Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücresiz Kaposi Sarkomu ile İlişkili Herpes Virüsü ile De Novo Litik Enfeksiyonun Kurulması ve Miktarının Belirlenmesi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68959

⸱

15 Ağustos 2025

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

Bu makalede

Özet

Bu protokol, BAC16'dan türetilmiş viryonları kullanarak Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsünün de novo litik enfeksiyonunu modellemek için bir in vitro sistemi tanımlar. Yöntem, erken viral replikasyon ve yayılımının araştırılmasını sağlar. Enfeksiyöz virüs üretimi, GFP tabanlı enfeksiyöz birim testleri ve kapsüllenmiş viral genomların gerçek zamanlı PCR'si ile ölçülür.

Özet

Birden fazla insan malignitesinde rol oynayan bir gamaherpes virüsü olan Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsü (KSHV), viral yayılmaya, immün kaçınmaya ve hastalık patogenezine katkıda bulunan bir süreç olan primer enfeksiyon sırasında litik replikasyona uğrayabilir. Bununla birlikte, de novo litik enfeksiyon için sağlam in vitro sistemlerin olmaması, erken enfeksiyon olaylarına ilişkin sınırlı bilgilere sahiptir. Burada, KSHV bakteriyel yapay kromozom 16 (BAC16) ile yeniden aktive edilen iSLK üretici hücrelerinden türetilen hücresiz viryonlarla enfeksiyon için hedef olarak insan kolorektal kanseri HCT 116 hücrelerini kullanan izlenebilir bir protokol sunuyoruz. Bu model, viral giriş, genom iletimi, litik gen ekspresyonu ve döl üretimi dahil olmak üzere birincil enfeksiyondaki temel adımları özetlemektedir. Enfeksiyon spinokülasyon yoluyla senkronize edilir ve zamansal olarak izlenir. Virüs üretimi, yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı enfeksiyöz birim (IU) tahlilleri ve kapsüllenmiş viral DNA'nın qPCR'sini içeren ikili bir okuma sistemi kullanılarak ölçülür. Bu yaklaşımlar, viral replikasyon kinetiğinin ayrıntılı analizini mümkün kılar. Mevcut protokol geç aşama olayların tespitine odaklanırken, sistem, değiştirilmiş örnekleme zaman noktaları aracılığıyla enfeksiyonun erken aşamalarını incelemek için uyarlanabilir. Üretken de novo enfeksiyon için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir bir platform sunan bu sistem, KSHV araştırmasındaki metodolojik bir boşluğu giderir ve herpesvirüs-konak etkileşimi ve antiviral stratejilerin mekanik çalışmalarını destekler.

Giriş

Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsü (KSHV), etiyolojik olarak Kaposi sarkomu (KS), primer efüzyon lenfoma (PEL), multisentrik Castleman hastalığı (MCD) ve KSHV inflamatuar sitokin sendromu 1,2 ile bağlantılı bir insan gamaherpes virüsüdür. Tüm herpesvirüsler gibi, KSHV de latent ve litik fazlar arasında geçiş yaparak konakta yaşam boyu kalıcılık sağlar. Enfekte olmuş hücrelerin çoğunda gecikme baskın olsa da, bir alt küme ya birincil (de novo) enfeksiyon sırasında ya da gecikme3'ten yeniden aktivasyon yoluyla litik döngüye girebilir. Litik replikasyon, genom replikasyonu, virion montajı ve döl salınımı ile sonuçlanan düzenli bir viral gen ekspresyonu kaskadını içerir. Bu süreç viral yayılma ve hastalığın ilerlemesi için kritik öneme sahiptir 4,5. KSHV litik replikasyonunun erken çalışmaları genellikle heterolog sistemlerde bireysel viral genlerin ektopik ekspresyonuna dayanıyordu. Bilgilendirici olmasına rağmen, bu yaklaşımlar, otantik enfeksiyon sırasında mevcut olan koordineli gen regülasyonunu ve virüs-konakçı etkileşimini yakalamadı. Tam uzunlukta KSHV genomunu taşıyan rekombinant bir bakteriyel yapay kromozom (BAC) olan BAC-16'nın geliştirilmesi, replikasyon ve enfeksiyöz virion üretimi için yetkinliğini koruyan genetik olarak manipüle edilebilir virüslerin üretimini mümkün kılmıştır6. Bu sistem, tüm genom bağlamında viral genlerin hedeflenen mutajenezini ve fonksiyonel analizini kolaylaştırır. BAC-16 veya KSHV ile latent enfekte iSLK veya BCBL-1 hücrelerini kullanan reaktivasyon modelleri, o zamandan beri KSHV litik replikasyonunu incelemek için standart hale gelmiştir. Bu sistemler, doksisiklin (Dox) ve sodyum bütirat 7,8 gibi ajanlar kullanılarak litik döngünün senkronize indüksiyonuna izin verir. Bununla birlikte, reaktivasyon modelleri, viral giriş, hücre içi kaçakçılık ve gecikme ile litik replikasyon arasındaki ilk karar dahil olmak üzere erken enfeksiyon adımlarını atladığından, birincil enfeksiyon dinamiklerini tam olarak özetleyemez.

De novo enfeksiyon modelleri, bu boşlukları ele almak için tamamlayıcı bir çerçeve sunar. İnsan endotel ve dişeti epitel hücreleri gibi çeşitli birincil hücre modellerinin, KSHV de novo enfeksiyonu takiben litik replikasyonu desteklediği gösterilmiştir 3,9,10,11. Bununla birlikte, sınırlı ömürleri, yüksek maliyetleri ve genetik manipülasyona zayıf elverişlilikleri, mekanik çalışmalar için tekrarlanabilirliklerini ve ölçeklenebilirliklerini kısıtlar. Bu protokolde, HCT 116 insan kolorektal karsinom hücre hattını kullanarak izlenebilir ve ölçeklenebilir bir KSHV de novo litik enfeksiyon modeli tanımlanmıştır. KSHV'nin doğal bir hedefi olmasa da, HCT116 hücreleri enfeksiyona karşı sağlam bir izin verir ve mekanik çalışmalar ve yüksek verimli uygulamalar için uygun, stabil ve uygun maliyetli bir platform sağlar. KSHV'nin kültürdeki sınırlı plak oluşturma yeteneği göz önüne alındığında, enfeksiyon için hücresiz virüs oluşturmak için bir GFP raportörü içeren BAC16 sistemini kullanıyoruz. Bu, enfekte olmuş hücrelerin doğrudan görselleştirilmesini ve GFP bazlı enfeksiyöz birim (IU) tahlilleri 12 yoluyla enfeksiyöz titrelerin nicelleştirilmesini sağlar. Bunu tamamlamak için, virionla ilişkili DNA, DNaz tedavisini takiben kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ile ölçülür ve kapsüllenmiş viral genomları tespit etmek için hassas bir yöntem sunar. Birlikte, bu tahliller, primer enfeksiyon sırasında litik replikasyon dinamiklerinin zamansal olarak çözülmüş, kantitatif analizine izin verir.

Bu protokol, in vitro olarak KSHV de novo litik enfeksiyonu modellemek için güvenilir ve esnek bir platform sağlar, viral yaşam döngüsündeki erken olayların diseksiyonunu kolaylaştırır, gen fonksiyonunun ve antiviral aktivitenin değerlendirilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

KSHV, Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) insan patojeni olarak sınıflandırılır. Bulaşıcı materyal içeren tüm prosedürleri sertifikalı bir BSL-2 biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Her prosedürden önce ve sonra çalışma yüzeylerini %70 etanol ile dekontamine edin. Tüm atıkları kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine ve WHO BSL-2 yönergelerine uygun olarak atın. Tam iş akışına şematik bir genel bakış Şekil 1'de verilmiştir. Prosedür, yeniden aktive edilmiş iSLK hücrelerinden hücresiz BAC16'dan türetilmiş KSHV'nin üretilmesini, HCT 116 hücrelerinin de novo enfeksiyonunu, enfeksiyöz birim (IU) testi ile virüs titrelerinin nicelleştirilmesini ve virionla ilişkili viral DNA'nın qPCR analizini içerir. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücresiz BAC16 türevi KSHV üretimi

  1. Yaklaşık% 80 birleşmede geniş tip (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) barındıran Dox ile indüklenebilir iSLK hücrelerinin beş T75 şişesini tohumlayın. 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  2. Her şişeye 1 μg / mL Dox ve 1 mM sodyum bütirat ekleyerek litik reaktivasyonu indükleyin. 72-96 saat inkübasyona devam edin.
  3. Faz kontrast mikroskobu ile hücreleri günlük olarak izleyin. Hücrelerin %>90'ı yuvarlama, şişe yüzeyinden ayrılma ve/veya görünür lizis sergilediğinde, sağlam litik reaksiyonun göstergesi olan sitopatik etkinin (CPE) ayırt edici özellikleri olduğunda süpernatan toplayın. Süpernatan toplamanın ardından, litik olarak indüklenen iSLK-BAC16 hücrelerini %10 ağartıcı kullanarak dekontamine edin ve atın.
  4. Toplanan süpernatantları kalıntıları gidermek için 1,500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Arıtılmış süpernatanı, peleti bozmadan 0,45 μm polietersülfon (PES) membran filtreden süzün.
  5. Filtrelenmiş süpernatanları ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Viral partikülleri bir SW28 rotor kullanarak 4 ° C'de 3 saat boyunca 25.000 x g'da santrifüjleme yoluyla peletleyin.
  6. Süpernatanı% 10 ağartıcıya dikkatlice atın. Viral peleti 1 mL serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) yeniden süspanse edin.
  7. Yeniden süspanse edilen virüsü steril, vidalı kapaklı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine koyun. Alikotları kullanana kadar -80 °C'de saklayın. SLK hücrelerinde GFP bazlı enfeksiyöz birim (IU) tahlillerini kullanarak virüs stoğunun enfeksiyöz titrelerini belirleyin (bkz. adım 3).

2. HCT116 hücrelerinin de novo enfeksiyonu

NOT: De novo KSHV enfeksiyonunu takiben HCT116 hücrelerinde litik replikasyonu verimli bir şekilde başlatmak için yüksek sayıda enfeksiyon (MOI) kritik öneme sahiptir. Bu durum, eksojen uyaranlara ihtiyaç duymadan sağlam viral gen ekspresyonunu ve üretken replikasyonu mümkün kılar. Virion üretimi üzerindeki MOI'ye bağlı etkiyi gösteren temsili bir sonuç Ek Şekil 1A'da verilmiştir.

  1. 12 oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına 1 x10 5 HCT116 hücresi tohumlayın. Nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  2. 10'luk bir enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için konsantre virüs stoğunu önceden ısıtılmış, serumsuz DMEM'de 250 μL'lik bir nihai hacme seyreltin.
  3. Her kuyucuktan aspire kültür ortamı. 250 μL seyreltilmiş virüsü doğrudan hücrelere ekleyin.
  4. Enfeksiyonu senkronize etmek için plakayı 30 ° C'de 1 saat boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin (spinokülasyon). Plakayı hemen 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın ve inkübasyona 1 saat daha devam edin.
  5. Aşıyı aspire edin ve kalan virüsü çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın. Her kuyucuğa 1 mL tam DMEM ekleyin.
  6. Enfeksiyondan 36 saat, 60 saat ve 96 saat sonra floresan mikroskobu ile enfekte hücrelerde GFP ekspresyonunu izleyin. Her zaman noktasında, her kuyucuktan 1 mL kültür süpernatanı toplayın.
    NOT: Süpernatan toplanmasından sonra, KSHV ile enfekte HCT116 hücreleri, deneysel hedeflere dayalı olarak RNA ekstraksiyonu, protein analizi, immünofloresan veya akış sitometrisi gibi aşağı akış uygulamaları için tutulabilir.
  7. Hücre kalıntılarını gidermek için toplanan süpernatanları 1.500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Arıtılmış süpernatanları taze tüplere aktarın. Sıvı nitrojeni dondurun ve daha fazla analiz için -80 °C'de saklayın.

3. Enfeksiyöz birimler testi (IU testi)

NOT: SLK hücreleri KSHV girişine izin verir ve erken litik gen ekspresyonunu destekler. Bu test, seri olarak seyreltilmiş virüs içeren süpernatanlara maruz kaldıktan sonra enfekte SLK hücrelerinde GFP ekspresyonuna dayalı enfeksiyöz birimleri ölçer.

  1. Enfeksiyondan 24 saat önce 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 x 104 SLK hücresi tohumlayın. Hücrelerin eşit olarak dağıldığından ve enfeksiyon gününde ~% 60 -% 70 birleşmeye ulaştığından emin olun.
  2. Seri iki katlı dilüsyonlar için dokuz adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin: Tüp 1 (seyreltilmemiş, 1:1), Tüp 2 (1:2), Tüp 3 (1:4), Tüp 4 (1:8), Tüp 5 (1:16), Tüp 6 (1:32), Tüp 7 (1:64), Tüp 8 (1:128) ve Tüp 9 (1:256).
  3. Tüp 1'e 200 μL virüs süpernatanı ekleyin. 2'den 9'a kadar olan tüplerin her birine 100 μL önceden ısıtılmış, serumsuz DMEM ekleyin. Seyreltme serisine başlamak için, 100 μL'yi Tüp 1'den Tüp 2'ye aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra 100 μL'yi Tüp 2'den Tüp 3'e aktarın ve bu işlemi Tüp 9'dan sırayla tekrarlayın ve her adımda iyice karıştırın.
    NOT: Her tüp 100 μL'lik bir nihai hacim içermelidir. Tüm seyreltmeleri üç kopya halinde gerçekleştirin.
  4. Kültür ortamını SLK hücrelerinden aspire edin. Belirlenen kuyucuklara her virüs seyreltmesinden 100 μL ekleyin. Toplamda 27 kuyu kullanın (1:1 ila 1:256 arasında seyreltme başına 3 kuyu).
  5. Flakon adsorpsiyonunu teşvik etmek için 96 oyuklu plakayı 1.500 x g'da 30 ° C'de 1 saat santrifüjleyin. Plakayı 1 saat daha 37 °C CO 2 inkübatöre aktarın.
  6. İnkülumu çıkarın ve her bir oyuğa nazikçe 100 μL tam DMEM ekleyin. Plakayı 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
  7. Hücreleri hasat edin ve akış sitometrisi ile GFP ekspresyonunu analiz edin. Kuyucuk başına GFP pozitif hücrelerin sayısını kaydedin.
  8. Aşağıdaki formül13'ü kullanarak mL (IU/mL) başına bulaşıcı birimleri hesaplayın:
    IU/mL = [(kuyucuk başına GFP-pozitif hücre sayısı)/ aşı hacmi (mL)] x seyreltme faktörü. Saptanabilir GFP pozitif hücrelerle son seyreltmeyi kullanarak son virüs titresini belirleyin

4. Kapsüllenmiş viral genomların qPCR ile ölçülmesi

  1. DNaz I'yi 100 U/mL ila 400 μL arıtılmış süpernatan nihai konsantrasyonuna ekleyin (süpernatan arıtması ve kalıntıların giderilmesi için adım 1'e bakın). Kapsüllenmemiş viral ve hücresel DNA'ları sindirmek için 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. DNaz tedavisinin özgüllüğünü ve etkinliğini gösteren temsili bir sonuç Ek Şekil 1B'de gösterilmiştir.
  2. DNaz reaksiyonunu durdurmak için EDTA'yı 50 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. DNaz I'i inaktive etmek için 75 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  3. Üreticinin protokolüne göre DNA Mini Kitini kullanarak DNaz ile muamele edilen süpernatandan viral DNA'yı çıkarın.
  4. Viral DNA'yı 30 μL elüsyon tamponunda elute edin. Her qPCR reaksiyonu için 5 μL ayrıştırılmış DNA kullanın.
  5. Aşağıdaki primerleri kullanarak KSHV açık okuma çerçevesi 73'ü (ORF 73) yükseltin: İleri: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Ters: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. SYBR Green Master SuperMix kullanarak qPCR reaksiyonlarını üç kopya halinde hazırlayın. Döngü koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: İlk denatürasyon: 3 dakika boyunca 95 °C; Amplifikasyon: 10 sn için 95 °C, 30 sn için 52 °C ve 30 sn için 72 °C'lik 40 döngü; Erime eğrisi analizi: amplikon özgüllüğü için standart rampa.
  7. Reaksiyon başına 109 ila 101 kopya arasında değişen, BAC-16'dan türetilmiş viral DNA'nın 10 kat seri dilüsyonlarını kullanarak standart bir eğri oluşturun. Tahlil doğrusallığını değerlendirmek için Ct değerlerini giriş kopya numarasının10 günlüğüne göre çizin. Temsili bir standart eğri Ek Şekil 1C'de gösterilmiştir.
  8. Ct değerlerini standart eğri ile karşılaştırarak viral genom kopya sayısını belirleyin. Sonuçları normalleştirin ve süpernatan mL başına viral DNA kopyaları olarak raporlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Enfeksiyöz virüsün titresini ölçmek için, iSLK-BAC16 hücrelerinin litik reaktivasyonundan 72 saat sonra hasat edilen süpernatantlar, iki kat seri seyreltmeye tabi tutuldu ve SLK hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. Her bir dilüsyondaki GFP-pozitif SLK hücrelerinin sayısı Şekil 2A'da gösterilmiştir ve mL başına karşılık gelen enfeksiyöz birimler (IU) hesaplanmış ve Şekil 2B'de sunulmuştur. <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

KSHV'nin de novo litik enfeksiyonunun modellenmesi, virüsün çoğu izin verilen hücre tipinde gecikme sağlama konusundaki güçlü eğilimi nedeniyle uzun süredir engellenmektedir. Endotel ve oral epitel hücreleri gibi bazı primer hücrelerin de novo enfeksiyon 9,10'u takiben litik replikasyonu desteklediği gösterilmiş olsa da, sınırlı ömürleri, yüksek maliyetleri ve kültür bakımındaki teknik zorluklar tekrarlanabilirl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Teşekkürler

Yazarlar, rekombinant KSHV üreten iSLK-BAC16 hücre hattını paylaştığı için Dr. Jae U. Jung'a (Cleveland Clinic) teşekkür eder. Grafik tasarım, yazarların lisansına sahip olduğu BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışma, NIH ödülleri R21 DE028256, R01 CA140964 ve R01 CA262631 C. Liang'a (PI), Wistar Science Accelerator Doktora Sonrası Ödülü'nü Q. Zhu'ya verdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 &mikro; m polietersülfom (PES) filtre VWR76479-020
Biyolojik renderBiyolojik renderYOKGrafik tasarım, yazarların lisansına sahip olduğu BioRender.com ile oluşturulmuştur
CFX Opus 96 Gerçek Zamanlı PCR SistemiBiyo-Rad184-5072
DMEM'i tamamlayınDulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's ortamı (DMEM; Sigma-Aldrich) %10(h/h) fetal sığır serumu (FBS; Gibco), 2 mM L-glutamin (Gibco) ve 100U/ml penisilin-streptomisin (Pen-Strep; GenClone).
DNase INew England BiyolaboratuvarlarıM0303S
DoksisiklinSigma-AldrichD9891 Serisi
LSR II 18 akış sitometresiBD BiyobilimYOK
PerfeCTa SYBR Yeşil Usta Süper KarışımQuantabio95054-02K
QIAamp DNA Mini KitiQiagen56304
sodyum bütirat (NaB)Sigma-AldrichB5887 Serisi
Ultra Saf 0,5 M EDTA, pH 8,0Termo Balıkçı15575020

Kaynaklar

  1. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
  2. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).
  3. Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology. 536, 27-31 (2019).
  4. Dittmer, D. P., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy. J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).
  5. Chang, H. H., Ganem, D. A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity. Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).
  6. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Grundhoff, A., Ganem, D. Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis. J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).
  9. Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells. J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).
  10. Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop. J Virol. 97 (3), e0169622(2023).
  11. Lagunoff, M., et al. De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells. J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  12. ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity. J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).
  13. Chandran, B. Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells. J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).
  14. Zhu, Q., et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production. Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).
  15. Lee, S. C., et al. Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection. J Virol. 97 (11), e0097223(2023).
  16. White, I. E., Campbell, T. B. Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).
  17. Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).
  18. Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions. J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).
  19. Watzinger, F., et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).
  20. Cho, H. J., et al. Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses. Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).
  21. Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication. Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

KSHV Litik EnfeksiyonuDe Novo EnfeksiyonHücreden Arındırılmış KSHVHCT116 HücreleriBAC16 VirüsüSpinokülasyonGFP AnaliziAkış SitometrisiKantitatif PCRViral Replikasyon
Hücresiz Kaposi Sarkomu ile İlişkili Herpes Virüsü ile De Novo Litik Enfeksiyonun Kurulması ve Miktarının Belirlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.