Yöntem makalesi

Salmonella Serotip Tahmini İçin Stratifike Genomik Çerçeve: Güneybatı Çin'de MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S ve SISTR'nin Değerlendirilmesi

500 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

9 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Salmonella serotip tahmini için stratifike genomik bir iş akışı oluşturur; rutin gözetim için MLST veya SeqSero2S, salgın tespiti için çekirdek genomlu SISTR MLST ve hızlı tarama için SeqSero2S kullanılır. Protokol, Çin'de gözetimi artırmak için çok merkezli bir analizle doğrulandı.

Özet

Salmonella'nın doğru serotiplenmesi, etkili gözetim ve salgın araştırması için gereklidir; çünkü serotip çeşitliliği doğrudan patogenlik ve halk sağlığı risk değerlendirmesini etkiler. Ancak, geleneksel slayt aglütinasyon yöntemleri, düşük tekrarlanabilirlik, emek yoğunluğu ve yüksek maliyetler nedeniyle sınırlıdır; bu da yüksek verimli izleme programlarında uygulanmasını engeller. Bu sınırlamaları gidermek için, Multilocus Sequence Tipleme (MLST), Salmonella In Silico Tipleme Kaynağı (SISTR), SeqSero, SeqSero2 ve SeqSero2S'yi bütüngenom dizileme verileriyle serotip tahmini için entegre eden genomik bir iş akışı geliştirdik ve doğruladık. Bu protokol, Güneybatı Çin'deki gıda ve insan kaynaklarından toplanan 315 Salmonella izoletinin çok merkezli analiziyle değerlendirildi. Bu çalışmanın bulguları, genomik yaklaşımlar arasında (eğitim setinde sırasıyla %100/%99,1/%90,1 ve SISTR/MLST/SeqSero2S doğrulama setinde %100/%97,1/%93,1) geleneksel serotiplemeye kıyasla anlamlı derecede daha yüksek uyumluluk göstermiştir. İş akışı, gözetim bağlamına dayalı uygun tahmin yöntemlerinin seçilmesi için öneriler içerir; rutin izleme için MLST ve SeqSero2S, hızlı tarama için SeqSero2S ve salgın araştırmaları için çekirdek genomlu SISTR ile SISTR vurgulanır. Bu yaklaşım, genomik serotiplemenin halk sağlığı uygulamalarına entegrasyonunu kolaylaştırır, geleneksel serolojiye bağımlılığı azaltır ve Salmonella izleme programlarında tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirliği artırır.

Giriş

Salmonella, küresel olarak en önemli gıda kaynaklı patojenlerden biridir ve önemli hastalık ve ölümlere nedenolur 1,2. Çin'de, gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir; enfeksiyonların çoğunluğunu sınırlı sayıda serotipoluşturur 3. Doğru serotip tanımlama, gözetim ve salgın araştırmaları için çok önemlidir; çünkü serotip çeşitliliği patogenlik ve halk sağlığı riskiyle yakından ilişkilidir. Bu, Salmonella enteritidis ve Salmonella typhimurium gibi yaygın serotiplerde iyi bilinir, ancak Salmonella Panama gibi daha az incelenen bazı serotipler de küresel yayılma ve istilacıhastalıkların önemli bir nedenidir ve sağlam serotipleme yeteneklerine olan genel ihtiyacı ortaya koyuyor. Uzun süredir altın standart olarak kabul edilen geleneksel serotipleme yöntemleri, 150'den fazla antisera gerektiren, zaman alıcı ve yüksek maliyetli birsüreçtir. Zayıftekrarlanabilirlik 6, emek yoğun işakışları 7 ve agglutinasyon reaksiyonlarının öznelyorumlanmasından kaynaklanan doğaüstü değişkenlik ile daha da kısıtlanırlar 8; bu da yüksek verimli izleme programları için yetersizkılar 9.

Tam genom dizilemesinin (WGS) ortaya çıkışı, hızlı ve yüksek çözünürlüklü serotip tahminini mümkün kılarak patojenlerinkarakterizasyonunu dönüştürdü 10,11,12. Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 ve Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15 dahil olmak üzere birkaç in silico araç geliştirilmiştir. MLST standart, uzun vadeli epidemiyolojik takipsunarken, SeqSero2 ve SeqSero2S ham okumalardan doğrudan analiz sağlar ve yaygınserotipler 14,15'in yüksek verimli taramasını kolaylaştırır. Buna karşılık, SISTR birleştirilmiş genomlar gerektirir ancak antijen gen tespitini çekirdek genom çoklu lokus dizisi tipi (cgMLST) ile entegre eder ve salgın araştırmaları için kapsamlı çözünürlüksağlar 17. WGS tabanlı Salmonella karakterizasyonu araştırmalarda giderek birincil kanıt olarakbenimsense de 16,18,19, ancak büyük ölçekli gözetimde uygulanması sınırlı kalır; bu boşluk, yöntemin uygunluğunu etkileyen ele alınmamış pratik hususlara bağlı. Küresel bir anket, katılımcı laboratuvarların sadece %8'inin rutin gözetim için WGS kullandığını ve analitik karmaşıklığın büyük bir engelolduğunu ortaya koydu. Örneğin, güvenilir serotip tahmini, uygun dizileme derinliğine (maliyet etkinliği için genellikle >75×, yüksek kaliteli analiz için ideal olarak ~200×) ve yüksek kaliteli genom montajlarına (maliyet etkin minimum olarak N50 > 30 kbp, tercihen >100 kbp), özellikle montaj bağımlısı araçlar (SISTR 21,22,23 gibi) bağlıdır. Ayrıca, araç seçimi laboratuvarın hesaplama kaynakları ve uzmanlığıyla uyumlu olmalıdır: SeqSero2S gibi açık kaynak araçlar, ham okumaları analiz ederek ve hesaplama açısından yoğun montaj15'i atlayarak hızlı tarama için daha hızlı alternatifler sunarken, sınırlı biyoinformatik kapasiteye sahip laboratuvarlar veri analizi ve depolama konusunda zorlanabilir. Sonuç olarak, serolojik testlerin büyük ölçekli gözetimde azaltılıp azaltılamayacağını belirlemek için yeterli veriyoktur 20,24, bu da kaynaklara uyarlanabilir yaklaşımların gerekliliğini ortaya koymaktadır. Özellikle, COVID-19 pandemisinin ardından, sağlık kurumlarının çeşitli seviyelerinde önemli miktarda boşta dizileme cihazları ve qPCR bulunmakta olup, bu kapasitenin genomik gözetim için yeniden kullanılmasına olanak sağlamaktadır.

Bu boşluğu gidermek için, yukarıda bahsedilen genomik serotipleme araçlarının çok merkezli bir değerlendirmesini yaptık; Güneybatı Çin'de gıda ve insan kaynaklarından toplanan 315 Salmonella izolat 25,26 kullandık. Bu bulgulara dayanarak, farklı laboratuvar kaynakları ve gözetim ihtiyaçlarını hesaba katan tabakalı bir iş akışı geliştirdik ve farklı bağlamlarda araç seçimi için net kriterler sağladık. Bu çerçeve, hızlı tarama için SeqSero2S ve salgın araştırmaları için SISTR ile cgMLST'yi birleştirerek genomik yaklaşımların benimsenmesini kolaylaştırıyor ve geleneksel serotipleme yöntemlerine bağımlılığı azaltıyor. Burada, iş akışının her adımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz; izole tanımlama, dizileme, veri analizi ve farklı gözetim bağlamlarında tahmin araçları seçme kriterleri dahil.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan dışkı örneklerinin toplanması ve işlenmesi, Helsinki Bildirgesi ve İyi Klinik Uygulama uyarınca, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Dördüncü Hastanesi Etik Komitesi'nin (Protokol Numarası: HXSY-EC-2022093) onayı altında gerçekleştirilmiştir. Bilgilendirilmiş onay, ulusal halk sağlığı düzenlemelerine uygun olarak muaf edildi.

NOT: Canlı Salmonella kültürleri ve insan dışkı örnekleriyle ilgili tüm işlemler, standart mikrobiyolojik uygulamalar ve biyogüvenlik prosedürlerinde eğitimli personel tarafından Seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında yapılmalıdır. Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takın; laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük dahil. Kirlenmiş eldivenleri düzenli olarak dezenfekte edin ve değiştirin. Deneylerden önce ve sonra uygun bir dezenfektan (örneğin, %70 etanol, %1 sodyum hipoklorit) ile tüm çalışma yüzeylerini dezinfekte edin. Biyolojik maddeler içeren tüm sıvı ve katı atıkları otoklavlama yoluyla (örneğin, en az 30 dakika boyunca 121 °C'de) dezinfekte edin. Aerosol ve sıçrama oluşumundan kaçının. Aerosol oluşturabilecek tüm işlemleri (örneğin, santrifüjleme, şiddetli sallanma) sertifikalı biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin.

1. Gıda örneği toplama ve sürün tanımlanması

  1. Perakende pazarlardan veya işleme tesislerinden gıda örnekleri toplayın. Ulusal gıda güvenliği standardı GB 4789.4 ve Gıda Kaynaklı Hastalık Gözetim Programı'nın gizlilik protokollerine göre gıda örneklerinden Salmonella'yı izole edin.
  2. Ön zenginleştirme:
    1. Her bir gıda örneğinin tam olarak 25 gramını tartın. Numuneye 225 ml tamponlu Pepton Suyu (BPW) ekleyin (1:10 seyrelme oranı) ve tam homojenleşme ve daldırma için 30 saniye girdaba basın.
    2. Örneği BPW'de 36°C ± 1°C aralığında, 150 rpm'ye ayarlanmış sallama kuluçka makinesinde, 8-18 saat boyunca kuluçka edin.
      NOT: Seçici olmayan çorbada ön zenginleştirme, patojen yükünü önemli ölçüde artırır. Tüm sonraki malzemeleri (kaplar, pipetler vb.) son derece bulaşıcı olarak ele alın.
  3. Seçici zenginleştirme: Ön zenginleştirmeden sonra 1 mL numuneyi Tetrationat Buluşuna (TTB) aktarın. TTB'yi 42 °C'de 18-24 saat boyunca sarsmadan kuluçka edin.
  4. İzolasyon: Kuluçkadan sonra, zenginleştirilmiş kültürü aşağıdaki seçici agar plakalarına çizerek yerleştirilin: Hektoen Enterik (HE) agar, Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) agar ve CHROMagar Salmonella. Plakaları 36 °C'de 18-24 saat boyunca kuluçka edin.
    NOT: Plakaları çizerken, aerosol oluşumu ve çapraz kontaminasyon oluşturmaktan kaçınmaya dikkat edin. HE agar'da, varsayılan Salmonella kolonileri genellikle mavi-yeşil ile mavi renkte, siyah merkezli veya siyah olmayan renklerde görünür. Çevresindeki agar benzer yeşilimsi bir ton alabilir. XLD agar'da, varsayılan Salmonella kolonileri genellikle kırmızı ve siyah merkezli olur. CHROMagar'da, varsayılan Salmonella kolonileri, üreticinin belirttiği gibi magenta ile mor rengiyle karakterize edilir. Her seçici plakada, 18-24 saatlik kuluçkadan sonra iyi izole edilmiş koloniler bekleyin. Aşırı büyümüş plakalar (>300 koloni) seyreltme ve yeniden çizgileme gerektirebilir.
  5. Tanımlama: Plakaları şüpheli Salmonella kolonileri açısından inceleyin. Üreticinin analiz talimatlarına uygun olarak, Gram-negatif (GN) kimlik kartı ile otomatik tanımlama sistemi kullanarak şüpheli suşları tespit edin.
    NOT: GN kartlarının parti numaralarının geçerli olduğundan ve son kullanma tarihi içinde olduğundan emin olun.
    1. Saf bir koloniden belirlenen bulanıklığa (0,50-0,63 McFarland standardı) %0,45 tuzlu çözelti kullanarak bakteriyel bir süspansiyon hazırlanın.
    2. Askıyı GN kartına yükleyin ve testi yapın. Sistemin kartı otomatik olarak 35,0 °C ± 2,0 °C'de inkubasyon edecek şekilde ayarlandığından emin olun ve biyokimyasal reaksiyonları 8 saate kadar izleyin.
    3. Salmonella enterica ssp. enterica sonucunu %95 ≥ olasılık ve Mükemmel güven puanı ile kabul edin.
  6. Serotipleme: 37 °C'de gece kuluçkasından sonra Swarm agar plakasından tek koloniler alın. O-antijenleri ve H-antijenleri tespit etmek için slide agglutinasyon testleri yapın. Test için ticari olarak bulunan Salmonella antiserum kitlerini (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.

2. İnsan örnek toplama ve suş tanımı

NOT: Salmonella'nın insan dışkı örneklerinden izolasyonu için, Gıda Kaynaklı Hastalık Gözetim Programı'nın gizlilik protokollerini takip edin.

  1. Toplama: Yaklaşık 2 g taze boşalmış insan dışkısı örnekleri toplayın. Dışkı örneklerini temiz, kuru, geniş ağızlı kaplara yerleştirin. Dışkı örneklerini laboratuvara 1 saat içinde izole taşıma kutuları kullanılarak taşın, böylece örnek bütünlüğünü koruyun.
    DIKKAT: İnsan dışkı örnekleri Salmonella'nın ötesinde birden fazla patojen içerebilir. Tüm örnekleri potansiyel olarak bulaşıcı olarak ele alın ve biyolojik tehlike malzeme taşıma için standart önlemlere uyun.
  2. Aşılama: Toplanan dışkı örneklerini doğrudan aşağıdaki seçici agar plakalarına aşılayın: CHROMagar Salmonella, Salmonella-XLD agar ve Shigella (SS) agar.
    NOT: CHROMagar Salmonella ve XLD agar üzerindeki karakteristik koloni morfolojisi için adım 1.4'e bakınız. SS agar'da, varsayılan Salmonella kolonileri genellikle renksiz, opak veya siyah merkezli kahverengi olarak görünür. Agarın kendisi nispeten değişmemiştir.
  3. Tanımlama: Şüpheli Salmonella kolonilerini adımda 1.5'te tanımlandığı gibi tespit edin.
  4. Serotipleme: Adım 1.6'da açıklandığı gibi slayt aglütinasyonu ile serotipleme yapılmaktadır.

3. Kütüphane hazırlığı ve tüm genom dizileme

  1. Bakteriyel kültür: LB agar'da Streak Salmonella , 37 °C'de 12 saat kuluçka içinde. Bir koloni seçin, 200 mL LB çorbasına aşılayın ve 150 rpm'de (37 °C, 12 saat) çallayın. Hücreleri toplamak için 12.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    NOT: Tüm santrifüj adımlarını aerosol oluşumunu önlemek için kapalı rotorlar veya emniyet kaplarıyla yapın.
  2. DNA çıkarma: Üreticinin protokolüne uygun olarak ticari bir DNA çıkarma kiti ( bkz. Materyal Tablosu) kullanarak genomik DNA çıkartın.
    DIKKAT: Ticari DNA ekstraksiyon kitlerindeki reaktifler (örneğin, lizis tamponları, proteinaz K) solulursa veya cilt ile gözlerle temas halinde zararlı olabilir. Eğer uçucu reaktifler kullanılıyorsa, çıkarımı bir duman davlumbazında veya biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin ve uygun PPE giyin.
  3. DNA kalite değerlendirmesi: Genomik DNA'yı arındırın ve dsDNA Yüksek Duyarlılık Tahlil Kiti ile florometre kullanarak niceliklerini ölçerin. DNA bütünlüğünü 100 V'da %1 agaroz jel üzerinde elektroforez ile 45 dakika boyunca doğrulayın; yüksek kaliteli DNA, minimum lekelenme ile tek bir kompakt bant olarak >20 kbpolarak 27 görünür.
    NOT: (Kritik adım) Yüksek kaliteli, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA (~1.8-2.0 A260/A280 oranında) başarılı kütüphane hazırlığı ve dizilemesi için çok önemlidir.
    DIKKAT: Agararoz jel elektroforezinde kullanılan nükleik asit boyama boyaları (örneğin, GelRed, Ethidium Bromid) mutajeniktir. Jel ve boyama çözücüleriyle çalışırken her zaman eldiven takın ve bunları kurumsal tehlikeli atık düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edin.
  4. DNA parçalanması: Üreticinin protokolüne göre odaklı ultrasonikasyon sistemi kullanılarak yaklaşık 150 ng nitelikli genomik DNA yaklaşık ~350 bp boyutuna parçalanın.
  5. Dizileme kütüphanesini, ticari bir kütüphane hazırlık kiti kullanarak kesilen DNA parçalarından oluşturun ( bkz. Materyal Tablosu). Kesilen DNA parçalarının son onarımı ve 5' fosforilasyonu yapıldı. Sonra, 3' uçlara tek bir 'A' tabanı ekleyin ve indeksli dizileme adaptörlerini bağlayın.
  6. Kitte belirtildiği gibi sınırlı döngülü PCR programıyla adaptör ile bağlanmış DNA parçalarını amplifikasyon ve zenginleştirme.
  7. Florometri ve kapiller elektroforez gibi yöntemlerle nihai kütüphaneyi nitelendirmek ve niceliklendirmek.
  8. Standart operasyonel prosedürleri takip ederek bir dizileme platformunda eşleştirilmiş uçlu dizileme (2 × 150 bp) gerçekleştirin.

4. Veri analizi

  1. Ham dizileme verilerinin kalite kontrolü: Ham FASTQ dosyalarında varsayılan parametrelerle fastp (sürüm 0.23.0) kullanılarak ilk kalite kontrolünü gerçekleştirin. Amaç, adaptör dizilerini ve düşük kaliteli okumaları kaldırarak böylece sonraki analiz için temiz FASTQ verileri üretmektir.
  2. Yüksek kaliteli, filtrelenmiş okumaları SPAdes (sürüm 3.15.0) kullanarak taslak genomlara birleştirin; uyumsuzlukları ve kısa indelleri azaltmak için dikkatli bir seçenekle 26.
  3. Genom dizilerini (FASTQ / FASTA dosyaları) çeşitli serotip tahminleri için giriş olarak kullanın.
    1. MLST için, FASTQ dosyasını BioNumerics yazılımına (sürüm 7.6) aktarın.
      1. Şablonu İçe Aktar penceresinde, gelişmiş seçenekler altında Düzenleme ayrıştırma'ya tıklayın. Veri ayrıştırma dizesini ve veri dekorasyonunu [DATA] olarak ayarlayın. Dosya adının ayrıştırılması için DATA]_* ve [DATA] düzenli ifadelerini uygulayın. Şablonu kaydedin, seçin ve Sonra'ya tıklayın, ardından Bitir'e tıklayın. Göndermeyi Görev Gönder penceresinde doğrulamak için veri yüklemeyi onaylayın. CEStoreUploader aracı, WGS ham verilerini hesaplama motoruna aktarmak için otomatik olarak açılır.
      2. Yüklemeden sonra genom girişini seçin. WGS Tools'a gidin ve otomatik ST tahmini için "TraNetGenotype"ı seçin. TraNetGenotype diyalog kutusunda, suş türü olarak Salmonella seçin, Serotype Analizi, Virulans Analizi ve Antimikrobiyal Duyarlılık Analizi'ni seçin ve Evet'e tıklayın.
    2. SISTR için (sürüm 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parametreler: tüm parametreler varsayılan), bir terminal açın ve assembleed genom dosyasını içeren directory'ye assembly .fasta gidin.
      1. Serovar tahminini gerçekleştirmek ve CSV formatında kapsamlı bir rapor oluşturmak için aşağıdaki komutu çalıştırın: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Bu komut, tahmin edilen serovarı içeren bir rapor oluşturur.
        NOT: -QC: Montajda kalite kontrol kontrolleri yapar. -i assembly.fasta: Giriş FASTA dosyasını belirtir. -f csv: Çıkış formatını CSV olarak tanımlar. -o sistr_results: Çıktı dosyasının temel adını ayarlar (örneğin, sistr_results.csv). -p 4: Hesaplamayı hızlandırmak için analiz için 4 CPU iş parçacığı kullanır. --allel-output: allel dizilerini ve bilgileri bir JSON dosyasına kaydeder. --cgmlst-profiles: cgMLST allel profillerini bir CSV dosyasına dışa aktarır.
    3. SeqSero için (sürüm 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parametreler: tüm parametreler varsayılan), giriş veri dosyasını içeren dizine gidin. Analiz için varsayılan parametrelerle aşağıdaki komutu çalıştırın: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. Araç, öngörülen serotipe sahip dosyayı içeren Seqsero_result.txt içeren bir çıkış dizini oluşturur.
      NOT: -m 4, giriş tipini genom montajı olarak belirtir. -i giriş FASTA dosyasını tanımlar.
    4. SeqSero2 için (sürüm 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parametreler: tüm parametreler varsayılan). Aşağıdaki komutu çalıştırın: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Araç, tamamlandığında tahmin edilen serotipi doğrudan terminal ekranına gönderir. Çıktı, tahmin edilen serotipi sağlar.
      NOT: -m k: serotip determinantlarının benzersiz k-mer'leri kullanılarak hızlı serotip tahmini için k-mer tabanlı iş akışını belirtir. -t 4: Giriş tipini birleştirilmiş diziler olarak gösterir.
    5. SeqSero2S için (sürüm 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parametreler: tüm parametreler varsayılan): Verilen script ile çalıştırın: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Çıktı, tahmin edilen serotipi sağlar.
      NOT: -m k, ham okumaların veya genom montajlarının k-mer tabanlı analizini sağlar. -t 4, montajlı dizis girişini belirtir.

5. Kritik parametreler ve pratik hususlar

NOT: Aşağıdaki hususlar, özellikle kaynak sınırlı ortamlarda bu genomik iş akışının başarılı uygulanması için kritik öneme sahiptir.

  1. Ham dizileme verilerinin yeterli kapsama derinliği sağladığından emin olun. Yaklaşık 100x dizileme derinliği genellikle yüksek kaliteli analiz için yeterlidir.
    NOT: Maliyet etkinliğini önceliklendiren laboratuvarlar için, MLST veya SeqSero221 kullanılarak güvenilir serotip tahmini için pratik bir alt eşik olarak minimum 75x dizileme derinliği önerilir.
  2. Ham okumaların kalitesinin yüksek olduğunu ve Q30 puanının (temel çağrı doğruluğu %99,9) genellikle %90'ın üzerinde olduğunu doğrulayın.
  3. Birleştirilmiş contig gerektiren serotip tahmin araçlarına geçmeden önce de novo genom montajının kalitesini değerlendirin. N50 istatistiklerini ana ölçüt olarak kullanın.
    NOT: En az 100 kbp'ye sahip bir N5022 önerilirken, 30 kbp'den büyük bir N50 güvenilir analiz için asgarigereklilik olarak kabul edilmelidir 23.
  4. Filtrelenen okumalar birleştirilmiş genoma geri eşlendiğinde en az %≥98 okuma eşleme oranı sağlayarak montajın tamlığını kontrol edin.

6. Yüksek verimli salmonella gözetimi için önerilen serotip tahmin protokolü

NOT: Gözetim bağlamı, gerekli doğruluk ve mevcut laboratuvar kaynaklarına göre serotip tahmin yöntemleri seçin. Yüksek verimli Salmonella gözetimi için aşağıdaki protokolü takip edin:

  1. Ön Tanımlama: İzolatların Salmonella türleri olarak doğrulanması için GB 4789.4 uyarısına uygun ilk tarama yapılmalıdır.
    NOT: Bu aşamada, izolatların spesifik serotipini belirlemeye gerek yoktur.
  2. Rutin gözetim (Yüksek Geçirimli mod): BioNumerics artık güncellenmediği için, rutin gözetim için, açık kaynak MLST28, SeqSero2S veya sürekli teknik destek ve güncellemeler alan diğer doğrulanmış, kullanıcı dostu genomik analiz platformlarını kullanın.
    NOT: MLST için: 7-genlik şema, uzun vadeli epidemiyoloji ve küresel suş karşılaştırması için ideal, standartlaştırılmış, taşınabilir ve filogenetik olarak bilgilendirici bir profil (Dizi Tipi, ST) sunar. Basitliği, hızlı analiz ve minimum hesaplama yükü sağlar. SeqSero2S için: Hızlı serotip tahmini ve entegre MLST sonuçlarının tek bir çalışmada çift avantajını sağlar. Ham dizileme okumalarını doğrudan analiz edebilir, genom montajını atlayarak zaman ve kaynak tasarrufu sağlar. Toplu FASTA verileriyle bile, serotip tahminini hesaplamalı analizlere dayanmadan bağımsız olarak gerçekleştirdiği için SISTR gibi araçlardan daha hızlıdır.
  3. Hızlı tarama (Zaman hassasiyetli ayarlar): Hızlı sonuçlar veya sınırlı hesaplama kapasitesine sahip laboratuvarlarda ön serotip tahmini için SeqSero2S kullanın.
    NOT: SeqSero2S tahminleri yapılırken, temel olarak "I_4,[5],12:i:-" kavramının Salmonella Typhimurium olarak yorumlanması önerilir.
  4. Salgın araştırması (Yüksek doğruluk modu): Yüksek çözünürlük gerektiren salgın izleme için, serotip tahminini desteklemek ve kaynak takibi için yüksek çözünürlüklü küme analizi sağlamak amacıyla cgMLST kullanan SISTR kullanabilirsiniz.
  5. Kalite kontrolü ve tutarsız sonuç onayı:
    1. Yaygın dizileme tipi suşlar için rastgele doğrulama yapılabilir. Yaygın olmayanlar için %20 doğrulama oranı kullanın. Tutarsız serotipleme sonuçları durumunda, izolatları kesin sonuç için daha üst düzey veya referans laboratuvara yönlendirin.
    2. Doğrulayıcı analiz için, en az iki farklı in silico tahmin aracıyla tekrarlanan genomik analiz dahil olmak üzere birden fazla doğrulanmış yöntem kullanın; en az iki farklı araçla in silico tahmin tekrarı; Yüksek çözünürlüklü WGS tabanlı yöntemlerle filogenetik bağlamlandırma (örneğin, cgMLST veya tam genom SNP analizi)29.
    3. Bu kapsamlı kanıttan uzlaşıya dayanarak nihai serotipi atayın.
      NOT: Yaygın olmayan serotipler için önerilen %20 doğrulama oranı, genomik araçların yaygın olmayan serotipler arasında bile yüksek uyumluluk (SISTR vs. MLST için %93,3, SISTR vs. SeqSero2S için %95,0) koruması gözlemine dayanmaktadır (Tablo 1). Bu eşik maliyet açısından etkilidir ve rutin gözetimde genomik araçlar arasındaki düşük frekanslı tutarsızlıkları tespit etmek için yeterli bir güvenlik marjı sağlar.

7. İstatistiksel analiz

  1. R yazılımı (sürüm 4.1.2) kullanılarak veri analizi yapılabilir.
  2. Kategorik değişkenleri yüzdeli frekanslar olarak sunun.
  3. Kategorik veriler için χ2 testleri kullanan grupları karşılaştırın, P-değerini <0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol, Güneybatı Çin'den 315 Salmonella izolatı kullanılarak doğrulandı; 213 izolat (2/3) eğitim seti olarak kullanıldı; bu yöntem beş WGS tabanlı serotip tahmin yöntemini (MLST, SISTR, SeqSero2 ve SeqSero2S) geleneksel serotipleme sonuçlarıyla karşılaştırmak için kullanıldı; kalan 102 izolat (1/3) ise MLST, SISTR ve SeqSero2S performansını değerlendirmek için doğrulama seti olarak kullanıldı.

Eğitim kümesi analizi (n = 213)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Güneybatı Çin'den 315 Salmonella izolatını kapsayan bu geniş ölçekli değerlendirme, WGS tabanlı serotipleme yöntemlerinin geleneksel yaklaşımlara kıyasla daha iyi tekrarlanabilirliğini (%84,1 vs. %62,9 kapsama, P<0,001) göstermektedir. Bulgularımız, örnek hazırlama ve DNA kalite kontrolünün kritik ilk adımlarının (bölüm 1-3) doğrudan aşağı akış güvenilirliğini etkilediği kapsamlı bir genomik iş akışını doğrulamaktadır. Protokol, montaja bağlı araçlar için yüksek kaliteli genom m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Tibet ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Bürosu Finansmanı (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 H.Z. ve 2024NSFSC0033 to X.P.), Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2024JDRC0032 to Y.X.), Sağlık Yeni Verimlilik Enstitüsü Projesi (HN240302C H.Z.), Halk Sağlığı Laboratuvar Bilimleri Disiplin Canlandırma Projesi (2023SY-04 ile H.Z.), tarafından desteklendi. Batı Çin Halk Sağlığı Okulu/Batı Çin Dördüncü Hastanesi, Sichuan Üniversitesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BioNumerics (sürüm 7.6)Uygulamalı Matematikhttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/serotip tahmini/filojenik analiz
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson ve Şirketi214983Seçici Salmonella kromojenik ortamı
Fastp (sürüm 0.23.0)Açık kaynakhttps://github.com/OpenGene/fastpKalite kontrolünü okuyun
Illumina NovaSeq 6000 Dizileme SistemiIllumina20012850Tam genom dizileme platformu
M220 Odaklı ultrasonikatorCovaris500295DNA kesme
Magbeads Hızlı DNA Kiti Toprak İçinMP BiyomedikalMP116560200Genomik DNA çıkarma kiti
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Veri yönetimi
NEXTFLEX Hızlı DNA-Dizili KitiRevvity50-255-1124Kütüphane hazırlığı dizileme
Qubit 2.0 FluorometreThermo Fisher ScientificQ32866DNA nicelik
Kubit dsDNA Yüksek Duyarlılık Test KitiThermo Fisher ScientificQ32851DNA nicelik
R (sürüm 4.1.2)R Vakfıhttps://www.r-project.org/İstatistiksel hesaplama
Salmonella Antiserum KitiStatens Serum Enstitüsü60898O/H-antijen tespiti
SeqSeroAçık kaynakhttps://github.com/denglab/SeqSeroSerotip tahmini
SeqSero2Açık kaynakhttps://github.com/denglab/SeqSero2Serotip tahmini
SeqSero2SAçık kaynakhttps://github.com/denglab/SeqSero2sSerotip tahmini
SISTRAçık kaynakhttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdSerotip tahmini
SPAdes (sürüm 3.15.0)Açık kaynakhttps://github.com/ablab/spadesGenom montajı
Sürü AgarBD Biosciences211519Serotipleme inkubasyonu için kullanılır
TBS-380 FlorometreTurner BioSystemsP/N 3800-003DNA nicelik
VITEK 2 Kompakt SistemBioMé Rieux95061-768Otomatik mikrobiyal tanımlama sistemi

Kaynaklar

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Genomik Serotiplendirmeok Lokuslu Sekans TiplendirmesiT m Genom DizilemeHalk Sa l S rveyansSalg n Ara t rmasekirdek Genom MLSTSerotip Uyumu

İlgili makaleler