Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Oksaliplatin Kaynaklı Nörotoksisiteye Karşı Sinnal-Dehitin Koruyucu Etkisini Araştırmak İçin Ağ Farmakolojisinin Entegre Edilmesi

460 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69013

⸱

28 Kasım 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, fare dorsal kök ganglionu (DRG) hücrelerinde oksaliplatin (OXA) kaynaklı hasara karşı sinnamaldehitin (CA) koruyucu etkilerini araştırmaktadır. Temel mekanizma, ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulama yoluyla ortaya çıkarıldığı üzere JAK2/STAT3 sinyal yolunun baskılanması ve SLC7A11-GSH-GPX4 yolunun aktivasyonunu içerir.

Özet

Bu çalışma, fare dorsal kök ganglionu (DRG) hücrelerinde oksaliplatin (OXA) kaynaklı hasara karşı sinnamaldehitin (CA) koruyucu etkilerini araştırmaktadır. CA'nın farmakolojik aktiviteleri analiz edildi ve potansiyel hedefleri ile metabolitlerinin hedefleri, Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformu (TCMSP), Entegratif Farmakoloji tabanlı Geleneksel Çin Tıbbı Ağ Hesaplamalı Araştırma Platformu (TCMIP) ve PharmMapper platformları kullanılarak belirlendi. CCK-8 testi ilaçların optimal konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılırken, lipid peroksidasyon seviyesini değerlendirmek için malondialdehit (MDA) testleri uygulanır. Fe2+ ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) hücre içi seviyeleri floresan problar kullanılarak nicelendirildi. CA'nın OXA ile tedavi edilen DRG hücrelerinde p-STAT3, XCT ve GPX4 dahil protein ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisi, immünoblotlama yoluyla incelendi. Ağ farmakoloji analizi, "CA-nöropatik ağrı (NP)-ferroptoz" arasında 14 örtüşen hedef tespit etmiştir. Deneysel sonuçlar, 4.0 μmol/L CA ile 24 saatlik bir tedavinin optimal etkiler sağladığını, DRG hücrelerinde MDA, Fe2+ ve ROS seviyelerini önemli ölçüde azalttığını gösterdi (P < 0.05). Ayrıca, CA tedavisi JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 ve nükleer faktör-kappa B (NF-κB) (P < 0.05) ekspresyonunu aşağı regüle ederken XCT, GPX4 ve FTH1 ekspresyonunu (P < 0.05) yükseltti. Bu bulgular, CA'nın DRG hücrelerinde OXA kaynaklı hasarı azalttığını ve JAK2/STAT3 sinyal yolunu inhibe ederek SLC7A11-GSH-GPX4 eksenini aktive ettiğini göstermektedir.

Giriş

Son yıllarda, ferroptozun apoptotik olmayan bir hücre ölüm modu olarak, çeşitli kemoterapötik ilaçların neden olduğu doku hasarında rol oynadığı kanıtlanmıştır. Feroptozun temel mekanizması, demire bağımlı lipid peroksidasyon ürünlerininbirikimidir 1. Sisplatin nörotoksisitesinin mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalar, bu ilacın nöronal ferroptozu birden fazla yol yoluyla indüklediğini ve bu sürecin doğrudan nörotoksisite gelişimiyle bağlantılı olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle, sisplatin glutatyon peroksidaz 4 (GPX4) aktivitesini inhibe eder. Ferropozda kritik bir "fren molekülü" olarak, GPX4'ün inaktivasyonu lipid hidroperoksitlerin (L-OOH) temizlenmesini engeller ve böylece nöron hücre zarlarında oksidatif hasara yolaçar 2. Bu arada, oksaliplatin sinir hücrelerinde ferroptoz salınımını teşvik edebilir ve Fenton reaksiyonu yoluyla reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu zorlaştırarak ferroptozkaskadı 3'ü daha da artırabilir. Bu kanıt, nörodejenerasyonun hedefli düzenlenmesinin oksaliplatinin nörotoksisitesini hafifletmek için potansiyel bir strateji olabileceğini göstermektedir.

Kolorektal kanser için yaygın olarak kullanılan üçüncü nesil platin bazlı kemoterapî ajanı olan oksaliplatin (OXA), güçlü antitümör etkinliği sunar ancak sıklıkla önemli nörotoksisiteyle ilişkilidir. Kronik uygulama genellikle OXA kaynaklı nöropatik ağrıya (OINP) yol açar; insidans oranı %60'a ulaşır4, mekanik allodin, termal hiperaljezi ve soğuk aşırıduyarlılığı ile karakterize edilir 5. Yaygınlığına rağmen, OINP için mevcut tedavi stratejileri yetersiz kalmaktadır ve bu da hasta yaşam kalitesini önemli ölçüde düşürmektedir. Sonuç olarak, OINP'nin altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi, devam eden araştırmaların kritik alanlarıolarak kalmaktadır 6.

Tarçın uçucu yağının birincil aktif bileşeni olan sinnamamaldehit (CA), sarı, viskoz birsıvıdır ve çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir; bunlar arasında böceköldürücü 9, antimikrobiyal10, antifungal11, antioksidan12, antidiyabetik13, antikanser14, anti-inflamatuar ve nörovasküler koruyucu etkilerbulunur 15,16. Ortaya çıkan kanıtlar, CA'nın JAK/STAT sinyal yolu17'nin aktivasyonunu engelleyebileceğini göstermektedir. CA'nın kimyasal formülü C9H8O'dur ve kimyasal yapısı Şekil 1'de gösterilmiştir. Geleneksel Çin tıbbının doğal bir monomeri olarak CA, çok çeşitli farmakolojik aktiviteler sergiler. Nörokoruma açısından, birçok çalışma CA'nın kan-beyin bariyeri aracılığıyla merkezi sinir sistemine girebileceğini, Nrf2/ARE sinyal yolunu aktive ederek antioksidan enzimlerin (HO-1 ve NQO1 gibi) ekspresyonunu teşvik edebildiğini, sinir hücrelerinde ROS birikimini azaltabileceğini ve böylece iskemik inmede nöro-oksidatif hasarı hafifletebileceğini doğrulamıştır. Alzheimer hastalığı ve diğerhastalıklar 18,19. Aynı zamanda, CA mikroglia hiperaktivasyonunu engelleyebilir, inflamatuar faktör (örneğin TNF-α, IL-1β) salınımını azaltabilir ve nöroinflamatuaryanıtı azaltabilir. Ancak, CA'nın ferroptoz yolunu düzenleyerek oksaliplatinin indükettiği nörotoksisiteyi hafifledip hafifletmeyeceği bildirilmemiştir.

JAK2/STAT3 sinyal yolu, hücre zarından alınan sinyalleri hücre çekirdeğine ileten önemli bir hücre içi sinyal iletim mekanizmasıdır ve hücre çoğalması, farklılaşma, apoptoz, oksidatif stres ve inflamatuar yanıtlar gibi önemli biyolojik süreçlerle yakından ilişkilidir21. İnflamatuar yanıtlarla yakından ilişkili bir yol olarak, JAK3/STAT3 sinyal yolu, aktive durumda inflamatuar yanıtları tetikleyebilir ve doku inflamatuar hasara yol açabilir. Çalışmalar, JAK3/STAT3 sinyal yolunun inhibrelenmesinin, vasküler demansı olan sıçanlarda inflamatuar yanıtı ve oksidatif hasarı azaltabileceğini, böylece sıçanların bilişsel fonksiyonunuiyileştirebileceğini göstermektedir 22. Ayrıca, JAK3/STAT3 sinyal yolunun inhibrelenmesi, epileptik sıçanlarda inflamatuar yanıtı hafifletebilir, nöronal apoptoz oranını düşürebilir ve beyinhasarını hafifletebilir 23. Kafeik asit (CA) sinir sistemi üzerinde belirli koruyucu etkiye sahip olsa da, iyileştirme etkisinin JAK3/STAT3 sinyal yolunun düzenlenmesiyle ilişkili olup olmadığı şu anda net olarak kesindirilmemiştir.

Bu çalışma, JAK2/STAT3 sinyalinin in vitro inhibisyonunun ve LC7A11-GSH-GPX4 ekseninin aktivasyonunun sıçan DRG hücrelerinde OXA kaynaklı hasarı hafifledip azaltamayacağını doğrulamayı amaçlamaktadır. Ayrıca, CA'nın potansiyel anti-ferroptotik etkilerini inceliyor ve DRG hücrelerinde iltihabı modüle etmedeki ağ farmakolojisi yoluyla tanımlanan ana hedeflerin rolünü inceliyor.

Oksaliplatin kaynaklı nörotoksisite için mevcut tedavi yaklaşımları, öncelikle sinir hasarını azaltmak için serbest platin iyonlarının şelatlanmasına odaklanır; örneğin kalsiyum magnezyum kompleksleri kullanılır; ana amaç akut periferik nöropatileri (örneğin, ellerde ve ayaklarda uyuşma ve karıncalanma) hafifletmektir.24. Ancak kesin mekanizmalar hâlâ belirsizdir. Bu tedaviler, oksaliplatin kaynaklı aksonal dejenerasyon ve sinir lifi bozulması gibi kronik hastalıkları tersine çevirme kapasitesinden yoksundur ve kümülatif nörotoksisiteyi önlemede sınırlı bir etkinlik göstermektedir. Bu deneyde, 5 μM OXA tedavisi altında 4 μM CA'nın nöroprotektif etkisi, anti-inflamatuar ve anti-ferroptoz mekanizmalarının birleştirilmesiyle araştırıldı. Bulgular, bu mekanizmanın aktivasyonunun OINP'de kritik bir başlatıcı adım olduğunu doğrulamaktadır. Spesifik inhibitörlerin keşfi, mevcut spesifik olmayan yaklaşımların yerini alarak terapötik müdahalelerin hem hassasiyetini hem de etkinliğini artırabilir.

Bu deneyde kullanılan in vitro model, OINP'yi incelemek için izole fare dorsal kök ganglionu (DRG) nöronlarını içerir. Ancak bu model, genetik arka plan, metabolik özellikler ve toksisite hassasiyeti açısından insan birincil hücrelerinden önemli ölçüde farklıdır; bu da araştırma sonuçlarının klinik olarak doğrudan uygulanmasını zorlaştırabilir. Ayrıca, in vivo sinir dokularının fonksiyonel bakımı, çok hücreli koordinasyonun ve dinamik mikro ortamların hassas şekilde düzenlenmesine dayanır - bu karmaşık faktörler in vitro modellerde tam olarak çoğaltılması zordur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Hücre hattı fare hücre hatlarından türetilmiştir.

1. Ağ farmakolojisi analizi

NOT: Bağlantılar Materyaller Tablosu'nda bulunabilir.

  1. CA'nın olası hedeflerini bulmak
    1. PubChem veritabanından yapısal bilgileri almak ve CA'nın potansiyel biyolojik mekanizmalarını keşfetmek. Ardından, gelişmiş hesaplama yeteneklerinden yararlanarak SwissTargetPrediction kullanılarak hedef tahmin analizi yapılacaktır.
    2. Analizin doğruluğunu ve kapsamlılığını artırmak için, öngörülen hedefleri TCMSP ve TCMIP dahil olmak üzere Geleneksel Çin Tıbbına özgü veri tabanlarıyla çapraz referans alın.
    3. Ek potansiyel hedefleri belirlemek için ilgili literatürü inceleyin. Konsolide hedef listesini çoğaltarak kapsamlı bir veri seti oluşturulur; bu veri seti CA ile ilgili daha fazla biyolojik aktivite çalışmaları ve ilaç geliştirme için kritik bir referans olarak hizmet eder.
  2. Nöropatik ağrının (NP) potansiyel hedeflerinin belirlenmesi
    1. GeneCards veritabanı ve TTD veritabanını kullanarak, "nöropatik ağrı" ve "ferroptosis" anahtar kelimeleriyle kapsamlı bir arama yapın. GeneCards veritabanındaki gen hedeflerini önceliklendirin; "İlgi puanı" medyanı aşıyor, çünkü bu genler araştırma odağına daha fazla önem veriyor.
    2. Daha önce seçilen gen hedeflerini, TTD'den (Terapötik Hedef Veritabanı) alınan verilerle entegre edin. Entegrasyon sürecinde tüm seçilmiş gen hedeflerini TTD veritabanı girişleriyle çapraz referans yaparak potansiyel hedeflerin kapsamlı tanımlanmasını sağlamak. Entegre gen hedef veri setinden tekrarlayan girişleri sistematik olarak kaldırın. Ortaya çıkan veri setinin potansiyel hedeflerin benzersiz bir listesini içerdiğinden emin olun.
  3. "CA-NP-Feroptosis"in kesişim hedeflerinin belirlenmesi
    1. CA, NP ve ferroptoz için hedeflerin kesişimini çevrimiçi oluşturulan bir Venn diyagramı kullanarak belirleyin.
    2. Bu kesişim hedefleri, "CA tarafından düzenlenen NP-ferroptoz yolu" için potansiyel aday olarak belirlendi.
  4. Protein-Protein Etkileşimi (PPI) Ağının İnşası
    1. Daha fazla araştırma için, "CA-NP-ferroptoz", "CA-NP" ve "CA-ferroptosis" için yaygın hedefleri STRING veritabanına gönderin.
    2. Etkileşim puan eşiğini "en yüksek güven > 0.4" olarak ayarlayın ve hem birinci hem de ikinci etkileşim katmanları için maksimum etkileşimci sayısını 10 ile sınırlayın. Diğer tüm parametreler için varsayılan ayarlar uygulayın ve "CA-NP-ferroptosis" için 4.5 PPI ağı oluşturun.
  5. GO ve KEGG zenginleştirme analizleri
    1. "CA-NP-ferroptosis" için kesişim hedeflerini aşağıdaki parametrelerle DAVID platformuna yükleyin: "select identifier: official gen symbol," "list type: genelist" ve "species: Homo sapiens." Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi üç kategoride gerçekleştirildi: Biyolojik Süreç (BP), Hücresel Bileşen (CC) ve Moleküler Fonksiyon (MF).
    2. KEGG yol zenginleştirme analizini yapın ve ortaya çıkan verileri Hiplot platformunda oluşturulan çubuk grafikleriyle görselleştirin.

2. Moleküler kenetleme

  1. Aktif bileşikler ile hastalıkla ilişkili hedefler arasındaki etkileşimi aydınlatmak için, PubChem veritabanından aktif maddeler için küçük moleküller olarak yapısal bilgiler elde edinin, hedef proteinlerin 3D yapılarını Protein Veri Bankası'ndan (PDB) protein modelleri olarak alın.
  2. PyMOL'u su molekülleri ve temel olmayan ligandları çıkararak protein reseptör yapılarını ön işlemek için kullanın. Daha sonra, hedef proteinleri ve aktif maddeleri AutoDock Tools 1.5.7 ile kenetlenmeye hazırlayın ve AutoDock Vina ile yarı esnek moleküler kenetlenme gerçekleştirin.
  3. Reseptör proteinlerindeki bağlanma enerjilerini ve aktif madde bağlanma noktalarını analiz edin. JAK2 proteini için, yapısı (PDB ID: 3e64), X-ışını kristalografisi verileri ve optimal çözünürlük temelinde PDB veritabanından seçilmiştir.
  4. PyMOL yazılımını kullanarak ligandları ortadan kaldırarak, su moleküllerini çıkararak ve hidrojen ekleyerek JAK2 yapısını hazırlayın. Aktif bileşiklerin küçük molekül yapıları PubChem'den temin edilmiştir.
  5. AutoDock Tools 1.5.7'ye hem protein hem de bileşik yapılarını yükleyin, kenetlenme kutularını tanımlayın ve AutoDock Vina ile moleküler kenetleme gerçekleştirin.

3. Hücre kültürü

NOT: Doğrulama deneyinde aşağıdaki adımlar tekrar tekrar kullanılacaktır. Sıkı aseptik tekniklere bağlı kalın. Deneyin bu kısmında düşük hızlı yatay rotor santrifüj kullanıldı.

  1. %75 alkolle satın alınan steril hücrelerin dış ambalajı ve kültür şişelerini dezenfekte edin, ardından hücreler 10 cm çapında beş petri kabına yayılana kadar subkültür için süper temiz bir çalışma tezgahındaki kültür kaplarına aktarın; böylece yeterli hücre stoku sağlanır.
  2. Hücreleri sonraki deneyler için -80 °C'de kriyopreserve yapın.
    1. DMEM, hücre kültürü dereceli DMSO, fetal sığır serumu (FBS), 15 mL santrifüj tüpleri, pipetler, kriyovialler ve buz banyosu hazırlayın. 1 mL DMSO, 1 mL FBS ve 8 mL DMEM karıştırarak toplam 10 mL hacmi elde edin. DMSO'yu 15 dakika buzda soğut. Öncelikle, temel ortamı santrifüj tüpüne aktarın, ardından dönerken önceden soğutulan DMSO'yu yavaşça ekleyin. Pipetle iyice karıştırın, sonra FBS ekleyin ve tekrar karıştırın. Karışımı daha sonra kullanmak üzere buz banyosunda sakla.
      NOT: %20-%50 DMSO konsantrasyonu, LDH salınımında önemli bir artışa yol açmıştır; bu da yüksek DMSO konsantrasyonlarının sitotoksik olduğunu, %10 DMSO'nun ise nispeten güvenli olduğunu gösterir. Bu,deneyimiz 25'i etkilemedi.
    2. Logaritmik olarak büyüyen hücreleri alıp PBS ile 3 kez yıkayın, ardından %0,25 tripsin ekleyin ve 400 μL/10 cm tabak aralığında kullanın.
      NOT: Sitoplazmik geri çekilme gerçekleştiğinde, bağlantılar gevşediğinde veya büyük ölçekli yüzme belirtileri olduğunda, sindirim süreci hemen durdurulur.
    3. Sindirim öncesi hazırlık: Ana reaktifleri (%0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ve DRG tam ortam) 37 °C'ye kadar ısıtın. Hücre kültürü termosunu inkubatörden çıkarın ve kalıntı ortamın sindirim verimliliğini etkilemesini önlemek için steril bir pipet kullanarak eski ortamı atın. Tek katmanlı kültürlenmiş hücreleri 5 mL steril PBS ile iki kez nazikçe durulayın; böylece hücre elülasyonunu önlerken kalıntı serumu çıkarabilirsiniz.
    4. Kültür kabına 2 mL önceden ısıtılmış %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin, böylece tek hücre tabakasını tamamen kaplayın. Oda sıcaklığında 1-3 dakika kuluçka yapın. Bu süre boyunca, hücreleri her 30 saniyede bir ters mikroskop altında gözlemleyin. Çoğu hücre kasılmaya başladığında, yuvarlaşmaya ve belirgin hücrelerarası boşluklar göstermeye başladığında (aşırı sindirim ve hücre hasarını önlemek için) sindirimi hemen durdurun.
    5. Kültür kabına hızlıca 4 mL tam önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Karışımı steril pipetle 5 kez nazikçe pipetleyin ve hücre kümesi tek hücreli süspansiyona dağılsın. Tüm tek hücreli süspansiyon steril 15 mL santrifüj tüplerine aktarılır ve hücre pelletini 300 x g 5 dakikada 25 °C'de düşük hızlı yatay rotor santrifüj ile santrifüjle toplayın.
    6. Süpernatantı atın ve 5 mL hazırlanmış kriyokoruma ortamı ekleyin. Hücreleri eşit şekilde karıştırmak için pipetle nazikçe üfleyin. Bunları 5 şişeye eşit şekilde dağıtın.
    7. Kriyovial'ı hücre adı, donma tarihi ve operatörle etiketleyin; Dondurucu bir kaba koyup -80 °C dondurucuda saklayın, ardından gece boyunca depolamadan sonra sıvı azota aktarın.
  3. Hücre yeniden canlandırma
    1. Eldiven takın, şişeni sıvı azot kabından çıkarın ve hemen 37 °C sıcak suya batırın, ara sıra çalkalayarak hızlı erimesini (1 dakika içinde) sağlayın.
    2. Şişeyi 37 °C su banyosundan çıkarın, kapağını açın, hücre süspansiyonunu pipetle aspire edin, santrifüj tüpüne aktarın, kültür ortamının 10 katı hacmi ekleyin, iyi karıştırın ve 300 x g ile 5 dakika (25 °C) santrifüj yapın.
    3. Süpernatantı at, %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 5 mL kültür ortamı ekleyin (bu hücre kültürü durumu için tam ortam), kültür kabını aşılayın ve 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka içinde statik bir kuluçka yapın.
    4. Ertesi gün kültür ortamını değiştirin (kalıntı DMSO ve ölü hücreleri çıkarmak için) ve büyüme koşulları için kültürü gözlemlemeye devam edin. Hücre yoğunluğu yüksekse, sonraki deneyler için hemen alt kültür uygulanır.
  4. Hücre sayımı
    NOT: Deneyin bu kısmında düşük hızlı yatay rotor santrifüj kullanıldı.
    1. Sayma odasını ve kapak kazını temizlemek için önceden %75 alkol hazırlayın, sonra daha sonra kullanmak üzere kurutulun.
    2. Sindirilmiş ve santrifüjlenmiş hücreleri 1 mL ortamda yeniden süzüldürün ve hücre süspansiyonunun 50 μL'sini 1,5 mL EP tüpünde 150 μL ortamla seyreltirerek 4 kat seyreltme elde edilir.
    3. Eşit şekilde salınımlayın, 10 μL alın ve kapak ile sayma odası arasına enjekte ederek kamarcıqları önleyin. Gözlem ve sayma için mikroskop altına alın. Sayma ilkeleri: Atlamayın veya yeniden saymayın; üst ve sol sınırlara dokunan hücreleri sayın, ancak alt ve sağ kenarlara dokunanları hariç tutun.
    4. Deneysel gereksinimlere göre, hücre hacmini plata veya tabak tohumu için istenen hücre sayısına ve sayım sonuçlarına göre hesaplayın, ardından toplam orta hacmi tam ortamla tamamlayın.

4. Hücre yaşamlılık testi protokolü

NOT: Duloksetin, periferik nöropatik ağrı tedavisinde yaygın olarak kullanılan ve klinik olarak doğrulanmış bir ilaç olduğu için batı tıbbı kontrol ajanı olarak seçilmiştir. Bu endikasyondaki kanıtlanmış etkinliği (klinik uygulama kılavuzları ve randomize kontrollü çalışmalarla desteklenen), kontrol grubunun test müdahalesinin göreli etkinliğini değerlendirmek için güvenilir bir referans sağlamasını sağlar.

  1. Öncelikle, eski kültür ortamını kültür kapından atıp hücre yüzeyini 5 mL PBS ile durulayarak kalan serumu çıkarın. Sonra, %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi 2 mL ekleyip oda sıcaklığında 1-3 dakika kuluçka yapın. Mikroskobik gözlemde hücre küçülmesi, yuvarlanma ve ayrılma ortaya çıktığında, hemen 4 mL DRG Tam Ortam eklenerek sindirimi sonlandırın ve hücreleri pipetle yeniden süzülür.
  2. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre pelletini 300 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yaparak toplayın; 25 °C'de düşük hızlı yatay rotor santrifüj kullanın. Süpernatantı atıp hücre pelletini 15 mL'lik santrifüj tüpüne yeniden süsküyünüz, ardından süspansiyonu iyice yeniden süspansiyon ve karıştırın.
  3. 1.5 mL EP tüpü alın ve önce 150 μL kültür ortamı, ardından 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin. İyi karıştırarak 4 kat seyreltme elde edin.
  4. Sonra %75 alkol kullanarak sayma odasını temizleyin ve camı kapatın, kurutun ve EP tüpünü tekrar eşit şekilde sallayın.
  5. 10 μL hücre süspansiyonu çıkar ve kapağı cam ile sayma odası arasına enjekte edilir, böylece sıvının sayma odasını kabarcık oluşturmadan doldurmasını sağlar.
  6. Mikroskop altında gözlemleyin ve sayma prensibine göre hücre sayısını sayın, eksikliklerden veya tekrarlardan kaçının.
    NOT: Eğer sayılan hücre sayısı n ise, santrifüj tüpündeki hücre konsantrasyonu n/mL'dir.
  7. Deneysel gereksinimlere göre, hücreler 96 kuyu ölçüsünde 2.000 hücre yoğunluğunda tohumlanmalıdır.
  8. Öncelikle, 96 kuyruklu bir plakanın periferik dairesinin her kuyusuna 200 μL PBS enjekte edilir, ardından gruplandırmaya göre hücre içeren kültür ortamı eklenir.
  9. 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesinde 24 saat kuluçka yaptıktan sonra, eski ortamı aspire edin ve 200 μL PBS ile iki kez yıkayın. Deneysel düzene göre, CA adım adım seyreltildi (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) ve 96 kuyululu bir plakaya 200 μL eklenir.
  10. Hücreleri 24 saat boyunca OXA (5 μM) ile önceden tedavi edin, ardından sırasıyla 24 saat boyunca farklı CA konsantrasyonlarına sahip DRG hücreleri (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) tedavi edilir.
    NOT: Deneyin bu bölümü, CA için optimal ilaç konsantrasyonunu belirlemeyi amaçlamaktadır.
  11. 96 kuyu tabağını PBS tamponu ile üç kez yıkayın, ardından her kuyuya 200 μL taze hazırlanmış CCK-8 çalışma çözeltisi ekleyin. Bu adım karanlıkta yapılır ve deney süresi 10 dakika içinde tamamlanması için kontrol edilir. Çözeltiyi 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka içinde 4 saat kuluçka yapın. Son olarak, mikroplaka okuyucu kullanarak soğurma değerlerini ölçün. Tüm deneyleri aynı koşullarda en az üç kez tekrarlayın.

5. MDA

  1. 10 × 106 DRG hücresini 15 cm'lik bir kabada tohum ekin ve gece boyunca 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesinde kültürleyin. Kültür ortamını çıkarın, ilaç ekleyin ve 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka içinde 24 saat kuluçka yapın.
  2. Kültür ortamını çıkarın ve bir kez 5 mL PBS ile yıkayın. Sindirimden sonra, hücreleri DMEM ortamı kullanılarak konik bir tüpte toplayın.
  3. İşlenmiş DRG hücrelerini sırasıyla 5 mL mikrotüplere ekleyin. Düşük hızlı yatay rotor santrifüjle 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatı çıkarın. Sonra 1 mL PBS ekleyin, pipetle karıştırın ve yeni bir 1,5 mL mikrotübe aktarın. Düşük hızlı yatay rotor santrifüjle 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatı çıkarın.
  4. 100 μL Antioksidan PBS çözeltisi ekleyin, pipet karıştırın ve hücre süspansiyonunu hazırlayın. MDA standart çözümünü hazırlayın.
    NOT: Floresans yöntemiyle standart MDA çözeltisi hazırlanışına bakınız; Detaylı prosedürler için kitin "Kit Bileşenleri" bölümüne bakabilirsiniz.
  5. Örnek tüpüne ve standart tüpe sırasıyla 100 μL Lysis Buffer ekleyin ve vortex osilatörü kullanarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
  6. Her tüpte hazırlanan çalışan çözelti 250 μL ekleyin ve vortex mikser ile iyice karıştırın. Su banyosunu doğal ışık ortamında 95 °C'ye kadar 15 dakika ısıtın, ardından soğuması için 5 dakika buz banyosuna koyun. 10.000 x g yükseklikte yüksek hızlı açısal rotor santrifüj, 10 dakika (4 °C) süreyle.
  7. 100 μL üst yüzey alıp siyah bir 96 kuyu plakaya ekleyin. Flüoresans yoğunluğunu bir floresans mikroplaka okuyucu ile ölçün (Örneğin: 540 nm, Em: 590 nm). Örnekteki MDA konsantrasyonunu standart eğriye göre hesaplayın.

6. Fe 2+ tespit kiti kullanılarak ölçülen hücrelerdeki Fe2+ içeriği

  1. Su banyosunu önceden ısıtın ve sıcaklığı 37 °C'ye yükseltin. Eldiven takın, DRG hücrelerini sıvı azottan çıkarın, plastik bir torbaya sarın, ardından 37 °C sıcak suya batırarak aralıklı olarak nazikçe çalkalayın ki 1 dakika içinde tam erimesini sağlasın.
  2. Çözüldükten sonra, şişeyi 37 °C su banyosundan çıkarın, kapağını açın, hücre süspansiyonunu aspire edin, 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve damla olarak 10 mL kültür ortamı ekleyin, iyice karıştırın. 300 x g sıcaklıkta 5 dakika (25 °C) düşük hızlı yatay rotor santrifüj.
  3. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın, 10 mL taze kültür ortamı ekleyin, iyice karıştırmak için pipet yapın ve tekrar santrifüj yapın. Yeni kültür yemeklerine aşılamadan önce bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
  4. Hücreler 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka içinde statik olarak kültürlenir. Ertesi gün ortamı değiştirerek kalan DMSO ve ölü hücreleri çıkarın, sonra yetiştirmeye devam edin. Hücre yoğunluğu yüksekse, alt kültürü zamanında yapın. Daha sonra, logaritmik büyüme evresinde hücreleri toplayın, sindirin, santrifüj yapın ve yeniden süzülür. Yeniden askıya alınmış hücreleri %70-80 yoğunlukta 12 kuyu plakalarına tohumlayın, ardından plakaları 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesine yerleştirerek daha fazla yetiştirme için.
  5. Ertesi gün hücre durumunu gözlemleyin, deneysel düzene göre uygun tedaviler yapın ve ardından tekrar 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesine yerleştirin ve sürekli yetiştirilmesini sağlarsınız.
  6. İlaç uygulamasının 24 saatinden sonra, orijinal kültür ortamını atın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. HBSS'de seyreltilmiş FerroOrange probu (1 μM) kuyu başına 300 μL ekleyin ve 37 °C, %95 nem, %5 karbondioksitte 30 dakika kuluçka yapın.
  7. Sonra hücre plakasına 1:100 oranında Hoechst 33342 canlı hücre boyama çözeltisi (100x) ekleyin, hücre çekirdeklerini boyamak için oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika kuluçka yapın.
  8. Lekelenme etkisini floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve belgeleme için fotoğraflar alın. Daha sonra, ortalama floresans yoğunluğunu hesaplamak için ImageJ kullanın; deney istatistiksel analiz için üç kez tekrarlanacaktır.

7. ROS tespit kiti

  1. Logaritmik büyüme fazındaki hücreleri alın, sindirin, santrifüj yapın ve yeniden süzülün, ardından hücreleri 12 kuyuyla bir plakada (%70-%80) bir yoğunlukta tohumlayın. Hücreler iyice karıştırdıktan sonra, onları 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesine yerleştirerek yetiştirmeye devam etmelidir.
    NOT: Sindirim, santrifüj ve yeniden süspansiyon adımları için 4.1. adıma bakınız.
  2. Ertesi gün hücre durumunu gözlemleyin, deneysel düzene göre ilgili tedavileri uygulayın ve ardından hücreleri 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesine tekrar yerleştirerek kültüre devam edin. İlaç kullanımından 24 saat sonra, orijinal kültür ortamını atın ve hücreleri HBSS ile iki kez yıkayın.
  3. 200 μL Yüksek Duyarlı DCFH-DA boya çalışma çözeltisi ekleyin, ardından 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçka yapın.
  4. Süpernatantı at, HBSS ile iki kez yıkayın ve 2 μL Hoechst 33342 canlı hücre boyama çözeltisi (100x) ile 5 dakika boyan, ardından floresan mikroskopu altında inceleyin. Deneyi istatistiksel analizle üç kez tekrarlayın.

8. TEM kullanılarak gözlemlenen hücrelerin mitokondriyal morfolojisi

  1. İyi kültürlenmiş hücrelerden kültür ortamını at, 1 mL %2,5 oda sıcaklığında glutaraldehit fiksör çözeltisi ekleyin ve hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika sabitleyin. Hücreleri bir yöne nazikçe kazıyarak hücre kazıyıcıyla sürün.
  2. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 25 °C, 600 x g sıcaklıkta düşük hızlı yatay rotor santrifüj kullanarak 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Fiksatif çözeltinin üst yüzeyini attıktan sonra, taze elektron mikroskopik fiksator ekleyin (12 kuyuyla plaka için her kuyu başına 1 mL kullanın) ve ışıktan uzakta oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin, ardından depolamak için 4 °C'ye aktarın.
  4. Dehidrasyon sızması: Örneği gömülü plakaya yerleştirin ve gece boyunca 37 °C fırına koyun.
  5. Gömülü ortamı 60 °C bir fırında 48 saniye polimerize edin. 60-80 nm aralığında ultra ince kesitler ultramikrotom ile kesin.
  6. Bölümleri %2 uranyl asetat doymuş alkol çözeltisi ile 15 dakika boyayın, ardından 15 dakika daha kurşun sitratla boyanın. Lekeli kısımları gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Kesitleri geçirimli elektron mikroskobu altında gözlemleyin ve fotoğraflayın.

9. Western blotting

  1. Hücrelerin toplam proteinini çıkarın
    1. Hücreleri 6 cm bir petri kabına işleyip aşılayın, yoğunlukları %70'e ulaşana kadar.
      NOT: Hücre canlandırması ve aşılama talimatları için 3.3. adıma bakınız.
    2. Kültür kabına 3 mL OA (5 μM) ekleyin ve 4 saat sonra CA (4 μM) ekleyin.
    3. Önceden bir kutu buz hazırlayın, PBS'yi önceden soğutun, hücre kazıyıcıları, hazırlanmış liz tamponu ve birkaç etiketli EP tüpünü hazırlayın.
    4. İlaç tedavisinden sonra, kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve önceden soğutulmuş PBS ile iki kez yıkayın. Bu işlemi buz üzerinde gerçekleştirin ve kalan PBS'yi vakum santrifüjle aşerin.
    5. Her petri kabını etiketleyin, ardından 300 μL lizis tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca buzun üzerinde bekletin, böylece eksik liz ve donmayı önleyin.
    6. Sonra, yapışkan hücreleri ayırmak için önceden soğutulmuş bir hücre kazıyıcısı kullanın ve her kazımadan sonra 300 μL EP tüpüne toplayın. Her kazıma için yeni bir hücre kazıyıcı kullanın ve tekrar kullanmayın.
    7. EP tüpünün üst kısmını tutup vortex mikserinde iyice karıştırın, ardından 25 dakika boyunca buz üzerinde koymaya devam edin. Bu sırada, santrifüjün önceden soğutması belirli bir zaman gerektirdiği için 4 °C yüksek hızlı açısal rotor santrifüjünü önceden açın.
    8. Zamanlayıcı bittikten sonra bir kez daha girdab, ardından 4500 x g yükseklikli açısal rotor santrifüjle 15 dakika boyunca 4 °C santrifüjle yapılır.
    9. Şimdi kuru banyo ısıtıcısını açın ve sıcaklığı 100 °C'ye ayarlayın.
    10. BCA protein nicelik kitini çıkarın, örnekler ve reaktifler 96 kuyu tabakasına ekleyin, iyi karıştırın ve 37 °C, %95 nem, %5CO2 kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca reaksiyona verin. Çıkarılan protein içeriğini çok fonksiyonlu bir mikroplaka okuyucu kullanarak ölçün, ardından sonuçlara göre kalan liz tamponu ile ayarlayarak her örnek konsantrasyonunun tutarlı olmasını sağlar.
    11. Son olarak, her üst tamponun içeriğine göre, protein yükleme sistemini hazırlamak için 6× Yükleme Tamponundan 1/5 hacim ekleyin. 150 μL süpernatantı dikkatlice yeni bir EP tüpüne aspire edin. Süpernatana 30 μL 6× yükleme tamponu ekleyin ve iyice karıştırın (genellikle 1:5 oranında). Karışımı buz üzerinde sakla.
    12. Sonra ısıtıcıda 100 °C'de 6 dakika ısıt, EP tüpünün kapağını basılı tutarak açılmasını engellemeye dikkat edin. Isıttıktan sonra buzlu bir banyoda soğutun.
  2. %10 konsantrasyonlu bir protein jeli hazırlayın.
    1. Jel plakayı saf suyla durulayın, hava ile kurutun, fazla nemi silin ve su lekeleri ile tozdan mümkün olduğunca kaçının.
    2. Jel döküm standını çıkarın; iki cam plakanın kısa plakaları önde, uzun plakalar arkada olsun, alt kısımları hizalayarak cam plakalar arasındaki boşluğun kaptanma şeridine sıkıca uymasını sağlayarak sızıntıyı önleyin, ardından jel döküme hazırlanmak için plakaları sıkıca kelepçe yapın.
    3. Alt jeli 6 mL saf su, 3,75 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL %10 SDS, 5 mL %30 Acry/BIS, 75 μL %10 APS ve 7,5 μL TEMED ile hazırlayın.
    4. Köpüklenmemesi için nazikçe karıştır, ardından iki cam tabak arasına hızlıca ve eşit şekilde ekleyin, üst jel için yer bırakın. Daha sonra, sıvı yüzeyi 1 mL izopropanol ile düzleştirin ve yaklaşık 30 dakika bekletin.
    5. Jel hazırlamak için tarak saf suyla durulayın, hava ile kurutuldu ve bir kenara koyun. Alt jel tamamen katılaştıktan sonra izopropanol dökün, 2-3 kez saf suyla dikkatlice durulayın, sıvıyı emin ve jel plakayı ters çevirerek kalan sıvıyı boşaltın.
    6. Üst üst üst geli 6 mL saf su, 2,5 mL 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 mL %10 SDS, 1,34 mL %30 Acry/BIS, 50 μL %10 APS ve 10 μL TEMED ile hazırlayın.
    7. Üst katmanı doldurun ve dikkatlice 15 kuyluğa sahip, 1,5 mm kalınlığında bir tarak yerleştirin. 1-2 dakika sonra, boşlukları doldurun, bu süreçte baloncuk oluşumunu en aza indirin. Tam polimerize bir jel kullanın.
  3. Protein jel elektroforezi
    1. Çalışan Buffer ve Transfer Buffer'ı önceden yapılandırın, Transfer Buffer ise 4 °C bir buzdolabında önceden soğutulmuş olur.
    2. Protein jelini ultra saf suyla durulayın, temiz bir elektroforez tankı çıkarın, protein jelinin iki kısa plakasını içe ve karşı karşıya sıkıştırın, Running Buffer'ı doldurun ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
    3. Tarağı dikkatlice çıkarın, her kuyu başına 10 μL yükleyin ve toplamda 4 örnek grubu bulunuyor. Her jel için 3 örnek grubu yükleyin, her grup arasında 4 μL protein belirteciyle ayrılarak, toplamda 15 kuyu oluşun.
    4. Örnekler yüklendikten sonra, kalan tüm Çalışan Tamponu elektroforez tankına dökün, kapağını kapatın, voltajı 140 V'a ayarlayın ve 20 dakika boyunca sabit voltaj elektroforezi yapın.
    5. Protein bantları konsantrasyondan sonra ayırma jeline girdiğinde, sabit voltaj elektroforezi için voltajı 120 V'a ayarlayın. Bu süreçte, NC membranını Transfer Buffer'da bekletmek gerekir. Bromofenol mavisi numunenin jelin alt kenarına ulaştığını gösterdiğinde elektroforezi durdurun ve zar transferine hazırlanın.
    6. Bir köpük kutuyu yarı buzla doldurun, transfer kelepçesini, önceden soğuttulan Transfer Buffer'ı ve ıslatılmış NC membranını çıkarın. Transfer Buffer'ın yarısını düz kare bir kaba dök.
    7. Protein jelini çıkarın, ultra saf suyla iyice durulayın, siyah tarafı aşağıya, şeffaf tarafı ise yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Ortada bir katman sünger, bir katman filtre kağıdı, protein jeli, NC membran yerleştirin, ardından başka bir tabaka filtre kağıdı ve sünger koyun.
    8. Hava kabarcıklarını çıkarmak için bastıktan sonra, transfer kasetini kelepçe ile transfer tankına yerleştirin. Her iki protein jeli de tamamen yerleştirildikten sonra, tüm Transfer Buffer'ı transfer tankına dök, ardından soğutmak için iki buz paketi ekleyin ve kapağı kapatın.
    9. Transfer kasetini buzla çevreleyin ve 90 dakika boyunca sabit 120 V voltajda aktarın. Transfer süreci önemli bir ısı üretir, bu yüzden soğutma için bir buz banyosu gereklidir.
    10. NC membranını çıkarın, 20 mL Ponceau S boyama çözeltisine daldırın ve boyanın, işaretleyici boyutunu kalemle işaretleyin ve hedef proteinin boyutuna göre zarı kalemle kesin.
    11. Ponceau S boyama çözeltisini geri kazanın. Boyama çözeltisini PBS ile yıkayın ve NC membranını 20 mL bloklayıcı tampon ile inkübe edin, ardından oda sıcaklığında düşük hızda bir shaker üzerinde 1-2 saat bloklayın.
    12. Bloklayıcı çözeltiyi atın, zarı PBS ile renk giderici bir shaker üzerinde iki kez hızla durulayın ve bloklayıcı çözeltiyi iyice çıkarın, ardından her antikorun Western Blot kullanım oranlarına göre ilgili antikorları antikor kuluçka kutusundaki kutusuna ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
    13. Birincil antikorları ayrı ayrı elde edin ve -20 °C'de depolayın. Membranlar, primer antikorlar iyice giderilmesi için her biri 5 dakika süren bir renk giderici shaker'da TBST ile 4 kez hızlıca yıkandı. Sonra, 4 mL bloklayıcı tamponu ikincil antikorlarla ekleyin ve zarları oda sıcaklığında yavaş bir çalkalayıcıda 1 saat kuluçka edin.
    14. İkincil antikoru TBST tamponu ile dört kez 5 dakika boyunca yıkayın, ardından NC membranını tamamen nemlendirmek için PBS tamponuyla değiştirin.
    15. ECL kemilyüminsans reaktif kullanım kılavuzuna göre, lüminesans çözeltiyi hazırlayıp membran yüzeyine bırakın, ardından 1-2 dakika kuluçka yapın ve ardından jel görüntüleme sistemiyle geliştirin.
    16. Ham verileri Image J görüntüleme sisteminde işleyin, ardından figür oluşturmak için Photoshop yazılımına aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ağ Farmakolojisi ve Moleküler Kenetlenme
CA'nın potansiyel hedeflerinin belirlenmesi: CA'nın farmakolojik aktivitesinin kapsamlı incelemesinde, ilgili literatürün kapsamlı bir incelemesinden titizlikle 60 potansiyel hedef seçildi. Analizin kapsamını daha da genişletmek için, TCMSP veritabanı aracılığıyla CA ile ilişkili ek 12 potansiyel hedef belirlendi. Gelişmiş doğruluk ve detay için, SwissTargetPrediction platformunun gelişmiş tahmin yetenekleri kullanıldı ve böyle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Feroptoz, yakın zamanda tanımlanmış bir hücre ölümü yöntemi olup, aşırı hücre içi demir birikimi ve lipid peroksidasyonu ile karakterize edilir. Morfolojik olarak, ferroptoz mitokondriyal küçülme, krista yapılarının kaybı veya azalması ve artan zar yoğunluğu ile ortaya çıkar; hücre zarı ve nükleer morfolojisi ise etkilenmedenkalır 26. Mekanik olarak, ferroptoz glutatyon (GSH) tükenmesi ve GPX4 aktivitesinin bozulmasıyla tetiklenir; bu da GPX4 katalize edilmiş glut...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklanacak finansal çıkar çatışması yoktur

Teşekkürler

Bu sonuçları elde etmemizi sağlayan hastane ve bölümlerinin sunduğu üstün koşullar için içten minnettarlığımızı sunuyoruz. Aynı zamanda, yıllar boyunca yorulmak bilmeyen çabaları ve değerli katkıları için laboratuvarın birçok üyesine içten teşekkürlerimizi sunuyoruz. Her katılımcının sıkı çalışması başarımızın vazgeçilmez bir parçasıdır ve gelecekte tıp alanında ilerlemeyi ilerletmek için birlikte çalışmaya devam edeceğiz. Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82104838), Çin Tanıtım Vakfı Kıvılcım Programı (XH-D001), Liaoning Eyalet Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (2024JH2/102500062) ve Liaoning Eyalet Doğa Bilimleri Vakfı (2025-MSLH-490).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  GlisinBiofroxx1275KG001
  Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0.5  M  Tris-HCl tamponu (pH  6.8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7.5)BeyotimeST775
1.5  M  Tris-HCl tamponu (pH  8.8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Temel elektroforez güç kaynağıBIO-RAD PowerPac Basic
BCA Protein Nicelik KitiBeyotimeP0012
Beta Aktin Rekombinant AntikorHuabio81115-1-RR
Karbondioksit kuluçka makinesiTermo150L
CCK-8 test kitiApexbioK1018
Hücre Aktivitesi ve Sitotoksisite Test KitiBeyotimeC2015M
Sinnamaldehit (CA)MacklinC805134Saflık %98
Renk giderme shakerKylin-BellTS-100
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Dorsal kök gangliyonu (DRG)Fuheng BiyografisiFH165Seri numarası: 20211227-1
DRG tam ortamFuheng BiyografisiFH-DRG
ECL lüminesans çözeltisiTermo34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fetal  Sığır  SerumMacklinFO193
Demir iyon tespit probu - FerroOrangeDojindoF374
FTH1Hücre Sinyal Teknolojisi4393S1:1000
Jel görüntüleme sistemiBIO-RAD ChemiDoc Touch
Hanks'in Dengeli Tuz Çözümü (HBSS)SolarbioH1025
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjEppendorf5804R
Hoechst 33342 Canlı Hücre Boyanma ÇözeltisiBeyotimeC1028
İmmünohistokimya kitiBiosharpBS-24-PB
Ters floresans mikroskop sistemiLeicaLeica DMI 8
JAK2 Rekombinant Tavşan Monoklonal Antikor [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Laboratuvar ters faz kontrast mikroskobuLeicaLeica Dmi 1
Düşük hızlı santrifüjEppendorf5804
MDA İçerik Tespit KitiSangonD799762
Microplate okuyucuSUNRISE TECAN
Çok fonksiyonlu mikroplaka okuyucuBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-Κ B p65 Poliklonal antikorProteintech10745-1-AP1:1000
ParaformaldehitMacklinP804536
Ponceau boyama çözeltisiBeyotimeP0022
Protein BelirteciTermo26617
P-STAT3 (Ser727)Hücre Sinyal Teknolojisi9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Hücre Sinyal Teknolojisi9145S1:2000
Rekombinant Anti-Glutatyon Peroksidaz 4 Antikor[EPNCIR144]abcamAB1250661:1000
Rekombinant Anti-XCT antikor[EPR27115-64]abcamAB3076011:1000
ROS Test KitiDojindoR252
SDS-PAGE Protein Yükleme Tamponu (6X)BeyotimeP0289
Yağsız süt tozuBiosharpBS102-500g
Sodyum dodesil sülfat SDSBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSC-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000.5 & mikro; g/mL
Tween80SelleckS6702
Ultra temiz çalışma tezgahıHDLDL-CJ-2NDI
Dik mikroskopOlympusCX 31
Dikey elektroforezBIO-RAD Mini Protean Tetra
Islak transfer tankıBIO-RAD Mini Trans Blot
α-Tubulinα-TubulinER130905
GraphPad Prizmasıİstatistiksel analiz
ImageJ yazılımıProtein blot'un gri değerini elde edin

Kaynaklar

  1. Dolma, S., Lessnick, S. L., Hahn, W. C., Stockwell, B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 3 (3), 285-296 (2003).
  2. Ye, L. F., et al. Radiation-induced lipid peroxidation triggers ferroptosis and synergizes with ferroptosis inducers. ACS Chem Biol. 15 (2), 469-484 (2020).
  3. Huang, L., Bian, M., Zhang, J., Jiang, L. Iron metabolism and ferroptosis in peripheral nerve injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 5918218(2022).
  4. Hao, D., et al. Supercritical fluid extract of Angelica sinensis promotes the anti-colorectal cancer effect of oxaliplatin. Front Pharmacol. 13, 1007623(2022).
  5. Binder, A., et al. Pain in oxaliplatin-induced neuropathy: sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur J Cancer. 43 (18), 2658-2663 (2007).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Dorri, M., Hashemitabar, S., Hosseinzadeh, H. Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) as an antidote or a protective agent against natural or chemical toxicities: a review. Drug Chem Toxicol. 41 (3), 338-351 (2018).
  8. Hajimonfarednejad, M., et al. Cinnamon: a systematic review of adverse events. Clin Nutr. 38 (2), 594-602 (2019).
  9. Zaio, Y. P., et al. Cinnamaldehyde and related phenylpropanoids, natural repellents, and insecticides against Sitophilus zeamais (Motsch.): a chemical structure-bioactivity relationship. J Sci Food Agric. 98 (15), 5822-5831 (2018).
  10. Thirapanmethee, K., et al. Cinnamaldehyde: a plant-derived antimicrobial for overcoming multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection. Eur J Integr Med. 48, 101376(2021).
  11. Bi, Z., et al. Improvement of mould resistance of wood with cinnamaldehyde chitosan emulsion. Wood Sci Technol. 56 (1), 187-204 (2022).
  12. Qureshi, K. A., et al. Cinnamaldehyde-based self-nanoemulsion (CA-SNEDDS) accelerates wound healing and exerts antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory effects in rats' skin burn model. Molecules. 27 (16), 5225(2022).
  13. Safaei, F., Tamaddonfard, E., Nafisi, S., Imani, M. Effects of intraperitoneal and intracerebroventricular injection of cinnamaldehyde and yohimbine on blood glucose and serum insulin concentrations in ketamine-xylazine-induced acute hyperglycemia. Vet Res Forum. 12 (2), 149-156 (2021).
  14. Al Tbakhi, B., et al. Cinnamaldehyde-cucurbituril complex: investigation of loading efficiency and its role in enhancing cinnamaldehyde in vitro anti-tumor activity. RSC Adv. 12 (12), 7540-7549 (2022).
  15. Zhu, R., et al. Cinnamaldehyde in diabetes: a review of pharmacology, pharmacokinetics and safety. Pharmacol Res. 122, 78-89 (2017).
  16. Yang, D., et al. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of cinnamaldehyde on protecting high glucose-induced damage in cultured dorsal root ganglion neurons of rats. Chin J Integr Med. 22 (1), 19-27 (2016).
  17. Malemud, C. J. Negative regulators of JAK/STAT signaling in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 18 (3), 484(2017).
  18. Zhang, Q., et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 34, 43-63 (2021).
  19. Bagheri-Mohammadi, S., Askari, S., Alani, B., Moosavi, M., Ghasemi, R. Cinnamaldehyde regulates insulin and caspase-3 signaling pathways in the sporadic Alzheimer's disease model: involvement of hippocampal function via IRS-1, Akt, and GSK-3β phosphorylation. J Mol Neurosci. 72 (11), 2273-2291 (2022).
  20. Fu, Y., et al. Trans-cinnamaldehyde inhibits microglial activation and improves neuronal survival against neuroinflammation in BV2 microglial cells with lipopolysaccharide stimulation. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4730878(2017).
  21. Guo, B., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway with natural plants and phytochemical ingredients: a novel therapeutic method for combatting cardiovascular diseases. Biomed Pharmacother. 172, 116313(2024).
  22. Gao, Y., et al. Modified Erchen decoction ameliorates cognitive dysfunction in vascular dementia rats via inhibiting JAK2/STAT3 and JNK/BAX signaling pathways. Phytomedicine. 114, 154797(2023).
  23. Hu, Q. P., et al. Genistein protects epilepsy-induced brain injury through regulating the JAK2/STAT3 and KEAP1/NRF2 signaling pathways in developing rats. Eur J Pharmacol. 912. 912, 174620(2021).
  24. Kang, L., Tian, Y., Xu, S., Chen, H. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment. J Neurol. 268 (9), 3269-3282 (2021).
  25. Brayton, C. F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. 76 (1), 61-90 (1986).
  26. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (3), 234-245 (2008).
  27. Xiao, Z., La Fontaine, S., Bush, A. I., Wedd, A. G. Molecular mechanisms of glutaredoxin enzymes: versatile hubs for thiol-disulfide exchange between protein thiols and glutathione. J Mol Biol. 431 (2), 158-177 (2019).
  28. Georgiadis, M. M., et al. Small-molecule activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 reduces DNA damage induced by cisplatin in cultured sensory neurons. DNA Repair (Amst). 41, 32-41 (2016).
  29. Wei, G., et al. Platinum accumulation in oxaliplatin-induced peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 26 (1), 35-42 (2021).
  30. Maung, K., Chu, E., Rothenberg, M. Oxaliplatin combinations as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2 (2), 78-80 (2002).
  31. Egashira, N., et al. Mexiletine reverses oxaliplatin-induced neuropathic pain in rats. J Pharmacol Sci. 112 (4), 473-476 (2010).
  32. Lainez, S., Tsantoulas, C., Biel, M., McNaughton, P. A. HCN3 ion channels: roles in sensory neuronal excitability and pain. J Physiol. 597 (17), 4661-4675 (2019).
  33. Siau, C., Bennett, G. J. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in chemotherapy-evoked painful peripheral neuropathy. Anesth Analg. 102 (5), 1485-1490 (2006).
  34. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci Lett. 458 (2), 93-95 (2009).
  35. Carozzi, V. A., Canta, A., Chiorazzi, A. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: what do we know about mechanisms. Neurosci Lett. 596, 90-107 (2015).
  36. Di Cesare Mannelli, L., et al. Glial role in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Exp Neurol. 261, 22-33 (2014).
  37. Ta, L. E., Espeset, L., Podratz, J., Windebank, A. J. Neurotoxicity of oxaliplatin and cisplatin for dorsal root ganglion neurons correlates with platinum-DNA binding. Neurotoxicology. 27 (6), 992-1002 (2006).
  38. Bobylev, I., Joshi, A. R., Barham, M., Neiss, W. F., Lehmann, H. C. Depletion of mitofusin-2 causes mitochondrial damage in cisplatin-induced neuropathy. Mol Neurobiol. 55 (2), 1227-1235 (2018).
  39. Nassini, R., et al. Oxaliplatin elicits mechanical and cold allodynia in rodents via TRPA1 receptor stimulation. Pain. 152 (7), 1621-1631 (2011).
  40. Lee, J. H., Kim, W. The role of satellite glial cells, astrocytes, and microglia in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Biomedicines. 8 (9), 324(2020).
  41. Makker, P. G., et al. Characterisation of immune and neuroinflammatory changes associated with chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 12 (1), e0170814(2017).
  42. Holmes, J., et al. Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, cisplatin, and ormaplatin in a Wistar rat model. Toxicol Sci. 46 (2), 342-351 (1998).
  43. Podratz, J. L., et al. Cisplatin-induced mitochondrial DNA damage in dorsal root ganglion neurons. Neurobiol Dis. 41 (3), 661-668 (2011).
  44. Trecarichi, A., et al. Preclinical evidence for mitochondrial DNA as a potential blood biomarker for chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 17 (1), e0262544(2022).
  45. Mao, Y. F., et al. Edaravone, a free radical scavenger, is effective on neuropathic pain in rats. Brain Res. 1248, 68-75 (2009).
  46. Kim, H. K., Zhang, Y. P., Gwak, Y. S., Abdi, S. Phenyl N-tert-butylnitrone, a free radical scavenger, reduces mechanical allodynia in chemotherapy-induced neuropathic pain in rats. Anesthesiology. 112 (2), 432-439 (2010).
  47. Han, R., Li, X., Gao, X., Lv, G. C. Cinnamaldehyde: pharmacokinetics, anticancer properties and therapeutic potential. Mol Med Rep. 30 (3), 163(2024).
  48. Liao, J. C., et al. Anti-inflammatory activities of Cinnamomum cassia constituents in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012, 429320(2012).
  49. Liu, P., et al. Cinnamaldehyde suppresses NLRP3-derived IL-1β via activating succinate/HIF-1 in rheumatoid arthritis rats. Int Immunopharmacol. 84, 106570(2020).
  50. Li, X., Wang, Y. Cinnamaldehyde attenuates the progression of rheumatoid arthritis through down-regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Inflammation. 43 (5), 1729-1741 (2020).
  51. Dai, X. Y., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway for chronic pain. Aging Dis. 15 (1), 186-200 (2024).
  52. Reddy, A. M., et al. Cinnamaldehyde and 2-methoxycinnamaldehyde as NF-κB inhibitors from Cinnamomum cassia. Planta Med. 70 (9), 823-827 (2004).
  53. Youn, H. S., et al. Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligomerization. Biochem Pharmacol. 75 (2), 494-502 (2008).
  54. Chen, X., Kang, R., Kroemer, G., Tang, D. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 218 (6), e20210518(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sinnamaldehit NöroproteksiyonuOksaliplatin NörotoksisitesiDorsal Kök GanglionuFerroptozis YolağıJAK2 STAT3 Sinyal iletimiGPX4 EkspresyonuLipid Peroksidasyon AnaliziReaktif Oksijen TürleriProtein Ekspresyon Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.