Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CD8+CD103+ Tregs, farelerde CD4+ T hücresi aracılı iltihabı bastırarak ve göz yüzeyi bütünlüğünü koruyarak kuru göz hastalığını hafifleder

316 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69110

⸱

21 Kasım 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

Bu makalede

Özet

Burada, patojenik CD4+ T hücre yanıtlarının kapsamlı modülasyonu yoluyla stresten kaynaklanan kuru göz hastalığını hafifletmek için immünoterapik bir müdahale olarak CD8+CD103+ düzenleyici T hücrelerinin benimsenmesini gösteren bir protokol sunuyoruz.

Özet

CD8+CD103+ düzenleyici T hücreleri, otoimmün hastalıklarda tedavi potansiyeli kanıtlanmış uzmanlaşmış bir immünsüpres popülasyonu temsil eder; ancak göz yüzeyi iltihaplanmasındaki rolleri henüz keşfedilmemiştir. Bu protokol, kurutucu strese maruz kalan farelerden CD8+CD103+ T hücrelerinin izole edilmesi ve deneysel kuru göz hastalığında adoptik transfer yoluyla terapötik etkinliğinin değerlendirilmesi için sistematik bir yaklaşımı tanımlar. Metodoloji, CD8+CD103+ T hücresi arıtımı için manyetik aktifle aktifleşen hücre sıralaması, standartlaştırılmış kurutma stres indüksiyonu ve gözyaşı üretim ölçümü, kornea bariyer geçirgenliği testi ve inflamatuar aracıların moleküler analizi gibi kapsamlı fonksiyonel değerlendirmeleri kapsar. Temsil eden sonuçlar, CD8+CD103+ T hücre tedavisinin gözyaşı üretimini önemli ölçüde geri kazandığını, konjonktival kadeh hücre popülasyonlarını koruduğunu ve korneal epitel bariyer bütünlüğünü korduğunu göstermektedir. Tedavi, matriks metalloproteinaz ekspresyonunun önemli ölçüde baskılanması, apoptotik hücre ölümünün azalması ve sitokin profillerinin pro-inflamatuar desenlerden doku koruyucu desenlere modüle edilmesini sağladı. Protokol, göz dokularında CD4+ T hücre infiltrasyonunu etkili bir şekilde azaltırken, aynı zamanda patojenik IL-17A ve IFN-γ üretimini baskılar ve koruyucu IL-13 seviyelerini artırdı. Bu yaklaşım, göz yüzeyi bozukluklarında CD8+CD103+ T hücresi aracılı immünomodülasyonun araştırılması için sağlam bir deneysel çerçeve sağlar ve kuru göz hastalığı yönetimi için yeni hücre tabanlı tedavilerin geliştirilmesi için temel bir metodoloji oluşturur.

Giriş

Kuru göz hastalığı (DED), küresel nüfusun %10-30'unu etkileyen ve hastaların yaşam kalitesini, iş verimliliğini ve psikolojik iyiliğini önemli ölçüde tehlikeye atan yaygın ve engelleyici bir göz yüzeyi rahatsızlığını temsileder 1,2,3. DED'nin patofizyolojisi, gözyaşı filmi kararsızlığı, göz yüzeyi iltihabı ve nöroduyusal anormallikler arasında karmaşık bir etkileşimi içerir; bunlar birlikte doku hasarı ve fonksiyonel bozukluk gibi kısır bir döngüyüsürdürür 4. Moleküler düzeyde, gözyaşı hiperosmolaritesi merkezi bir patojenik mekanizma olarak hizmet eder; stres yanıt yollarını aktive eden, proinflamatuar aracı salınımını tetikleyen ve nihayetinde göz yüzeyi mikroçevresinin hassas homeostatik dengesini bozan zincirli inflamatuar olayları tetikler. 5,6,7.

DED'nin immünolojik yapısı, adaptif bağışıklık yanıtları tarafından domine edilir; CD4+ T hücresi aracılı bağışıklık, göz yüzeyinin bozulmasını organize etmekte ve kronik iltihabı sürdürmede kritik roloynar 8. CD8+ T hücreleri, göz dokularındaki normal homeostatik bağışıklık hücresi popülasyonunun temel bir bileşenini oluşturur ve fizyolojik koşullarda bağışıklık gözetimi ve doku bütünlüğünükorur 9. Temel araştırmalar, kurutma stresinin (DS) antijen sunan hücreleri aktive ettiğini ve ardından CD4+ T hücrelerini patojenik fenotiplere doğru hazırladığını göstermiştir; bu fenotipler, T hücresi eksikliği olan çıplak farelere otoimmün lakrimal keratokonjunktivit (KCS) avtomatik olarak aktarıldığında otoimmün lakrimal keratokonjunktivit sicca (KCS) oluşturabilir ve böylece insan DED 10,11'in temel özelliklerini yeniden ortaya koymaktadır.

DED patogenezinde düzensiz CD4+ T hücre yanıtlarının merkezi rolü göz önüne alındığında, patojenik T hücresi bağışıklığının modülasyonunu hedefleyen terapötik stratejiler bu hastalığın yönetimi için umut vadeden yaklaşımlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu bağlamda, CD8+ düzenleyici T hücreleri (Tregler), özellikle CD8+CD103+ alt kümesi, güçlü immünsüpresif yetenekleri ve çeşitli otoimmün ve inflamatuar durumlar üzerinde doku koruyucu işlevleri nedeniyle önemli ilgi görmüştür. Bu özel düzenleyici popülasyonlar, sitokin aracılı baskılama, doğrudan hücreden hücreye temas inhibisyonu ve efektör lenfosit fonksiyonunun metabolik düzenlemesi gibi birçok mekanizma aracılığıyla bağışıklık yanıtlarınımodüle eder. Integrin αEβ7 (CD103), mukoza dokular boyunca intraepitelyal lenfositlerin konumlanmasını kolaylaştıran kritik bir yönlendirme reseptörü olarak görev yapar ve CD8+CD103+ Tregs'in iltihaplanma15 bölgelerinde lokal immünoregülatif etkiler göstermesini sağlar.

CD8+CD103+ Treg'lerin, çeşitli otoimmün mukoza hastalıklarında zararlı bağışıklık reaksiyonlarını hafifletme konusunda önemli terapötik potansiyele sahip olduğuna dair giderek artankanıtlar bulunmaktadır 16,17,18. Bu hücreler, mukoza bölgelerinde tercihli birikimi sağlayan benzersiz taşıma kalıpları sergiler; burada doku yıkıcı bağışıklık yanıtlarını etkili bir şekilde dengeleyebilir ve iyileşmeyi ve homeostazı teşvik edebilir. Son araştırmalar, CD8+CD103+ T hücrelerinin göz yüzeyi bağışıklığındaki rolünü aydınlatmaya başlamış; DS maruziyeti sonrası servikal lenf düğümlerinde sayısal genişlemelerini ve konjonktival dokularagöç etme kapasitelerini göstermektedir 19,20,21,22. Ancak, bu ilginç gözlemlere rağmen, CD8+CD103+ T hücrelerinin kuru göz patogenezine özel fonksiyonel katkıları ve CD4+ T hücresi aracılı göz yüzeyi hasarını modüle etmedeki terapötik potansiyeli henüz tam olarak anlaşılmamaktadır.

CD8+CD103+ Tregs'in benimsenmiş transferi, yapay gözyaşları, anti-inflamatuar ajanlar ve immünosupresif ilaçlar dahil olmak üzere geleneksel DED tedavi yaklaşımlarına kıyasla belirgin bir ilerleme niteliğindedir ve yalnızca semptomatik belirtileri ele almak yerine altta yatan patojenik bağışıklık mekanizmalarını hedefalır 23. Bağışıklık fonksiyonunu geniş çapta baskılayan sistemik immünosupresif tedavilerin aksine, CD8+CD103+ Treg tabanlı müdahale, patojenik CD4+ T hücre yanıtlarının hedefli modülasyonunu sunarken koruyucu bağışıklığıkorur. Bu yaklaşım, mezenkimal kök hücre uygulamaları ve CD4+CD25+ Treg transferi gibi mevcut hücre tabanlı tedavileri tamamlar; CD103 aracılı homing mekanizmaları aracılığıyla geliştirilmiş mukozal doku özgüllüğüsağlar 25.

CD8+CD103+ T hücrelerinin kuru göz patogenezini etkileyebileceği düzenleyici mekanizmalarla ilgili kritik bilgi eksikliği, bu zayıflatıcı durum için hedefli immünoterapi müdahalelerinin geliştirilmesinde önemli bir engel oluşturur. Ayrıca, göz yüzeyi iltihabında düzenleyici ve efektör T hücre popülasyonları arasındaki karmaşık etkileşim, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi ve tedavi stratejilerinin optimize edilmesi için sistematik bir inceleme gerektirir. Bu çalışma, CD8+CD103+ T hücre aracılı CD4+ T hücre kaynaklı patojenik süreçlerin düzenlenmesini kuru göz hastalığının iyi kurulmuş bir fare modelinde kapsamlı şekilde karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Temel metodolojik yenilik, CD8+CD103+ düzenleyici hücrelerin ardışık izolasyonunu, ardından benimseme transferi ve fonksiyonel, histolojik ve moleküler okumaların kapsamlı değerlendirilmesini içerir; böylece terapötik etkinlik belirlenir ve altta yatan mekanizmalar aydınlanır. Nihai hedef, göz yüzeyindeki bağışıklık yanıtlarını daha iyi anlamak ve insanlarda DED yönetimi için potansiyel tedavi stratejilerini keşfetmekti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirisi ile sıkı bir şekilde yürütüldü ve Jinan İkinci Halk Hastanesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tüm çabalar, hayvan acısını en aza indirmek ve 3R ilkesine (Yenileme, Azaltma ve Geliştirme) uygun olarak kullanılan hayvan sayısını azaltmak için gösterildi.

1. Hayvan hazırlığı ve deneysel tasarım

  1. 6-8 haftalık dişi C57BL/6 farelerini, onaylı bir laboratuvar hayvanı tesisinden (suş kodu: 027) belirli patojensiz sağlık durumuna sahip alın.
  2. Kontrollü bir ortamda hayvanları barındırmak, 12 saat ışık-karanlık döngüleri (ışıklar 06:00-18:00 arası), sıcaklık 22 ± 2 °C ve 50-60% nisbəti çevresel izleme sistemleri kullanılarak korumak.
  3. Hayvanların deneysel işlemlerden önce 1 hafta boyunca alışmasına izin verin, standart laboratuvar yemeği ve sıvı ile su sağlanın.
  4. 32 fareyi bilgisayar tabanlı rastgeleleştirme kullanarak dört deneysel gruba (grup başına n = 8) ayırın: stressiz kontroller (NS), sadece kurutma stresi (DS), araç kontrolüyle kurutma stresi (DS + VC) ve CD8+CD103+ T hücre tedavisiyle kurutma stresi (DS + CD8+CD103+).
    NOT: Hayvanları günlük olarak aktivite azalması veya %10'un üzerinde kilo kaybı gibi sıkıntı belirtileri için izleyin.

2. Kurutma stresi indüksiyonu

  1. Scopolamin hidrobromid çözeltisi 0,5 mg'yi 0,2 mL steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) içinde hemen önce çözerek hazırlayın ve nihai konsantrasyon 2,5 mg/mL elde edilir.
  2. Skopolamin, vücut ağırlığı başına 0,5 mg/kg dozda (yaklaşık 0,04 mL) günde dört kez, 8:00, 12:00, 15:00 ve 18:00 saatlerde, beş üst üste 27-G iğnelerle verilmelidir.
  3. Dijital anemometre kalibrasyonu kullanılarak kafes seviyesinde ölçülürken standart 15 m/s hızda sürekli hava çekişi oluşturmak için değişken hızlı fanları konumlandırın.
  4. Çevresel koşulları dijital higrometrelerle (doğruluk ±%2) sürekli izlerken, aktif silika jeli (Grade 40, 6-12 ağ) içeren sedicant odaları kullanarak ortam nemini %40'ın altında tutmak (%40, 6-12 ağ).
  5. Sürekli izleme ile hassas çevresel kontrol sistemleri kullanarak tüm maruz kalma süresi boyunca 22 ± 1 °C sıcaklığını koruyun.
  6. Hayvanları günde iki kez susuzluk, kilo kaybı (>%15'i hariç tutulur) veya aşırı bakım veya azalmış aktivite gibi sıkıntı davranışları için izleyin.

3. CD8+CD103+ T hücre izolasyonu ve arındırılması

  1. Daha önce kurutucu strese maruz kalmış donör fareler, CO₂ boğulması ve ardından servikal dislokasyon uygulanarak onaylanmış ötenazi protokollerine göre kurbanlık edilir.
  2. Dalak ve yüzeysel servikal lenf düğümleri steril koşullarda steril aletlerle biyolojik güvenlik dolabında hasat edilir; dokular %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş buz gibi soğuk RPMI-1640 ortamına yerleştirilir.
  3. Tek hücreli süspansiyonlar, steril şırıngalı pistonlarla 70 μm hücre süzgeçleri aracılığıyla dokuları mekanik olarak bozarak hazırlayın; hücreleri %2 FBS ve 1 mM etilen diamintetraasetik asit (EDTA) içeren PBS ile iki kez yıkayarak hazırlanın.
  4. CD8+ T hücrelerini, üreticinin talimatlarına göre anti-CD8 antikor konjuge manyetik mikroboncuklarla manyetik aktive hücre sıralaması ile izole edin.
  5. Hücre canlılığını tripan mavi dışlama testi (%0,4 çözeltisi) kullanarak değerlendirin; canlı ve cansız hücreleri otomatik hücre sayacı ile sayarak, yalnızca %95'in üzerinde canlılık içeren preparatlarla devam edin.
  6. CD103+ ekspresyonunu anti-CD103-APC antikorlarıyla ardışık inkubasyon ile 1:100 seyreltmede, karanlıkta 4 °C'de 30 dakika boyunca zenginleştirin.
  7. Üreticinin protokollerine uygun olarak CD8+CD103+ çift pozitif hücreler elde etmek için LS Sütunlu anti-allofikosiyanin (anti-APC) mikroboncukları kullanılarak ikincil manyetik ayrım gerçekleştirin.
  8. Akış sitometrisi ile hücre saflığını doğrulayın; aliquotları anti-CD8-FITC ve anti-CD103-APC antikorlarıyla boyanarak %90 CD8+CD103+ çift pozitif hücre oluşmasını sağlayın> önce devam etmeden önce.

4. Benimseme transfer protokolü

  1. CD8+CD103+ T hücre süspansiyonlarını, steril fosfatla tamponlanmış tuzlu salinde, steril fosfatla tamponlanmış tuzlu sönümde 5 × 106 hücre konsantrasyonunda hazırlayın ve hücreleri 300 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj edip uygun hacimde yeniden süzülür.
  2. Kurutucu stres başlatmaya göre 200 μL steril PBS'ye 1 × 106 hücre enjeksiyonu, kurutma stresine göre -2, 0 ve +2 günlerde intraperitoneal olarak enjekte edilir; her enjeksiyondan önce nazik karıştırma sağlanır.
  3. Deneysel tutarlılığı korumak için aynı enjeksiyon programı ve tekniği kullanarak araç kontrol gruplarına eşdeğer miktarda steril PBS uygulanır.
  4. Hücre hazırlıklarını buz üzerinde sürdürün ve izolasyondan sonra 2 saat içinde transferleri tamamlayarak optimal canlılık ve işlevi koruyun.
  5. Enjeksiyon bölgelerini sol ve sağ alt karın arasında döndürerek lokal iltihabı en aza indirin ve enjeksiyondan sonraki 24 saat boyunca hayvanları yan reaksiyonlara karşı takip edin.

5. Fonksiyonel değerlendirme prosedürü

  1. Gözyaşı üretimi ölçümü
    1. Saat 20:00'de tutarlı ölçümler yapın, böylece gözyaşı üretimindeki sirkadiyen değişimleri hesaba katın.
    2. Doğal gözyaşı üretim mekanizmalarına müdahale etmemek için anestezi olmadan uygun kısıtlayıcı cihazlarla fareyi nazikçe tutun.
    3. Fenol kırmızısı emdirilmiş pamuk ipliğini, ince uçlu forsepslerle alt konjonktival forniks'e tam 15 saniye yerleştirin.
    4. Islak diş uzunluğunu hemen hassas dijital kaliperlerle (± 0,01 mm doğruluk) standart floresan aydınlatma koşullarında ölçün.
  2. Kornea bariyer fonksiyonudeğerlendirmesi 26
    1. İzleyici uygulaması sırasında fareyi %2 isofluran solumasıyla kısa bir süre anestezi ile anestezi yapın, böylece hassas yerleştirme sağlansın.
    2. Merkezi kornea yüzeyine 0,5 μL 50 mg/mL Oregon yeşil-dekstran çözeltisi, pozitif yer değiştirme uçlu hassas bir mikropipet kullanılarak yerleştirilin.
    3. Korneaları 1 dakikalık kuluçkadan sonra steril tuzlu suyla beş kez iyice durulayın; böylece fazla izleyici tamamen giderilir ve yüzey floresansı tamamen ortadan kalkar.
    4. Korneaları hemen floresan mikroskopisi ile Fluorescein izotiosiyanat (FITC) filtre seti (uyarılma 490 nm, emisyon 525 nm) ve standart pozlama parametreleriyle fotoğraflayın.
    5. Floresans yoğunluğunu ImageJ yazılımı ile tutarlı ilgi alanı seçimi ve arka plan çıkarma protokolleriyle nicelikle ölçün.
      1. Görüntüleri 8 bit gri tonlamaya dönüştürün, korneanın merkezi 3 mm çapını kapsayan standartlaştırılmış dairesel ilgi alanı (ROI) tanımlayın.
      2. Ortalama gri değeri ölçün, bitişik kornea olmayan bölgeden ölçülen arka plan floresansını çıkarın ve sonuçları düzeltilmiş toplam floresans (CTF) olarak şu şekilde hesaplayın: CTF = Entegre Yoğunluk - (Yatırım Getiri Alanı × Ortalama arka plan floresansı)22.

6. Histolojik işlem ve analiz

  1. Ötenazi sonrası hemen gözleri ve çevresindeki yapıları çıkarın, ardından %4 paraformaldehit ile 24 saat sabitlenin veya donmuş kesitler için optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömülerek sagital kesitleme için doğru yönü sağlanır.
  2. Tüm örneklerde tutarlı kesitleme düzlemleri için standart anatomik işaretler (optik sinir referans noktası olarak) kullanarak seri sagital kesitler (dondurulmuş için 6 μm, parafin için 5 μm) hazırlanın.
  3. Uygun pozitif ve negatif kontrollerle standartlaştırılmış protokoller kullanarak kadeh hücresi nicelendirmesi için periyodik asit-Schiff (PAS) boyama işlemi yapılabilir.
  4. Birincil antikorlar kullanılarak immünoflüoresans boyama yapın: anti-MMP-3 (1:200), anti-MMP-9 (1:100), anti-aktiflenmiş kaspaz-3 (1:300), anti-aktive kaspaz-8 (1:200) ve anti-CD4 (1:100) ile gece boyunca 4 °C'de kuluçka için.
  5. Sistematik örnekleme yöntemleriyle konjonktival uzunluğunun milimetresi başına kadeh hücrelerini nicelikle ölçerek, her bölüm başına örtüşmeyen beş yüksek güçlü alanda hücreleri sayarak ve sonuçların ortalamasını alın.

7. Moleküler analiz

  1. Doğrulanmış ekstraksiyon protokolleriyle birleştirilmiş konjonktival ve kornea dokularından toplam RNA çıkarma27.
  2. cDNA sentezi ve nicel gerçek zamanlı PCR28
    1. 1 μg toplam RNA, oligo-dT primerleri (50 μM), rastgele heksamer primerleri (100 μM), ters transkriptaz enzimi, reaksiyon tamponu ve nükleazsız su içeren ters transkripsiyon reaksiyonu karışımlarını 20 μL nihai hacimde hazırlayın.
    2. Reaksiyon karışımlarını termal döngüleyicide 37 °C'de 15 dakika boyunca kuluçka altına alın, böylece birinci zincirli cDNA sentezi sağlanır.
    3. Ters transkriptaz enzimini 85 °C'de 5 saniye ısıtarak inaktive edin, ardından 4 °C'ye soğutup cDNA'yı -20 °C'de depolayın ve kullanıma kadar.
    4. Sonraki PCR reaksiyonlarında şablon olarak kullanılmak üzere 1:10 derecesinde sülleleştirilmiş cDNA'yı nukleazsız su ile seyreltirin.
    5. 1 μL seyreltilmiş cDNA şablonu, ileri ve geri primerler (her biri 0,2 μM nihai konsantrasyon), SYBR Green master karışımı ve nükleaz içermeyen su içeren gerçek zamanlı PCR reaksiyon karışımları (20 μL son hacim) hazırlayın.
    6. Numuneleri üçlü olarak 96 kuyruklu optik reaksiyon plakalarına yükleyin, her primer çifti için şablonsuz kontroller dahil.
    7. Termal döngüleyiciyi şu koşullarla programlayın: başlangıçta 95 °C'de 10 dakika denatürasyon, ardından 40 denatürasyon (15 saniye 95 °C), tavlama (30 saniye 60 °C) ve uzatma (30 saniye 72 °C).
    8. Amplifikasyondan hemen sonra bir dissosiyasyon eğrisi aşaması ekleyin: 15 saniye 95 °C, 1 dakika 60 °C, ardından tek ürün amplifikasyonunu doğrulamak için 0,3 °C/s hızla sıcaklık kademeli olarak 95 °C'ye yükseltin.
    9. Cihaz yazılımı kullanarak amplifikasyon eğrileri ve döngü eşiği (CT) değerlerini analiz ederek tüm primer çiftleri için %90-110 arasında amplifikasyon verimliliği sağlanır.
    10. Hedef gen ifadesini (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 ve MMP-9) ev genine normalize etmek için 2-ΔΔCt yöntemiyle ev genleri GAPDH ile normalleştirin.
    11. Tüm hedef ve referans genler için Tablo 1'de belirtildiği primer dizilerini kullanın.
  3. Uygun standart eğriler ve kalite kontrolleriyle ticari olarak mevcut ELISA kitleri kullanarak doku ekstraktlarındaki sitokin protein seviyelerini nicelikle ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı uygulanması, CD8+CD103+ T hücre aracılı immünomodülasyon yoluyla kuruyan stresle indüklenen göz yüzeyi patolojisinin kapsamlı bir iyileştirilmesini sağlar. Olumlu sonuçlar, gözyaşı üretiminde önemli bir geri dönüş göstermekte; genellikle stressiz kontrollere kıyasla %60-80 iyileşme sağlanırken, araçla tedavi edilen hayvanlarda kalıcı lakrimasyon eksikliği gösterilmektedir (Şekil 1A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu araştırma, CD8+CD103+ düzenleyici T hücrelerini, CD4+ T hücresi aracılı patojenik yanıtların kapsamlı modülasyonu yoluyla stres kaynaklı kuru göz hastalığını kurutan güçlü terapötik ajanlar olarak ortaya koymaktadır. Bulgular, CD8+CD103+ T hücrelerinin sahiplenilen transferinin, gözyaşı üretiminin fonksiyonel restorasyonunu, mukozal mimarinin korunmasını, epitelyal bariyer fonksiyonunun korunmasını ve iltihap doku hasarının bastırılmasını kapsayan göz yüzeyi bütünlüğünün çok yönlü kor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu el yazmasında tanımlanan çalışmayı uygunsuz şekilde etkileyebilecek finansal veya başka bir rekabet eden çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Deney dönemi boyunca optimal barınma koşullarını koruyan Jinan 2. Halk Hastanesi laboratuvar personeli ve hayvan bakım tesisi personelinin teknik desteğini takdir ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-CD103-APC antikoruBiolegendKlon 2E7Akış sitometrisi ve hücre sıralaması
Anti-CD8 manyetik mikroboncuklarMiltenyi Biotec-Manyetik hücre ayrımı
Korneal Oregon yeşil-dextranInvitrogenD7172Moleküler ağırlık 70.000
ELISA kiti IFN-γeBioscienceBMS606Sitokin nicelenmesi
ELISA IL-13 kitieBioscienceBMS6015Sitokin nicelenmesi
ELISA kit IL-17AeBioscienceBMS6001Sitokin nicelenmesi
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleriversion 1.53k
Fenol kırmızı pamuk iplikleriHızlıca Yokota-Gözyaşı üretimi ölçümü
Skopolamin hidrobromidMelonepharmaMB5860Muskarinik antagonist

Kaynaklar

  1. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  2. Harrell, C. R., Feulner, L., Djonov, V., Pavlovic, D., Volarevic, V. The molecular mechanisms responsible for tear hyperosmolarity-induced pathological changes in the eyes of dry eye disease patients. Cells. 12 (23), 2755(2023).
  3. Britten-Jones, A. C., et al. Epidemiology and risk factors of dry eye disease: considerations for clinical management. Medicina (Kaunas). 60 (9), 1458(2024).
  4. Bhujbal, S., Rupenthal, I. D., Steven, P., Agarwal, P. Inflammation in dry eye disease-pathogenesis, preclinical animal models, and treatments. J Ocul Pharmacol Ther. 40 (10), 638-658 (2024).
  5. Nieto-Aristizabal, I., Mera, J. J., Giraldo, J. D., Lopez-Arevalo, H., Tobon, G. J. From ocular immune privilege to primary autoimmune diseases of the eye. Autoimmun Rev. 21 (8), 103122(2022).
  6. Sheppard, J., Shen Lee, B., Periman, L. M. Dry eye disease: identification and therapeutic strategies for primary care clinicians and clinical specialists. Ann Med. 55 (1), 241-252 (2023).
  7. Rolando, M., Merayo-Lloves, J. Management strategies for evaporative dry eye disease and future perspective. Curr Eye Res. 47 (6), 813-823 (2022).
  8. Vereertbrugghen, A., et al. CD4+ T cells drive corneal nerve damage but not epitheliopathy in an acute aqueous-deficient dry eye model. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (48), e2407648121(2024).
  9. Yaman, E., et al. Mouse corneal immune cell heterogeneity revealed by single-cell RNA sequencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (12), 29(2024).
  10. Niederkorn, J. Y., et al. Desiccating stress induces T cell-mediated Sjogren's syndrome-like lacrimal keratoconjunctivitis. J Immunol. 176 (7), 3950-3957 (2006).
  11. Ogawa, Y., Takeuchi, T., Tsubota, K. Autoimmune epithelitis and chronic inflammation in Sjogren's syndrome-related dry eye disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11820(2021).
  12. Flippe, L., Bezie, S., Anegon, I., Guillonneau, C. Future prospects for CD8+ regulatory T cells in immune tolerance. Immunol Rev. 292 (1), 209-224 (2019).
  13. Olson, K. E., Mosley, R. L., Gendelman, H. E. The potential for Treg-enhancing therapies in nervous system pathologies. Clin Exp Immunol. 211 (2), 108-121 (2023).
  14. Boonpiyathad, T., Sozener, Z. C., Akdis, M., Akdis, C. A. The role of Treg cell subsets in allergic disease. Asian Pac J Allergy Immunol. 38 (3), 139-149 (2020).
  15. Xu, W., Bergsbaken, T., Edelblum, K. L. The multifunctional nature of CD103 (αEβ7 integrin) signaling in tissue-resident lymphocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C1161-C1167 (2022).
  16. Zhang, X., et al. CD8+CD103+ iTregs inhibit chronic graft-versus-host disease with lupus nephritis by the increased expression of CD39. Mol Ther. 27 (11), 1963-1973 (2019).
  17. Liu, Y., et al. Phenotypic and functional characteristic of a newly identified CD8+ Foxp3- CD103+ regulatory T cells. J Mol Cell Biol. 6 (1), 81-92 (2014).
  18. Chen, Q., et al. CD8+ CD103+ iTregs protect against ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury by inhibiting pyroptosis. Apoptosis. 29 (9-10), 1709-1722 (2024).
  19. Kaneko, N., et al. Cytotoxic CD8+ T cells may be drivers of tissue destruction in Sjogren's syndrome. Sci Rep. 12 (1), 15427(2022).
  20. Kudryavtsev, I., et al. Circulating CD8+ T cell subsets in primary Sjogren's syndrome. Biomedicines. 11 (10), 2778(2023).
  21. Heidari, M., Noorizadeh, F., Wu, K., Inomata, T., Mashaghi, A. Dry eye disease: emerging approaches to disease analysis and therapy. J Clin Med. 8 (9), 1439(2019).
  22. Ibiayo, A. G., Varinthra, P., Nagarajan, M., Liu, I. Y. Coniferaldehyde reverses 3-nitropropionic acid-induced Huntington's disease pathologies via PKM2 restoration and JAK2/STAT3 inhibition. Mol Med. 31 (1), 271(2025).
  23. Loi, J. K., et al. Corneal tissue-resident memory T cells form a unique immune compartment at the ocular surface. Cell Rep. 39 (8), 110852(2022).
  24. Kennedy-Batalla, R., et al. Treg in inborn errors of immunity: gaps, knowns and future perspectives. Front Immunol. 14, 1278759(2023).
  25. Suffia, I., Reckling, S. K., Salay, G., Belkaid, Y. A role for CD103 in the retention of CD4+CD25+ Treg and control of Leishmania major infection. J Immunol. 174 (9), 5444-5455 (2005).
  26. De Paiva, C. S., et al. IL-17 disrupts corneal barrier following desiccating stress. Mucosal Immunol. 2 (3), 243-253 (2009).
  27. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  28. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  29. Zareh, H., et al. Doxycycline versus curcumin for inhibition of matrix metalloproteinase expression and activity following chemically induced inflammation in corneal cells. J Ophthalmic Vis Res. 19 (3), 273-283 (2024).
  30. Yang, X., et al. IFN-gamma facilitates corneal epithelial cell pyroptosis through the JAK2/STAT1 pathway in dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (3), 34(2023).
  31. Lollett, I. V., Galor, A. Dry eye syndrome: developments and lifitegrast in perspective. Clin Ophthalmol. 2018, 125-139 (2018).
  32. Zhang, X., et al. CD8+ cells regulate the T helper-17 response in an experimental murine model of Sjogren syndrome. Mucosal Immunol. 7 (2), 417-427 (2014).
  33. Zhou, H., Yang, J., Tian, J., Wang, S. CD8+ T lymphocytes: crucial players in Sjogren's syndrome. Front Immunol. 11, 602823(2020).
  34. Lu, Z., et al. Rapid and quantitative detection of tear MMP-9 for dry eye patients using a novel silicon nanowire-based biosensor. Biosens Bioelectron. 214, 114498(2022).
  35. Burgalassi, S., et al. Functionalized hyaluronic acid for "in situ" matrix metalloproteinase inhibition: a bioactive material to treat the dry eye syndrome. ACS Macro Lett. 11 (10), 1190-1194 (2022).
  36. Chen, X., et al. Tc17/IL-17A up-regulated the expression of MMP-9 via NF-kappaB pathway in nasal epithelial cells of patients with chronic rhinosinusitis. Front Immunol. 9, 2121(2018).
  37. Alam, J., et al. IL-17 producing lymphocytes cause dry eye and corneal disease with aging in RXRalpha mutant mouse. Front Med (Lausanne). 9, 849990(2022).
  38. Flores-Pliego, A., et al. Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) is an endogenous activator of the MMP-9 secreted by placental leukocytes: implication in human labor. PLoS One. 10 (12), e0145366(2015).
  39. You, Y., et al. Investigation of conjunctival goblet cell and tear MUC5AC protein in patients with Graves' ophthalmopathy. Transl Vis Sci Technol. 12 (10), 19(2023).
  40. Tukler Henriksson, J., Coursey, T. G., Corry, D. B., De Paiva, C. S., Pflugfelder, S. C. IL-13 stimulates proliferation and expression of mucin and immunomodulatory genes in cultured conjunctival goblet cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4186-4197 (2015).
  41. Fang, Z., et al. Clinical ocular surface characteristics and expression of MUC5AC in diabetics: a population-based study. Eye (Lond). 38 (16), 3145-3152 (2024).
  42. Garcia-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-gamma with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunol. 9 (1), 206-217 (2016).
  43. Volpe, E. A., et al. Interferon-gamma deficiency protects against aging-related goblet cell loss. Oncotarget. 7 (40), 64605-64614 (2016).
  44. Gustafsson, J. K., Hansson, G. C. Immune regulation of goblet cell and mucus functions in health and disease. Annu Rev Immunol. 43 (1), 169-189 (2025).
  45. Lin, N., et al. Ectoine enhances mucin production via restoring IL-13/IFN-gamma balance in a murine dry eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (6), 39(2024).
  46. Ogawa, Y., Shimizu, E., Tsubota, K. Interferons and dry eye in Sjogren's syndrome. Int J Mol Sci. 19 (11), 3548(2018).
  47. Zhang, X., et al. Interferon-gamma exacerbates dry eye-induced apoptosis in conjunctiva through dual apoptotic pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6279-6285 (2011).
  48. Hassan, M., Elzallat, M., Mohammed, D. M., Balata, M., El-Maadawy, W. H. Exploiting regulatory T cells (Tregs): cutting-edge therapy for autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 155, 114624(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ok ler Y zey nflamasyonuD zenleyici T H creleriAdaptif TransferManyetik H cre Ay klamaG zya retimiKornea Bariyer B t nlCD4 T H creleriSitokin Mod lasyonu
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.