinin ayrıntılı analizini mümkün kılar. Mevcut protokol geç aşama olayların tespitine odaklanırken, sistem, değiştirilmiş örnekleme zaman noktaları aracılığıyla enfeksiyonun erken aşamalarını incelemek için uyarlanabilir. Üretken de novo enfeksiyon için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir bir platform sunan bu sistem, KSHV araştırmasındaki metodolojik bir boşluğu giderir ve herpesvirüs-konak etkileşimi ve antiviral stratejilerin mekanik çalışmalarını destekler.
Giriş
Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsü (KSHV), etiyolojik olarak Kaposi sarkomu (KS), primer efüzyon lenfoma (PEL), multisentrik Castleman hastalığı (MCD) ve KSHV inflamatuar sitokin sendromu 1,2 ile bağlantılı bir insan gamaherpes virüsüdür. Tüm herpesvirüsler gibi, KSHV de latent ve litik fazlar arasında geçiş yaparak konakta yaşam boyu kalıcılık sağlar. Enfekte olmuş hücrelerin çoğunda gecikme baskın olsa da, bir alt küme ya birincil (de novo) enfeksiyon sırasında ya da gecikme3'ten yeniden aktivasyon yoluyla litik döngüye girebilir. Liti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
KSHV, Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) insan patojeni olarak sınıflandırılır. Bulaşıcı materyal içeren tüm prosedürleri sertifikalı bir BSL-2 biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Her prosedürden önce ve sonra çalışma yüzeylerini %70 etanol ile dekontamine edin. Tüm atıkları kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine ve WHO BSL-2 yönergelerine uygun olarak atın. Tam iş akışına şematik bir genel bakış Şekil 1'de verilmiştir. Prosedür, yeniden aktive edilmiş iSLK hücrelerinden hücresiz BAC16'dan türetilmiş KSHV'nin üretilmesini, HCT 116 hücrelerinin de novo enfeksiyonunu, enfeksiyöz birim (IU) testi ile v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Enfeksiyöz virüsün titresini ölçmek için, iSLK-BAC16 hücrelerinin litik reaktivasyonundan 72 saat sonra hasat edilen süpernatantlar, iki kat seri seyreltmeye tabi tutuldu ve SLK hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. Her bir dilüsyondaki GFP-pozitif SLK hücrelerinin sayısı Şekil 2A'da gösterilmiştir ve mL başına karşılık gelen enfeksiyöz birimler (IU) hesaplanmış ve Şekil 2B'de sunulmuştur. <.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
KSHV'nin de novo litik enfeksiyonunun modellenmesi, virüsün çoğu izin verilen hücre tipinde gecikme sağlama konusundaki güçlü eğilimi nedeniyle uzun süredir engellenmektedir. Endotel ve oral epitel hücreleri gibi bazı primer hücrelerin de novo enfeksiyon 9,10'u takiben litik replikasyonu desteklediği gösterilmiş olsa da, sınırlı ömürleri, yüksek maliyetleri ve kültür bakımındaki teknik zorluklar tekrarlanabilirl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.
Teşekkürler
Yazarlar, rekombinant KSHV üreten iSLK-BAC16 hücre hattını paylaştığı için Dr. Jae U. Jung'a (Cleveland Clinic) teşekkür eder. Grafik tasarım, yazarların lisansına sahip olduğu BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışma, NIH ödülleri R21 DE028256, R01 CA140964 ve R01 CA262631 C. Liang'a (PI), Wistar Science Accelerator Doktora Sonrası Ödülü'nü Q. Zhu'ya verdi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.45 &mikro; m polietersülfom (PES) filtre | VWR | 76479-020 | |
| Biyolojik render | Biyolojik render | YOK | Grafik tasarım, yazarların lisansına sahip olduğu BioRender.com ile oluşturulmuştur |
| CFX Opus 96 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | Biyo-Rad | 184-5072 | |
| DMEM'i tamamlayın | Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's ortamı (DMEM; Sigma-Aldrich) %10(h/h) fetal sığır serumu (FBS; Gibco), 2 mM L-glutamin (Gibco) ve 100U/ml penisilin-streptomisin (Pen-Strep; GenClone). | ||
| DNase I | New England Biyolaboratuvarları | M0303S | |
| Doksisiklin | Sigma-Aldrich | D9891 Serisi | |
| LSR II 18 akış sitometresi | BD Biyobilim | YOK | |
| PerfeCTa SYBR Yeşil Usta Süper Karışım | Quantabio | 95054-02K | |
| QIAamp DNA Mini Kiti | Qiagen | 56304 | |
| sodyum bütirat (NaB) | Sigma-Aldrich | B5887 Serisi | |
| Ultra Saf 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Termo Balıkçı | 15575020 |
Kaynaklar
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
- Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphopr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
