Lentiviral vektörler kullanılarak 10 kb'yi aşan transgenlere sahip kimerik antijen reseptör (CAR) T hücrelerinin verimli üretimi

Özet

Burada, lentiviral vektörler kullanılarak 10 kb'yi aşan büyük transgenlere sahip Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek için optimize edilmiş bir iş akışını sunuyoruz.

Özet

Birden fazla reseptörün kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerine mühendislik yapması, antijen negatif nüksü önlemek ve hedefte/tümör dışı toksisiteleri azaltmak için güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, çok reseptörlü CAR T hücrelerinin üretimi hâlâ zordur; çünkü lentiviral transgen boyutlarının artması viral titrerleri ve T hücresi transdüksiyon oranlarını önemli ölçüde azaltmaktadır. Mevcut üretim iş akışları, düşük verimli üretimlerden dönüştürülmüş T hücrelerini zenginleştirmek için hücre sıralamasına dayanır. Ancak, hücre ayırma teknikleri CAR T hücrelerinin mutlak sayısını artırmaz ve zaten karmaşık olan üretim sürecine daha fazla karmaşıklık eklemez. Sonuç olarak, bu sınırlamalar çoklu reseptörlü CAR T hücrelerinin klinik translasyonunu engeller ve yeni nesil immünoterapilerin gelişimini kısıtlar.

Burada, büyük lentiviral transgenlerle CAR T hücreleri üretmek için optimize edilmiş detaylı, adım adım bir üretim iş akışını sunuyoruz. Bu iş akışını kullanarak, transgen boyutlarında boyutlara bağlı transdüksiyon verimliliğinde boyuta bağlı artışlar gösteriyoruz; en belirgin artış ise 10,1 kb lentiviral vektörde gözlemlenerek 14,8 kata kadar gerçekleşmiştir. Önemli olarak, iş akışı sağlam T hücre genişlemesini destekler ve hücre sıralama ihtiyacını ortadan kaldırır. Lentiviral gen transferindeki mevcut boyut sınırlamalarını aşarak, bu iş akışı çoklu reseptörlü CAR T hücrelerinin verimli üretimini mümkün kılarak ileri immünoterapilerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Giriş

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri, immünoterapi alanında devrim niteliğinde bir hal yaratmıştır. Ancak, olağanüstü başarılarına rağmen, tümör mikroçevresi (TME) aracılı immünosupresyon, antijen negatif tümör nüksü ve hedefte/tümör dışı toksisiteler gibi kritik zorluklar^devam etmektedir ^1,2. Çift CAR'lar, birleşik CAR ve TCR yapıları veya sitokin anahtar reseptörleri gibi birden fazla sentetik reseptörle CAR T hücrelerinin mühendisliği bu engelleri aşma potansiyeline^{sahiptir 3,4}. Kan kanserlerinde, efektör T hücrelerinin çift CAR ile donatılması, CD19 ve^{CD20 5} gibi iki farklı antijenin eşzamanlı hedeflenmesine olanak tanır ve böylece tümör antijeninin kaçma riskini azaltır. Katı tümörlerde, hedefe uygun/tümör dışı toksisiteler, örneğin, mantıksal kapılı CAR ifadesini mümkün kılan ve hedefleme hassasiyetini artıran sentetik Notch (synNotch) reseptör devreleri^{dahil edilerek azaltılabilir} 6,7,8,9,10,11,12,13 . Ancak, birden fazla reseptör taşıyan CAR T hücrelerinin üretimi, transgen boyutundaki altta yatan artış nedeniyle hâlâ zordur. İnsan bağışıklık yetmezliği virüsü (HIV) tip 1'den türetilen kendini inaktive eden üçüncü nesil lentiviral vektörler, araştırma ve klinik ölçekte CAR T hücresi üretimi için^{güncel altın standart olarak} kabul edilmektedir. CAR T hücreleri üretmek için, lentiviral vektörler, T hücresi genomuna entegrasyonu sağlayan uzun terminal tekrar (LTR) dizileriyle çevrili özelleştirilmiş CAR ekspresyon kasetleriyle mühendislik edilir. Mevcut lentiviral vektörlerin maksimum etkili paketleme kapasitesi (EPC) yaklaşık 9,2 kilobaz (kb) LTR-den LTR'ye olup, HIV-1'in doğal genom boyutuna karşılık gelir. Lentiviral titrerler vektör uzunluğu arttıkça yarı-logaritmik^{olarak azaldıkça 15}, çoklu reseptörlü büyük transgenlerin mühendisliği lentiviral üretim verimlerini ciddi şekilde azaltır ve nihayetinde CAR T hücresi üretimini^{engeller 16}. Manyetik veya floresansla aktive hücre ayırma (sırasıyla MACS veya FACS) gibi hücre ayırma teknikleri, düşük verimli üretimlerden CAR T hücrelerini zenginleştirmek için kullanılabilse de, bu yöntemler CAR T hücrelerinin mutlak sayısını artırmaz ve zaten karmaşık olan üretim sürecine daha fazla karmaşıklık katmaz. Sonuç olarak, büyük lentiviral transgenlere sahip CAR T hücrelerinin üretim zorlukları, hem preklinik araştırmalar hem de klinik uygulama için büyük bir engel olmaya devam etmektedir.

Yakın zamanda, tek vektör synNotch (svsNotch) sistemi¹⁷ gibi büyük lentiviral transgenleri taşıyan efektör T hücreleri için optimize edilmiş bir CAR T hücresi üretim iş akışı oluşturduk. Burada, geniş çapta benimsenmesini kolaylaştırmak için metodolojiyi adım adım bir protokolle detaylandırıyoruz. Kavramın kanıtı olarak, 5.7 kb'den 9.2 kb'ye ve 10.1 kb'ye kadar değişen lentiviral transgen boyutlarında boyuta bağlı transdüksiyon verimliliğinde iyileşmeler gösteriyoruz. Genel olarak, bu optimize edilmiş iş akışı transdüksiyon oranlarını 14,8 katına kadar artırır, böylece hücre ayırma ihtiyacını ortadan kaldırır ve 10 kb'yi aşan transgen boyutlarına sahip efektör T hücrelerinin verimli üretimini sağlar.

Protokol

İnsan T hücreleri, MIATA ve Pennsylvania Üniversitesi etik yönergelerine uygun örnek alımı, işleme, dondurma ve analiz için belirlenmiş standart işletim prosedürleri ve/veya protokolleriyle İyi Laboratuvar Uygulamaları ilkeleri altında faaliyet gösteren Pennsylvania Üniversitesi İnsan İmmünoloji Merkezi'nden temin edilmiştir.

NOT: Lentivirüs ve CAR T hücresi üretimi için optimize edilmiş iş akışının şematik bir genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir. Temel optimizasyon adımlarının mevcut standart iş akışıyla karşılaştırılması Tablo 1'de özetlenmiştir. Tüm hücre kültürleri, %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş RPMI-1640 içeren T hücre ortamı (TCM) ile %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka ünitesinde 37 °C sıcaklıkta tutuldu; 10 mM HEPES tamponu, 2 mM L-alanil-L-glutamin (bkz. Malzeme Tablosu), 100 U/mL penisilin ve 100 U/mL streptomisin ile desteklendi.

Şekil 1: Büyük transgenlerle lentivirüs ve CAR T hücresi üretimi için optimize edilmiş iş akışı. Lentivirüs üretiminin şematik temsili (üstte) ve CAR T hücresi üretiminin (altta), viral titrerleri ve transdüksiyon verimliliğini artıran temel adımları ve optimizasyonları vurgular. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

		Standart iş akışı	Optimize edilmiş iş akışı
Virüs	Viral zarf	VSV-G	Cocal-G
	Transfeksiyon	L2000	L30001
	LV hasadı	24 saat2 + 48 saat2	30-36 saat3
T-hücresi	Gemi	T25 şişesi	96 kuyuklu düz taban plakası
	Yüzey/Hacim oranı	Değişken	5.12 cm2/mL4
	Adjuvant	Hiçbiri yok	SF1085
13 μL L3000 per 1 μg DNA, ortam değişikliği yok
2 santrifüj, 106.800 x g'de 2,5 saat için, yuvarlak taban boru
3 santrifüj, gece boyunca 12.300 x g, konik taban boru
Transdüksiyon sonrası 4ek medya takviyesi
555 μg/mL

Tablo 1: Standart ve optimize edilmiş iş akışlarının karşılaştırılması. Geliştirilmiş iş akışının mevcut standart iş akışına kıyasla temel optimizasyonları. Bu tablo, Rommel ve ^ark.17'nin izniyle uyarlanmıştır.

1. Lentivirüs üretimi

1. HEK293T hücrelerinin bakımı
   1. HEK293T hücrelerin eşit dağılımda, kümelerden arınmış ve %50-70 birleşimde olduğundan emin olun (tipik verim: 1,0-1,5 × T150 şişesi başına^10,7 hücre).
   2. Süpernatantı aspire edin, hücrelerin yerinden çıkmasını önlemek için flasın üst tarafına 20 mL oda sıcaklığında (RT) PBS ekleyin, hücrelerin üzerinde nazikçe PBS döndürün ve yıkamayı aspire edin.
   3. 3 ml %0,05 Tripsin-EDTA ekleyin ve termosları sağa sola çevirerek RT'de 15-30 saniye kuluçka yapın. Hücre ayrımını izle.
   4. 7 mL soğuk TCM ekleyin, hücreleri termosun altına yeniden süspansiyon ile tek hücreli süspansiyon oluşturacak şekilde yerleştirin ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Matayı 10-20 ml soğuk TCM ile yıkayın ve yıkamayı aynı tüpe ekleyin.
   5. Hücreleri santrifüj edin (300 × g, 5 dakika, 4 °C), süpernatantı aspire edin, 10 mL TCM ile tekrar süzülün ve hücreleri sayın.
   6. Plaka, T150 şişelerinde her 2 günde bir (örneğin Pazartesi ve Çarşamba) pasaj için 3 × 10-6 hücre HEK293T hücreler veya her 3 günde bir 1 × 10⁶ hücre (örneğin, hafta sonu için Cuma günü kaplama) 30 mL TCM ile 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış şekilde kullanılır.
2. Lentivirüs üretimi için HEK293T hücrelerin transfeksiyonu
   NOT: 2 gün sonra sürekli %70-80 birleşme sağlayan tohumlama yoğunluğunu belirlemek için küçük bir pilot deney yapın. Transfeksiyon anında HEK293T hücre birleşiminin %80'i geçmediğinden emin olun (bkz. Tartışma). Transfeksiyon, azaltılmış serum minimal temel ortam ve ticari lipofeksiyon reaktifleri (L3000 ve P3000, bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak optimize edildi.
   1. Yukarıda açıklandığı gibi tripsizasyon yoluyla HEK293T hücreleri hasat edin ve T150 şişesi başına plaka 4 × 10-6 hücre ile 30 mL TCM önceden 37 °C'ye ısıtılır.
   2. 2 gün sonra, kültürlerin eşit dağılımı ve %70-80 birleşik olduğunu doğrulayın.
   3. RT için 50 mL azaltılmış serum minimal temel ortamı ısıtın. Lentiviral plazmidleri erit, nazikçe karıştırın ve hızlıca spin yapın. Pulse vortex lipofeksiyon reaktiflerini hızlı döndürün ve RT'de bırakın.
   4. DNA master karışımlarını hazırlayın. Her şişe için şu sırayla birleştirin: 2 mL indirgenmiş serum minimal temel ortam, 39 μg lentiviral ambalaj plazmidleri (18 μg pTRP Gag-Pol, 18 μg pTRP RSV-Rev, 3 μg pTRP Kokal-G), 15 μg transfer plazmidi ve 108 μL P3000 reaktifi (2 μL P3000/μg DNA). Gerektiğinde ölçeklendirin ve pipetleme kaybını hesaba katmak için nihai miktarı en az %10 artırın. Pulse vortex, hızlı dönüş ve RT'de depola.
   5. L3000 master miksleri hazırlayın. Her şişe için şu sırayla birleştirin: 1,84 mL indirgenmiş serum minimal temel ortam ve 162 μL L3000 (3 μL L3000/μg DNA). Gerektiğinde ölçeklendirin ve pipetleme kaybını hesaba katmak için nihai miktarı en az %10 artırın. Pulse vortex, hızlı spin ve RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
   6. 5 dakika sonra, ilgili DNA ana karışımına her şişe başına 2 mL L3000 master karışımı ekleyerek yaklaşık 1:2 seyreltme elde edilir. L3000 karışımını yavaşça trubun altından başlayarak yanlarına dokunmadan ekleyin. Pipetle iyice karıştırın ve RT'de 15 dakika kuluçka yapın.
   7. Bu arada, her HEK293T kültüründen dikkatlice 6 mL süpernatantı çıkarın ve her termosunu etiketleyin.
   8. 15 dakika sonra, her kültürü şişeyi üst tarafa doğru eğip hücrelerin yerinden çıkmasını önlemek için termosun üst tarafındaki üst yüzeye yavaşça 4 mL transfeksiyon karışımı salarak transfekte edin. Yavaşça iki kez yukarı/aşağı pipetleyin, matayı orijinal konumuna geri getirin, nazikçe döndürün, tekrar kuluçka makinesine yerleştirin ve zamanı kaydedin.
      NOT: Kültürleri lentivirüs hasadına kadar rahatsız edilmeden bırakın. Üreticinin L3000 transfeksiyon karışımını içeren HEK293T süpernatantı transfeksiyon¹⁸ sonrası taze kültür ortamıyla değiştirmesi önerisine karşı, bu adımın çıkarılması daha yüksek lentiviral^{titrerleri 17} korur.
3. Lentiviral süpernatantların hasadı, konsantrasyonu ve dondurulması
   NOT: Bozulmayı önlemek için tüm işlem aşamalarında lentiviral süpernatantları buz üzerinde veya 4 °C'de tutun.
   DIKKAT: Lentiviral vektörler bulaşıcı maddeler olarak sınıflandırılır. Kişisel koruyucu ekipman (örneğin, çift eldiven, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü) kullanımı dahil olmak üzere uygun biyogüvenlik önlemlerine uyun. Tüm çalışma yüzeylerini %10 çamaşır suyu ve ardından %70 etanol ile dezinfekte edin. Kontamine edilmiş tüketim malzemeleri ve sıvı atıkları, kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak biyotehlike atık olarak bertaraf edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile dezenfekte edin.
   1. Ultrasantrifüj ekipmanlarını (kovalar, konik tüpler ve konik adaptörler) %10 çamaşır suyu ile temizleyin, ardından suyla durulayın. Kısa bir süre hava kurutma, ardından %70 etanol ile püskürtme ve doku kültürü kapağı altında hava ile kurutma işlemi yapılır.
   2. Ultrasantrifüjü yerleştirilmiş rotor ile önceden 4 °C'ye soğutun.
   3. Transfeksiyondan 30-36 saat sonra lentiviral süpernatantları 50 mL'lik tüplere aktararak hasat edin. Süpernatantları santrifüjle (500 × g, 5 dakika, 4 °C) aydınlaştırın, 0,45 μm gözenek filtresinden geçirin ve buzda saklayın.
   4. Kovalara konik adaptörler yerleştirin, filtrelenmiş süpernatantları konik ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve kovalara yükleyin. Karşı kovaları soğuk TCM ile dengeleyin, ağırlık farklarının 0.1 g'nin altında olmasını sağlayın.
   5. Süpernatantları gece boyunca 4 °C'de 12.300 × g ultrasantrifüjasyonla konsantre edin.
   6. Ertesi sabah, kovaları dikkatlice çıkarın ve buzun üzerinde saklayın.
   7. Dondurmak için kuru buzlu bir kutu ve alikot için etiketli kriyovialler hazırlayın.
   8. Bir doku kültürü başlığı altında, her kovayı açın ve içindeki ultrasantrifüj tüpünü forsepsle çıkarın. Her tüp için şu şekilde ilerleyin:
   9. Süpernatantı tüpün dibinden 0,5 inç mesafeye kadar dikkatlice aspire edin ve kalan sıvıyı 6 delikli bir plakaya boşaltın. Tüpten nazikçe dokunarak kalan sıvının bir kısmını çıkar.
   10. 300 μL soğuk TCM ekleyin, 30 saniye boyunca nazikçe tekrar süspansiyon yapın ve süspansiyonu kriyovial'e aktarın.
   11. Tüpü 200 μL soğuk TCM ile yıkayın ve yıkamayı aynı kriyoviale ekleyin.
   12. Lentivirüs titerasyonu için 60 μL nazikçe karıştırın ve aliquot yapın (bkz. adım 1.4), CAR T hücresi üretimi için birkaç 100 μL aliquot ve kalan hacim ile bir ek tüp ile kalan hacmi kalmak için kullanın. Aliquotları hemen kuru buzda snap-dondurun. Aliquotları uzun süreli depolama için -80 °C'ye aktarın.
4. Konsantre lentivirüslerin primer T hücreleriyle titerlenmesi
   NOT: Yaklaşık 1 × 10⁵ Her lentivirüs için seyreltme başına T hücreleri gereklidir. Örneğin, her biri sekiz seyreltici olan altı lentivirüs şu tür bir şey gerektirir: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4.8 × 10⁶ T hücreleri. Pipetleme kaybını hesaba katmak için ek hücreler hazırlanmalıdır. T hücreleri, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlarıyla kaplanmış manyetik aktivasyon boncukları kullanılarak uyarılır (bkz. Materyal Tablosu).
   1. T hücresi aktivasyonu (0. gün)
      1. Ön Şart: TCM'deki arındırılmış insan CD4⁺ ve CD8⁺ T hücrelerini hazır tutun.
      2. CD4⁺ ve CD8⁺ T hücrelerini sayın ve bunları 1:1 oranında birleştirin.
      3. Aktivasyon boncuklarını aşağıdaki şekilde yıkayın: Bir tüpe 1 mL TCM ekleyin, boncukları vortex ile yeniden süzülün ve gerekli miktarı aktararak boncuk-T hücrelerinin 3'e 1 oranı elde edin. Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve boncukların tüp duvarı boyunca bir pelet oluşturmasına izin verin. 30 saniye sonra, süpernatantı dikkatlice aspire edin, tüpü manyetik standtan çıkarın ve boncukları 1 mL TCM ile yeniden askıya alın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
      4. T hücrelerine aktivasyon boncukları ekleyin ve TCM önceden 37 °C'ye ısıtılmış şekilde son konsantrasyonu 1 × 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın.
      5. İyi karıştırın ve süspansiyonu bir reaktif rezervuarına aktarın. Çok kanallı pipet kullanarak her kuyu başına 100 μL TCM içeren 96 kuyu düz tabanlı plakalarda plaka hücreleri. Boncukların birikmesini önlemek için her 1-2 dakikada bir iyice karıştırın.
   2. T hücresi transdüksiyonu (1. gün)
      NOT: Büyük transgenlere sahip lentivirüsler için (örneğin, 9 kb LTR-to-LTR) 1:2 seri sulandırmalarla 6 şart hazırlanın (seyreltmemiş, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Daha küçük transgenlere sahip lentivirüsler için (örneğin, 7 kb LTR-to-LTR), 1:4 seri sulandırmalı 8 şart gereklidir. Kalan kuyular aktarılmamış (UTD) kontroller olarak kullanın.
      1. Her konsantre lentivirüsden 60 μL eritme ve buzda saklanın.
      2. 96 kuyuyuk yuvarlak tabanlı bir plakada bir seyreltme serisi hazırlayın: Üst sıraya 60 μL lentivirüs ekleyin, alttaki her sıraya 30 μL soğuk TCM ekleyin, üstten ikinci sıraya 30 μL aktarın ve karıştırın (1:2 seyreltme), ikinci sıradan üçüncü sıraya 30 μL aktarın ve karıştırın (1:4 seyreltme). Toplamda altı koşul hazırlanana kadar devam edin (seyreltilmemiş, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Transdüksiyon için hemen kullanın.
      3. Boncuk uyarısından 23-26 saat sonra, çok kanallı pipet kullanarak seyreltme plakasından 25 μL lentivirüs kuyusundaki T hücrelerini transdüksiyon edilir. UTD kontrol kuyruklarına 25 μL TCM ekleyin.
   3. T hücresi beslenmesi (3. gün)
      1. Her kuyuya çok kanallı pipet kullanarak 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış 125 μL TCM nazikçe ekleyin.
   4. T hücresi boncuk çözme ve akış sitometrisi analizi (5. gün)
      1. Her durum için üç set 1.5 mL vida kapaklı tüp hazırlayın ve kapakları çıkarın. Üç setten ikisini manyetik bir standa yerleştirin.
      2. Her kuyu tekrar askıya alın ve hücreleri ilk tüp setine aktararak boncukların tüp duvarı boyunca bir pelet oluşturmasını sağlar. 30 saniye sonra, süpernatantları dikkatlice ikinci tüp setine aktarın. 30 saniye bekleyin (boncuklar artık görünmemeli), sonra süpernatantları üçüncü tüp setine aktarın ve buzda saklayın.
      3. Uygun transdüksiyon belirteci (örneğin, anti-CD19 CAR veya anti-HER2 senkronizasyonu) için T hücrelerini antikorlarla boyamak ( bkz. Malzeme Tablosu) ve belirtici ifadesini akış sitometrisiyle analiz etmek.
      4. Transdüksiyon oranlarının %30'un altında olduğu koşulları tespit edin; virüs hacmi ile transdüksiyon oranı arasındaki doğrusal aralıklara yaklaşık olarak karşılık gelir.
      5. Lentiviral titrerleri aşağıdaki formülle hesaplayın:
         Titer (TU/mL) = (başlangıçta T hücre sayısı x transdüksiyon edilen hücrelerin yüzdesi x seyreltme faktörü)/virüs hacmi (mL)
         örneğin, lentiviral stokun 1:32 seyrelmesiyle %20 CAR ekspresyonu elde edilir:
         (100.000 hücre x 0.2 x 32) / (0.025 mL) = 2.56 × 10⁷ TU/mL

2. CAR T hücresi üretimi

NOT: CAR T hücresi üretimi için tipik başlangıç miktarları grup başına 1-5 × 10⁶ T hücresidir. UTD kontrol grubundaki hücre sayısını %50 artırın; çünkü bu grup, sonraki deneylerde transdüksiyon seviyelerini normalleştirmek için de kullanılacaktır. Genişleme boyunca 5-6 nüfus ikiye katlanması bekleniyor. T hücresi transdüksiyonu, bir blok kopolimer kullanılarak ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 96 kuyu düz tabanlı plakalarda belirli yüzey-hacim kültür oranlarıyla optimize^{edildi 17}.

1. 100 mg/mL artırıcı stok çözeltisi hazırlama
   1. Plastik şişeye 5 g kopolimer güçlendirici ekleyin, ardından 45 ml ultra saf su ekleyin. RT'de gece karıştırın.
   2. Çözeltiyi dereceli bir silindire aktarın ve hacmi ultrasaf suyla 50 mL'ye ayarlayın.
   3. Çözeltiyi 0,22 μm gözenek filtresinden geçirin ve 4 °C'de saklayın.
2. T hücresi aktivasyonu (0. gün)
   1. Ön Şart: TCM'deki arındırılmış insan CD4⁺ ve CD8⁺ T hücrelerini hazır tutun.
   2. CD4⁺ ve CD8⁺ T hücrelerini sayın ve bunları 1:1 oranında birleştirin.
   3. Yıkama aktivasyon boncuklarını aşağıdaki gibi yapın.
      1. Bir tüpe 1 mL TCM ekleyin, boncukları vortex ile yeniden askıya alın ve boncuk-T hücrelerinin 3'e 1 oranı elde etmek için gereken miktarı aktarın. Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve boncukların tüp duvarı boyunca bir pelet oluşturmasına izin verin.
      2. 30 saniye sonra, süpernatantı dikkatlice aspire edin, tüpü manyetik standtan çıkarın ve boncukları 1 mL TCM ile yeniden askıya alın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   4. T hücrelerine aktivasyon boncukları ekleyin ve TCM önceden 37 °C'ye ısıtılmış şekilde son konsantrasyonu 1 ×^{10 6} hücre/mL olarak ayarlayın.
   5. İyi karıştırın ve süspansiyonu bir reaktif rezervuarına aktarın. Çok kanallı pipet kullanarak 96 kuyulu, düz tabanlı plakalarda 50 μL TCM ile plaka hücrelerini yerleştirir. Boncukların birikmesini önlemek için her 1-2 dakikada bir iyice karıştırın.
3. T hücresi transdüksiyonu (1. gün)
   NOT: Lentivirüs miktarlarını önceki titrasyon sonuçlarına göre seçin, böylece nihai transdüksiyon seviyeleri gruplar arasında karşılaştırılabilir (genellikle %20 ila %30 arasında) olduğundan emin olun. Birden fazla lentiviral entegrasyonu önlemek için maksimum transdüksiyon seviyelerini %30 ≤ tutun. Büyük transgenlere sahip lentivirüsler genellikle ya seyreltilmemiş virüs ya da 1:4-1:8 oranında seyreltme gerektirir. Her donma-erime döngüsü lentiviral titremelerini azalttığı için lentivirüs artıklarını önlemek için grup büyüklüklerini ayarlayın. Lentiviral master karışımlarını hazırlandıktan hemen sonra kullanın.
   1. Gerekli miktarda konsantre lentivirüs RT'de eritip buzda saklanın.
   2. Örneğin, 100 μL artırıcı (100 mg/mL stok) ile 4,9 mL TCM karıştırarak soğuk TCM'de 2 mg/mL bir güçlendirici stok hazırlayın.
   3. Titrasyon sonuçlarına göre lentivirüs master karışımları hazırlayın ve nihai konsantrasyon 275 μg/mL'ye enhancer ekleyin. Pipetleme kaybını karşılamak için nihai hacimleri en az %10 artırın. Örneğin, 100 kuyu ile 1:16 seyreltme elde etmek için:
      Toplam hacim: 100 kuyu × 12,5 μL lentivirüs × %110 = 1.375 μL
      1:16 seyreltme: 1.375 μL/ 16 = 85,9 μL lentivirüs
      Artırıcı: 189 μL (275 μg/mL final)
      Son ana karışım: 1.100 μL TCM + 85,9 μL lentivirus + 189 μL artırıcı = 1.375 μL
   4. Boncuk stimülasyonundan 23-26 saat sonra, çok kanallı pipet kullanılarak lentivirüs master karışımının her kuyusu'nda 12,5 μL ile T hücrelerini transdüksiyon edilir; bu da nihai artırıcı konsantrasyonu 55 μg/mL olur. UTD kontrol kuyruklarına 12,5 μL TCM ekleyin.
4. T hücresi beslenmesi (3. gün)
   1. Her kuyuya çok kanallı pipet kullanarak 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış 125 μL TCM nazikçe ekleyin.
5. T hücresi boncuklarının açılması (5. gün)
   NOT: Her kültür için steril bir rezervuar ve üç set 50 mL tüp hazırlayın. Hücrelerin 8 ×^10-5 hücre/mL'nin altında seyrelmesini önlemek için toplam yıkama hacmini T hücresi kültürünün %20'si ≤ sınırlandırın.
   1. Her kültürü çok kanallı pipet kullanarak steril bir rezervuara biriktirin, orijinal plakaları TCM ile yıkayın ve yıkamayı rezervuara ekleyin. Her hücre süspansiyonunu ilk 50 mL tüp setine aktarın.
   2. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirerek boncukların tüp duvarı boyunca bir pelet oluşturmasını sağlar. 30 saniye sonra, süpernatanları dikkatlice ikinci tüp setine aktarın ve manyetik standa yerleştirin. 30 saniye bekleyin (boncuklar artık görünmemeli), sonra süpernatantları üçüncü tüp setine aktarın ve kuluçka makinesinde depolayın.
   3. Her kültürü sayın ve TCM önceden 37 °C'ye ısıtılmış şekilde 8 ×^{10 5} hücre/mL olarak normalize edin. Son hacme bağlı olarak uygun kültür kabında plaka (Tablo 2).
   4. T hücrelerinin 1 gün dinlenmesine izin verin, ardından 7. günden itibaren günlük beslenmeye başlayın (bir sonraki adıma bakınız).
6. T hücresi beslenmesi (7. gün ve sonrasında her gün)
   NOT: T hücreleri yaklaşık her 24-36 saatte bir çift katlanır ve dinlenmeden önce 5-7 popülasyon ikiye kaplanır. Kriyo-rezervasyon için optimal zaman noktasını belirlemek amacıyla elektriksel empedans tabanlı hücre sayacı kullanarak T hücre hacimlerini izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Her kültürü birleştirin, iyi karıştırın ve hücreleri sayın.
   2. Her kültürü 8 ×^{10 5} hücre/mL olarak normalize edin, TCM önceden 37 °C'ye ısıtılmış ve uygun kültür kapında yeniden tabaka alın (Tablo 2).
   3. Ortalama hücre hacmi 320^{μm 3'ün} altına düşene kadar genişlemeye devam edin, ardından kriyokoruma aşamasına geçin.
7. T hücresi transdüksiyonunun akış sitometrisi kullanılarak doğrulanması
   NOT: T hücresi transdüksiyonu, 5. gün ile kriyo-rezervasyon günü arasında herhangi bir noktada değerlendirilebilir. İfade seviyeleri, genişleme boyunca düşer, böylece erken bir ölçüm, akış sitometrisi analizi sırasında negatif ve pozitif fraksiyonların net ayrılmasını sağlar.
   1. Her kültürden 2 × 10⁵ T hücresi alın.
   2. Uygun transdüksiyon belirteci (örneğin, anti-CD19 CAR veya anti-HER2 synNotch) için T hücrelerini antikorlarla boyantın ( bkz. Materyal Tablosu) ve akış sitometrisiyle belirtici ifadesini analiz edin
8. T hücresi kriyokonserasyonu (genellikle 10-12. günler arasında)
   NOT: Cryopreserve ile genişletilmiş T hücreleri dinlenme halinden hemen önce veya sonra kullanarak erime sırasında canlılığı artırır. Ortalama 320^{μm 3} hacm, kriyo-koruma için bir kesme noktası olabilir. Hücre hacmi 300^{μm 3'ün} altına düştüğünde, T hücreleri bölünmeyi durdurur ve toplam sayıları azalmaya başlar. Tüm grupların kriyo-koruma zamanı benzer hacimlere sahip olduğundan emin olun; bu bazı gruplar için ek bir kültür günü gerektirebilir. Hücreleri uygun dondurma kapları kullanarak dakikada sabit -1 °C hızda dondurun (örneğin, alkolsüz hücre dondurma kapları, bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Her kültürü uygun bir tüpte (örneğin 500 mL) toplayın, hücreleri sayın ve kuluçka ünitesinde saklayın.
   2. Toplam hücre sayısını ve istenen aliquot miktarlarını hesaplayın.
   3. Santrifüj hücreleri (300 × g, 10 dakika, 4 °C), süpernatantları aspire eder ve her kültürü %50 serumsuz ortam, %40 ısıya inaktive edilmiş FBS ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren dondurucu ortamda 2 ×^{10 7} hücre/mL aralığında yeniden askıya alır ( bkz. Malzeme Tablosu).
   4. Aliquot hücreleri kriyoviallere (250 μL ile 1 mL arasında, şişe başına 5-20 × 10⁶ hücreye karşılık gelir) kriyoviallere dönüştürür. Kryovialleri hücre dondurucu kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 °C sıcaklıkta saklayın.
   5. Kriyovialleri uzun süreli depolama için sıvı azota aktarın.
9. T hücresinin çözülmesi
   NOT: Her T hücre grubu için, dondurma ortamında dondurma ortamında seyreltilmesi amacıyla 50 mL TCM ile önceden ısıtılmış bir tüp hazırlanın. Kaplama için ekstra TCM ısıtın.
   1. Kriyovialleri 37 °C'de su banyosu veya akan sıcak su altında hızla çözebilirsiniz.
   2. Sıvı görünür görüner görünmez, doku kültürü kapağına geçin, 500 μL önceden ısıtılmış TCM ekleyin, nazikçe karıştırın ve hücreleri 50 mL TCM içeren hazırlanmış tüplere aktarın.
   3. Kriyovial'ı 500 μL TCM ile yıkayın ve yıkamayı aynı tüpe ekleyin.
   4. Hücreleri RT'de 10 dakika kuluçka edin.
   5. Santrifüj hücreleri (300 × g, 10 dakika, oda sıcaklığında) süpernatanları aspire eder ve hücreleri 4 × 10⁶ hücre/mL ile yeniden süzülür.
   6. Hücreleri uygun kültür kapına yerleştirin (Tablo 2).
   7. Hücreleri gece boyunca kuluçka ünitesinde dinlendirin ve ardından aşağı akış deneylerine geçin.

Gemi	Minimum hacim	Maksimum hacim
96-well	0.1 mL/well*	0.25 mL/well
48-well	0.2 mL/kuyu	1 mL/kuyu
24-well	0.5 mL/kuyu	2 mL/well
12-well	1 mL/kuyu	4 mL/kuyu
6-well	2 mL/well	6 mL/well
T25 (yatay)	3 mL	8 mL
T75 (yatay)	8 mL	20 mL
T150 (yatay)	20 mL	60 mL
* kültür hacmi geçici olarak 50 μL/kuyu olarak düşürülerek T hücresi transdüksiyonu artırılır

Tablo 2: CAR T hücre genişlemeleri için önerilen kültür ortam hacimleri. T hücresi genişlemesi sırasında yaygın kullanılan damar formatlarında minimum ve maksimum kültür ortam hacimleri.

Sonuçlar

Optimize edilmiş iş akışıyla (Şekil 1) çok çeşitli transgen boyutlarında elde edilen iyileştirmeleri göstermek için üç lentiviral vektör boyutu seçtik: 5.7 kb (CD19 CAR), 9.2 kb (HER2-MSLN svsNotch) ve 10.1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Şekil 2A). Lentivirüsler standart veya optimize edilmiş koşullarda üretilmiştir (Şekil 2B: std vs. opt ve Tablo 1).

5,7 kb ile en küçük vektör için, bir üretim partisinde T hücresi transdüksiyonunda yalnızca orta düzeyde bir iyileşme gözlemlenmiştir (Şekil 2B: üst, %73 vs. seyreltilmemiş virüs ile %88). Tutarlı olarak, lentiviral titrerleri yalnızca yaklaşık 1,5 kat mütevazı bir şekilde arttı (Şekil 2C: üst, 2,86 × 10⁸ TU/mL ile 4,35 × 10⁸ TU/mL). Buna karşılık, 9,2 kb'lik vektör performansı önemli ölçüde iyileşti; maksimum T hücresi transdüksiyon oranları partiye bağlı olarak yaklaşık 5,4 veya 3,8 kat arttı (Şekil 2B: orta, %8,3/%16,6 vs. seyreltilmemiş virüs ile %45,1/%63,1) ve fonksiyonel titrerler yaklaşık 3,3 kat iyileşti (Şekil 2C: orta; 3,1 × 10⁶ TU/mL ile 10,1 × 10⁶ TU/mL ile karşılaştırıldığında). En güçlü etki 10,1 kb vektörde görüldü; burada transdüksiyon oranları yaklaşık 12,4 veya 9,8 kat arttı (Şekil 2B: alt, %1,4/%1,5 vs. seyreltilmemiş virüs ile %17,3/%14,7) ve fonksiyonel titreler yaklaşık 10 kat iyileşti (Şekil 2C: alt, 0,24 × 10⁶ TU/mL ile 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Sonrasında, sağlıklı bağışçılardan alınan T hücreleri, standart veya optimize edilmiş koşullar altında üretilen lentiviral vektörlerle, ilgili iş akışları kullanılarak transdüksiyon edildi (Şekil 3 ve Tablo 1). Transdüksiyon verimliliklerini karşılaştırmak için, her iş akışında eşit miktarda lentivirüs kullanıldı ve viral doz, birden fazla entegrasyon olayını önlemek için transdüksiyon oranlarını %30 veya altında tutacak şekilde ayarlandı. Standart koşullar ve standart lentivirüs üretimiyle transdüksiyon yapılan T hücreleriyle karşılaştırıldığında, transdüksiyon ortalama olarak 5,7 kb vektör için 5,1 katı, 9,2 kb vektör için 13,3 kat ve 10,1 kb vektör için 14,8 kat arttı (Şekil 3A ve Ek Tablo 1). Optimize edilmiş iş akışıyla oluşturulan seçilmiş T hücre kültürleri, dinlenme durumuna ulaşana kadar daha da genişletildi (Şekil 3B,C). Popülasyon ikiye katlanmaları, T hücresi donörüne bağlı olarak 5,3 ila 6,7 arasında değişiyordu (Şekil 3B). Günlük T hücre hacmi ölçümleri minimum hücre kalıntısı gösterdi ve genişleme sırasında toksisite belirtisi yoktu. Kriyokonservadan önce, transdüksiyon oranları CAR/synNotch reseptör ekspresyonu için boyama veya mTag-BFP2¹⁹ floresansı ölçülerek değerlendirildi (Şekil 3C ve Ek Şekil 1). Transdüksiyon oranları 5,7 kb vektör için %31,2 (siyah; 1:512 lentivirüs seyreltme), 9,2 kb vektör için %29,8 (kırmızı; 1:16 lentivirüs seyreltme) ve 10,1 kb vektör için %20,2 (mavi; 1:4 lentivirüs seyreltme) idi. Üretilen svsNotch T hücrelerinin ve CAR T hücrelerinin performansını doğrulayan ek fonksiyonel veriler, eşlik eden çalışma^17'de sunulmaktadır. Önemli olarak, optimize edilmiş protokolle üretilen efektör T hücreleri, standart iş akışı¹⁷ ile üretilenlere kıyasla popülasyon ikiye katlanma veya T hücresi fenotipinde hiçbir fark göstermedi.

Şekil 2: Lentivirüs üretimi standart ve optimize edilmiş iş akışlarına uygun olarak. (A) Karşılık gelen transgen boyutlarına sahip lentiviral vektörlerin şematik^{genel bakışı 17}. Üst: CD19'a karşı CAR'ın (CD19 CAR), insan uzatma faktörü-1 alfa (EF1α) promotoru tarafından ifade edilir ve toplam transgen boyutu yaklaşık 5,7 kb'dir. Orta ve alt: Bir HER2 sentezi reseptörü, EF1α promotör tarafından 2A kendiliğinden ayrılan peptit (P2A) aracılığıyla ya mavi-floresan raporlayıcı protein (BFP2) (ortada) ya da klik böceği yeşili lusiferaz (CBG) (altta) ile birlikte eksprese edilir. Mezotelin (MSLN) hedefleyen CAR (MSLN CAR) ekspresyonu, GAL4-spesifik minimal sitomegalovirüs (CMV) promotörü (GAL4-CMV) tarafından kontrol edilir. Toplam transgen boyutları HER2-MSLN svsNotch (orta) için yaklaşık 9,2 kb, HER2-MSLN-CBG svsNotch için ise 10,1 kb (alt) olarak belirlenir. SIN = kendini etkisiz hale getiren vektör; LTR = uzun terminal tekrar dizisi. (B) T hücrelerinin standart (std) ve optimize edilmiş (opt) koşullarda üretilen lentivirüs seri seyreltmeleriyle transdüksiyonu, (A)'da tanımlanan vektörler kullanılarak. Her vektörde iki bağımsız üretim (daireler ve üçgenler) ve her partide iki farklı T hücresi donörü. Transdüksiyon oranları T hücresi donörleri arasında ortalanmıştır. (C) (B)'de gösterilen standart (std, açık daireler) ve optimize edilmiş (opt, kapalı daireler) virüs üretimlerinin fonksiyonel titreleri. Veriler, her partide iki ayrı T hücresi donörü kullanılarak iki bağımsız lentivirüs üretiminden üretildi. Tüm hata çubukları ortalama ± SD'yi gösterir. İstatistiksel anlamlılık iki kuyruklu çift t testi kullanılarak hesaplandı. *p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bu figür, Rommel ve ^ark.17'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Standart ve optimize edilmiş iş akışlarıyla CAR T hücresi üretimi. (A) Optimize edilmiş (opt) iş akışıyla standart (std) iş akışına kıyasla T hücresi transdüksiyon hızlarının katlanma artışı (ayrıca bkz. Tablo S1). Veriler, ayrı donörler ve iki bağımsız lentivirüs üretimi kullanılarak iki veya üç bağımsız T hücresi genişlemesinden elde edildi. (B) Optimize edilmiş iş akışı kullanılarak üretilen T hücresi genişlemelerinin popülasyon iki katına çıkması. Her vektör için, ayrı bir lentivirüs üretimi kullanan farklı normal donörlerden (ND) iki bağımsız T hücresi genleşmesi gösterilmiştir. (C) 7. gün (10.1 kb) veya 10. gün (5.7 kb ve 9.2 kb) genişletilmiş efektör T hücrelerinde CAR, BFP2 ve synNotch reseptör ekspresyonunu gösteren akış sitometri grafikleri (ayrıca bkz. Ek Şekil 1). Tüm hata çubukları ortalama ± SD'yi gösterir. İstatistiksel anlamlılık iki kuyruklu çiftli t testi kullanılarak hesaplandı. *p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bu figür, Rommel ve ^ark.17'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: CAR, synNotch reseptörü ve BFP2 ifadesini değerlendirmek için Kapı Stratejisi, Şekil 3C ile bağlantılı. Genişletilmiş T hücre kültürlerinde CAR, synNotch ve BFP2 ekspresyonunu belirlemek için kullanılan kapı stratejisini gösteren temsilli akış sitometrisi grafikleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Tek tek T hücresi genişlemeleri arasında transdüksiyon hızları, Şekil 3A ile bağlantılı. Standart ve optimize edilmiş iş akışlarıyla üretilen T hücresi genişlemelerinin transdüksiyon hızları. Bu tablo, Rommel ve ^ark.17'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, svsNotch T hücreleri gibi büyük lentiviral transgenlere sahip CAR T hücreleri için optimize edilmiş üretim iş akışını detaylandıran adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, hücre ayırma ihtiyacını ortadan kaldırır ve büyük lentiviral transgenleri taşıyan efektör T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu iş akışını kullanarak, lentiviral transgenleri 9-10 kb ve maksimum transdüksiyon oranları %60-70 (9 kb) veya %15-20 (10 kb) olan efektör T hücreleri üretiyoruz.

Düşük viral titrerler veya transdüksiyon oranları sorunlarını giderken birkaç temel faktör göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, HEK293T hücrelerinin kalitesi. HEK293T hücrelerin tutarlı bir programla geçirilmesi ve %50-70 birleşimin üzerine büyümelerine asla izin verilmemesi önemlidir. Deneyimimize göre, daha önce aşırı büyümüş HEK293T hücrelerden üretilen lentiviral vektörler, hücreler morfolojik olarak iyileşmiş görünse bile azalmış titreler gösterir. Geçiş 30'un ötesinde HEK293T hücreler kullanarak rutin olarak yüksek titrli viral vektörler üretiyoruz; bu da hücreler düzgün şekilde korunursa daha yüksek geçiş sayılarının tolere edildiğini gösteriyor. Hücre kalitesinin yanı sıra, transfeksiyon anında HEK293T hücrenin birleşmesi kritik bir faktördür. Yüksek birleşme noktasında (%90-100) HEK293T hücreleri transfekte ederken lentiviral titrerin azaldığını gözlemledik.

İkincisi, bu protokolde belirtilen zamanlamalara, konsantrasyonlara ve hacimlere sıkı şekilde uyulmak şarttır; çünkü birçok adım önceki bir çalışmada kapsamlı şekilde optimize edilmiştir¹⁷. Örneğin, kopolimer artırıcı ( bkz. Malzemeler Tablosu), tespit edilebilir toksisite olmadan transdüksiyon oranlarını maksimize etmek için titrlenmiştir. Yüksek konsantrasyonlar transdüksiyonu daha da artırabilirken, aynı zamanda toksisitelere yol açar ve T hücre genişlemesini azaltır. Benzer şekilde, önerilen 30-36 saat aralığı dışında (örneğin 24 saat veya 48 saatte) lentiviral süpernatantların hasatı, ilgili bir zaman kulturu^{deneyi 17'de} daha düşük titrler elde etti. Buna karşılık, değişken CD4/CD8 dağılımlarına sahip toplu T hücreleri kullanıldığında transdüksiyon verimliliğinde önemli farklar gözlemlemediğimiz için, 1:1 CD4-CD8 T hücre oranına sıkı bir şekilde bağlı olmak gerekmez. Ancak, bu orandan sapmalar genişleme süresini ve popülasyon artışlarının sayısını etkileyebilir. Bu nedenle, deneyler arasında tutarlılık için genellikle 1:1 CD4-CD8 oranını koruruz.

Gelecekteki optimizasyon çabaları, özel ortam formülasyonları veya özel sitokin rejimleri gibi daha büyük lentiviral transgenlerle T hücresi transdüksiyonunu iyileştirmek için ek stratejilere odaklanabilir. Bu iş akışını, doğal katil hücreler ve makrofajlar dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücre tiplerine genişletmek, terapötik uygulamalarını genişletebilir. Önemli olarak, bu iş akışının klinik çevirisi lentivirüsle modifiye hücre tedavisi ürünlerinin üretim maliyetlerini de azaltmaya yardımcı olabilir.

Burada sunulan kapsamlı adım adım protokol, büyük lentiviral transgenlere sahip CAR T hücreleri üretmek için pratik bir referans sağlar ve katı ile kan kanserlerine karşı yeni CAR T hücrelerinin geliştirilmesinin temelini oluşturur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Antikor - anti-CD19 CAR	Sitoart	200101	Anti-CD19 CAR (idiotip), AF647 ile konjuge, 1:100
Antikor - anti-HER2 sentezi	R& D Sistemleri	FAB95471G	Anti-Trastuzumab (idiotip), AF488-konjuge olmuş, 1:80
Çamaşır suyu	Clorox	Mikrobisit Ağartıcı
Hücre dondurma kabı	Biyosisyon	FTS30	Alkolsüz
Santrifüj (büyük)	Termo Bilimsel	Legend XTR
Santrifüj (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Santrifüj (küçük)	Eppendorf	5425
Coulter Sayacı	Beckman Coulter	Çok boyutlu 4	Hücre sayısını ve hücre hacmini belirleyen elektriksel empedans tabanlı hücre sayacı
Kriyo tüpler	Termo Bilimsel	375418
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Hücre Sinyal Teknolojisi	12611P
DPBS (kalsiyum yok, magnezyum yok)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	T hücresi stimülasyonu için kullanılan aktivasyon boncukları
Etanol	Decon Laboratuvarları	200 Proof
FBS (ısıyla inaktif değil)	Avantor (VWR)	97068-091
Akış sitometresi	BD	LSRFortessa (647177)
Dondurucu (-80 derece ve derece; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Dondurucu (sıvı azot)	MVE HEco	1500-190
Buzdolabı (4 derece ve derece; C)	Fisher Scientific	İzotemp
Eldivenler (Nitril)	Halyard	55082
GlutaMAX Takviyesi	Gibco	35050-061	L-alanil-L-glutamin
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Buz (kuru)	N.A.	N.A.
Buz (ıslak)	N.A.	N.A.
Buz kovası	Fisher Scientific	07-210-108
Laboratuvar önlüğü (tek kullanımlık)	Kappler	PVS112WH-MD
Lentiviral ambalajlama plazmidleri	Mülkiyet	N.A.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Lentiviral transfer plazmidleri	Mülkiyet	N.A.	örneğin pTRPE svsNotch
Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi	Invitrogen	L3000015	Ticari lipofeksiyon reaktifi; Lipofektamin 3000 (L3000) ve onun artırıcı reaktifini (P3000) içerir
Manyetik stand (büyük)	Kök hücre	EasySep 18103	5 mL/15 mL için
Manyetik stand (küçük)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	1.5 mL tüpler için
Manyetik karıştırma çubuğu	Fisher Scientific	14-513-82	Karıştırma çubuğu kiti
Manyetik karıştırma platformu	Termo Bilimsel	S88857100
Ölçüm silindiri (100 mL)	VWR	76019-316
MQ su	Merck	Q-POD	Ultrapue su; Millipak 40 Express Son Filtre kullanır, 0.22 Mikron (MPGP04001)
Çok kanallı pipet	Fisher Scientific	Yorumlara bak	30-300 ve mikro; L:  FBE1200300; 5-50 ve mikro; L:  FBE1200050
Opti-MEM (L-glutamin ile, Fenol Kırmızı ile)	Gibco	31985-070	DNA transfeksiyonu için kullanılan indirgenmiş serumlu minimal temel ortam
Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL, 10.000 ve mikro; g/mL)	Gibco	15140-122
Pipotler	Fisherbrand	Yorumlara bak	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipetler (aspirasyon)	Falcon	357558	2 mL
Pipet	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Pipet kontrolörü	Hirschmann	Pipetus Z314951
Pipet uçları	Thomas Scientific	Yorumlara bak	1000 µ L: 1159M42; 200 µ L: 1159M40; 20 µ L: 1159M43; 10 µ L: 1159M41
Plastik depolama şişesi (500 mL)	Corning	430282
Reaktif rezervuarı	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (L-glutamin, Fenol Kırmızı ile)	Gibco	11875-085
Ölçek	Ohaus	Öncü	0.1 g minimum hassasiyet gereklidir
Steriflip filtresi (0.45 ve mikro; m)	Millipore	SE1M003M00
Synperonic F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	T hücresi transdüksiyonunu artırmak için kullanılan blok kopolimer
Doku kültürü şişesi - T150	Corning	430825
Doku kültürü şişesi - T25	Corning	430639
Doku kültürü şişesi - T75	Corning	430641U
Doku kültürü başlığı	Termo Bilimsel	1300 Serisi A2
Doku kültürü kuluçka makinesi	Termo Bilimsel	Heracell 150i
Doku kültür plakası - 6-kuyu	Corning	3516
Doku kültür plakası - 96 kuyuyla düz taban	Falcon	353072
Doku kültür plakası - 96 kuyu yuvarlak taban & nbsp;	Falcon	353077
Tripsin-EDTA (%0,05)	Gibco	25300-054
Tüpler - 1.5ml vida kapakları	Sarstedt	72692005
Borular - 15 mL	Falcon	352099
Tüpler - 5 mL	MSP	62-1028-2
Borular - 500 mL	Corning	431123
Tüpler - 50ml	Falcon	352098
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Kovalı ultrasantrifüj rotörü	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Ultrasantrifüj tüp adaptörleri (konik tüpler için)	Seton Scientific	4230
Ultrasantrifüj tüpleri (konik)	Seton Scientific	5067
Vortex	Fisher Scientific	02215414
Su banyosu (37 derece ve derece; C)	Fisher Scientific	İzotemp 210	Su yerine Lab Amor Beads (Gibco) ile kullanılır
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	T hücrelerinin dondurulması için kullanılan serumsuz ortamlar