Yöntem makalesi

Aterosklerotik Kardiyovasküler Hastalıkla İlgili Lipoprotein Alt Fraksiyonlarının Analizinde Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Uygulanması

DOI:

10.3791/68996

⸱

24 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kardiyovasküler hastalık risk değerlendirmesi için önemli bir tanısal temel sağlayan poliakrilamid jel elektroforezine dayalı bir lipoprotein alt fraksiyon analiz yöntemini geliştirmeyi amaçlamaktadır. LDL'yi yedi alt fraksiyona bölebilir. LDL1 ve LDL2 büyük parçacıklar olarak karakterize edilirken, LDL3 ila LDL7 küçük parçacıklar olarak karakterize edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C), aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (ASCVD) gelişiminde önemli bir faktördür. Yüksek LDL-C seviyeleri, aterosklerotik plakların oluşumu ve kardiyovasküler olay riski ile yakından bağlantılıdır. Bununla birlikte, LDL'nin heterojenliği, aterosklerozu teşvik etme yeteneğini önemli ölçüde etkiler. Araştırmalar, Düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) partiküllerinin ayrıca küçük yoğun LDL (sdLDL) ve büyük yüzer LDL (lbLDL) olarak kategorize edilebileceğini göstermektedir. Bunlar arasında, sdLDL'nin vasküler endotelyuma nüfuz etme olasılığı daha yüksektir ve özellikle ASCVD ile ilişkili olan daha güçlü oksidatif modifikasyon aktivitesine sahiptir. Metabolik sendrom, diyabet ve hipertrigliseridemi hastalarında LDL-C seviyeleri normal olabilir, ancak sdLDL oranı yükselir ve bu da kardiyovasküler riskin hafife alınmasına yol açar. Bu nedenle, LDL alt fraksiyonlarını doğru bir şekilde tespit etmek, ASCVD riskini sınıflandırmak ve müdahale stratejilerini optimize etmek için çok önemlidir.

Friedewald formülü ve doğrudan ölçüm gibi geleneksel LDL-C tespit yöntemleri yalnızca toplam kolesterol seviyelerini yansıtır ve alt fraksiyonlar arasında ayrım yapamaz. LDL-C alt fraksiyonlarını tespit etme yöntemleri arasında ultrasantrifüjleme (UC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) teknikleri bulunur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin yüksek teknik gereksinimleri, karmaşık operasyonları veya pahalı ekipmanları vardır ve bu da onları yaygın klinik kullanım için pratik hale getirmez.

Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) teknolojisi, lipoprotein partiküllerini moleküler elek etkisi ve yük farkları ile ayırır. Bu teknik, Sudan siyahı gibi spesifik lekelerle birleştirilmiş, yüksek çözünürlük, güçlü tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı sunan, denatüre olmayan gradyan jel sistemlerini kullanır. PAGE teknolojisini kullanan lipoprotein tiplemesi, hastaların lipoprotein seviyelerinin daha kapsamlı ve kesin bir değerlendirmesini sağlayarak klinik tedavi kararlarına yardımcı olabilir. Bu makale beş temsili sonuç sunmuştur. A, B, C, D, E numunesinin ortalama LDL partikül boyutu 275.3 Å, 266.6 Å, 258.2 Å, 257.4 şve 252.9 Å'dir ve sırasıyla dislipidemiye bağlı düşük, marjinal, hafif, orta ve şiddetli kardiyovasküler hastalık riskini gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2021 Dünya Sağlık Örgütü raporuna göre, kardiyovasküler hastalık (KVH), insan hastalıkları arasında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam ediyor. Rapor, 2019 yılında dünya çapında 17,9 milyon insanın KVH'den öldüğünü ve bunun küresel ölümlerin yaklaşık üçte birini oluşturduğunu gösteriyor1. Bir KVH türü olan ASCVD, Çin'deki kentsel ve kırsal kesimde yaşayanlar arasında önde gelen ölüm nedenidir ve tüm ölümlerin %40'ından fazlasını oluşturur2. Ateroskleroz, hem geleneksel hem de geleneksel olmayan risk faktörleri tarafından yönlendirilen kronik inflamatuar bir vasküler hastalıktır3. Arter duvarındalipid birikimi 4, fibröz doku proliferasyonu ve kalsifikasyonu ile karakterizedir, sonuçta damar duvarının kalınlaşmasına, elastikiyetin azalmasına ve lümenin daralmasına yol açar. Dislipidemi ASCVD için en önemli risk faktörüdür ve LDL-C, ASCVD için patojenik bir risk faktörüdür ve ASCVD gelişiminde çok önemli bir rol oynar5. Çok sayıda epidemiyolojik çalışma, mendel randomizasyon çalışmaları ve randomize kontrollü çalışmalar, plazma LDL-C düzeylerinin ASCVD riski ile pozitif korelasyon gösterdiğini tutarlı bir şekilde göstermiştir. LDL-C seviyelerini düşürmek ASCVD6 riskini azaltabilir.

LDL, vücutta endojen kolesterolün taşınmasından sorumlu birincil lipoproteindir7. Plazma LDL, farklı boyutlara, yoğunluklara ve kimyasal bileşimlere sahip çeşitli parçacıklardan oluşan heterojendir8. LbLDL parçacıkları daha düşük yoğunluğa ve daha büyük boyuta sahipken, sdLDL parçacıkları daha yüksek yoğunluğa ve daha küçük boyuta sahiptir. LDL heterojenliği, çeşitli biyolojik etkilerinin temelini oluşturur9. LbLDL partiküllerinin çapı daha büyüktür (≥ 25.5 nm), yoğunluğu daha düşüktür (1.02 g/mL'ye yakın) ve LDL1 ve LDL2'den oluşan morfolojisi gevşektir. LbLDL partikülleri daha yüksek miktarda kolesterol esteri içerir. Oksitlenme veya vasküler endotelyuma nüfuz etme olasılıkları daha düşüktür, bu da onları nispeten daha güvenli hale getirir. Buna karşılık, sdLDL partikülleri daha küçük bir çapa (< 25.5 nm)10, daha yüksek yoğunluğa (1.06 g / mL'ye yakın) ve LDL3 ila LDL7'den oluşan yoğun bir yapıya sahiptir. SdLDL partikülleri, lbLDL'ye kıyasla daha düşük miktarda kolesterol ester içerir, ancak daha yüksek trigliserit ve apolipoprotein B (ApoB) seviyeleri içerir. Fiziksel özellikleri, arteriyel endotel bariyerine geçme olasılıklarını artırır. Subendotel altında, sdLDL partikülleri, oksitlenmiş LDL (ox-LDL)11 oluşturmak için reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oksitlenir. Ox-LDL, endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) aktivitesini inhibe eder, NO üretimini azaltır ve endotel hücrelerini VCAM-1/MCP-1'i eksprese etmeye teşvik ederek monosit yapışmasını ve göçünü teşvik eder12. Göç eden endotelyal mononükleer hücreler, çöpçü reseptörleri aracılığıyla sınırsız olarak ox-LDL'yi alan makrofajlara farklılaşır. Hücre içi kolesterol esterinin birikmesi, aterosklerotik lipid çizgilerinin temel bileşenleri olan köpük hücrelerine dönüşür. Köpük hücreleri, oksidatif stresi ve endotel hasarını daha da genişleten ve pozitif bir geri besleme döngüsü oluşturan IL-1β ve TNF-α gibi enflamatuar faktörler salgılar13. Endotel hücre iltihabını aktive edebilir, köpük hücre oluşumunu teşvik edebilir ve plak ilerlemesini hızlandırabilir. İki büyük kohort çalışması, sdLDL-C'nin ASCVD14-15'in potansiyel risklerini tahmin etme ve değerlendirmede LDL-C'den daha yüksek klinik referans değerine sahip olduğunu göstermiştir. Ancak geleneksel LDL-C saptama yöntemi, yöntemin sınırlaması nedeniyle lipoprotein alt fraksiyonlarını test edemez.

LDL partikülleri (LDL-P), birim kan hacmi başına LDL partiküllerinin sayısını yansıtır ve her biri bir ApoB molekülü ve birden fazla kolesterol molekülü içeren LDL molekülleri için taşıyıcı görevi görür. LDL-C, bu parçacıklar tarafından taşınan toplam kolesterol kütlesini temsil eder. LDL-C seviyeleri, LDL partiküllerinin sayısından ve kolesterol yoğunluğundan etkilenir ve bu da gerçek riski tam olarak yansıtmayabilir16. Örneğin, metabolik sendrom, diyabet veya hipertrigliseridemi olan hastalar normal LDL-C seviyelerine sahip olabilir, ancak anormal derecede yüksek LDL-P'ye sahip olabilir (daha küçük partiküller ve daha düşük kolesterol içeriği nedeniyle). LDL-C seviyeleri hedefi karşılasa bile, yüksek LDL-P yine de rezidüel kardiyovasküler riski artırabilir. Çalışmalar, LDL-P'nin LDL17 ile ilgili diğer parametrelerden daha öngörücü olduğunu göstermiştir. Lipoprotein alt fraksiyonlarının analizi, ASCVD'nin patogenezini anlamak, rezidüel riski değerlendirmek ve hassas tedaviyi yönlendirmek için kritik öneme sahiptir. Son yıllarda, yerel kılavuzlar da ASCVD risk değerlendirmesi veya tedavi izleme için gösterge olarak LDL alt fraksiyonlarını önermiştir18.

ASCVD dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Önleme ve kontrol stratejileri büyük ölçüde lipid yönetimine bağlıdır. Şu anda, klinik uygulamada dislipidemili bireylerin taranması öncelikle trigliseritler (TG), toplam kolesterol (TC), yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-C) ve LDL-C dahil olmak üzere geleneksel dört lipid testine dayanmaktadır. Ek olarak, lipoprotein (a), apolipoprotein A1 (ApoA1) ve ApoB gibi diğer lipid belirteçleri esas olarak diyabetik hastalar, hipertansif hastalar ve sigara içenler veya LDL-C seviyeleri kontrol edilmiş ancak yine de yüksek risk oluşturanlar gibi yüksek riskli ASCVD19 popülasyonları için kullanılır.

Araştırma ilerledikçe, geleneksel lipid testinin sınırlamaları, özellikle erken uyarı etkinliği ve kalıntı riskin açıklanmasında giderek daha belirgin hale geldi. Önemli sayıda ASCVD hastasına başlangıçta normal lipid seviyeleri teşhisi konur, bu da LDL-K'yi birincil uyarı için etkisiz hale getirir. Epidemiyolojik veriler, akut koroner sendromlu hastaların yaklaşık %20'sinin başvuru sırasında LDL-C düzeylerinin normal aralıkta (<3,4 mmol/L) olduğunu göstermektedir, bu da geleneksel lipid testinin yüksek riskli bireyleri gözden kaçırabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, LDL-C hedeflerine ulaştıktan sonra bile, ASCVD hastaları hala yüksek bir rezidüel kardiyovasküler riskle karşı karşıya kalabilir. Bu hastalarda rezidüel koroner arter olaylarının çoğu LDL-K düzeylerindeki azalma ile açıklanamaz. Bu nedenle, basit LDL-K testi, ASCVD tanı ve tedavisi için klinik ihtiyaçları tam olarak karşılamayabilir, çünkü rutin lipid testleri lbLDL-K ve sdLDL-K arasında ayrım yapamaz.

Birden fazla çalışma, lipoprotein alt fraksiyonları ile ASCVD arasında açık bir korelasyon olduğunu doğrulamıştır. Lipoprotein subfraksiyon testinden elde edilen anormal sonuçlar, normal lipid seviyelerine sahip bireylerde ASCVD'nin birincil önlenmesi için bir uyarı görevi görebilir ve gizli yüksek risk gruplarının belirlenmesine yardımcı olabilir. LDL-C seviyelerinin zaten hedef aralıklarda olduğu ASCVD'nin ikincil önlenmesi için, lipoprotein subfraksiyon testi, rezidüel riskin değerlendirilmesine yardımcı olabilir ve daha ileri tedaviye rehberlik edebilir20. Bu nedenle, yeni LDL alt fraksiyonlarının saptanmasının, geleneksel lipid testlerine kıyasla dislipidemi ve ASCVD'nin önlenmesi ve tedavisi için yeni hedefler sağlaması beklenmektedir.

Laboratuvarımızdaki tespit ve analiz sistemi, lipoproteinlerin alt fraksiyonlarını boyutlarına ve yüklerine göre ayırmak için öncelikle PAGE'yi kullanır. Lipoprotein partikülleri, poliakrilamid matrisinde PAGE tarafından moleküler eleme nedeniyle öncelikle boyutlarına göre ayrılır. Küçük moleküller hızlı göç ederken, büyük moleküller sterik tıkanıklık tarafından engellenir ve yavaş göç eder. Ve bir molekül ne kadar çok yük taşırsa, o kadar hızlı göç eder. Bu yöntem, lipoproteinleri hızlı bir şekilde on iki alt fraksiyona bölebilir. LDL, LDL1 ila LDL7 olarak etiketlenen yedi alt fraksiyona bölünmüştür. Hepsinin farklı boyutları, yoğunlukları, fizikokimyasal özellikleri, metabolik davranışları ve aterosklerotik potansiyeli vardır. LDL1 ve LDL2 lbLDL olarak sınıflandırılırken, LDL3 ila LDL7 sdLDL olarak sınıflandırılır. Lipoprotein alt fraksiyon tespit teknikleri arasında UC, HPLC ve NMR bulunur. Bununla birlikte, yüksek ekipman gereksinimleri, karmaşık çalışma ve zaman tüketimi nedeniyle klinik uygulamaları nispeten sınırlıdır21. PAGE yöntemi, LDL'nin çeşitli alt fraksiyonlarını verimli bir şekilde ayırarak diğer tekniklere kıyasla daha kullanıcı dostu hale getirir. Kullanılan ekipmanın uygun maliyetli ve taşınabilir olması, klinik rutin laboratuvarlarda yaygın kullanıma daha uygun olmasını sağlar. Bu çalışma, klinik karar vermeyi desteklemek için serum örneklerinde LDL subfraksiyon analizi için PAGE'yi hızlı, uygun maliyetli bir yöntem olarak doğrulamayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmadaki tüm örnekler Guangdong İl Halk Hastanesi Etik İnceleme Kurulu tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır (Onay Numarası: KY2025-435-01). Tüm katılımcılar deneyden önce yazılı bilgilendirilmiş onam imzaladılar.

1. Kit hazırlama

  1. Jel tamponunun hazırlanması
    1. %30 akrilamidin (ACR) hazırlanması: 30 g akrilamid tartın, 80 mL deiyonize su ekleyin, çözünmesi için karıştırın ve 100 mL'ye ayarlayın. Kullanana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
    2. %1 bisakrilamid (BIS) hazırlanması: 1 g bisakrilamid tartın, 80 mL deiyonize su ekleyin, çözünmesi için karıştırın ve 100 mL'ye ayarlayın. Kullanana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
    3. %25 sükrozun hazırlanması: 25 g sakkarozu tartın, 70 mL deiyonize su ekleyin, çözünmesi için karıştırın ve 4 °C'de saklamak için 100 mL'ye ayarlayın.
    4. %10 amonyum persülfatın (APS) hazırlanması: 0,1 g amonyum persülfatı 1 mL deiyonize suda çözün ve hemen kullanın.
    5. 1M Tris'in Hazırlanması (pH = 6,8): 121,14 g trishidroksimetilaminometan tartın, 800 mL deiyonize su ekleyin, çözünmesi için karıştırın ve pH değerini 6,8'e ayarlayın, ardından 1000 mL'ye kadar yapın.
    6. 1M Tris'in Hazırlanması (pH = 8,6): 121,14 g trishidroksimetilaminometan tartın, 800 mL deiyonize su ekleyin, çözünmesi için karıştırın ve pH değerini 8,6'ya ayarlayın, ardından 1000 mL'ye kadar yapın.
      NOT: Akrilamid ile çalışırken bütil lastik eldiven, koruyucu gözlük, koruyucu giysi giyin ve çeker ocakta çalıştırın. Ciltle teması halinde derhal sabun ve suyla yıkayın, ardından tıbbi yardım alın. Solunması halinde temiz havaya çıkın.
  2. Ayırma jelinin hazırlanması
    1. Temiz bir cam tüp alın ve alt tabakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın.
    2. Sırayla temiz bir behere 8.29 mL %30 ACR, 17.76 mL %1 BIS, 10 mL %25 sakaroz, 1 mL %10 APS, 10 mL 1M Tris (pH = 8.6), 0.1 mL tetrametiletilendiamin (TEMED) ve 32.85 mL deiyonize su ekleyin. 80 mL ana likör (%3,3 poliakrilamid konsantrasyonu) elde etmek için iyice karıştırın ve kök başına 1,2 mL cam tüpe ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika polimerize edin ve düz bir sıvı yüzeyi sağlamak için sıvıyı arıtılmış suyla kapatın.
  3. Konsantre tutkalın hazırlanması
    1. 4.07 mL %30 ACR, 3.05 mL %1 BIS, 5 mL %25 sakaroz, 0.5 mL %10 APS, 5 mL 1M Tris (pH = 6.8), 0.05 mL TEMED ve 32.33 mL deiyonize suyu temiz bir behere sırayla ekleyin, 50 mL ana likör (%3.05 poliakrilamid konsantrasyonu ile) elde etmek için iyice karıştırın, kök başına 0,2 mL'de cam tüpe ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika polimerize edin ve düz bir sıvı yüzeyi sağlamak için sıvıyı arıtılmış suyla kapatın.
  4. Koruma solüsyonunun hazırlanması
    1. 6,4 g Tris, 75 g sakaroz, 2,5 mL gliserin ve 0,3 mL PC-300 (antibakteriyel koruyucu) tartın ve 800 mL deiyonize su ekleyin, çözünmesi için karıştırın, PH değerini 6,8'e ayarlayın ve son olarak 1000 mL'ye seyreltin. Tris-HCl konsantrasyonu yaklaşık 52 mM'dir.
  5. Sudan siyah boyama solüsyonunun hazırlanması
    1. 0,03 g Sudan siyahı tartın ve 2 mL etilen glikol, 6 mL susuz etanol ve 2 mL dimetil sülfoksit karışımı içinde çözün. Filtrasyondan sonra flakon başına 1 mL'ye bölün.
      NOT: Sudan siyahı ve dimetil sülfoksit ile çalışırken, doğrudan teması önlemek için nitril eldiven ve koruyucu gözlük takın. İşlemler havalandırılmış bir ortamda yapılmalıdır. Maruz kaldıktan sonra cildi ve gözleri hemen suyla yıkayın, ardından gerekirse tıbbi yardım alın.
  6. İç ambalaj
    1. Kit bileşimi gereksinimlerine göre komple paketleme.

2. Kit bileşimi

  1. Ürünün prefabrik kolonlar, koruyucu solüsyon ve Sudan siyahı boyama solüsyonu içerdiğinden emin olun. Prefabrike kolonlar akrilamid, bisakrilamid, sakaroz, amonyum persülfat, Tris ve tetrametiletilendiamin içermelidir. Prefabrike kolonun uzunluğu 75 ± 0,5 mm, iç çapı 5,5 ± 0,02 mm ve dış çapı 7,0 ± 0,02 mm'dir. Koruyucu çözelti Tris, sakaroz, gliserin ve koruyucular içermelidir. Sudan siyahı boyama çözeltisi, Sudan siyahı, etilen glikol, susuz etanol ve dimetil sülfoksit içermelidir. Ambalaj özelliklerinin prefabrik kolon miktarına göre farklı olmasına dikkat edin. Bir reaktif porsiyonunun bir prefabrik sütunu olmalıdır. Deneysel sonuçları etkileyebileceğinden farklı partilerden oluşan reaktif kitlerini birleştirmeyin.

3. Numune hazırlama

  1. Hasta hazırlığı: Kan örnekleri alınırken hastanın aç karnına olduğundan emin olun.
  2. Serum ayırma jeli numune alma tüplerini kullanın ve numune toplama işlemini Standart Çalışma Prosedürüne uygun olarak gerçekleştirin. Hemolizi önlemek için kan alındıktan sonra kan mümkün olan en kısa sürede ayrılmalıdır.
  3. Serum örneklerini ayırdıktan sonra mümkün olan en kısa sürede oda sıcaklığında test edin. Hemen test mümkün değilse, numuneleri 2-8 °C'de 7 güne kadar veya -20 °C'de 30 güne kadar saklayın.
  4. Numuneleri oda sıcaklığına getirin ve özellikle dondurulmuş ve çözülmüş numuneler için kullanmadan önce tamamen karıştırın. Numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden tekrarlanan dondurarak çözdürmeye izin verilmez. Hem lipemi hem de hemoliz örnekleri test sonuçlarını etkileyebilir. Hafif bir lipemi veya hemoliz örneği ise, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 14.462 x g'da yüksek hızlı santrifüjleme yapılması önerilir. Lipemi numuneleri için, tüm şeffaf tabakayı alttan aspire etmek için bir pipet kullanın. Hemoliz örnekleri için süpernatanı toplayın. Ardından yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve boyayın. Ancak lipemi veya hemoliz çok şiddetli ise tekrar kan alınması önerilir.

4. İşlem adımları

  1. Hazırlık
    1. Test edilecek prefabrik kolonları ve numuneleri çıkarın. Prefabrik kolonların numune portundan kalan koruma sıvısını aspire etmek için bir pipet kullanın. Prefabrike kolonları ve numuneleri oda sıcaklığına getirin ve 14,3 g elektroforetik tampon tozunu 800 mL deiyonize su ile çözün.
  2. Boya
    1. Temiz santrifüj tüplerini alın ve numaralandırın. Tüp sayısı, kan alma tüplerinin sırası ile tutarlıdır. Santrifüj tüplerini 50 μL numuneye 10 μL Sudan siyahı boyama solüsyonu oranında ekleyin, iyice karıştırın ve lekelenmesi için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
      NOT: Sudan siyahının boyama prensibi lipofilik özelliğine dayanmaktadır. Hücreler içindeki nötr yağlar, fosfolipitler ve steroidler gibi lipit maddelerle spesifik kromojenik reaksiyonlara neden olarak kahverengimsi siyah veya koyu siyah parçacıklara neden olabilir. Bu sistemde, aşağıdaki protokol ile tek faktörlü bir deneysel tasarım kullanarak boyama süresini ve dozajını optimize ettik. Sırasıyla 5 μl, 10 μl, 15 μl ve 20 μl'lik karşılık gelen boyama hacimleri ile üç LDL-C serum numunesi (yüksek, orta ve düşük konsantrasyonlar) seçilir. Boyama süreleri 10 dakika, 15 dakika, 20 dakika, 25 dakika, 30 dakika, 35 dakika, 45 dakika ve 60 dakika olarak ayarlanmıştır. Elektroforetik deneyler yapılır, ardından boyama etkinliğini doğrulamak için elektroforetik bantların gri tonlamalı analizi yapılır. Optimal koşullar, 30 dk ± 5 dk boyama süresi ile 10 μl boyama hacmi olarak belirlenir. Daha düşük boyama hacmi ve süresi, hafif lekeli lipoprotein kolesterol ile sonuçlanır. Optimum koşullar dengeyi sağlamış olsa da, daha yüksek boyama hacmi ve süresi gerekli değildir.
  3. İyonofortik ayırma
    1. Önceden dengelenmiş kolonları elektroforez tankının kauçuk yuvasına yerleştirin. Jel kolonunun numune portu, kauçuk tıpadan yaklaşık 2 cm uzaktadır. Sıkıca kapatıldığından ve sızıntı olmadığından emin olun. Numune jel kolonlarının sayısı dolmadığında, boş alanı deliksiz bir lastik tapa ile doldurun.
    2. Ardından elektroforez tamponunu üst ve alt tanklara dökün. Prefabrike kolonların ağzındaki kabarcıkları çıkarın. Prefabrike kolonların numune portuna 25 μL boyalı numune ekleyin.
    3. Kapağı kapatın, güç anahtarını bağlayın ve elektroforez ayrımı için voltaj (U = 100 V), akım (I = 3 mA/tüp), güç (P = 120 W), zaman (T = 70 dakika) parametrelerini ayarlayın.
      NOT: Voltaj, güç ve zaman sabit parametrelerdir. Akımın test numunesi sayısına göre ayarlanması gerekir (örn. 10 numune tüpü, I = 3 mA x 10 tüp = 30 mA).
    4. Elektroforez tamamlandıktan sonra gücü kapatın, kapağı çıkarın ve elektroforez cihazının üst kısmına elektroforez tamponu dökün. Jel kolonları sırayla çıkarın ve sabitleme çerçevesine yerleştirin, üst yüzeydeki fazla elektroforez tamponunu dökün ve taramalı analiz sisteminde analiz edin.
  4. Tarama analizi
    NOT: Analizör tipi DY-03'tür ve tarama yazılımı KBL 3.3.9 GD'dir.
    1. Tarama analizörünün güç anahtarını açın, masaüstü sistem yazılımına çift tıklayın ve yazılım arayüzüne girmek için Koleksiyon'a tıklayın. Yazılım arayüzünde Numune Kasetini Dışa Aktar'a tıklayın, numune alma ucu cihazın iç kısmına bakacak şekilde numune rafına jel sütunları yerleştirin. Jel kolonlarının karşılık gelen numaralandırılmış konumlara yerleştirildiğinden emin olun. 25 ve 26 numaralı pozisyonlar yalnızca kalite kontrol testleri için belirlenmiştir.
    2. Numune kasetini cihaza içe aktarmak için yazılım arayüzünde Sample kasetini içe aktar'ı tıklatın. Örnek tarama görüntüleri elde etmek için Tara'yı tıklatın. Cihazda yerleşik bir otomatik odaklama sistemi vardır. Net görüntüleme sağlamak için tarama modülü ile jel tüp arasındaki odağı otomatik olarak ayarlar. Yazılım, elektroforogramın başlangıç konumunu (VLDL) ve sonlandırma konumunu (HDL) otomatik olarak tanımlar. Bu konumlarda bariz tepe noktaları tespit edildiğinde yazılım, spektral analiz için belirlenen analiz alanına kilitlenir.
    3. Hastaların bilgilerini girdikten ve barkodu taradıktan sonra, yazılım arayüzünde Analiz ve işleme'ye tıklayın, sistem otomatik olarak analiz edecek ve test raporları oluşturacaktır. Test raporlarını LIS sistemine aktarmak için LIS'i Yükle'ye tıklayın.
    4. Prefabrik kolonları tarama ve analizden sonra çıkarın ve tıbbi atık özelliklerine göre işlemden geçirin.

5. Kalite kontrol

  1. Günlük numune testinden önce iki seviyeli bir kalite kontrol testi gerçekleştirin. Kalite kontrol testinin çalışma adımları, numune testininkilerle aynıdır. Tip A referansı, 268 Å'den büyük ortalama partikül çapıdır. Tip B referansı, 265 Å'den küçük ortalama partikül çapıdır.
    NOT: Sonuç analizi: TİP A, ortalama LDL partikül boyutu > 268 Å'dir, LDL1 ve LDL2 daha fazlasını oluşturur ve bu da düşük KVH riskini gösterir. TİP ARA (TYPE INT), ortalama LDL partikül boyutu 265 ila 268 Å'dir, bu da LDL3'ün LDL7'ye oranının kritik değerin üzerinde olduğunu gösterir. TİP B, ortalama LDL partikül boyutu < 265 Å'dir, LDL3 ila LDL7 daha fazlasını oluşturur ve bu da yüksek KVH riskini gösterir.

6. Teknik iyileştirmeler

  1. Doğru teşhis sonuçları sağlamak için aşağıdaki teknik iyileştirmeler uygulanmalıdır.
    1. Ön muayene: Kan almadan önce hastaların tamamen aç olduğundan emin olun. Heparin antikoagülan plazma yerine serum veya EDTA antikoagülan plazma kullanın. Pipetin alımının doğru olduğundan emin olun. Şiddetli şilli veya hemolitik numunelerden kaçının.
    2. İnceleme sırasında: Voltaj (U = 100 V), akım (I = 3 mA/tüp), güç (P = 120 W), zaman (T = 70 dakika) elektroforez parametrelerini standart protokollere göre ayarlayın. Fotoğraf çekme ve tarama yeteneğini etkileyebilecek cam tüplerin kirlenmesini önlemek için steril eldiven giyin.
    3. Muayeneden sonra: Raporları yayınlarken, anormal kromatogramları potansiyel girişim açısından gözden geçirin ve yanlış teşhis sonuçları vermekten kaçınmak için yeniden analiz yapın.
      1. Normal kromatogram: VLDL'nin başlangıç pozisyonunda ve HDL'nin sonlandırma pozisyonunda, her ikisinin de ayrı bir tepe noktası vardır (bkz.
      2. Anomali kromatogramı: VLDL'nin başlangıç pozisyonunda veya HDL'nin sonlandırma pozisyonunda birden fazla tepe noktası yoktur veya daha fazladır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, katılımcıların serumundaki lipoprotein alt fraksiyonlarını saptamak için PAGE kullanan bir yöntem icat etmeyi amaçlamaktadır. Amaç, LDL-C alt fraksiyonlarının öncelikle büyük parçacıklar (LDL1 ve LDL2) veya küçük parçacıklar (LDL3 ila LDL7) olup olmadığını belirlemektir. Sudan siyahı ile boyandıktan sonra numuneler elektroforez cihazı ile poliakrilamid jel içerisinde ayrıştırılır. Lipoproteinler daha sonra jel tüpler içinde farklı bantlara ayrılır ve bir tarama analiz sistemi kullanılarak alt fraksiyon analiz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ateroskleroz gelişiminde kardiyovasküler bir risk faktörü olarak sdLDL'nin rolü araştırmalarla doğrulanmış olsa da, şu anda LDL alt fraksiyonlarını tanımlamak için belirlenmiş bir yöntem yoktur. Son birkaç on yılda, LDL alt fraksiyonları için tespit yöntemlerinin geliştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. UC altın standart olarak kabul edilir. LDL alt fraksiyonlarını yoğunluk farklılıklarına göre ayırabilir, sdLDL ve lbLDL'yi yüksek çözünürlükle ayırt edebilir. Ancak bu yöntem,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Guangdong İl Tıp Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Fonu Projesi'nden (A2024108) alınan hibelerle desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Elektroforetik tampon tozuGuangxi Kangbolai Teknoloji Şirketi25030401Tampon çözeltileri hazırlamak ve elektroforez koşulları sağlamak için
Yüksek değerli kalite kontrol ürünleriGuangxi Kangbolai Teknoloji Şirketi25030301Doğruluğu ve hassasiyeti izlemek için
Lipoprotein numune yoğunluğu ayırma çözeltisi (gradyan jel elektroforezi)Guangxi Kangbolai Teknoloji ŞirketiLSS60-SB1-A1  25030301Lipoprotein alt tip bileşenlerini serum örneklerinden ayırmak için
Düşük değerli kalite kontrol ürünleriGuangxi Kangbolai Teknoloji Şirketi25030301Doğruluğu ve hassasiyeti izlemek için
Sudan siyah boyama solüsyonuGuangxi Kangbolai Teknoloji ŞirketiLSS60-SB1-A1  25030301Numune boyama için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  2. Li, J. J., et al. 2023 Chinese guideline for lipid management. Front Pharmacol. 14, 1190934(2023).
  3. Kong, P., et al. Inflammation and atherosclerosis: signaling pathways and therapeutic intervention. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 131(2022).
  4. Xiang, Q., et al. New insight into dyslipidemia-induced cellular senescence in atherosclerosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 97 (5), 1844-1867 (2022).
  5. Chen, L., et al. Low-density lipoprotein cholesterol, cardiovascular disease risk, and mortality in China. JAMA Netw Open. 7 (7), e2422558(2024).
  6. Mansoor, T., et al. Inclisiran as a siRNA inhibitor of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9): past, present, and future. Am J Cardiovasc Drugs. 25 (3), 293-306 (2025).
  7. Alam, M. R., et al. Lipid profile of coronary heart disease patients: a prospective observational study. World J Cardiovasc Surg. 11 (11), 114-124 (2021).
  8. Thongtang, N., et al. Metabolism and proteomics of large and small dense LDL in combined hyperlipidemia: effects of rosuvastatin. J Lipid Res. 58 (7), 1315-1324 (2017).
  9. Wang, J., et al. Discordance of small dense LDL cholesterol beyond LDL cholesterol or non-HDL cholesterol and carotid plaque. JACC Asia. 5 (8), 1012-1028 (2025).
  10. Ivanova, E. A., et al. Small dense low-density lipoprotein as biomarker for atherosclerotic diseases. Oxid Med Cell Longev. 2017, 1273042(2017).
  11. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  12. Li, J., et al. The EGR3 gene modulates CRP and VCAM-1 expression to promote the development of atherosclerosis. Gene. 963, 149630(2025).
  13. Rodríguez-Fernández, M. A., et al. Virtual screening and molecular dynamics of cytokine-drug complexes for atherosclerosis therapy. Int J Mol Sci. 26 (7), 2931(2025).
  14. Ikezaki, H., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol is the most atherogenic lipoprotein parameter in the prospective Framingham offspring study. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019140(2021).
  15. Higashioka, M., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol and the risk of coronary heart disease in a Japanese community. J Atheroscler Thromb. 27 (7), 669-682 (2020).
  16. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  17. Kanonidou, C. Small dense low-density lipoprotein: analytical review. Clin Chim Acta. 520, 172-178 (2021).
  18. Joint Committee on the Chinese Guidelines for Lipid Management. Chinese guidelines for lipid management (2023). Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 51 (3), 221-255 (2023).
  19. Jha, M., et al. Lipoprotein(a) - from biomarker to therapy: a review for the clinician. Am J Cardiol. 245, 42-53 (2025).
  20. Hirano, T. Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol measurement in type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 16 (3), 370-383 (2025).
  21. Rief, M., et al. Comparison of two nuclear magnetic resonance spectroscopy methods for the measurement of lipoprotein particle concentrations. Biomedicines. 10 (7), 1766(2022).
  22. Kroner, G. M., et al. Retrospective comparison of results for simultaneous orders for LDL particle count, apolipoprotein B, and LDL-C. Clin Chim Acta. 518, 38-42 (2021).
  23. Chary, A., et al. Association of LDL-cholesterol subfractions with cardiovascular disorders: a systematic review. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 533(2023).
  24. Duan, R., et al. Estimation of the LDL subclasses in ischemic stroke as a risk factor in a Chinese population. BMC Neurol. 20 (1), 414(2020).
  25. Kotani, K., et al. Similarity and differences in small dense low-density lipoprotein assessment: two methods compared. Arch Med Sci Atheroscler Dis. 6, e166-e168 (2021).
  26. Simachew, Y. M., et al. Lipoproteins and cholesterol homeostasis in paediatric nephrotic syndrome patients. Biochem Med (Zagreb). 32 (2), 020706(2022).
  27. Hirano, T. Hypertriglyceridemia contributes significantly to high prevalence of small dense LDL-cholesterol in patients with type 2 diabetes, even when LDL-C targets are achieved. Diabetol Int. 14 (3), 288-293 (2023).
  28. Zhang, C., et al. Lipid and lipoprotein particle profiles in patients with type 2 diabetes mellitus: a comparative study between highlanders and lowlanders. Lipids. 60 (5), 293-302 (2025).
  29. Waldmann, E., et al. Effect of PCSK9 inhibition with evolocumab on lipoprotein subfractions in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipidemia). PLoS One. 17 (3), e0265838(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k Yo un LDLLDL Partik l BoyutuGradyan Jel ElektroforeziLipoprotein TiplendirmesiSudan Black BoyamaKardiyovask ler Risk StratifikasyonuLDL Heterojenli i

İlgili makaleler