Yöntem makalesi

Alt Uzuv Arteriosklerozu Obliterans ile Diyabetik Fare Modelinin Oluşturulması ve Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/68991

⸱

2 Ocak 2026

 ,  ,  ,  , 
1The Second Clinical Medical College of Binzhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Shandong Second Medical University, 3Department of Vascular Surgery, YanTai Yuhuangding Hospital Affiliated to Qingdao University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alt ekstremite arterioskleroz obliterans, diyabetin yaygın bir komplikasyonudur. Burada, aterosklerotik tıkanık hastalığın ilerlemesini simüle eden ve damar yapısını bozmak için etanol enjekte ederek damar hastalıklarının tedavisi için yeni bir platform sağlayan yeni bir hayvan modelleme yöntemi sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, diyabetik sıçanlarda alt ekstremite arterioskleroz obliterans (ASO) için yeni bir fare modeli oluşturmak ve doğrulamayı amaçladı. Geleneksel femoral arter ligasyonun aksine, dış iliak artere %95 etanol (0,1 mL) enjekte ettik. Ameliyat sonrası, 1., 3., 7. ve 14. günlerde Doppler ultrason, termal görüntüleme ve ıslak kas ağırlığı ölçümü ile arterial tıkanma ve arka ayak iskemisi değerlendirildi. Modelin başarı oranı ve stabilitesi değerlendirilmek için kan damarları ve kas dokularının histolojik analizi yapıldı. Yüksek konsantrasyonlu etanol (%95) damar endotel hücre hasarına yol açar ve femoral arter tıkanmasına yol açar. Kontrol grubuna kıyasla, Doppler ultrasonu etkilenen uzuvda arterial çapta kademeli bir azalma ve artan akış hızı gösterdi. Termal görüntüleme uzuv sıcaklığının azaldığını gösterirken, kas ağırlığı ölçümü ipsilateral kas kütlesinde önemli bir azalma gösterdi. Histopatolojik analiz, zamanla arterial lümen tıkanıklığı, mikrovasküler yoğunluğun azalması ve ilerleyici lezyon alevlenmesini doğruladı. Sonuç olarak, %95 etanol içeren iliak arter enjeksiyonu, alt uzuv arterial tıkanmasının patofizyolojik özelliklerini etkili bir şekilde kopyalamış ve diyabetik sıçanlarda arterioskleroz obliterans'ı incelemek için yeni bir model sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik alt ekstremite arteriyel tıkanıklığı (DLEAO), diyabet hastalarında engellilik ve ölüm nedenlerinden biri olup, yaşam kalitesini ciddi şekilde düşürür ve önemli bir sosyoekonomik yükoluşturur 1. Diyabetik arter hastalığının patogenezi, hiperglisemi, dislipidemi, kronik iltihap ve damar fonksiyon bozukluğu arasındaki karmaşık etkileşimleriiçerir 2. Hayvan modelleri, bu mekanizmaların aydınlatılmasında önemli rol oynamış ve terapötik gelişim için kritik içgörüler sağlamıştır. Hayvan modelleri, insan diyabet hastalarında periferik arter hastalığının (PAD) patofizyolojisini simüle etmek için değerli araçlar olarak hizmet vermektedir. Bu modeller, hastalık ilerlemesini araştırmak ve altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için yüksek verimlilikli, tekrarlanabilir çalışmaları mümkün kılar. Ayrıca, hayvan modellerini kullanan preklinik denemeler, farmakolojik ajanlar, gen terapisi ve rejeneratif tıp yaklaşımları (örneğin, kök hücre tedavisi) dahil olmak üzere yeni tedaviler için temel veriler sağlar. Bu temel araştırmalar, sonraki klinik çalışmaların bilgilendirilmesi ve translasyonel tıbbın ilerlemesi için kritik öneme sahiptir.

Şu anda, femoral arteri ligasyonu (FAL) yöntemi, laboratuvarlarda arka uzuviskemisi 4'ün fare modellerini oluşturmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, alt uzuvlarda iskemik belirtileri hızlaindükler 5; ancak ortaya çıkan arteriyel tromboz, alt ekstremite arterial hastalığı (LEAD) olan diyabetik hastalarda gözlemlenen patofizyolojik ilerlemeden farklıdır; bu ilerleme endotel hasarı, iltihap faktör birikimi ve düz kas hücreproliferasyonunu içerir 2,6. Ayrıca, FAL hızlı neovaskülarizasasyon ve kollateral damar oluşumunu tetikler; düşük akışlı perfüzyonu 5,7 modellemesinden kısa süre sonra geri kazanır. Bu, diyabetik LEAD'ın kronik ilerlemesiyle tezat oluşturur. Bu nedenle, insan arteriosklerozunun patofizyolojik mekanizmalarını daha doğru şekilde kopyalayan bir hayvan modeli geliştirmeye ihtiyaç vardır.

Diyabetik hayvan modellerinde, balon kateter veya kimyasal indüksiyon (örneğin, ferrik klorür stimülasyonu) yoluyla femoral arter intimasında mekanik hasar, endotel denudasyonu, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve düz kas hücre göçü/proliferasyonu gibi patolojik değişikliklerietkili bir şekilde tetikler. 8. Bu yaklaşım, insan aterosklerozunun kendine özgü patolojik özelliklerini daha iyi yansıtır. Geleneksel FAL modeline kıskında, etanol kaynaklı yöntemin temel avantajı, diyabetik LEAD'in karmaşık patofizyolojik sürecini daha doğru simüle edebilme yeteneğinde yatmaktadır. Etanol, doğrudan damar endotelyumunu bozarak trombosit agregasyonunu ve trombozu aktive eder ve diyabetik LEAD9'daki ilk olayı taklit eder. Daha da önemlisi, damar mikroyapısını yavaş yavaş yok ederek, etanol FAL modelinde yaygın olarak görülen hızlı yan dolaşım telafisini etkili bir şekilde önler ve böylece diyabetik LEAD10'un tipik kronik hipoperfüzyon durumunu başarıyla çoğaltır. Buna karşılık, femoral arter ligasyonuyla indüklenen iskemi modelinin belirgin sınırlamaları vardır: kemirgenler (örneğin, fareler, fareler) iyi gelişmiş yan dolaşımları sayesinde akut iskemiyi hızla telafi eder; bu da iskemik şiddetin tutarsız olmasına ve insan kritik uzuv iskemisinin (CLI)11,12 kötü tekrarlanmasına yol açar. Ayrıca, insan periferik arter hastalığı (PAD) öncelikle aterosklerozun kronik ilerlemesinden kaynaklanırken, femoral arter ligasyon modeli akut iskemik bir olay - temelde farklı patofizyolojikmekanizmaları temsil eder 13. Bu çalışmanın temel amacı, hastalarda hastalık ilerlemesini doğru şekilde taklit eden kararlı, uzun vadeli bir alt ekstremite arterioskleroz obliterans (LEAOD) deneysel modelini oluşturmak ve karakterize etmekti. Etanol kaynaklı tıkanma operasyonel olarak basittir; sadece minimal invaziv enjeksiyon gerektirir; bu da teknik engeli ve hayvan ölümünü azaltır. Ana parametreleri kolayca standartlaştırılır ve yüksek tekrarlanabilirlik sağlar. Ayrıca, yöntem maliyet etkinliğindedir, özel ekipmana olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve laboratuvarlar arasında kolayca aktarılabilir. Şu anda, yeni terapötik müdahaleleri doğrulamak için dayanıklı hayvan modelleri eksikliği yaşanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Yantai Yuhuangding Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kapsamında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, 12 saatlik ışık/karanlık döngü altında barındırılan 40 erkek Sprague-Dawley faresi (ağırlık: 250-300 g, yaş: 6 hafta) kullanıldı. 7 haftalıktan itibaren yüksek yağlı, yüksek sakarozlu diyet ile beslendiler ve 8 hafta boyunca ücretsiz suya erişimi sağlandı. Diyetin 4. haftasında, diyabet streptozotosin (STZ) enjeksiyonuyla indüklendi¹⁶. 8 hafta sonra, diyabet modelinin başarılı şekilde kurulması sonraki deneylerden önce doğrulandı. Aşağıda açıklandığı gibi 14 haftalık farelerde arka uzuv arteriyel tıkanma ameliyatı yapıldı.

1. Diyabetik sıçanlarda arka uzuv arteriosklerozu obliteranlarının cerrahi indükasyonu

  1. Tüm cerrahi aletleri ve malzemeleri Malzeme Tablosu'nda listelenen ve Şekil 1'de gösterildiği şekilde hazırlayın.
  2. Fareyi anestezi makinesiyle anestezi yapın; izofluran (%1,5-2,5) ve oksijen (O2, 1-2 L/dakika) verilmektedir. Tüm süreç boyunca spontan solunumu koruyun. Anestezi derinliğini parmak sısması refleksi ile değerlendirerek cerrahi bir anestezi düzlemi sağlanır.
  3. Fareyi sırtüstü pozisyona koyun, bir tutucu platforma yerleştirin. Karın bölgesinden alt uzuvlara kadar tüyleri temizleyerek depilatör krem ve jilet ile çıkarın.
  4. Uzuvları sabitleyin. Arka uzuv derisini alkolle dezenfekte edin. Medial sağ uylukta kıvrımlı forseps ve makasla 2-3 cm kesi yapın.
    NOT: Tüm cerrahi işlemler, hayvan modellerinin tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için deneyimli bir cerrah tarafından gerçekleştirilmiştir.
  5. Mikroskop altında, çevredeki dokuları disseksiye ederek dış iliak arter/ven ve femoral siniri ortaya çıkarın. Damarları ve siniri izole edin. Dış iliak arteriyanı, yüzeysel ve derin femoral arterlere ikiye ayrılmasına kadar izleyin.
  6. Femoral arterin orta segmentini ve derin femoral arteri damarlı klipslerle sıkıştırın. Yavaş yavaş %95 etanol enjekte ederek distal dış iliak artere enjekte edin. 60 saniye sonra klipsleri çıkarın; hemostazı kompresyonla elde eder. Yarayı katman katman kapatın.
    NOT: Enjeksiyon sırasında atardardın anında ağarması ve ipsilateral ayağın geçici titremesi gözlemlendi; bu da etanolün başarılı intravasküler teslimatını doğruladı.
  7. Ameliyat sonrası etkilenen uzuvu hareketsiz bırakmayın. Enfeksiyonu önlemek için kas içi penisilin sodyum enjeksiyonu (400.000 IU) uygulanır.
    NOT: Bu tek taraflı alt uzuv arterial tıkanma modelinde, karşı taraf uzuv kontrol görevi görür. Tıkanma süresi, işlemden 24 saat sonra hesaplanır.

2. Alt uzuv sıcaklığının belirlenmesi

  1. Fareyi anestezi yapın ve ameliyat platformunda sırtüstü pozisyona yerleştirin.
  2. Her iki arka uzuvu tıraş edin ve simetrik konumlandırın.
  3. Her iki arka uzuvun sıcaklığını kızılötesi termografî sistemi kullanarak ölçün.

3. Arterial çapı ve kan akışı hızı

  1. Fareyi anestezi altına al.
  2. Ultrason sistemini ve probu hazırlayın.
    1. Ön paneldeki güç düğmesine basarak ultrason cihazını açın.
    2. Yüksek frekanslı lineer dizi probunu (örneğin 40 MHz) seçin ve sisteme bağlayın.
    3. Prob yüzeyine bolca akustik bağlantı jeli uygulayın.
  3. Yüzeysel femoral arteri bulun.
    1. Fareyi vücut sıcaklığını korumak için ısınma pedine sırtüstü pozisyona koyun.
    2. Medial uyluk bölgesindeki tüyleri iki tarafta, diz ekleminden yaklaşık 1-2 cm yukarıda, elektrikli makas makinesiyle tıraş edin.
    3. Probu tıraş edilen alanın üzerine cilt yüzeyine dik olarak nazikçe yerleştirin.
    4. Sonda pozisyonunu B-modunda ayarlayarak femoral arteri pulsatile, anechoik bir tübüler yapı olarak görselleştirin.
  4. Arterial çapı ölç.
    1. B modu görüntünü dondurun, makine veya yazılım arayüzündeki Dondur düğmesine basın.
    2. Ekran menüsünden Ölçüm aracını seçin.
    3. Kaliper fonksiyonunu kullanarak damar duvarının yakınından uzak duvarına kadar iç çapı ölçebilirsiniz.
    4. Aynı yerde ölçümü üç kez tekrarlayın ve ortalama değeri kaydedin.
  5. Kan akış hızını ölç.
    1. PW Doppler simgesine tıklayarak darbeli dalga Doppler moduna geçin.
    2. Örnek kapısını arter lümeninin merkezine yerleştirin.
    3. Doppler açısını açı düzeltme aracıyla ≤ 60°'ye ayarlayın.
    4. En az üç kalp döngüsü boyunca hız dalga formunu kaydetmek için Güncelleme veya Yakalama tuşuna basın.
    5. Bilgisayarın otomatik takip fonksiyonunu kullanarak zirve sistolik hız (PSV) ve son diyastolik hız (EDV) hesaplayabilirsiniz.
    6. Verileri kaydet'e tıklayarak ve sonuçları bir tablo (örneğin, CSV, Excel) dosyasına aktararak kaydet.

4. Kas ağırlığı

  1. Derin anesteziden sonra, sıçan servikal dislokasyon yoluyla ötenazi edilir.
  2. Her iki arka uzuvdan gastroknemius kaslarını disseksiye ederek Aşil tendonlarını koruyun (Şekil 2).
  3. Kasları hemen elektronik bir teraziye yerleştirerek ıslak ağırlığı ölçmek için alın.
  4. Karşı taraf kasları kontrol olarak kullanın.
  5. Dört zaman noktasından yapılan ölçümleri karşılaştırın ve bunları bir eğri grafikte sunun.

5. Histopatolojik analiz

  1. Dört zaman noktasının her birinde, bir fare grubunu hızlıca ötenazi yapın.
  2. İki taraflı yüzeysel femoral arterleri hemen alın.
  3. %4 paraformaldehit ile arteriyel dokuları düzeltin.
  4. Dokuları parafine gömüp 5 μm kalınlıkta kesimler.
  5. Histopatolojik değişiklikleri incelemek için hematoksilin ve eozin (H&E) boyama işlemi yapılabilir.

6. İstatistiksel analiz

  1. Tüm verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edin. <0,05 p-değerinde istatistiksel olarak anlamlı farkları ele alın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, diyabetik SD sıçanlarda (n = 40) bir model oluşturmak için intra-arterial etanol enjeksiyonu kullandı. Model, enjeksiyon sonrası 14 gün içinde azalan kontralateral arterial çapın ve kan akış hızının ultrasonik doğrulamasına dayanarak %85 başarı oranı (33/40) ile karakterize edildi. Modele bağlı ölüm oranı %8 (5/40) olarak kaydedildi ve bu oran ağırlıklı olarak başlangıç döneminde gerçekleşti. Etanolun sitotoksisitesi gangren gibi spesifik olmayan doku hasarı riski teşkilatsa da, dikkatli izleme, çapta ve akış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özetle, diyabet hastalarında gözlemlenen klinik belirtileri yakından taklit eden progresif arterial tıkanma fare modelini başarıyla kurduk. Arka uzuv hipoperfüzyonun tutarlı değerlendirmeleri, ultrasonografik ölçümler ve kas ıslak ağırlığı değerlendirmeleriyle iki haftadan fazla dönemler için sağlandı. Femoral arterin bağlanması, yüzeysel damar tıkanmasına yol açarken, sağlam derin venöz sistem üzerinden kan dolaşımına izinverdi 17. Proksimal arter veya dallarında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Üniversitesi İnovasyon Fonu (Hibe Numarası 2024GR043) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GraphPad sürüm 8.0.1RRID:SCR_002798
Telefon tabanlı Kızılötesi TermometreHIKMICROHM-TJP10B-3AMF
Sprague-Dawley sıçanıJinan Pengyue Deneysel Hayvan Yetiştiriciliği Şirketi, Ltd.250 g
Ultrason makinesiVevo 2100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnes, J. A., Eid, M. A., Creager, M. A., Goodney, P. P. Epidemiology and risk of amputation in patients with diabetes mellitus and peripheral artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (8), 1808-1817 (2020).
  2. Yang, S. L., et al. Pathophysiology of peripheral arterial disease in diabetes mellitus. J Diabetes. 9 (2), 133-140 (2017).
  3. Ko, S. H., Bandyk, D. F. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia. Semin Vasc Surg. 27 (1), 23-31 (2014).
  4. Krishna, S. M., et al. Development of a two-stage limb ischemia model to better simulate human peripheral artery disease. Sci Rep. 10 (1), 3449(2020).
  5. Wang, H., et al. Effect of miR-206 on lower limb ischemia-reperfusion injury in rat and its mechanism. Sci Rep. 13 (1), 21574(2023).
  6. Creager, M. A., Lüscher, T. F., Cosentino, F., Beckman, J. A. Diabetes and vascular disease: pathophysiology, clinical consequences, and medical therapy: part I. Circulation. 108 (12), 1527-1532 (2003).
  7. Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol. 152 (6), 1667-1679 (1998).
  8. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  9. Parsi, K. Interaction of detergent sclerosants with cell membranes. Phlebology. 30 (5), 306-315 (2015).
  10. Hellenthal, K. E. M., Brabenec, L., Gross, E. R., Wagner, N. M. TRP channels as sensors of aldehyde and oxidative stress. Biomolecules. 11 (10), 1401(2021).
  11. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  12. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. (23), e1035(2009).
  14. Rai, V., Moellmer, R., Agrawal, D. K. Clinically relevant experimental rodent models of diabetic foot ulcer. Mol Cell Biochem. 477 (4), 1239-1247 (2022).
  15. Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Res. 2016, 2902351(2016).
  16. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Curr Protoc. 1 (4), e78(2021).
  17. Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. J Vasc Surg. 56 (6), 1669-1679 (2012).
  18. Goto, T., et al. Search for appropriate experimental methods to create stable hind-limb ischemia in mouse. Tokai J Exp Clin Med. 31 (3), 128-132 (2006).
  19. Parikh, P. P., et al. A reliable mouse model of hind limb gangrene. Ann Vasc Surg. 48, 222-232 (2018).
  20. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (2), 205-212 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Alt Ekstremite skemisiEtanol Arter EnjeksiyonuFemoral Arter Okl zyonuDoppler UltrasonTermal G r nt lemeKas A rl l mHistolojik AnalizVask ler Endotelyal Hasar
Video yakında

İlgili makaleler