Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

PAK5, transkriptomik profilleme ile ortaya çıkan özofagus skuamöz hücreli karsinomun ilerlemesini teşvik eder

349 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69085

⸱

16 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Center, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 2Department of Radiology, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 3Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, ESCC'de PAK5 fonksiyonunu değerlendirmek için bir yöntem sunmakta olup, aşırı ekspresyonunun kötü prognozu öngördüğünü ve PAK5-GAREM1 sinyal ekseni boyunca tümör ilerlemesini teşvik ettiğini göstermektedir.

Özet

Özofagus skuamöz hücreli karsinom (ESCC), özellikle Asya'da, küresel çapta kanserle ilişkili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Erken semptomların olmaması nedeniyle, çoğu hasta ileri evrelerde teşhis edilir, bu da tedavi etkinliğini sınırlar ve prognozu kötüleştirir. ESCC'nin altında yatan mekanizmaları anlamak ve biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri belirlemek, hasta sonuçlarını iyileştirmek için çok önemlidir. P21 ile aktive edilmiş protein kinaz 5 (PAK5), mitojenle aktive edilmiş protein kinaz ailesinin bir üyesi olup, hücre döngüsü, göçü ve istilayını düzenleyerek çeşitli malignitelerde rol oynamıştır. Ancak ESCC'deki rolü hâlâ belirsizdir. Bu çalışma, ESCC dokularında ve bitişik normal dokularda PAK5 ekspresyonunu immünohistokimya kullanarak değerlendirdi ve PAK5 ile prognoz arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için Kaplan-Meier sağlıklama analizi yaptı. PAK5 aşırı ekspresyonu ve knockdown ile ESCC hücre modelleri kuruldu ve CCK-8, koloni oluşumu ve Transwell testleri dahil fonksiyonel testler yapıldı. Ayrıca, mRNA dizileme işlemi PAK5 tarafından düzenlenen aşağı akış hedefleri ve sinyal yollarını belirlemek için gerçekleştirilmiştir. Bu sonuçlar, PAK5 ekspresyonunun ESCC dokularında normal dokulara kıyasla anlamlı şekilde yüksek olduğunu ve kötü prognozla ilişkili olduğunu gösterdi. Fonksiyonel testler, PAK5'in ESCC hücre çoğalması, koloni oluşumu, göç ve istilayı teşvik ettiğini, transkriptomik analizlerin ise GAREM1'in önemli bir sonraki efektör olduğunu ortaya koydu. Bu bulgular, PAK5'in ESCC ilerlemesine katkıda bulunduğunu ve prognostik bir biyobelirteç ve terapötik hedef olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.

Giriş

Küresel olarak, özofagus kanseri en ölümcül kanserler arasında yer alır. Çin'de, özofagus skuamöz hücreli karsinom (ESCC), baskın histolojik alt tipi temsil eder. Terapötik ilerlemeler elde edilmiş olsa da, ESCC hastalarının prognozu hâlâ kötü kalıyor ve 5 yıllık sağkım oranı sadece %10 ila %25 ile 1 arasında kendini gösteriyor. Bu büyük ölçüde erken teşhisin zorlukları ve etkili moleküler hedefli tedavilerin sınırlı erişimindenkaynaklanmaktadır 2. Hedefli tedavilerin önemli umut vaat ettiği diğer katı tümörlerin aksine, ESCC'de bu tür yaklaşımlar henüz emekte ve uygulanabilir moleküler hedeflerin kıtlığı nedeniyle engellenmektedir.

PAK5, grup II PAK, sitoskelet dinamiklerini ve hayatta kalma sinyalini entegre eder ve çeşitlimalignitelerde kemodirençle bağlantılıdır 3,4,5,6,7,8,9,10,11. ESCC biyolojisi ve terapiyanıtı 1,2,12'de MAPK sinyalizasyonunun belirgin rolü göz önüne alındığında, PAK5'in ESCC'de yükseltilmiş ve MAPK sinyalizasyonunun modülasyonu yoluyla kötü huylu fenotipleri teşvik ettiği ve GAREM1'in adaptör/regülatörolarak dahil olabileceği hipotez edilmiştir 13,14,15,16 . Bu hipotezi test etmek için nicel IHC, fonksiyonel genetik bozulma ve transkriptomik profilleme kullanıldı.

ESCC yönetimi genellikle özofagektomi, kemoterapi ve radyoterapinin birleşimini içerir. Özofagektomi iyileştirici olabilir, ancak yüksek morbidite riskitaşır 4,8. Ayrıca, kemoterapi ve radyoterapi genellikle tüm kanser hücrelerini yok edemez; bu da direnç, nyöleme ve metastaz 8,9 ile sonuçlanır. İmmünoterapi, son zamanlarda onkolojide öne çıkan bir odak noktası olarak ortaya çıkmış ve ileri kanserlerin tedavisinde etkinliğini göstermiştir. Bu artan ilgi, ESCC için erken teşhis ve tedavi planlamasına yardımcı olabilecek yeni biyobelirteçlere acil ihtiyacı ortaya koymaktadır. Önceki çalışmalar, PAK1 ve PAK4 gibi diğer PAK aile üyelerinin ESCC'de çoğalma, istila ve tedavi direncini teşvik ettiğini göstermiş, bu da bu kinaz ailesinin ESCC biyolojisindeki önemini vurgulamaktadır. Ancak, daha az incelenen grup II PAK'ın rolü hâlâ belirsiz tanımlanmış olup, mevcutçalışmayı motive etmektedir 17,18.

PAK II alt ailesinin bir üyesi olan P21-aktive kinaz 5 (PAK5) ilk kez 2002 yılında beyne özgü bir kinaz olarak tanımlanmıştır. 20p12 kromozomunda bulunan PAK5, yaklaşık 80 kDa'lık bir proteini kodlar ve esas olarak mitokondri ve çekirdekte bulunur; burada hücreseldüzenlemede çeşitli roller oynar 10,11,13. Mitokondrilerdeki işlevleri enerji metabolizması ve düzenlemesini içerirken, nükleer varlığı gen transkripsiyonu ve hücre döngüsü kontrolüyle bağlantılıdır. PAK5, muadillerine göre daha az incelenmiş olsa da, nörogelişim, hücresel hayatta kalma ve kanser ilerlemesi için kritik olduğunainanılır 10. Özellikle, PAK5 sitoskelet regülasyonu, anti-apoptotik mekanizmalar ve hücreselproliferasyonda rol oynamıştır 12. Neoplastik hücrelerde yukarı regülasyonu, PAK5'in aşırı ekspresyonunu kemoterapiye karşı tümör hücre direncinin artmasıyla ilişkilendiren bulgularla örtüşmektedir 10,11,13,14. Ancak, PAK5'in ESCC ilerlemesindeki kesin işlevi hâlâ belirsizdir. Bu çalışma, PAK5'in ESCC transkriptomik ortamı üzerindeki etkisini ve fonksiyonel sonuçlarını incelemektedir. ESCC hücrelerinde PAK5 aktivitesiyle ilişkili gen ifadesi değişikliklerini belirlemek için transkriptomik profilleme yapıldı. Ayrıca, tümör büyümesi ve metastatik potansiyelindeki rolünü açıklamak için kontrollü PAK5 modülasyonuna sahip bir ESCC hücre modeli oluşturuldu. ESCC'deki geleneksel biyobelirteç keşif stratejilerinin aksine, esas olarak Western blotting veya tek modaliteli transkript ölçümlerine dayanırken, mevcut iş akışı nicel immünohistokimya, transkriptomik profilleme ve fonksiyonel testleri entegre etmektedir. Bu birleşik yaklaşım, moleküler ve fenotipik doğrulamanın eşzamanlı olmasını sağlar, mekanik içgörü sağlarken biyolojik önemi artırır. Ayrıca, protokol deneysel tekrarlanabilirliği vurgular; eşleşmiş tümör ve bitişik doku örnekleri, standartlaştırılmış immünboyama prosedürleri ve dizileme için yüksek kaliteli RNA girdileri (RNA bütünlük numarası ≥ 7) kullanılır. Bu özellikler, özellikle ESCC'de klinik anlamlı kinaz odaklı düzenleyici ağları tanımlamayı amaçlayan çalışmalar için laboratuvarlar arasında tahlil sağlamlığını ve uygulanabilirliğini artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemler, Hainan Tıp Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. LW2022602) ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak her katılımcıdan bilgilendirilmiş onay alındı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hasta ve doku örnekleri toplama

Patolojik olarak doğrulanmış ESCC ile toplam 40 hasta kayıt altına alındı ve hepsi ameliyattan önce normal karaciğer ve böbrek fonksiyonuna sahipti. Tümör örnekleri (Grup T) ve bitişik normal dokular (Grup N; tümör kenarından ≥2 cm) cerrahi rezeksiyondan hemen sonra toplandı. Dokular, parafin gömmesinden önce oda sıcaklığında PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ile 7 gün boyunca sabitlendi.

2. İmmünohistokimyasal boyama

Parafinli gömülü bloklar 5 μm aralığında kesitlenip 60 °C'de 1 saat pişirildi. Bölümler ksilen ikamesiyle deparafinize edildi, derecelendirilmiş etanol ile yeniden hidlendirildi ve 10 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 6.0) 95-98 °C sıcaklıkta 20 dakika boyunca antijen alınmasına maruz kaldı. Endojen peroksidaz aktivitesi %3 hidrojen peroksit ile 10 dakika söndürüldü, ardından oda sıcaklığında %5 normal serumla 30 dakika bloklandı. Bölümler gece boyunca (12-16 saat) 4 °C'de anti-PAK5 birincil antikor ile kuluçka edildi (1:100 seyreltme, bkz. Malzeme Tablosu). PBS yıkamalarından sonra, slaytlar oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yaban turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikor ile inkübe edildi, renk ortaya çıkana kadar DAB ile geliştirildi (1-5 dakika, aşırı boyamayı önlemek için mikroskop altında izlendi) ve 30-60 saniye boyunca hematoksilin ile karşı boyama yapıldı. Bölümler kurutuldu, monte edildi ve parlak alan mikroskobu altında görüntülendi. Pozitif hücrelerin boyama yoğunluğu ve oranı, her bölüm başına en az beş rastgele alan (200× büyütme) olan görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi. Nicel yöntemi, H-puanı hesaplamasını benimsedi ve formül şöyleydi: H-puanı = ∑ (boyama yoğunluğu derecesi × pozitif hücrelerin yüzdesi) (yoğunluk 0 = negatif, 1 = zayıf, 2 = orta, 3 = güç; yüzde 0-25%, %26-50, %51-75%, %76-100 olarak sınıflandırıldı). Güvenilirliği sağlamak için, iki bağımsız patolog kör puanlama yaptı ve gözlemciler arasında κ değeri 0.75 ≥ oldu. Kalite kontrol kriterleri sıkı bir şekilde uygulandı: Pozitif kontroller (bilinen PAK5-pozitif ESCC dokusu) ve negatif kontroller (birincil antikor PBS ile değiştirilmiş) doğrulamadan geçmelidir; arka plan boyama yoğunluğu önceden belirlenmiş bir eşiğin altında olmalı (örneğin, H-puanı < 50); Tekrarlanan partiler arasında boyama sonuçlarının varyasyon katsayısı (CV) deneysel değişkenliği dışlamak için %<20 olmalıdır.

3. Hücre hatları ve kültür

KYSE-150 (insan ESCC) ve HEK-293 (viral paketleme) hücreleri kısa tandem tekrar (STR) profilleme ile doğrulandı ve mikoplazmadan arındıkları doğrulandı. KYSE-150 hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin (100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında kültürlendi. HEK-293 hücreleri, aynı katkı maddeleriyle desteklenerek DMEM'de tutuldu. Hücreler, %70-80 birleşime ulaştıklarında %0,25 tripsin-EDTA kullanılarak alt kültüre geçirildi ve her deneyden 24 saat önce uygun yoğunluklara tohumlandı.

4. Lentiviral vektör yapısı ve enfeksiyonu

Lentiviral vektörler, ya PAK5'i aşırı eksprese etmek (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro) ya da PAK5'i (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro) susturmak için tasarlandı. HEK-293 hücreleri, 10 cm tabak içinde tohumlanarak transfer plazmidi, paketleme plazmidleri (gag/pol ve devir) ve zarf plazmidi (VSV-G) ile 4:3:1 oranında, lipid bazlı transfeksiyon reaktifiyle %70-%80 birleşimde transfekte edildi; toplam DNA miktarı 10 cm çanlık için ~20 μg idi. Medium transfeksiyondan 6-8 saat sonra değiştirildi. Viral süpernatanlar 48 saat ve 72 saat içinde toplanmış, 500 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjlenerek döküntüleri uzaklaştırılmış, 0,45 μm filtreden filtrelenmiş ve ya konsantre edilmiş, −80 °C'de saklanmıştır. Transdüksiyon için, KYSE-150 hücreleri enfeksiyondan bir gün önce tohumlanarak 8 μg/mL polibren varlığında 5-10 enfeksiyon oranı (MOI) ile viral süpernatana maruz bırakıldı. MOI, enfeksîyon birimlerin hedef hücre sayısına oranı olarak tanımlandı. GFP sayımı veya qPCR kullanılarak MOI tahmini için ön deney yapıldı ve 5-10 MOI seçildi. Ortam 12-16 saat sonra değiştirildi ve 72-96 saat boyunca 0-4 μg/mL arasında değişen puromisin konsantrasyonlarıyla dönüştürülmemiş hücrelerin işlenmesiyle minimum ölümcül konsantrasyon belirlendi. Seçilen konsantrasyon 1-2 μg/mL ve bakım konsantrasyonu 0,5-1 μg/mL idi. Hücreler, 48 saat sonra başlayan puromisin (1-2 μg/mL) ile seçildi. PAK5 aşırı ifade veya susturma, PAK5 (ileri 5′-CCAAAGCCTATGGGGGGACCC-3′, ters 5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) ve GAPDH (ileri 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′, ters 5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′) için özel primerler kullanılarak RT-qPCR ile doğrulandı. PAK5'in göreli ifadesi 2−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Tüm deneyler en az üç biyolojik kopya ile gerçekleştirildi.

5. CCK-8 hücre canlılık testi

Hücre canlılığı, WST-8 reaktifinin hücresel dehidrojenazlar tarafından indirgenmesine dayanan Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) kullanılarak değerlendirildi. Logaritmik olarak büyüyen KYSE-150 hücreleri, 100 μL tam ortamda 96 kuyu levhalarında her kuyu başına 2.000 hücre olarak tohumlanmıştır. 0 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat mesafelerde, her kuyuya 10 μL CCK-8 reaktifi (WST-8 içeriyor) eklendi. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapıldıktan sonra, 450 nm (A450) soğukkanlılık mikroplaka okuyucu ile ölçüldü. Sadece ortam içeren boş kuyular dahil edildi. Her deneysel grup en az üç biyolojik kopya içeriyordu ve her ölçüm beş teknik kopya ile gerçekleştirildi.

6. Koloni oluşumu testi

KYSE-150'nin tek hücreli süspansiyonları, 6 kuyu plakalarında 1.000 hücre olarak tohumlanarak 14 gün boyunca kültürlendi; ortam her 2-3 günde bir değiştirildi. Koloniler 15 dakika boyunca %4 PFA ile sabitlendi, %0,1 kristal violet ile %20 metanolle 15 dakika boyandı, suyla duruldu ve hava ile kurutuldu. 50'den fazla hücre içeren koloniler görüntü analiz yazılımı kullanılarak sayıldı ve koloni oluşum hızı hesaplandı.

7. Transwell işgal testi

8 μm gözenekli insertler, bazal membran matrisi (50 μL per insert, 1:8 seyreltme) ile önceden kaplanmış ve 37 °C'de 1 saat inkübe edilmişti; Hücreler tohumlanmadan önce kalite kontrolü yapıldı: analiz geçerliliğini doğrulamak için boş (hücresiz) ve negatif kontrol ekleri (kemoattrektantsız) kuruldu ve bazal membran matris katmanının uniformliği görsel inceleme (veya daha sıkı kontrol için ağırlık ölçümü) ile doğrulandı. Hücreler %1 FBS ortamında 6-12 saat serumda ısıtıldı ve üst odaya 2 × 10⁵ hücre/mL (200 μL per insert) tohumlandı. Alt odada 600 μL ortam ve %20 FBS kimyasal çekici olarak bulunuyordu. 24 saat kuluçkadan sonra, üst yüzeydeki istila olmayan hücreler çıkarıldı, alt yüzeydeki istila hücreler 10 dakika boyunca metanol ile sabitlendi ve 15 dakika boyunca %0,1 kristal violet ile boyandı. Boyalı hücreler parlak alan mikroskopu altında görüntülendi ve her eklemede en az beş rastgele mikroskobik alanda sayıldı (200× büyütme); Sayım, öznel önyargıyı önlemek için kör bir yöntemle (sayma personeli grup atamalarından habersizdi) gerçekleştirildi.

8. Apoptozun akış sitometrik tespiti

Hücreler (yüzen hücreler dahil) hasat edildi, PBS ile iki kez yıkandı ve 1 × 106 hücre/mL ile bağlanma tamponunda yeniden süspansiyona getirildi. Süspansiyonun 100 μL'sine annexin V-FITC (5 μL) ve propidium iyodid (5 μL) eklendi, ardından oda sıcaklığında 15 dakika karanlıkta kuluçka yapıldı; kuluçkadan sonra, her numuneye 400 μL bağlama tamponu eklendi. Akış sitometrik analizinden önce, telafi ayarlaması tek boyalı kontroller (Annexin V-FITC tek boyalı hücreler ve PI tek boyalı hücreler) kullanılarak gerçekleştirilerek floresan yayılmasını ortadan kaldırdı ve FSC/SSC kapısı tek hücreleri seçecek şekilde ayarlandı (hücre döküntüleri ve agregalar hariç). Örnekler, 488 nm lazerle donatılmış bir akış sitometresinde 1 saat içinde analiz edildi ve her örnek için en az 10.000 olay kaydedildi. Apoptotik indeksler, akış sitometrisi analiz yazılımı kullanılarak nicelleştirildi: tutarlılığı sağlamak için tüm örneklerde eşit bir kapı eşiği uygulandı ve erken apoptotik hücrelerin (Annexin V⁺/PI⁻) oranları (Annexin V⁺/PI⁺) oranları ayrı ayrı rapor edildi ve her grubun apoptotik profilini karakterize etti.

9. RNA dizileme ve biyoinformatik analiz

Toplam RNA çıkarıldı ve saflık (A260/280 arasında 1.8 ile 2.1 arasında) ve bütünlük (kalite kontrol eşiği olarak RIN ≥7) açısından değerlendirildi. mRNA, oligo(dT) boncukları kullanılarak arıtıldı, 94 °C'de 5-7 dakika boyunca parçalandı ve tersiyle cDNA'ya transkribe edildi. Kütüphaneler, uç onarım, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu (8-12 döngü) ile hazırlanmış ve örnek başına 30-50 milyon okunma çifti derinlikte eşleştirilmiş uç 150 bp okumalar oluşturmak üzere Illumina platformunda sıralanmıştır. Okumalar, STAR veya HISAT2 kullanılarak insan referans genomuna göre kesilip hizalandı. Gen sayıları featureCounts ile alındı ve DESeq2 ile diferansiyel ifade analizi yapıldı; FDR < 0.05 ve |log2 kat değişim| ≥ 1. Farklı olarak eksprese edilen genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi, Gen Ontolojisi ve KEGG yolları için clusterProfiler kullanılarak (Benjamini-Hochberg (BH) düzeltilmiş FDR < 0.05 ile birlikte) yapıldı ve STRING veritabanı kullanılarak protein-protein etkileşim ağları oluşturuldu.

10. İstatistiksel analiz

Sürekli veriler, en az üç bağımsız deneyden ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar iki kuyruklu eşleşmesiz t-testlerle yapıldı ve üç veya daha fazla grup arasında karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ile yapıldı, ardından Tukey'nin post-hoc testi yapıldı. Uygun olduğunda parametrik olmayan testler uygulandı. Hayatta kalma dağılımları, Kaplan-Meier analiziyle log-rank testleriyle tahmin edilmiştir. RNA-dizisi verileri için Benjamini-Hochberg yöntemiyle çoklu test düzeltmeleri yapıldı. Kesin p-değerleri şekil efsanelerinde bildirilir; İstatistiksel anlamlılık < 0.05'te değerlendirildi; bunlara* p < 0.05, **p < 0.01 olarak belirtildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PAK5, ESCC'de yüksek şekilde ifade edilir ve kötü prognozla ilişkilidir
Şekil 1, PAK5'in klinik doğrulamasından fonksiyonel ve transkriptomik analizlere kadar genel iş akışını göstermektedir; bu analizler GAREM1'i bir sonraki hedef olarak tanımlar. PAK5'in, GAREM1 üzerinden MAPK yolunu modüle ederek ESCC ilerlemesini teşvik ettiği hipotezini test etmek için , ESCC dokularındaki PAK5'in ekspresyon kalıpları ve bunların klinik pr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, klinik örnekler, fonksiyonel testler ve transkriptomik analizleri birleştirerek özofagus skuamoz hücre karsinomunun (ESCC) ilerlemesinde PAK5'in rolünü derinlemesine incelemektedir. Bu bulgular, PAK5'in ESCC'deki rolünü genişleterek, hem prognostik bir belirteç hem de terapötik hedef olarak potansiyelini ortaya koymaktadır.

ESCC dokularında PAK5'in belirgin aşırı ifası ve hasta hayatta kalma oranının daha kötü olmasıyla ilişkisi, PAK5'in tümör iler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek herhangi bir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Hainan Eyalet Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (Hibe No. 822QN474).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Annexin V-FITC apoptoz tespit kitiBeyotime BiyoteknolojisiC1062SApoptoz tespit boyama kiti
Anti-PAK5 antikorAbcamAB110069IHC için primer antikor, seyrelme 1:100
Otomatik elektroforez sistemiÇevik2100 BiyoanalizörüRNA bütünlüğü değerlendirmesi
cDNA sentez kitiInvitrogen1896649Ters transkripsiyon kiti
Kristal mor çözeltisiSigma-AldrichC3886Koloniler ve işgal için boyama boyası
DMEM OrtamıGibco (Termo Balıkçı)11965092Hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco (Termo Balıkçı)16000044Hücre kültürü takviyesi
Akış sitometresiBD BiosciencesFACSCanto IIHücre analizi için alet
GraphPad PrizmasıGraphPad YazılımıSürüm 8İstatistiksel analiz ve grafik yazılımı
H& E Boyama KitiSolarbioG1120Hematoksilin ve eozin boyama çözeltisi
HRP ile konjuge edilmiş Anti-Rat IgGAbcamab150165IHC için ikincil antikor
Illumina NovaSeq sekvencisiIlluminaNovaSeq 6000Yüksek verimli dizileme platformu
KYSE-150 hücre hattıRIKEN Hücre BankasıRCB2057İnsan özofagus skuamöz karsinom hücre hattı
Lipofektamin 3000ThermoFisherL3000008Transfeksiyon reaktifi
Microplate okuyucuBio-Tek InstrumentsELx808Absorbans ölçüm cihazı
DynabeadTM Oligo(dT)25sThermo Fisher Scientific61005mRNA arıtması için
Penisillin-StreptomisinGibco (Termo Balıkçı)15140122Hücre kültürü için antibiyotikler
Propidium iyodid (PI)Sigma-AldrichP4864DNA boyama boyası
RPMI-1640 OrtaGibco (Termo Balıkçı)11875093Hücre kültürü ortamı
SpektrofotometreThermo FisherNanoDrop ND-1000RNA konsantrasyonu ve saflık ölçümü
SPSS yazılımıIBMSürüm 23İstatistiksel analiz yazılımı
Transwell eklemeleriCorning3422Hücre istilası testi ekleri

Kaynaklar

  1. Chen, W., et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin. 66 (2), 115-132 (2016).
  2. Pennathur, A., Gibson, M. K., Jobe, B. A., Luketich, J. D. Oesophageal carcinoma. Lancet. 381 (9864), 400-412 (2013).
  3. Zhang, D. G., et al. P21-activated kinase 5 potentiates the chemoresistant phenotype of liver cancer. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 47(2021).
  4. Kumar, R., Sanawar, R., Li, X., Li, F. Structure, biochemistry, and biology of PAK kinases. Gene. 605, 20-31 (2017).
  5. Wang, X. X., et al. PAK5-EGR1-MMP2 signaling controls the migration and invasion in breast cancer cell. Tumour Biol. 34 (5), 2721-2729 (2013).
  6. Li, D., Yao, X., Zhang, P. The overexpression of p21-activated kinase 5 (PAK5) promotes paclitaxel-chemoresistance of epithelial ovarian cancer. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 191-199 (2013).
  7. Zhang, D. G., et al. P21-activated kinase 5 affects cisplatin-induced apoptosis and proliferation in hepatocellular carcinoma cells. Tumour Biol. 36 (5), 3685-3691 (2015).
  8. Li, T. T., et al. Microrna-138-1-3p sensitizes sorafenib to hepatocellular carcinoma by targeting PAK5 mediated β-catenin/ABCB1 signaling pathway. J Biomed Sci. 28 (1), 56(2021).
  9. Huo, F. C., Pan, Y. J., Li, T. T., Mou, J., Pei, D. S. PAK5 promotes the migration and invasion of cervical cancer cells by phosphorylating satb1. Cell Death Differ. 26 (6), 994-1006 (2019).
  10. Zhang, Y. C., et al. PAK5-mediated phosphorylation and nuclear translocation of nf-κb-p65 promotes breast cancer cell proliferation in vitro and in vivo. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 146(2017).
  11. Chen, S., et al. Vaccinia-related kinase 2 blunts sorafenib's efficacy against hepatocellular carcinoma by disturbing the apoptosis-autophagy balance. Oncogene. 40 (19), 3378-3393 (2021).
  12. Cao, J. X., Lu, Y. Targeting CDC7 improves sensitivity to chemotherapy of esophageal squamous cell carcinoma. Onco Targets Ther. 12, 63-74 (2019).
  13. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).
  14. Kratchmarova, I., Blagoev, B., Haack-Sorensen, M., Kassem, M., Mann, M. Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation. Science. 308 (5727), 1472-1477 (2005).
  15. Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
  16. Tashiro, K., et al. a novel adaptor protein for growth factor receptor-bound protein 2, contributes to cellular transformation through the activation of extracellular signal-regulated kinase signaling. J Biol Chem. 284 (30), 20206-20214 (2009).
  17. Zou, X., et al. PRMT5-PAK1 signaling participates in metastasis and is associated with poor prognosis in human esophageal carcinoma. Anticancer Res. 44 (2), 593-604 (2024).
  18. Wei, Y., et al. Nuplazid suppresses esophageal squamous cell carcinoma growth in vitro and in vivo by targeting PAK4. Br J Cancer. 126 (7), 1037-1046 (2022).
  19. Nakagawa, S., et al. An organoid library of human esophageal squamous cell carcinomas (ESCCs) uncovers the chemotherapy-resistant ESCC features. Commun Biol. 8 (1), 507(2025).
  20. Huang, H., et al. P21-activated kinase 4 promotes the progression of esophageal squamous cell carcinoma by targeting lasp1. Mol Carcinog. 60 (1), 38-50 (2020).
  21. Zhong, H., et al. Overexpression of microrna-19a-3p promotes lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma via the rAC1/CDC42-PAK1 pathway. Transl Cancer Res. 10 (6), 2694-2706 (2021).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

PAK5 EkspresyonuPrognostik BiyobelirteçTerapötik HedefHücre ProliferasyonuHücre MigrasyonuİmmünohistokimyaKaplan-Meier AnalizimRNA Sekanslama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.