REM Unutma için Seçici Burun Sallaması (SNiFFer) kullanılarak Seçici REM Uyku Yoksunluğu Yöntemi

Summary

Kemirgenlerde Hızlı Göz Hareketi (REM) uykusunun seçici yoksunluğu için yeni bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Uyku, genel olarak Hızlı Göz Hareketi (REM) ve REM dışı evrelere ayrılır ve işlevlerini incelemek için çeşitli uyku yoksunluğu teknikleri geliştirilmiştir. Mekanik uyarım veya hayvanı REM uykusu sırasında bırakmak gibi geleneksel yöntemler genellikle hızlı alışkanlık ve istenmeyen stres etkilerine yol açar, bu da yorumlamayı zorlaştırır. Burada, kemirgenlerde REM uyku yoksunluğu için yeni, hafif ve nazik bir yöntem sunuyoruz: SNiFFer. Kemirgenlerin burun uyaranlarına karşı son derece hassas olduğu bilinir. Bu yöntemde, REM uykusu sırasında yumuşak bir fırça hayvanın burnunu nazikçe okşar ve bu da uyarılmayı güvenilir şekilde tetikler. Bu tekniği REM uykusu sırasında seçici olarak uygulamak için, yapay zeka tabanlı gerçek zamanlı Elektroensefalografi (EEG) uyku evresi sınıflandırma sistemi kullandık. Müdahale yalnızca REM ataklarında tetiklendi ve uyku durumu ne olursa olsun aynı uyarı desenini alan bir kontrol grubu dahil edildi. Ayrıca, öğrenmeden sonraki 6 saat içinde REM uyku yoksunluğunun hafıza konsolidasyonuna müdahale edip etmediğini test etmek için SNiFFer'i İz Korku Koşullandırma paradigmasında uyguladık. Yok bağlanmış kontrol gruplarına kıyasla, SNiFFer ile tedavi edilen hayvanlarda toplam REM epizon ve REM epiz süresinde anlamlı bir azalma görüldü; bu da yöntemin özgüllüğünü ve etkinliğini gösteriyor. Sonuç olarak, SNiFFer tekniği farelerde REM uyku yoksunluğu için son derece seçici, minimal invaziv dokunsal bir yaklaşım sunar. Deneysel koşulların hassas kontrolünü sağlar ve REM uykusunun hafıza ve bilişsel rolünü araştırmak için yeni olanaklar açar—gıdıklayıcı bir dokunuşla.

Introduction

Hızlı göz hareketi (REM) uykusu, hafıza konsolidasyonu gibi bilişsel^{süreçlerde kritik bir rol oynar 1,2}. Beyinde REM uykusunun işlevsel önemini araştırmak için REM uyku yoksunluğu deneysel bir yaklaşım olarak yaygın olarak kullanılır. Şu anda, kemirgenlerde REM uyku yoksunluğunu tetiklemek için yaygın olarak dört ana yöntem kullanılmaktadır: döner disk^{yöntemi 1}, çiçek saksı^{yöntemi 3}, hava puff^{yöntemi 4} ve fiziksel uyarım^{teknikleri 5,6}. Döner disk ve saksı yöntemleri REM uykusunu ortadan kaldırmada son derece etkili olsa da, hayvana genellikle suya maruz kalma veya fiziksel yorgunluk gibi ciddi stres getirir^ve bu da davranışsal ve fizyolojik sonuçların yorumlanmasını karıştırabilir. Benzer şekilde, hava puffu ve geleneksel fiziksel uyarım yöntemleri vücuda geniş, spesifik olmayan uyaranlar verme eğiliminde, uyaran yoğunluğunda değişkenlik ve kontrol gruplarının sınırlı seçimi^{ile sonuçlanır 4,8}.

Ek Dosya 1 ve Ek Tablo 1'de sunulan altmış yılı aşkın REM uyku yoksunluğu araştırmasını kapsayan kapsamlı bir literatür karşılaştırması yaptık. Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen ve Borbély gibi ana araştırma alanlarından temel tarihsel, mekanik, nörokimyasal, hormonal ve davranışsal çalışmaları birleştirdik. Ek Tablo 1 , önemli makaleleri kronolojik olarak düzenler. REM uyku yoksunluğu tekniklerinin metodolojik evrimini izler ve başlıca biyolojik, nörokimyasal, hormonal, bağışıklık, termoregülatif ve davranışsal bulgularını özetler. Mevcut el yazması, kapsamlı bir tarihsel inceleme yerine bir yöntem makalesi olarak yapılandırıldığından, bu da ek bilgi olarak eklenmiştir.

Bu sınırlamaları gidermek için, REM uyku yoksunluğu için yüksek seçicilik sunan yeni bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, kemirgenleri REM uykusundan kesin ve kontrollü şekilde seçici olarak mahrum bırakmak için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımda, uyaranı hayvanın burnuyla sınırlıyoruz—kemirgenlerin^{en hassas bölgelerinden biri 9}. Ayrıca, zaman özgüllüğü¹⁰ ile REM uyku ataklarını tespit etmek ve kesmek için yapay zeka tarafından gerçek zamanlı uyku aşaması sınıflandırma sistemi kullanıyoruz. Bu yapay zeka sistemi, tek bir kanaldan son 4 saniyelik dönemdeki EEG sinyalini ifade eder ve mevcut fare uyku evrelerini değerlendirir. Bu düzen ayrıca boyunduruk kontrol gruplarının uygulanmasını sağlar ve böylece zamansal olarak eşleştirilmiş müdahale sağlanır. Fiziksel uyarım temelli bir REM uyku yoksunluğu tekniği olarak kategorize edilmesine rağmen, protokolümüz geleneksel yöntemlerden farklıdır. İlk olarak, doğru ve tutarlı REM spesifik müdahale için yapay zeka kullanarak gerçek zamanlı uyku aşaması analizi uyguladık. İkincisi, uyarım bölgesini sadece burnun üst kısmıyla sınırlar; bu da^{farelerde en hassas alanlardan biridir 6}, bu da uyarılma süresi ve gücünde minimum değişiklik sağlar. Son olarak, karıştırıcı faktörleri kontrol etmek için aynı miktarda uyarım alan yeni bir kontrol grubu kurduk. Bu protokol, REM uykusuna özgü fonksiyonların araştırılması için bir yöntem önerir.

Bu yöntemin faydasını değerlendirmek için, REM uykusunun iz korkusu hafıza konsolidasyonundaki rolünü incelemek için uyguladık. Önceki çalışmalar, REM uyku yoksunluğunun, hipokampusa bağlı korku hafıza konsolidasyonunu bozduğunu ve gecikmeli korku anılarını da içeren ^11,12 olduğunu bildirmiştir^. Ancak, REM uyku eksikliğinin, dağınık ve karmaşık beyin devrelerini ele geçiren hafıza süreçleri üzerindeki etkisiyle ilgili çelişkili^{kanıtlar vardır 5,13}. İz korkusu hafıza konsolidasyonu, bir ayak şoku (koşulsuz uyaran), işitsel bir işaret (koşullu uyaran) ve aralarındaki iz aralığının ilişkilendirilmesini gerektirir—bu süreç, hipokampus, medial prefrontal korteks ve amigdala¹⁴ dahil olmak üzere birden fazla beyin bölgesini işe aldığı bilinir. Bu nedenle, iz korkusu^{koşullandırma 15'in} hemen ardından fareleri 6 saat boyunca REM uykusundan mahrum bıraktık; bu, hafıza konsolidasyonu 16 için kritik olduğu bilinen bir zaman^{aralığıdır.} Bu protokolü kullanarak, REM uyku yoksunluğunun, dağıtık sinir sistemlerinin koordineli aktivitesine bağlı hafıza izlerinin konsolidasyonu üzerindeki etkisini değerlendirdik. Bu makale, etkileri test eden ayrıntılı bir deneysel protokolü tanımlayan yeni bir yöntem sunmaktadır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Tsukuba Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada erkek ve dişi C57BL/6J fareleri (11–13 haftalık, 20–35 g) kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan malzeme ve aletlerin tam listesi Materyaller Tablosu'nda sunulmaktadır.

1. EEG elektrotlarının cerrahi implantasyonu¹⁷

1. Anestezi ve hayvanın hazırlanması
   1. 3 dakika içinde %4 isofluran ile hava karışımı ile anestezi başlatın. Pedal çekilme refleksi ve kas tonusunun olmaması ile dengeli solunum düzenleri ile yeterli anestezi doğrulandı.
   2. Sırt baş ve boyun bölgesini, enseden gözlerin arasındaki bölgeye kadar elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin. Bir fare bıyık hareketi gibi uyanıklık gösterdiğinde, tekrar anestezi yapın.
2. Baş sabitleme ve kafatası açısı
   1. Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin, burun ve kafatasındaki hizalanmayı garanti edin. Bu dönemden tüm cerrahi işlemin sonuna kadar, anestezi izofloran buharlaştırıcı pompa sistemi aracılığıyla sürekli olarak sürdürüldü.
   2. Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze oftalmik merhem uygulayın. Kalan tüyleri depilyatif kremle temizleyin.
   3. Orta hat saç derisi kesisi yapın ve cildi nazikçe geri çekerek kafatasını arka kulak hattından ön göz hattına kadar açığa çıkarın. Mukoza dokusunu pamuk çubukla çıkarın.
3. Simge yapı tanımlama ve düzleştirme
   1. Bregma ve lambda tanımlayın; Stereotaksik kolu bu noktaların ±0,05 mm içinde düz olması için ayarlayın. Bregma'dan ±3,0 mm uzaklıktaki yan koordinatların da düz olduğunu (±0,05 mm) doğrulayın.
4. Delme ve vida yerleştirme
   1. Bregma ile ilgili aşağıdaki koordinatları işaretleyin. Bu koordinatlar olarak dört pilot deliği aç. Ön–Arka / Medial–Yan: +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
   2. Her deliğe EEG kayıt vidaları implant edilir ve siyanoakrilat bazlı jel yapıştırıcı ile sabitlenir. Açıkta kalan kafatası ve başlığı ince bir diş çimentosu tabakasıyla paketleyin ve örtün.
5. Ameliyat sonrası bakım
   1. 0,5 mL %5 glikoz çözeltisi ve 0,13 mL ibuprofen (veya eşdeğer analjezik) verin.
   2. Fareyi ev kafesine geri döndürün; bu kafese (çapı 21,9 cm, yüksekliği 31,6 cm) ve yalıtımlı bir odaya yerleştirilmiş (45,7 x 50,8 x 85,4 cm) bir hücreye yerleştirilir. Oda, 23,5 ± 2,0 °C sıcaklıkta, %50,0 ± %10,0 arasında göreli nem ve 12 saat ışık/karanlık döngüsünde (ışık fazı: 09:00 - 21:00) tutulur.
   3. Hayvanı ısıtılmış bir kurtarma kafesine yerleştirin. Kafesin önünde bir fare uyanana kadar bekle. Ameliyattan sonra, hayvanlar bireysel barınakta tutuldu ve deney süresince grup konusuna geri gönderilmedi.

2. Kullanım ve alışkanlık

1. Deney Programı
   1. Ameliyattan 24–48 saat sonra hafif faz aşamasında işlemeye başlayın. Dört gün ardışık devam et.
2. Ameliyat prosedürü
   1. 1. gün, 2 kat için 2 dakika boyunca bir fare bulundurun. Faresi, deneyciyi deneycinin açık avucuna, parmaklarını açacak şekilde ve avuç içi yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Avuç içi ön koldan biraz daha yukarı konumlandırın, çünkü fareler doğal olarak yüksek yüzeylere tırmanma eğilimindedir. Fareşin özgürce hareket etmesine izin verin; Fare ön kola tırmanmaya çalışırsa, kuyruğun tabanını hafifçe tutarak onu nazikçe avuca geri getirin. Her aralık 20 dakikadan fazladır. Bu işlem ışık fazında yapılmalıdır.
      NOT: Bir fare elden atlarsa veya ısırırsa, elinizi sadece ilk gün bez veya mendil kağıdıyla kapatın. Kıyafetler tekrar kullanılabilir ve her 2 haftada bir temizlenmelidir.
   2. 2–4. günlerde, 3 kez 2 dakika boyunca bir fare bulundurun. Her aralık ve yapılan dönem 1. günle aynıdır. Alışkanlığı davranışsal olarak değerlendirin: alışkanlık yaşamayan fareler genellikle zıplayarak veya zorla ısırarak kaçmaya çalışırken, alışkanlık haline gelmiş fareler avucunu aktif olarak keşfeder; kaçış girişimleri az ve neredeyse hiç güçlü ısırmalarla yapılır.
   3. Son işlem seansının sonunda, fareyi EEG kayıt kablosuna bağlayın.
      NOT: Yatak malzemesi farenin burnunu engelleyecek kadar fazlaysa, bazılarını manuel olarak alıp işlem sırasında veya bağlantı sırasında çıkarın.

3. Temel EEG kaydı

1. Ameliyat sonrası 5. ve 6. günlerden başla. Her gün 11:00'dan 17:00'e kadar sürekli EEG kaydedin. Yatak malzemesi farenin burnuna erişimi engelliyorsa, fazladan yatak örtülerini kademeli olarak çıkararak burun erişiminin net olmasını sağlarken hayvanın daha fazla işlem için en aza zararını en aza indirin.

4. Korku^{koşullandırma 18,19}

1. Ameliyat sonrası 7. (veya 8) gün 10:00 ile 11:00 arasında başlayın. Hazırlık olarak, %70 etanol, şeffaf akrilik duvarlar ve paslanmaz çelik ızgara zeminden (2,0 mm çapında çubuklar 6,0 mm aralıklı olarak yerleştirilmiş) olan koşma odasına (30 x 25 x 24 cm) püskürtün.
2. Eğitim protokolü (toplam oturum 1.100 saniye)
   1. 180 s, 400s, 620s, 840s ve 1060 s. frekanslarda beş işitsel işaret (20 saniye yükselen ses, 5–20 kHz 1.25 Hz, 0.8 saniye süre) sun. Her ses işaretini ayak şoku (1.0 mA, 2 s) ile eşleştirin; bu frekanslar 218 s, 438 s, 658 s, 878 s ve 1098 saniye hızlarda verilir.

5. REM uyku eksikliği

1. REM uyku yoksunluğu grubu (RSD grubu)
   1. Korku koşullandırmasının hemen ardından (ZT2-ZT8), REM uykusunun gerçek zamanlı tespitini sağlamak için yapay zeka tabanlı uyku aşaması sınıflandırma sistemini etkinleştirerek EEG'yi gerçek zamanlı izleyin. REM uykusu tespit edildiğinde, hayvanın burnunu yumuşak bir fırçayla nazikçe gıdıklayın; uyarılmaya kadar ortalama gecikme 0,89 ± 0,063 saniye (ortalama ± SEM) olur.
   2. Deney sırasında, uyarılma, özellikle uyarı sonrası bıyık hareketi olmak üzere dokunsal uyarana karşı davranışsal bir tepki olarak tanımlandı. Her gıdıklamanın zaman damgasını daha sonra analiz için kaydedin.
      NOT: Gıdıklama hareketi, sabit bir yön deseni olmadan (örneğin, ileri geri yukarı veya dairesel) yapıldı ve burun üstüyle sınırlı tutarlı hafif dokunsal uyarım korundu. Burun tıkanmışsa, uyarıyı genellikle açıkta olan vibrissal (bıyık) bölgesine yönlendirir. Fare fırçadan uzakta dönüyorsa, kafesi gerektiği gibi döndürerek burun bölgesine engelsiz erişim sağlansın. Üstü açık kafes kullanıldığında, burun veya vibrissal erişimin tutarlı olmasını sağlamak için yukarıdan uyarım uygulanabilir.
2. Yoked kontrol grubu (Yoked grup)
   1. Her boyunduruk fareyi REM yoksunluğu olmayan bir fareyle eşleştirin. Burun gıdıklama, partnerinin REM ataklarıyla eş zamanlı olarak uygulan, başlangıç ve süreyi eşleştir. Her fare, REM uyku yoksunluğu deneyi boyunca aynı özel fırçayı kullanır. Her kullanımdan sonra fırçaya zayıf asidik su sprey ve mendil ile silin. Temizlenmiş fırçanın tamamen kuru olduğundan emin olmak için kullanımlar arasında en az 24 saat ara verin.

6. Hafıza hatırlama testleri

1. Bağlamsal hatırlama testi (Test A)
   1. Uykusuzluktan sonra 24 saat (±3 saat) ile başlayın. Fareyi orijinal kondisyon odasına (%70 etanol kokusu olan) geri döndürün. 5 dakika boyunca donma davranışını kaydettim.
2. Sesli çağrılı geri çağırma testi (Test B)
   1. Oturumu Test A'dan 3 saat sonra gerçekleştirin.
   2. Bağlam hazırlığı: B bağlamında (üçgen prizma (30 cm yüksekliğinde), yan uzunlukları 31 cm, 24 cm ve 24 cm olan üç duvardan oluşan su püskürtün. Duvarlardan ikisi beyaz kağıtla kaplıdır, üçüncü duvar ise şeffaf akrilikten yapılmıştır ve arka planda mavi bir dikdörtgen görünür. Yapının zemini plastik ve şeffaf akrilik tavanı vardır).
   3. 6 dakika boyunca donma davranışını kaydedin. 180 saniyede antrenmanla aynı şekilde tek bir 180 saniyelik işitsel işaret ver.

7. Veri analizi

1. Uyku Evresi Puanlaması (Şekil 1C-G)¹⁷
   1. Her Wake/NREM/REM için, insan uzmanlarının puanladığı verilere dayanarak toplam miktar, bölüm sayısı, bölüm ortalama süresi ve uyku geçiş sayısını hesaplayın. Her aşamanın kriterleri bir takip eder.
      Wake: Düşük genlikli, yüksek frekanslı (β/γ)
      NREM: Yüksek genlikli, düşük frekanslı (δ)
      REM: Düşük genlikli, theta-dominant
2. Yoksunluk kalitesi (Şekil 1B)
   1. Her gıdıklama uyarıcısının uygulandığı uyku aşamasını, zaman damgasını bir insan uzmanı tarafından notlanmış EEG verileriyle karşılaştırarak değerlendirin.
3. Donma davranışı (Şekil 1H, J-K)
   1. Korku koşullandırma ve hatırlama testleri sırasında hareketsizliği (solunum hariç) ölçmek için FreezeFrame4 (Aktimetrik) kullanın.
      1. FreezeFrame 4 yazılımını başlatın ve Kaydedici modunu seçin. Dosya menüsünden (sol üst köşe), kayıt dosyalarını kaydetmek için hedef klasörü belirleyin. Sol paneldeki dört beyaz giriş alanında, her fareye karşılık gelen benzersiz tanımlayıcıları girerek ekranın sağ tarafındaki dört dosya görüntüleme penceresiyle hizalanmayı sağlar.
      2. Arayüzün altındaki Protokol paneline tıklayın ve toplam kayıt süresi ile işitsel işaretler ile ayak şoklarının zamanlaması dahil olmak üzere kayıt parametrelerini tanımlayın.
      3. Arka plan referans görselini elde etmek için ekranın ortasındaki Referans'a tıklayın. Fareyi koşullandırma odasına yerleştirin, sonra kayda başlamak için Başlat'a tıklayın.
4. Ayrımcılık endeksi analizi (Şekil 1L)
   1. Aşağıdaki formülle ayrımcılık indeksi hesaplanın:
      Test A'da ortalama 5 dakikada donma - test B'de ilk 3 dakikada donma) / test A'da maksimum donma 5 dakika ortalamada, test B'de ilk 3 dakika ortalamada donma.
5. Şok reaktivite indeksi analizi (Şekil 1I)
   1. Korku koşullandırma seansında şok başlangıç noktasından önce ve sonra hayvan 2'lerin iki boyutlu hareketini ölçmek için elle takip kullanın. Şok reaktivite indeksini aşağıdaki formülle hesaplayın:
      Şok sırasında hareket - hareket preşoku / şok sırasında hareket + hareket preşok

Results

EEG elektrotlarının cerrahi implantasyonu
Ameliyat sırasında fareler tamamen anestezi edilmelidir. Eğer anestezi eksikliği belirtileri gösterirse, örneğin zorlanma gibi, protokolden çıkarılmalıdır. Benzer şekilde, kanama 10 saniyeden fazla sürerse, farenin beyninde ciddi hasar verebilir ve deneylerden uzaklaştırılması önerilir. Ameliyattan sonra, çoğu fare genellikle 1 saat içinde uyanır. Yürüyüş ve göz hareketleri, ameliyat öncesi koşullara benzer şekilde normale dön...

Discussion

Bu protokol, kontrol fareleri boyunduruk olan farelerde seçici REM uyku yoksunluğunu sağlar. Çiçek saksı ve döner disk teknikleri gibi geleneksel yöntemlerin aksine, bu sistem hayvanların aynı sirkadiyen zamanda aynı uyarımı aldığı ince eşleşmiş kontrol gruplarının uygulanmasına olanak tanır. Ayrıca, bu yaklaşım, geleneksel nazik taşıma ve hava üfleme yöntemlerinin yaygın bir sınırlaması olan uyarım konumundaki değişkenliği en aza indirir. Sonuç olarak, bu teknik REM uyku fonksiyonunun d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
%5 glukoz	Otsukba	35061410
6 pinli başlık	Hirose	172-0989
Yapıştırıcı	Konishi	16351
Anestezi makinesi	Shinano Seisakusho	SN-487-0T
Sıkma yuvası	Hirose	688-9095
Sıkma soketi	Hirose	688-8982
Freezeflame4	Med Associates	RRID:SCR_014429	Sürüm 4.104
GraphPad Prizması	GraphPad	RRID:SCR_002798	Sürüm 10.5.0
İbuprofen	Tokyo Kimya Endüstrisi	I0415
İzofluran	Viatris	901036504
Loctite454	Henkel	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Fare (C57BL/6J)	Jackson Laboratuvarı	RRID: IMSR_JAX:000664	11.0 - 13.0 haftalık korku kondisyon seansında
Fırça	Namurataiseidou	4943668000448	SDflat No.8, Uç uzunluğu: 8.2 mm; Genişlik: 18,8 mm
Provinice sıvı	Shofu	21400BZZ00451000	250 mL
Provinice tozu	Shofu	21400BZZ00451000	250 g
SleepSignRecorder	KISSEI COMTEC	RRID:SCR_018200	Sürüm 1.2.10
Paslanmaz çelik vida	Yamazaki	Yok	φ 1.0 & Times; 2.0
Standart Stereotaksik Aletler	ALA Scientific	68038
Ayçiçeği yağı	Sigma-Aldrich	S5007-250ML
Beyaz petrolatum	Taiyo Pharmaceutical	K09-TS