Yöntem makalesi

Mikroskopi Yaklaşımları için Drosophila melanogaster Dolaylı Uçuş Kaslarının Diseksiyonu

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69185

⸱

7 Kasım 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

Bu makalede

Özet

Drosophila , miyogenezin temel mekanizmalarını anlamak için güçlü bir modeldir. Toraks hemi-sezaritlerinin diseksiyonu ve hazırlanması için bu protokol, hem pupa hem de yetişkin aşamalarından dolaylı uçuş kasının mikroskopi analizini sağlar. Bu protokol, hücresel morfolojinin, protein lokalizasyonunun, kas yapısının ve miyogenezin diğer birçok yönünün konfokal görüntülenmesini sağlar.

Özet

Drosophila melanogaster'ın dolaylı uçuş kasları (IFM'ler), miyogenezin temel prensiplerini keşfetmek için güçlü bir genetik modeldir. Kasılma mekanizması ve birçok sarkomer bileşeni, sineklerden omurgalılara kadar korunur ve transkripsiyonel düzenleme ve RNA işlemeden kas gelişimini yönlendiren ve ince ayar yapan metabolizma ve mekanobiyolojiye kadar hücresel süreçlerin incelenmesini sağlar. Bu hücresel yolların çoğu insan miyopatilerinde değişir ve IFM çalışmaları, kas hastalığının moleküler etiyolojisi hakkında ilgili bilgiler sağlar. Özellikle sinekler, miyoblast spesifikasyonundan miyofibril oluşumuna, olgunlaşmasına ve bakımına kadar tüm IFM miyogenez süreci boyunca miyofiber ve sarkomer morfolojisini ve işlevini analiz etmek için mikroskopi için çok uygundur. Burada, mikroskopi yaklaşımları için D. melanogaster IFM'lerin pupa ve yetişkin zaman noktalarında diseksiyonu için bir protokol sunulmaktadır. Geç pupa ve yetişkin IFM'lerin hemitoraks diseksiyonu ve erken pupa IFM'lerinin açık kitap diseksiyonu için resimli protokoller sağlanmıştır. Fiksasyon, boyama ve numune montaj prosedürleri ve yaygın diseksiyon artefaktları, IFM diseksiyonunun farklı fiksasyon reaktifleri ile uyumluluğunu gösteren temsili verilerle açıklanmaktadır. Bu protokoller, puparyum oluşumundan (APF) 26 saat sonra, 72 saat APF'de ve yetişkin IFM'lerde RNA bağlayıcı protein hayatta kalma motor nöronunun (Smn) hipomorfik SmnE33 alelini incelemek için uygulanır ve bir Spinal Motor Atrofi (SMA) modeline yeni bir bakış açısı sağlar ve bu protokolün genel faydasını gösterir. Bu ayrıntılı protokol, IFM model sistemine erişimi ve miyogenez ilkelerini araştırmak için yüksek kaliteli mikroskopi verilerinin elde edilmesini kolaylaştırır.

Giriş

Hayvanların, ambulasyonu sağlamaktan konuşmayı kolaylaştırmaya ve bir aleti kavramaya kadar farklı hareketleri kontrol eden yüzlerce kası vardır. Bu kadar geniş bir işlev dizisini desteklemek için kaslar boyut, bağlanma, kasılma yeteneği, metabolizma ve gen ekspresyonu bakımından farklılık gösterir1. Kas biyolojisi alanındaki ana odak noktası, bu yapısal ve işlevsel farklılıkların gelişim sırasında nasıl ortaya çıktığını ve kas hastalığında nasıl değiştiğini anlamaktır2. Kas kasılması, M çizgisi3'e sabitlenmiş bipolar miyozin içeren kalın filamentlerle iç içe geçen Z-diskine sabitlenmiş aktin içeren ince filamentlerle oluşturulmuş sarkomerler tarafından desteklenir. Sarkomerler uçtan uca miyofibriller halinde düzenlenir ve çizgili kastaki bu düzenli düzenleme, mikroskop4 altında değişen açık ve koyu bantlar olarak görünür ve sarkomer montajı ve organizasyonundaki değişiklikleri izlemek için pratik bir görsel yöntem sağlar. Genetik ve biyokimyasal yaklaşımlarla birlikte mikroskopi, kas gelişimi ve işlevini talimat veren ve ince ayar yapan transkripsiyonel düzenleme, RNA işleme, metabolizma ve mekanotransdüksiyon 5,6,7 gibi hücresel süreçler hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bu hücresel süreçlerin çoğu, insan miyopatilerinde ve nöromüsküler bozukluklardabozulur 8,9, bu da kas hastalığının etiyolojisi hakkında fikir edinmek için kas gelişimini anlamanın önemini vurgular. Genetik mühendisliğindeki ilerlemeler, tek tek hücrelerin manipülasyonunu ve proteinlerinendojen etiketlenmesini 10,11 mümkün kılarak, görüntü elde etme ve çözünürlükteki teknolojik gelişmelere12,13 birleştiğinde, kas araştırmaları için mikroskopinin öneminin devam etmesini sağlar. Kas diseksiyonu ve numune hazırlama için açık ve kolay uygulanan protokollere sahip model sistemler bu nedenle kas alanında değerlidir.

D. melanogaster'ın dolaylı uçuş kasları (IFM'ler), miyogenezin temel ilkelerini incelemek için güçlü ve iyi karakterize edilmiş bir modeldir8. IFM'ler, larva kas şablonları üzerinde oluşan hemitoraks başına altı dorsal-uzunlamasına kastan (DLM) ve pupa gelişimi sırasında de novo olarak inşa edilen yedi dorsal-ventral kas lifinden (DVM) oluşur14. Orta hatta yakın erişilebilirlikleri nedeniyle, birçok IFM çalışması, göğüs kafesinin15 mm uzunluğunun tamamını kapsayan yetişkin sineklerdeki en büyük kas olan DLM'lere odaklanmaktadır. Pupa döneminin başlangıcında, IFM miyoblastları kanat diski menteşesindeki nişlerinden göğüs kafesine göç eder ve burada sinsityal miyotüpler16 oluşturmak üzere birleşirler. 27 ° C'de 24 saat APF civarında tendon bağlanmasından sonra, IFM miyofiberleri sitoplazmalarını ve hücre iskeletlerini aşamalı olarak düzenler, sıkıştırır ve 30-32 saat APF17'den miyofibrillogenezi başlatır. Miyofibrillere yeni sarkomerler eklenir ve miyofiberler yaklaşık 48 saatlik APF'ye kadar göğüs kafesini dolduracak şekilde büyür. IFM'ler daha sonra, yetişkin metabolik ve kasılma özelliklerinin kazanılmasını ve gerilme aktivasyonunu destekleyen hem transkripsiyon hem de eklemedeki değişikliklerle uyumlu bir olgunlaşma sürecinden geçer18. Yetişkin sinekler, 27 ° C'de 90 saat ile 100 saat APF arasında ve 25 ° C'de yaklaşık 100 saat APF'de (dişiler yaklaşık 98 saat APF'de ve erkekler yaklaşık 102 saat APF'de) pupa vakasından yaklaşır19. IFM'ler çok yönlü ve ilgili bir model sistemdir. Miyogenezin tüm aşamalarında izlenebilirler, morfolojik ve işlevsel olarak sinekteki diğer miyofiber tiplerinden farklıdırlar ve çok çeşitli erişilebilir genetik araçlardan ve manipülasyon yaklaşımlarından yararlanırlar 8,20. Kasılma mekanizması, temel sarkomer morfolojisi ve birçok yapısal bileşen sineklerden omurgalılara5 korunur ve miyojenik ilkelerin sineklerden insanlara çevrilmesini sağlar. Gerçekten de, miyotonik distrofi, spinal motor atrofi (SMA), miyofibriler miyopatiler ve aktinopatiler gibi nöromüsküler hastalıkların sinek modelleri etiyolojik ve terapötik bilgiler sağlamıştır21,22. Özellikle sinekler, miyoblast spesifikasyonundan miyofibrillogeneze, sarkomer olgunlaşması ve bakımına kadar miyogenez boyunca miyofiber ve sarkomer morfolojisini analiz etmek için mikroskopi için çok uygundur.

Drosophila IFM'ler kırk yılı aşkın bir süredir mikroskopi uygulamaları için kullanılmakta ve kas büyümesi ve gelişiminin anlaşılmasına büyük katkı sağlamaktadır8. Bu süre zarfında, IFM diseksiyon protokolleri, teknoloji ilerledikçe sürekli olarak uyarlandı ve bu da bazıları için optimal ve diğer görüntüleme teknikleri için optimal olmayan değişken ayrıntı seviyelerinde sunulan çok çeşitli protokollere yol açtı. Örneğin, elektron mikroskobu için geliştirilen protokoller, güçlü fiksasyon koşulları, ultra ince kesit alma ve ağır metallerlekontrast boyama 3,23,24,25 içerir, ancak ışık mikroskobu için optimal değildir. Biyokimyasal tahlillerde veya moleküler analizlerde26,27 kullanılmak üzere IFM'leri torakstan hızlı bir şekilde incelemek için geliştirilen protokoller doku bağlamını kaybeder ve miyofibril yapısını bozabilir ve bu nedenle mikroskopi yaklaşımları için optimaldir. Diseksiyon yaklaşımları, larva kası veya yetişkin karın kası20,28 analizi için geliştirilmiştir, ancak sağlam IFM'lerin izolasyonu için optimal değildir. Canlı görüntüleme yaklaşımları, görüntüleme işlemi29,30 sırasında IFM dokusunu canlı tutmak için minimal invaziv diseksiyonlar veya özel ortamlar gerektirir ve immünohistokimya için kasları korumak için gerekli fiksasyon adımlarını içermez. IFM dokularının parafin gömülmesi veya kriyo-kesitlenmesi için birden fazla protokol mevcuttur ve histokimya veya antikor boyama 27,31,32 ile uyumludur, ancak bu yaklaşımlar tipik olarak kas üst yapısını değiştirebilen ve belirli antijenlerin birincil antikorlar tarafından tanınmasını sınırlayabilen dondurma ve doku dehidrasyonunu içerir. IFM'leri doğrudan sabitleyen protokoller, kas morfolojisini korur ve antijen konformasyonundaki değişiklikleri sınırlar ve birçok immünohistokimya deneyi için arzu edilir24. Bununla birlikte, bu protokoller aynı zamanda belirli uygulamaları da hedef alır, örneğin, floresan, kriyoEM veya süper çözünürlüklü mikroskopi 20,33,34 ile tek miyofibril analizine olanak tanıyan IFM'leri ayrıştıran protokoller. Diğer örnekler, bozulmamış IFM liflerini torakstan32,35 diseksiyon veya hem miyofiberlerin hem de sarkomerlerin bozulmamış bir bağlamda analizini sağlayan tam montaj veya hemitoraks preparatları 20,32,36 oluşturmak için protokolleri içerir. Yeni bir kullanıcının, çoğunluğu metin tabanlı olan çok sayıda mevcut protokolü sıralaması zor olabilir. Stajyerler ve lisans araştırmacıları, standart immünohistokimya uygulamalarına uygulanan ayrıntılı bir IFM diseksiyon protokolünden faydalanacaktır.

Bu makale, immünohistokimya mikroskobu yaklaşımları için D. melanogaster IFM'lerin pupa ve erişkin evrelerde diseksiyonu ve hazırlanması için bir dizi protokol içermektedir. Bu yaklaşım, IFM miyogenezi boyunca RNA bağlayıcı proteinler Bruno137 ve Rbfox138'in gelişimsel fonksiyonlarını izleyen son yayınlarda kullanılmıştır. Protokol, toraksın orta hat boyunca ikiye bölündüğü ve miyofiber yapıyı sağlam tuttuğu yetişkin ve geç pupa (48 saat ila 96 saat APF) IFM'lerin IFM hemitoraks diseksiyonu boyunca potansiyel kullanıcılara rehberlik etmek için ayrıntılı çizimler ve adım adım görüntüler içerir. Ek olarak, bu protokol, dorsal epidermise bağlı sağlam IFM'leri ortaya çıkarmak için toraksın ventral kısmının bir kitap açar gibi kesildiği ve kaldırıldığı erken pupa (8 saat ila 48 saat APF) aşamalarının açık kitap diseksiyonunu kapsar. Protokoldeki diğer adımlar arasında fiksasyon, boyama ve numune montajı yer alır ve temsili veriler, bu yaklaşımın dokuları immünohistokimya ve floresan mikroskobu için hazırlamak için çeşitli fiksasyon yöntemleriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Yeni kullanıcıların yaygın diseksiyon artefaktlarını tanımlamalarına yardımcı olmak için temsili örnekler verilmiştir. Protokol, 26 saat APF, 72 saat APF ve yetişkin IFM'lerde Spinal Motor Atrofi (SMA)21,39'un sinek modeli olarak kullanılan hayatta kalma motor nöronunun (Smn) hipomorfik bir aleli olan SmnE33'ün gelişimsel IFM fenotipini analiz etmek için uygulanır. Burada sunulan veriler, Smn'nin kasa özgü işlevi hakkında fikir vermekte ve bu diseksiyon protokolünün kas gelişimini ve kas hastalığının etiyolojisini incelemek için uygulanabilirliğini vurgulamaktadır.

Protokol

Etik beyan:
Bu protokoldeki tüm deneyler, holometabolöz bir böcek olan Drosophila melanogaster'ı kullanır. Omurgasızlar, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki hayvan refahı düzenlemelerine tabi değildir ve kullanımları etik onay gerektirmez. Tüm çalışmalar standart kurumsal biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği yönergeleri kapsamında yürütüldü ve Missouri Üniversitesi Kansas City Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından 21940 (22-11) protokol numarası altında onaylandı.

1. Erişkin İFM'nin hemimotoraks diseksiyonu (Şekil 1)

  1. Biyoloji uçlu iki Dumont #5 forseps, bir Dumont #3 forseps, bir çift Vannas yaylı makas, bir plastik pipet, bir boya fırçası, 24 oyuklu bir plaka, tüy bırakmayan mendiller, bir mikroskop lamı ve kriyostat bıçakları dahil olmak üzere gerekli malzemeleri bir araya getirin (bkz. 1x PBS, %0.05 PBS-T ve fiksasyon solüsyonları hazırlayın ( bkz. Aşağıdaki erişkin hemitoraks diseksiyonunun akış diyagramına genel bir bakış mevcuttur (Ek Şekil 1).
  2. İstenilen genotip ve yaştaki yetişkinleri toplayın (örneğin, yeni kapatılmış, 1 günlük yetişkin veya 5 günlük yetişkin). Numune sineklerini CO2 veya buz üzerinde uyuşturun.
    NOT: Bu protokolde kullanılan sinekler, sıcaklık ve nem kontrollü bir inkübatörde 12 saatlik bir günde: 12 saatlik gece döngüsünde büyütülmüştür. Drosophila standart olarak 25 °C veya 27 °C'de yetiştirilir ve 18 °C'de yetiştirilebilir, bu da büyüme döngüsünü 10 günden yaklaşık 20 güne uzatır.
  3. Stereo diseksiyon mikroskobu altında bir mikroskop lamına 1x PBS40 damlası aktarmak için plastik bir pipet kullanın.
  4. Numune sineklerini bir boya fırçası veya forseps kullanarak küçük gruplar halinde PBS damlasına aktarın (Şekil 1A). Vannas yaylı makas kullanarak başı (Şekil 1B), kanatları (Şekil 1C - D) ve karnı (Şekil 1E) çıkarın. Bacakları bağlı bırakın (Şekil 1F).
  5. Bir fırça veya forseps kullanarak 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğunda 500 μL fiksasyon çözeltisine nazikçe aktarın. Bir nutator/sallanan çalkalayıcı üzerinde istenen süre boyunca (tipik olarak 15-60 dakika) sabitleyin.
    NOT: Bu protokol, paraformaldehit, glutaraldehit, metanol, glioksal çözeltisi ve diğerleri dahil olmak üzere çoklu fiksasyon tamponları ile uyumludur. Fiksasyon koşullarının optimize edilmesiyle ilgili ayrıntılar için Temsili Sonuçlara ve Ek Dosya 1'e bakın. Fiksatifler, kurumunuzun tehlikeli kimyasal yönergelerine göre eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılarak kullanılmalıdır.
  6. Fiksatifi 200 μL'lik bir pipetle çıkarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir nutatör/sallanan çalkalayıcı üzerinde 1 mL %0,05 PBS-T içinde yıkayın.
    NOT: Fiksatifi kurumun tehlikeli kimyasal yönergelerine göre atın. Çoğu antijen için, sabit toraslar, kesme ve boyamadan önce 4 °C'de 2 haftaya kadar 1 mL %0.05 PBS-T içinde saklanabilir. Deterjandaki uzun inkübasyonlar sarkomer yapısını bozabileceğinden, kullanımdan önce daha yüksek konsantrasyonlarda Triton X-100 test edilmelidir.
  7. Tamponu 200 μL'lik bir pipetle çıkarın ve bir fırça veya forseps kullanarak bir stereo diseksiyon mikroskobu altında bir mikroskop lamı üzerinde% 0.05 PBS-T'lik bir damlaya aktarın.
  8. Toraksı, scutellum yukarı bakacak ve bir çift Dumont #3 forseps arasında stabilize olacak şekilde yönlendirin (Şekil 1G-H).
  9. Scutellum'u çentiklemek için göğüs kafesi boyunca bir kriyostat bıçağı kaydırın (Şekil 1H, J, L) ve ardından IFM'leri açığa çıkaran göğüs hemi kesitini oluşturmak için orta hat boyunca (Şekil 1I, J, L - N) düzgün bir aşağı doğru vuruşla kesin (Şekil 1K).
    NOT: Sarkomer yapısına zarar veren gerilme artefaktlarını önlemek için IFM'leri kesmeden önce kütikülün "çentikli" veya çatlamış olması önemlidir. Bıçağı ileri geri "kesmeyin", çünkü bu hareket IFM'lere mekanik olarak zarar vererek miyofibrillerin yıpranmasına neden olur. Çok fazla tampon, forseps arasındaki göğüs kafesinin dengesini bozar ve kesimi zorlaştırır. Alternatif yaklaşımlar, kesikleri kolaylaştırmak için toraksların çift yapışkanlı bant üzerinde birer birer stabilize edilmesini ve ayrıca toraksın ventral tarafından kesilmesini içerir.
  10. Göğüs kafesinin iki yarısını, kurumayı önlemek için tamponla kaplı kalacakları, ancak gelecekteki kesiklere engel olmayacakları slayt üzerinde bir konuma getirin. Tüm toryaklar kesilene kadar 1.8-1.10 adımlarını tekrarlayın.
  11. Toraks hemikesitlerini mikroskop lamından 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğunda 500 μL %0.05 PBS-T'ye aktarmak için bir forseps kullanın ve bloke etme ve immün boyama ile devam edin (aşağıdaki bölüm 4'e bakın).

2. Geç pupa IFM'nin hemithoraks diseksiyonu (~48 saat ila 96 saat APF) (Şekil 2, Şekil 3)

  1. İstenilen genotip ve yaştaki pupaları pupa gelişiminde seçilen noktaya kadar evreleyin (Şekil 2). Nemli bir boya fırçası kullanarak erkek veya dişi beyaz pre-pupaları (Şekil 2A, B) toplayın ve 60 mm'lik bir hücre kültürü kabında ıslatılmış filtre kağıdı üzerinde inkübe edin. Pupa evrelemesi ve pupa olgusundan çıkarılması daha önce tanımlanmıştır20,26.
    NOT: Pupalar yaşlandıkça başın ters dönmesi ve pupa kasasının, gözlerin ve kıllarınpigmentasyonu gibi birçok morfolojik değişikliğe uğrar 19,41 (Şekil 2C). Bu morfolojik özellikler, bir pupanın yaşını belirlemek (Şekil 2D-E) ve normal gelişmeyen pupaları tanımlamak için kaba bir kılavuz olarak kullanılabilir (Şekil 2F). Bununla birlikte, doğru bir evreleme zaman çizelgesi sağlamak için, beyaz ön pupaların dar zaman aralıklarında, örneğin her 30 dakikada bir veya her 2 saatte bir evreleme olarak toplanması önerilir. 24 saat ila 35 saat APF arasında meydana gelen hücre iskeleti yapısındaki ve miyofiber uzunluğundaki büyük değişiklikleri ayırt etmek ve ayrıca 35 saat, 48 saat, 60 saat, 72 saat, 80 saat ve 90 saat APF 18,42'de sarkomer yapısındaki farklılıkları ayırt etmek için sıkı aşamalı zaman noktaları gereklidir.
  2. Bir boya fırçası, biyoloji uçlu iki Dumont #5 forseps, bir çift Vannas yaylı makas, çift yapışkanlı bant, bir mikroskop lamı, bir plastik pipet, 24 oyuklu bir plaka, Kimwipes ve kriyostat bıçakları dahil olmak üzere gerekli malzemeleri bir araya getirin (bkz. 1x PBS, %0.05 PBS-T ve fiksasyon solüsyonları hazırlayın ( bkz. Aşağıdaki pupa hemitoraks diseksiyonunun akış diyagramına genel bir bakış mevcuttur (Ek Şekil 2).
  3. İstenilen zaman noktasında, pupaları filtre kağıdından 10-20x büyütmede bir stereo diseksiyon mikroskobu altında bir mikroskop lamına yapıştırılmış bir çift yapışkanlı bant şeridine aktarmak için bir boya fırçası kullanın (Şekil 3A, B). Pupaları bant üzerinde aynı yöne bakacak şekilde, ventral tarafı aşağı bakacak şekilde hizalayın.
  4. İlk pupanın pupa kasasının önünü açmak için bir çift #5 forseps kullanın, operkulumu (başın üzerindeki bölge) nazikçe çıkarın (Şekil 3C, D, I).
  5. Pupa kılıfı boyunca kanadın hemen dorsalinde kesmek için dikkatlice #5 forseps kullanın ve pupa kılıfını 1-2 mm'lik artışlarla pupadan uzaklaştırın. Pupa kılıfını önden arkaya doğru çalışırken çift yapışkanlı banda yapıştırın (Şekil 3E - G, I). Pupanın kendisini dürtmekten kaçının, bunun yerine forseps ucunu pupa kılıfı ile pupayı çevreleyen bazal membran/pupa kesesi arasına sokun.
  6. Vaka çıkarıldıktan sonra, forseps ile bir kepçe hareketi kullanarak altını kaldırın (Şekil 3H, I) ve dehidrasyonu önlemek için pupayı ikinci bir mikroskop lamında (Şekil 3J, K) 1x PBS'lik bir damlaya nazikçe aktarın. Tüm pupalar pupa kasasından çıkarılana kadar 2.4-2.6 (Şekil 3I) adımlarını tekrarlayın.
  7. Vannas yaylı makas kullanarak disseke edilmiş pupalardan karnı çıkarın (Şekil 3L).
    NOT: Bir sonraki adımda fiksatif ile daha iyi penetrasyon sağlamak için karın çıkarılır. Göğüs kafesine zarar vermemek için, doğrudan karın bölgesinden kesin ve karnın %30'una kadarını göğüs kafesine bağlı bırakın.
  8. Pupa başını toraks ile birlikte nazikçe aktarın (Şekil 3M) bir fırça veya forseps kullanarak 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğunda 500 μL fiksasyon çözeltisine aktarın. İstenilen süre boyunca (tipik olarak 15-60 dakika) sabitleyin ve 1.5-1.6 adımlarında açıklandığı gibi 1 mL %0.05 PBS-T ile yıkayın.
  9. Tamponu 200 μL'lik bir pipetle çıkarın ve bir fırça veya forseps kullanarak 10x büyütme altında bir stereo diseksiyon mikroskobu altında bir mikroskop lamı üzerinde% 0,05 PBS-T'lik bir damlaya aktarın.
  10. Bir numuneyi diğerlerinden ayırın ve ventral tarafı aşağı bakacak şekilde yönlendirin ve bir çift Dumont #3 forseps arasında stabilize edin (Şekil 3N).
  11. Bazal membran ve kütikül yarılana kadar bir kriyostat bıçağını göğüs kafesi boyunca kaydırın ve ardından IFM'leri açığa çıkaran göğüs hemi kesitlerini oluşturmak için orta hat boyunca (Şekil 3O) düzgün bir aşağı doğru vuruşla kesin (Şekil 3P).
    NOT: Bıçağı ileri geri "kesmeyin", çünkü bu hareket IFM'lere mekanik olarak zarar vererek miyofibrillerin yıpranmasına neden olur. Çok fazla tampon, forseps arasındaki göğüs kafesinin dengesini bozar ve kesimi zorlaştırır. Pupa toynakları, baş takılıyken kesilebilir ve sola veya sağa doğru yönlendirilebilir.
  12. Göğüs kafesinin iki yarısını, kurumayı önlemek için tamponla kaplı kalacakları, ancak gelecekteki kesiklere engel olmayacakları slayt üzerinde bir konuma getirin. Tüm thorace'ler kesilene kadar 2.10-2.12 adımlarını tekrarlayın.
  13. Toraks hemikesitlerini mikroskop lamından 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğunda 500 μL %0.05 PBS-T'ye aktarmak için bir forseps kullanın ve blokaj ve immün boyama ile devam edin (aşağıdaki adım 4'e bakın).

3. Erken pupa IFM'nin açık kitap diseksiyonu (~15 saat ila 48 saat APF) (Şekil 4)

  1. İstenilen genotip ve yaştaki pupaları yukarıda açıklandığı gibi pupa gelişiminde seçilen noktaya (Şekil 2) evreleyin (Adım 2.1).
    NOT: Açık kitap diseksiyonları için pupalar 8-10 sinekten fazla olmayan gruplar halinde diseke edilmelidir.
  2. Bir boya fırçası, biyoloji uçlu iki Dumont #5 forseps, bir çift Vannas yaylı makas, çift yapışkanlı bant, bir mikroskop lamı, bir plastik pipet, bir siyah silikon diseksiyon kabı, bir siyah cam boyama kabı, böcek iğneleri ve tüy bırakmayan mendiller dahil olmak üzere gerekli malzemeleri bir araya getirin (bkz. 1x PBS, %0.05 PBS-T ve fiksasyon solüsyonları hazırlayın ( bkz. Aşağıdaki pupa açık kitap diseksiyonunun akış diyagramına genel bir bakış mevcuttur (Ek Şekil 3).
  3. İstenilen zaman noktasında, 2.3-2.6 adımlarında açıklandığı gibi pupaları pupa kasasından çıkarın. Pupaları, pupa kasasından çıkarıldıktan sonra 1x PBS ile doldurulmuş siyah bir silikon diseksiyon kabına aktarın (Şekil 4A).
  4. Tüm pupalar pupa kasasından kurtulduktan sonra, yüzey geriliminin üstesinden gelmek için bir Dumont #5 forseps kullanın ve disseke edilmiş pupaları yavaşça silikonun yüzeyine doğru itin. Pupaları tabağın ortasına yakın bir sıra halinde düzenleyin (Şekil 4B).
  5. Yerinde tutmak için her pupanın karnından bir Dumont #5 forseps kullanarak iki böcek iğnesi sokun (Şekil 4C, D). Pupaların karın tarafları yukarı bakacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun.
  6. Her pupanın bazal membranını ve ön baş bölgesini kesmek için bir Vannas yaylı makas kullanın (Şekil 4E).
  7. Makası açıklığa yerleştirin ve her pupanın sağ ve sol tarafları boyunca kesin (Şekil 4F, G, Q). Makası konumlandırın ve bacakları ve kanatları ventral kısımla çıkarmak için gelişmekte olan notumun hemen altından göğüs kafesi ile karın arasındaki kavşağa kadar kesin. Makasın yatay olarak yerleştirildiğinden ve göğüs kafesinin dorsal kısmına temas etmediğinden emin olun (Şekil 4Q).
  8. Pupanın ventral kısmını kavramak ve kaldırmak için bir Dumont #5 forseps kullanın ve bir Vannas yaylı makasla çıkarın (Şekil 4H, I, Q).
  9. Dumont #5 forseps kullanarak beyni, ventral sinir kordonunu (VNC), trakeayı ve bağırsağı çıkarın (Şekil 4J,K,Q). Toraksın dorsal kısmındaki epidermise bağlı trakea ve VNC'nin hemen altında bulunan gelişmekte olan IFM'leri rahatsız etmemeye dikkat edin.
  10. Daha geniş bir açıklık oluşturmak için 200 μL'lik bir pipet ucunun ucunu klipsleyin. IFM'leri açığa çıkarmak için kalan yağ gövdelerinin çoğunu çıkarmak için göğüs kafesi üzerinde 1x PBS tamponunu nazikçe yıkamak için kırpılmış uçlu 200 μL'lik bir pipet kullanın (Şekil 4L, M). Miyofiberleri epidermise bağlayan tendon eklerinin yırtılmasını önlemek için nazik olun.
  11. Dorsal toraksın orta hattını kesmek için bir Vannas yaylı makas kullanın ve IFM'leri içeren iki "broşür" oluşturun (Şekil 4N).
  12. Dorsal toraksın yaprakçıklarını bir makas kullanarak karından uzağa kesin (Şekil 4O, Q) ve yaprakçıkları bir Dumont #5 forseps kullanarak siyah bir cam tabakta 300 μL fiksatif çözeltiye aktarın (Şekil 4P). IFM miyofiberlerine veya tendonlarına zarar vermemek için kafa kasasındaki broşürleri forseps ile kavrayın.
  13. İstenilen süre boyunca (tipik olarak 15 dakika) sabitleyin. Fiksatifi dikkatlice çıkarmak için 200 μL'lik bir pipet kullanın ve 500 μL %0,05 PBS-T ile yıkayın. Blokaj ve immün boyama ile devam edin (aşağıdaki 4. adıma bakın).
    NOT: Numuneyi siyah cam kaplarda taşlamayın veya sallamayın. Erken pupa evrelerinde kas-tendon ekleri çok kırılgandır ve sürekli tampon ajitasyonu ile yırtılarak IFM'lerin kaybına neden olur. Çözeltileri değiştirirken numunelerin pipet ucuna emilmesini önlemek için çanaktaki tamponun kenarlarından yavaş ve dikkatli bir şekilde pipet çekin.

4. Sabit IFM numunelerinin immün boyama ve histokimyası

  1. Pipet, pipet uçları ve gerekli antikorlar veya lekeler dahil olmak üzere gerekli malzemeleri bir araya getirin. %0.05 PBS-T, bloke edici çözelti ve antikor/leke karışımları hazırlayın (bkz.
  2. Yıkama solüsyonunu (%0,05 PBS-T) numunelerden pipetleyin ve bloke edici solüsyonu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloke edici solüsyonda inkübe edin (1-2. adımlar için sallayarak, 3. adım için sallamadan).
    NOT: Numuneler alternatif olarak gece boyunca 4 °C'de bloke edilebilir. Bu protokolde numuneler %0,05 PBS-T içinde %5 normal keçi serumu (NGS) içinde bloke edildi. Engelleme çözümü seçenekleri hakkında daha fazla bilgi Ek Dosya 1'de verilmiştir.
  3. Bir pipet kullanarak blokaj solüsyonunu thoraces'ten çıkarın. Birincil antikor karışımını ekleyin ve oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin (1-2. adımlar için sallayarak, 3. adım için sallamadan).
    NOT: Bu protokol primer antikorların çoğu ile uyumludur. Antikorlar bloke edici solüsyonda seyreltilmelidir. Bu protokolle test edilen birincil antikor dilüsyonları 1:10 ila 1:2000 arasında değişir ve her bir antikor için deneysel olarak belirlenir. Birincil antikor boyamanın optimizasyonu hakkında daha fazla ayrıntı Ek Dosya 1'de verilmiştir.
  4. Birincil antikor karışımını bir pipet kullanarak çıkarın ve numuneleri %0,05 PBS-T içinde her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  5. Numuneye ikincil antikor veya leke karışımı ekleyin. Ağartmayı en aza indirmek için numuneyi bir parça alüminyum folyo ile örtün. Oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin (adım 1-2 için sallayarak, adım 3 için sallamadan).
    NOT: Çoğu ikincil antikor ve floresan hücresel leke bu protokolle kullanılabilir. 1:500 seyreltmede birçok ikincil antikor kullanılır. Aşağıdaki temsili verilerde (bkz.
  6. İkincil/leke karışımını bir pipet kullanarak çıkarın ve numuneleri oda sıcaklığında %0,05 PBS-T içinde her biri 10 dakika boyunca 4 kez yıkayın. Yıkadıktan hemen sonra montaja (adım 5) geçin.

5. Mikroskopi analizi için lekeli numunelerin slaytlara monte edilmesi (Şekil 5)

  1. Boya fırçası, forseps, buzlu mikroskop lamları, lameller (#1 kalınlık), şeffaf oje, montaj ortamı ve tüy bırakmayan mendiller dahil olmak üzere gerekli malzemeleri bir araya getirin ( bkz.
  2. Mikroskop lamının buzlu yazı alanını ilgili numune numarası veya tercih edilen tanımlayıcı bilgilerle (tarih, genotip, antikor, slayt numarası vb.) etiketleyin.
  3. Numune yerleştirme için lameller arasında yaklaşık 1 cm bırakarak lamel ara parçaları (# 1 lamel) ekleyin (Şekil 5A-C). Ara parçaları yerinde tutmak için küçük bir damla %50 gliserol kullanın (Şekil 5A, D).
    NOT: Ara parçalar, kalın numuneleri monte ederken s'nin bozulmasını önler.ample. Yetişkin toynaklar tipik olarak 2 lamel kalınlığında bir ara parça, 48 saatlik APF toynaklar 1 lamel kalınlığında bir ara parça gerektirir ve açık kitap broşürlerinde ara parça yoktur.
  4. Lamelin ara parçaları arasındaki kuyuya veya erken pupa numuneleri monte ediliyorsa mikroskop lamının ortasına bir damla montaj ortamı ekleyin (Şekil 5C-D). Slaytı bir stereo diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
    NOT: Birden fazla montaj ortamı türü mevcuttur. Kendiliğinden sertleşen bir ortam kullanıyorsanız, ortam sertleşmeden önce numuneleri uygun şekilde yönlendirmek için yeterli zaman tanımak için kürlenme süresi birkaç saat olan bir ortam düşünün. Montaj ortamının sarkomer boyutlarını 43,44,45 etkilediği gösterilmiştir, bu nedenle bir deneydeki tüm numuneler için aynı reaktif kullanılmalıdır.
  5. Numunelerden mümkün olduğunca fazla yıkama tamponunu çıkarmak için bir pipet kullanın. Numuneleri hemen bir forseps veya boya fırçası kullanarak slayt üzerindeki montaj ortamının damlasına aktarın (Şekil 5E).
  6. Dumont #5 forseps kullanarak numuneleri satırlar ve sütunlar halinde düzenleyin, numunelerin üst üste gelmediğinden emin olun ve kronikleri IFM'ler yukarı bakacak şekilde yönlendirin (Şekil 5F,J,Q,S). Oryantasyon, kılların/kütikülün yukarı baktığı numunelerin dikkatlice çevrilmesini gerektirebilir (Şekil 5G, H, K, L, R). Temas sarkomer yapısına zarar vereceğinden IFM'lere dokunmamaya dikkat edin (bkz.
  7. Toraks örneklerinin üzerine dikkatlice #1 lamel (18 x 18 mm veya 22 x 22 mm) ekleyin (Şekil 5M). Ara parçalar kullanıyorsanız, numunelerin her iki tarafındaki ara parçalara temas edene kadar lamel hafifçe bastırın (Şekil 5N).
  8. Tüm toynaklar kaplanana kadar numune alanını montaj ortamıyla doldurmak için bir pipet ucu veya damlalık kullanın (Şekil 5O). Görüntü alımını bozacak hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
  9. Islak montajı kapatmak için şeffaf oje kullanın. Hem numune lamel hem de ara lamellerin etrafını kapatmayı unutmayın (Şekil 5P,S).
    NOT: Son kat veya çabuk kuruyan oje kullanmaktan kaçının, çünkü bunlar zayıf bir şekilde kapanır ve montaj ortamı buharlaştıkça hava kabarcıkları oluşur.
  10. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika kurutun. 4 °C'de sürgülü kutuda saklayın. Slaytlar birkaç gün veya hafta boyunca görüntülenebilir.
  11. Deneysel tasarıma göre bir floresan mikroskop, konfokal mikroskop veya başka bir sistem üzerinde görüntü örnekleri. Edinme ve görüntü analizi protokolleri başka yerlerde mevcuttur 14,30,46,47,48.

Sonuçlar

Yukarıda sunulan diseksiyon protokolü, IFM miyofiber ve sarkomer morfolojisinin mikroskopi analizi için yüksek kaliteli numuneler oluşturmak için kullanılabilir: açık kitap yöntemi kullanılarak puparyum oluşumundan (APF) 8 saat sonra (adım 3) hemitoraks diseksiyon yaklaşımı kullanılarak yetişkin aşamalarına kadar (adım 1 ve 2). Bu diseksiyonlar, diğerlerinin yanı sıra kas ve sarkomer oluşumunu 18,42,49, transkripsiyon faktörü fonksiyonunu 50,51 ve RNA regülasyonu 37,38'i araştırmak için uygulanmıştır. Aşağıda verilen temsili sonuçlar, bu protokolün farklı fiksasyon yöntemleriyle uyumluluğunu gösterir, yaygın diseksiyon artefaktlarını detaylandırır ve IFM modelindeki morfolojik ve hücre biyolojik sorularını ele almak için bu protokolün faydasını göstermek için SmnE33 mutant fenotipini kullanır.

İFM diseksiyonu birden fazla fiksasyon yöntemi ile uyumludur

Histokimya veya immünofloresan numuneleri için numune hazırlamanın kritik bir yönü, fiksasyon yoluyla hücresel yapıların doğru şekilde korunmasıdır. Fiksatifler, bozulmayı önleyerek ve çapraz bağlanma yoluyla protein ve lipid yapılarını stabilize ederek doku yapısını ve morfolojisini korur52,53. Farklı fiksatif sınıfları, örneğin aldehit bazlı ve organik çözücüler, farklı penetrasyon ve çapraz bağlanma verimliliklerine sahiptir ve farklı fonksiyonel gruplarıhedefleyerek antikor hedefi tanımayı farklı şekilde etkiler 53,54. İFM diseksiyonları, %4 paraformaldehit (PFA), %9 glioksal ve metanol fiksasyonu dahil olmak üzere çoklu fiksasyon yöntemleriyle uyumludur (Şekil 6), bu diseksiyon protokolünün genel faydasını vurgulamaktadır.

Sarkomer boyutu ve morfolojisini farklı fiksasyon yöntemlerinin uygulanmasıyla karşılaştırmak için 1 günlük erişkin w 1118 sineğin hemitoraks diseksiyonları yapıldı. Fosfat tamponlu salin (PBS) (Şekil 6A,E) veya rahatlatıcı solüsyonda (RS) (Şekil 6B,F) %4 PFA fiksasyonu karşılaştırıldı. Rahatlatıcı solüsyon ATP içerir ve sarkomerleri rahat durumlarında20,55 korumak için sarkomer boyutlarını ölçerken kullanılması önerilir (bkz. %4 PFA fiksasyonu sarkomer morfolojisini etkili bir şekilde korur, ancak PBS'de %4 PFA fiksasyonu ile RS arasında sarkomer genişliğinde anlamlı bir fark görülmüştür (Şekil 6I,J). Metanolde fiksasyon miyofiber ve sarkomer yapısını korudu (Şekil 6C,G), ancak sarkomerler %4 PFA fiksasyonuna göre önemli ölçüde daha kısa ve daha inceydi (Şekil 6I,J). IFM'ler, bir gecede %9 glioksal fiksasyon ile etkili bir şekilde korunabildi (Şekil 6D,H) (%3 glioksal fiksasyon etkisizdi), bu da %4 PFA fiksasyonuna kıyasla sarkomer genişliğini önemli ölçüde değiştirdi (Şekil 6I,J). Sonuç olarak, İFM hemitorikasları çoklu fiksatif ilaçlarla etkili bir şekilde korunabilir. Bununla birlikte, hem fiksatif hem de tampon sarkomer boyutlarının ölçümünü etkileyebileceğinden, deneyler uygun kontroller ve iyi tanımlanmış ve tutarlı bir fiksasyon protokolü ile tasarlanmalıdır.

IFM'lerde sık görülen diseksiyon ve fiksasyon artefaktları

Özellikle yeni kullanıcılar ve kursiyerler için mikroskopi ile ilgili bir zorluk, teknik eserleri kemik gerçek fenotiplerden ayırt etmektir. Drosophila IFM'lerinde bu ayrıma yardımcı olmak için, en sık gözlenen artefaktların ve diseksiyon başarısızlıklarının temsili verileri sunulmuştur (Şekil 6). Fiksasyon protokolleri, yetersiz veya fazla fiksasyonu önlemek için fiksasyon tipinin, konsantrasyonunun ve uzunluğunun optimizasyonunu gerektirir 52,53,54. Rahatlatıcı solüsyonda %4 PFA içinde inkübe edilen w1118 1 günlük yetişkin hemitoraks diseksiyonlarının fiksasyon süresi kullanılarak, 15 veya 30 dakikalık fiksasyon süresi sarkomer morfolojisini doğru bir şekilde korurken, 7 dakikalık fiksasyonun tutarsız sarkomer morfolojileri ürettiği gözlendi (Şekil 6K-M). Ek olarak, doku daha kısa fiksasyon süresi ile daha az serttir, bu da IFM'lere zarar vermeden göğüs kafesinin kesilmesini ve ikiye bölünmesini zorlaştırır. Hem kesim hem de montaj işlemi sırasında ek artefaktlar ortaya çıkabilir. Bıçak körelmişse ve yırtılmaya veya yıpranmaya neden oluyorsa (Şekil 6N) veya bıçak kayarsa veya kesim açılıysa (Şekil 6O) IFM miyofiber yapısı düzensiz görünebilir. Forseps, taşıma veya montaj sırasında sabit IFM'lerle doğrudan temas ederse, bölünmelere veya gerilmeye yol açabilecek ve sarkomerleri birbirinden ayırabilecek bir izlenim bırakırlar (Şekil 6P). Kesme, taşıma veya montaj sırasında göğüs kafesinin gerilmesi veya deformasyonu da sarkomerleri birbirinden ayırır ve açıkça sınırlandırılmış bir Z-diskinin kaybına neden olur (Şekil 6Q). Son olarak, IFM'lerin bir forseps veya bıçakla "kesilmesi" veya "ovulması", özellikle miyofiber yüzeyinde miyofibrillerin aşınmasına ve çözülmesine, yıpranmasına ve düzensizliğine yol açar (Şekil 6R). Potansiyel kullanıcılar bu teknik eserlere aşina olmalı ve bunları fenotipik analizin dışında tutmalıdır.

IFM'lerde Smn E33 fenotipinin gelişimsel ilerlemesi

Açık kitap ve hemitoraks diseksiyonları, bir kas fenotipinin gelişimsel yörüngesini izlemek ve gelişim sırasında ilgilenilen bir genin ne zaman hareket ettiğini veya miyofibril fenotiplerinin ne zaman ortaya çıktığını belirlemek için özellikle yararlıdır. RNA bağlayıcı protein Survival motor nöronunun (Smn)39 hipomorfik bir aleli olan SmnE33'ün IFM gelişimsel fenotipi, açık kitap ve hemitoraks diseksiyonlarının geniş faydasını gösteren temsili veriler olarak sunulmaktadır.

mRNA'ları7 oluşturmak için ekleme reaksiyonunu katalize eden makromoleküler kompleks olan spliceosome'u oluşturan küçük nükleer ribonükleoproteinler (snRNP'ler), SMN kompleksi tarafından birleştirilir. Hayatta kalma motor nöronu (Smn) ve Gemin proteinlerinden oluşan SMN kompleksi, tüm organizmalarda canlılık için gereklidir56. İnsanlarda azalan SMN seviyeleri, ciddi kalıtsal nöromüsküler bozukluk Spinal Motor Atrofi'ye (SMA) yol açar21. Drosophila, hipomorfik alel SmnE33'ün gelişimi de dahil olmak üzere SMA'nın etiyolojisini ve Smn'nin hücresel fonksiyonunu anlamak için bir model olarak kullanılmıştır. SmnE33 sinekleri canlı ve doğurgandır, ancak uçamaz veya zıplayamaz39. SmnE33 sinekleri motor nöron ağaçlandırma kusurlarına sahipken, aynı zamanda düzensiz IFM yapısı ve uçuş kasına özgü Actin88F ekspresyonukaybı 39,57 gösterirler. SMN, sineklerde ve farelerde39 Z-diskinde alfa-aktinin ile birlikte lokalizedir, bu da Smn'nin kasa özgü bir işlevi olabileceğini düşündürür.

Miyofibril yapısının ne zaman kaybolduğunu ve kas gelişiminde Smn fonksiyonunun ne zaman gerekli olduğunu daha iyi anlamak için, 26 saatlik APF, 72 saatlik APF ve 1 ila 5 günlük yetişkinde IFM'lerde SmnE33 fenotipinin gelişimsel bir zaman seyri analizi yapıldı. Hem 72 saatlik APF'de hem de yetişkinlerde kontrol w1118 IFM'ler güçlü falloidin lekeli F-aktin sinyaline (Şekil 7E,E',I,I') ve düzenli sarkomer yapısına (Şekil 7G,G',K,K') sahipken, falloidin sinyali önemli ölçüde azalır (Şekil 7F,F',J,J') ve sarkomer yapıları yoktur (Şekil 7H,H',L,L') SmnE33'te IFM'ler. F-aktin bunun yerine çekirdeklerin etrafındaki ağ benzeri yapılarda veya sitoplazmadaki düzensiz demetlerde veya "yıldız patlaması" yapılarında gözlenir (Şekil 7H,H',L,L'), Act88F ekspresyonu18, 39 kaybı ve ince filamentlerin bir araya getirilememesi ile tutarlıdır. 26 saatlik APF'de SmnE33 fenotipini incelemek için açık kitap diseksiyonları yapıldı ve erken IFM gelişiminin SmnE33'te normal şekilde ilerlediği ortaya çıktı. w1118 kontrol IFM'leri ile karşılaştırılabilir (Şekil 7A,A',C,C'), SmnE33 sinekleri hemitoraks başına 6 dorsal uzunlamasına IFM lifine sahiptir, miyofibrillogenezden önce miyofiber çevresinde organize F-aktin kabloları oluşturur (Şekil 7B,B') ve miyofiber boyunca ağ benzeri bir F-aktin ağı sergiler (Şekil 7D,D'). Bu sonuçlar, IFM farklılaşmasının ilk aşamalarının normal şekilde ilerlediğini, Act88F ekspresyonunu sürdürmek ve sarkomerler oluşturmak için IFM gelişiminin sonraki aşamalarında Smn'nin gerekli olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, bu temsili sonuçlar, açık kitap ve hemitoraks diseksiyonları ile elde edilebilecek fenotipik ayrıntıyı ve çözünürlüğü göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Yetişkin IFM'lerin hemiseksiyon diseksiyonu. (A) Yetişkin bir sineği bir mikroskop lamı üzerinde 1x PBS'ye yerleştirin. (B) Sineği stabilize etmek için bir forseps (camgöbeği, nokta) kullanarak, kafayı bir makasla (turuncu) çıkarın. (C-E) Sol (C) ve sağ (D) kanatları ve karnı (E) çıkarın. (F) Baş, karın ve kanatları atın ve göğüs kafesini fiksatife aktarın. (G,H) Oryantasyonu (H) stabilize etmek için bir forseps kullanarak, posterior (P) ve scutellum yukarı bakacak şekilde (G) 1x PBS-T'lik bir damlada sabit bir göğüs kafesini bir slayt üzerinde yönlendirin. (I-K) İki göğüs hemikesiti (K) oluşturmak için göğüs kafesini ikiye (I-J) kesmek için bir kriyostat bıçağı kullanın. (L) Yarım kesitler oluşturmak için sagital kesimin konumunu gösteren bir kriyostat bıçağı ve bir göğüs kafesinin diyagramı. Bıçak, göğüs kafesinin scutellumunu çentiklemek için sağa kaydırılır ve ardından göğüs kafesini (noktalı kırmızı çizgi) kesmek için yumuşak bir hareketle (sarı oklar) aşağı doğru hareket ettirilir. (M,N) Ana kas gruplarının konumunu ve kesiğin konumunu (sarı üçgenler arasında) gösteren, göğüs kafesinin koronal (M) ve enine (N) görünümünün şeması. Toraksın yönü belirtilir (L, sol; R, sağ; V, ventral; D, dorsal; A, ön; P, arka). Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Pupa evrelemesi ve pupa gelişiminin özellikleri. (A) Erkek ve (B) dişi pupalar, 0-2 saat APF'de beyaz pre-pupa olarak ayırt edilebilir. Erkek pupalar, arkaya doğru (oklar) çift, yuvarlak, yarı saydam yapılara (gelişmekte olan testis) sahiptir. (C) Pupa gelişiminin ayırt edici özellikleri olarak hizmet eden özellikler tablosu. Özellikleri arasında pupa vakasının olgunlaşması, başın eversiyonu ve pupanın pupa kasasından ayrılması, göz pigmentasyonunun gelişimi, kılların, kanatların, bacakların, ependrium ve kütikülün pigmentasyonu ve bakire noktanın (mekonyum) görünürlüğü yer alır. Göz rengi ve pigmentasyon giderek koyulaşır. Tablodaki her sütunun üstünde etiketlenen pupa gelişiminin zamanlaması ve aşamaları (siyah metinle gösterilen zaman noktaları, aşağıda mavi metinle gösterilen pupa gelişimindeki karşılık gelen aşama) daha önce Bainbridge ve Bownes19,41 tarafından tanımlanmıştı. (D-E) Kırmızı gözlü sağlam bir pupada 0-2 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat APF'de pupa gelişiminin zaman süreci (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) ve pupa kasasından diseke edilmiş turuncu gözlü bir pupada (E; fln-gal4). Gözlerin ve kılların 48 saatten 96 saate kadar aşamalı olarak koyulaştığına dikkat edin. (F) Gelişimin erken, orta ve geç zaman noktalarında pupa öldürücülük örnekleri. Farat öldürücü sinekler tamamen oluşmuştur, ancak pupa kasasından tamamen kapanamazlar. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Pupa IFM'lerinin hemiseksiyon diseksiyonu (>48 saat APF). (AH) Pupa vakasından bir pupanın çıkarılması. Pupaları bir çift yapışkanlı bant şeridine (A,B) yapıştırın. Ön sırtta (C) açın ve bir çift Dumont #5 forseps kullanarak operkulumu (D) çıkarın (mavi, ok hareket yönünü gösterir, nokta sabittir). Pupa kasasını şeritler halinde (G) kesmek (E) ve soymak (F) için forseps kullanın. Pupa kasasının şeritleri çift yapışkanlı banda yapıştırılır. Karnı açığa çıkardıktan sonra pupayı kasadan (H) çıkarın. (I) Bir pupanın pupa kasasından diseksiyon sürecini gösteren şematik. Devre şemasındaki her adıma karşılık gelen şekil panelleri etiketlenmiştir (altta). Kırmızı noktalı çizgi, pupa kasasını kesmek için pupaya zarar vermeden forsepslerin yerleştirilebileceği yerleri işaretler. (J-L) Pupayı kasadan (J) çıkardıktan ve 1x PBS (K) damlasında mikroskop lamına aktardıktan sonra, karnı (L) çıkarmak için bir makas kullanın. (M) Karnı atın ve göğüs kafesini fiksatife aktarın. (N) Fiksasyondan sonra, pupa toynaklarını 1x PBS-T'lik bir damla halinde bir slayta aktarın. Pupanın sırt tarafını yukarı doğru yönlendirin ve bir forseps ile sabitleyin. (O-P) Pupa hemikesitini (P) kesmek için bir kriyostat bıçağı (O) kullanın. Kesimin yerleşimi Şekil 1 M-N ile aynıdır. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Pupa IFM'lerinin açık kitap diseksiyonu (<48 saat APF). (A) Şekil 3 A-I'de gösterildiği gibi pupayı pupa kasasından çıkardıktan sonra, pupayı siyah bir silikon diseksiyon kabında 1x PBS'ye aktarın. (B-D) Bir forseps (B) kullanarak pupayı silikon kabın yüzeyine doğru yavaşça itin ve iki böcek iğnesi (C,D) kullanarak ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sabitleyin. (E) Bir makas (turuncu) kullanarak başın bazal zarını (bm) ve kütikülünü açın. (F,G) Sağ (F) ve sol (G) tarafı boyunca kesin. Kesimin konumu (Q)'da diyagram olarak gösterilmiştir. (H,I) Ventral bölümü bir forseps (H) ile kaldırın ve bir makasla (I) çıkarın. (J,K) Beyni (J), lateral gövde trakeasını ve bağırsağı (K) çıkarmak için bir forseps kullanın. (L-M) Yağ gövdelerini çıkarmak ve IFM'leri açığa çıkarmak için bir pipetten hafif bir tampon akışı kullanın. (N) Göğüs kafesini iki yaprakçık halinde kesin. (O,P) Broşürleri kesin ve sabitleyiciye aktarın. (Q) Açık kitap diseksiyonundaki adımları özetleyen şematik. Her adıma karşılık gelen şekil panelleri etiketlenmiştir (altta). Üst ve yan görünümler, pupanın sol ve sağ tarafındaki kesiklerin (noktalı kırmızı çizgi) yerleşimini göstermek için sağlanmıştır. Kanatlar, bacaklar ve hortum (etiketli) pupanın dorsal ve ventral taraflarını ayırt etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Mikroskop lamlarına numune montajı. (AD) Lamel, ara parçaları kalın toraks hemikesit numunelerini monte etmek için kullanılır. Gliserol (A), ara parçaları (#1 lameller) etiketli bir slayta (B) yapıştırmak için kullanılır ve numuneler, ara parçalar (C) arasındaki boşluğa montaj ortamına monte edilir. Geç pupa ve yetişkin thoraces, iki #1 lamel ara parçası (D) gerektirir. Orta pupa zaman noktaları tek bir #1 lamel ara parçası gerektirir ve erken pupa diseksiyonları ara parça olmadan monte edilebilir. (E-H) Erişkin hemitoraks örnekleri forseps veya boya fırçası (E) ile montaj ortamına aktarılır. Thoras'lar başlangıçta rastgele yönlendirilir (F) ve IFM'lerin lamel (H) yönünde yönlendirilmesi için bir forseps (G) kullanılarak çevrilmesi gerekebilir. (I-L) Erken pupa açık kitap diseksiyonlarından elde edilen broşürler, bir forseps (I) kullanılarak montaj için aktarılır. Yaprakçıklar rastgele yönlendirilir (J) ve IFM'ler lamel (L) yönüne bakacak şekilde bir forseps (K) kullanılarak çevrilebilir. (Milletvekili) Numuneler düzgün bir şekilde yönlendirildikten sonra, numunelerin (M) üzerine bir lamel yerleştirin ve ara parçalara (N) hafifçe vurun. Kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek numunelerin etrafını montaj ortamı (O) ile doldurun. Montaj ortamının buharlaşmasını önlemek için lamel ve ara parçaların tüm açık kenarlarını oje (P) ile kapatın. (Q-R) IFM'ler lamel (R, 20x büyütme) bakacak şekilde yönlendirilmiş uygun şekilde monte edilmiş yetişkin toraks örneklerinin görüntüleri (Q, 10x büyütme). (S) Ara parçalar ve tüm açık kenarları kapatan oje arasında IFM-yukarı yönlendirilmiş numunelerle tamamlanmış slaytın bir şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: IFM diseksiyonları farklı fiksatiflerle uyumludur. (AH) Miyofiber yapının (AD) konfokal z-projeksiyonu veya 1118 yetişkin IFM kontrolünün miyofibril ve sarkomer yapısının (E-H) tek düzlemli görüntüleri. Hemithoraks diseksiyonu, fosfat tamponlu salin (PBS) (A,E) veya rahatlatıcı solüsyon (RS) (B,F), metanol (C,G) veya %9 glioksal solüsyon (D,H) içinde %4 paraformaldehit (PFA) dahil olmak üzere çoklu fiksasyon yöntemleriyle uyumludur. DAPI (1:1000), mavi; falloidin (1:500) boyalı F-aktin, gri. (I,J) Sarkomer uzunluğunun (I) ve genişliğinin (J) E-H'den ölçülmesi. Fiksasyon yöntemi ve tampon, sarkomer uzunluğu ve genişliğinin ölçümünü önemli ölçüde etkileyebilir. Metanol fiksasyonu ile 3,040 ± 0,2935 μm sarkomer uzunluğu, PFA (PBS), PFA (RS) ±% 9 glioksal fiksasyon ile sırasıyla 3,271 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm ve 3,217 ± 0,2023 μm olan ölçülen uzunluklardan anlamlı olarak daha kısaydı (p < 0,001). Sarkomer genişliği, test edilen tüm fiksasyon yöntemleri arasında anlamlı olarak farklıydı (PFA (PBS), 1.410 ± 0.1331 μm; PFA (RS), 1.284 ± 0.2514 μm; metanol, 1.280 ± 0.1538 μm; ve %9 glioksal fiksasyon, 1.137 ± 0.2032 μm). Kutu grafikleri, siyah noktalarla işaretlenmiş aykırı veri noktalarına sahip Tukey bıyıklarıyla gösterilir. Anlamlılık ANOVA ile post hoc Tukey testi ile belirlendi (**, p < 0.01; ***, p < 0.001). (K-M) RS fiksasyonunda %4 PFA'da yetişkin w1118'in fiksasyon süresi seyrinin tek düzlemli konfokal görüntüleri, 7 dakika (K) ile karşılaştırıldığında 15 (L) veya 30 (M) dakikalık fiksasyon sürelerinin iyi korunmuş ve tutarlı sarkomer yapısı ile sonuçlandığını göstermektedir. (N,O) Miyofiberlerde diseksiyon artefaktlarını gösteren %4 PFA'da sabitlenmiş yetişkin Act88F-Gal4 IFM'lerin Z-yığını projeksiyonları. Yaygın artefaktlar arasında kör bir bıçaktan (N) veya açılı bir kesikten (O) kesilmiş, yıpranmış veya kısmi miyofiberler bulunur. (P-R) Sarkomerlerde ve miyofibrillerde yaygın diseksiyon artefaktlarını gösteren PBS'de %4 PFA'da sabitlenmiş yetişkin w1118 örneklerinin tek düzlemli konfokal görüntüleri. Yaygın teknik artefaktlar arasında montaj sırasında forseps ile temas nedeniyle sarkomerlerin düzensiz gerilmesi (P), uzunlamasına kesimler sırasında miyofiberleri gererek Z-disklerinin kayıttan çekilmesi (Q) ve aşınma veya kör bir bıçak ( R ) nedeniyle yıpranmış, düzensiz veya kıvrılmış miyofibriller yer alır. DAPI (1:1000), mavi; falloidin (1:500) boyalı F-aktin, gri. Ölçek çubuğu = 100 μm (AD, YOK), 5 μm (EH, KM, PR). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: SmnE33'ün gelişimsel IFM fenotipini araştırmak için diseksiyonların uygulanması. (M.S.) 26 saatlik APF'de erken pupalarda kas yapısı. Kontrol (A, A', C, C') ve Smn E33(B, B', D, D') ve SmnE33(B, B', D, D') içindeki miyofiber yapının (A, A', B, B') ve miyofibril ve sarkomer yapısının (C, C', D, D') tek düzlemli konfokal görüntüsü. Hem kontrol hem de SmnE33, hemitoraks başına altı IFM miyofibere sahiptir ve F-aktin kabloları oluşturur. (E-H) 72 saatlik APF'de geç pupalarda kas yapısı. Kontrol (E, E') ve SmnE33'teki (F, F') miyofiber yapının Z-projeksiyon görüntüsü. SmnE33'teki IFM'ler, DAPI boyamasına dayalı olarak mevcuttur ancak güçlü bir F-aktin sinyalinden yoksundur. Tek düzlemli konfokal görüntüler, kontrol IFM'lerinin oldukça organize bir sarkomer yapısına (G, G') sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Buna karşılık, SmnE33 IFM'ler (H, H') anormal yıldız benzeri F-aktin yapılarına (sarı oklar) sahiptir ve kontrol IFM'lerinde gözlenen organize sarkomer yapısından yoksundur. (I-L) Yetişkin kas yapısı kontrolde (I, I', K, K') ve SmnE33(J, J', L, L'). Z-projeksiyonu (I,J) ve tek düzlemli konfokal görüntüler (K,L), SmnE33IFM'lerde büyük ölçüde azalmış F-aktin içeriğini ve anormal aktin yapılarını (sarı oklar) ortaya koymaktadır. DAPI (1:1000), mavi; falloidin (1:500) boyalı F-aktin, macenta veya gri. Ölçek çubuğu = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Metinde kullanılan sabitleme ve boyama yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklaması ve özellikle Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterilen verileri oluşturmak için. Birincil antikorların dilüsyonlarının belirlenmesine ilişkin ek bilgiler dahildir. Bu protokolde kullanılan tampon bileşenlerinin ve tariflerin bir listesi de sağlanmıştır. Bu veriler diseksiyon protokolünü motive eder ve konfokal mikroskopi ve gelişimsel IFM fenotiplerinin analizi için faydasını gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Yetişkin IFM'lerin hemitoraks diseksiyonundaki adımların akış diyagramı. Hemitoraks IFM kesitlerini hazırlamak için Şekil 1'deki adımların metinsel özeti. Diseksiyon, fiksasyon ve toraks biseksiyonundan sonra kesitler mikroskopi analizi için boyanır. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Pupa IFM'lerinin hemitoraks diseksiyonundaki adımların akış diyagramı. Pupa IFM'lerinin hemitoraks kesitlerini hazırlamak için Şekil 3'teki adımların metinsel özeti. Pupa kılıfından çıkarıldıktan sonra pupa sabitlenir, ikiye bölünür ve mikroskopi için boyanır. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Erken pupa IFM'lerinin açık kitap diseksiyonundaki adımların akış şeması. 48 saatlik APF'den önce pupa IFM'lerin açık kitap diseksiyonunu gerçekleştirmek için Şekil 4'te gösterilen adımların metinsel özeti. Diseksiyon ve fiksasyondan sonra, bağlı IFM'lere sahip epitel yaprakçıkları mikroskopi için boyanır. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, D. melanogaster yetişkin (Şekil 1) ve geç pupa (48 saat - 96 saat APF) (Şekil 3) IFM'lerin hemitoraks diseksiyonu ve ayrıca erken pupa (8 saat - 48 saat APF) (Şekil 4) zaman noktalarında IFM'lerin açık kitap diseksiyonu için bir prosedür sunar. Bu protokol immünohistokimya ve floresan mikroskobu uygulamaları için idealdir. Protokol, diseksiyon prosedürünün şematik diyagramları ve adım adım fotoğrafları ile gösterilmiştir. Genel bakış diyagramları, protokolü Drosophila alanında yeni olan bilim adamlarının yanı sıra lisans araştırmacıları ve erken aşamadaki kursiyerler için de erişilebilir hale getirir. Protokol kullanıcılarının artefaktları iyi niyetli sarkomer fenotiplerinden ayırt etmelerini sağlamak için zayıf fiksasyon ve numune hazırlama artefaktlarının temsili örnekleri dahil edilmiştir.

İFM hemitoraks diseksiyonunda en zor basamak toraksın bikeslenmesidir (Şekil 1I,J,L ve Şekil 3O). Bu adım, ustalaşmak için zaman ve pratik gerektirir. Kesim sırasında ek stabilite için, tek tek toraslar çift yapışkanlı bant üzerine yerleştirilebilir ve36 kesilebilir, ancak IFM'lerin kurumasını önlemek için dikkatli olunmalıdır. Göğüs kafesinin ventral tarafından, sırt tarafı aşağı bakacak şekilde kesmek de mümkündür, böylece yeni kullanıcılar kurulumlarında hangi yaklaşımın en etkili olduğunu test edebilir. IFM'lere zarar vermemek için kesimler yeni, keskin bıçaklarla yapılmalı ve bıçak köreldiğinde değiştirilmelidir. Mikrotom (kriyostat) bıçakları, iğne, forseps veya neşter bıçağı kullanan diğer protokollere kıyasla bu protokolde göğüs kafesini temiz bir şekilde kesmek için kullanılır24, 32, 36. Tıraş bıçakları, göğüs kafesini temiz bir şekilde ikiye bölmek için başka bir alternatiftir. Biseksiyondan önce fiksasyon da önemlidir, çünkü hafifçe sabitlenmiş doku, stabil bir şekilde korunmuş olmasına rağmen "yumuşacık" olabilir ve kesilmesi daha zor olabilir. 30-60 dakikalık fiksasyon süreleri, antijen mevcudiyetini ve doku sertliğini dengeleyerek kesikleri kolaylaştırır ve deneyimle 15 dakikaya kadar kısaltılabilir.

Hemitoraks preparatlarının bir sınırlaması antikor penetrasyonudur. Hemitoraceler kalın numunelerdir32 ve en kaliteli konfokal mikrograflar IFM'lerin42, 58 üst 10-20 μm'sinden elde edilir. Çok düşük deterjan konsantrasyonu veya çok kısa geçirgenlik süresi, zayıf ve tutarsız lekelenmeye neden olabilir. Antikor penetrasyonu, birincil antikorda daha uzun (2-3 gün) bir inkübasyon ile de geliştirilebilir. İki fotonlu bir sistem veya daha büyük bir çalışma mesafesine sahip bir objektif de görüntüleme derinliğiniartırabilir 59. Deneycinin IFM miyofiberinin tam çapını görüntülemesi gerekiyorsa, sagital düzlemde mikrotom24, 58 veya kriyoseksiyon27 gibi alternatif bir yaklaşım düşünülmelidir.

Ana protokolde ele alınmayan önemli bir husus, görüntü veri analizidir. 10x veya 20x görüntülerde IFM miyofiberlerinin analizi için (Şekil 6A-D, Şekil 7A,B,E,F,I,J), standart analiz, miyofiberlerin bağlı olup olmadığının ve miyofiberin brüt morfolojisinin sağlam olup olmadığının belirlenmesini içerir37, 38. Deneye bağlı olarak ölçülebilen parametrelere örnek olarak uzunluk, genişlik, sayı, ekli sayı veya yırtık miyofiberlerin sayısı37, 60 verilebilir. Bu protokolün önemli bir avantajı, floresan mikroskobu ile uyumluluk ve sarkomer ve miyofibril morfolojisini 60x veya 100x'lik daha yüksek büyütmelerde analiz etme yeteneğidir (Şekil 6E-H, Şekil 7C,D,G,H, K,L). Sarkomer morfolojisi, teknik artefakt içermeyen örneklerde analiz edilmelidir (Şekil 6K-P). Olası miyofibril ve sarkomer fenotiplerinin bir dizi kategorisi daha önce tanımlanmıştır60. En yaygın olarak, sarkomer uzunluğu ve genişliği, görüntü işleme yazılımında Z-diskinden Z-diskine bir çizgi çizilerek ve ölçülerek ya da dönüşümlü olarak ücretsiz olarak temin edilebilen birkaç otomatik araçtan biri kullanılarakölçülür 18, 45, 61. Sarkomer morfolojisinin değerlendirilmesi, Z-diski veya M-çizgisini veya kalın veya ince filamentleri30, 34,58 etiketleyen belirteçler dahil edilerek geliştirilebilir. Bu veriler, bu diseksiyon protokolü kullanılarak hazırlanan bir kontrol ve test numunesi arasındaki miyofiber, miyofibril ve sarkomer fenotiplerini nicel olarak tanımlamak için kullanılabilir.

Protokol kullanıcıları, fiksasyonun miyofiber ve sarkomer morfolojisini korurken, fiksatifin yanı sıra tamponlar ve montaj ortamının doku büzülmesine veya şişmesine neden olabileceğini ve morfolojik parametrelerin ölçümünü etkileyebileceğini bilmelidir45. Elektron mikroskobu için gerekli olan glutaraldehit fiksasyonu ve dehidrasyonunun sarkomer çapını43 küçülttüğü bilinirken, lif kabuklanması ve gliserasyonun sarkomer çapını44,45 arttırdığı gösterilmiştir. Bu fenomen, literatürdeki sarkomer parametrelerindeki farklılıkların altında yatıyor olabilir ve her deneye kontrol ve test örneklerinin dahil edilmesinin önemini vurgulamaktadır. Sarkomer kantitatif parametrelerinin doğru bir şekilde karşılaştırılması için kontrol ve test IFM'leri aynı tamponlarda aynı anda işlenmelidir.

Bu ayrıntılı protokol, immünohistokimya ve floresan mikroskopi için yetişkin ve pupa IFM diseksiyonunu başlangıç ve ileri düzey Drosophilistler için daha erişilebilir hale getirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol, diğer böceklerle ve ayrıca kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), tek moleküllü floresan in situ hibridizasyon (smFISH) veya uzamsal transkriptomik gibi diğer görüntüleme teknikleri için uyarlanabilir. Güçlü Drosophila genetik araçlarının floresan mikroskobu ile kombinasyonu, korunmuş miyogenez ve kas fonksiyonu ilkelerini araştırmak için benzersiz fırsatlar sunar. IFM'ler moleküler ve biyokimyasal yaklaşımlara da uygun olduğundan26, 27, moleküler fenotipleri kas morfolojisi, hücre biyolojisi ve işlevine bağlayan gelecekteki çalışmalar, miyogenez ve kas bozukluklarının etiyolojisi hakkında daha derin bir anlayış sağlayacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, SmnE33 alelini sağladığı ve Smn hakkındaki faydalı tartışmalar için Gregory Matera'ya teşekkür eder. Yazarlar, yararlı tartışmalar ve destek için Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat ve Aynur Kaya-Copur'a teşekkür eder. Yazarlar, sinek sağlamak için Bloomington stok merkezini kabul ediyor. Bu çalışma, Missouri Üniversitesi Kansas City (UMKC) Bilim ve Mühendislik Fakültesi, Biyolojik ve Biyomedikal Sistemler Bölümü (MLS), UMKC Mükemmellik Finansmanı Programı (MLS) ve UMKC Lisans Araştırma ve Yaratıcı Burs Ofisi'nin (SF, MLS) başlangıç finansmanı ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
60 mm doku kültürü çanaklarıFisher ScientificFB01292160 mm, polistiren
Asetik Asit, Glacial (Sertifikalı ACS)Fisher ScientificA38S-212
Adenozin Trifosfat (ATP)Millipore SigmaA1852
Alüminyum folyo, ağır hizmetAmazon12 inç. x 1000 ft.
Siyah silikon diseksiyon kabları: aktif kömür tozuMillipore SigmaC9157Ayrıca çoğu eczaneden temin edilebilir
Siyah silikon diseksiyon tabakları: Sylgard 184Millipore Sigma761036Silikon disseksiyon tabakları yapmak için Sylgard bileşenlerini ziploc torbada birleştirip iyi karıştırın. Sylgard'a (~50 g) aktif kömür tozu (~200 mg) ekleyin, iyi karıştırın, poşetin köşesini kesin, 60 mm kültür kablarını doldurun, pipet ucuyla kabarcıkları çıkarın ve gece boyunca kürleyin. 
Karton slayt tepsisi, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Konfokal mikroskop, Nikon AXR ters konfokalNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Konfokal mikroskop, Zeiss LSM 780 ters konfokalZeisswww.zeiss.com
Darwin Böcek Yetiştirme Odası (Kuluçka Makinesi)Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034ışık, sıcaklık ve nem kontrollü kuluçka makinesi
Diseksiya Kabı (Siyah Cam)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (boyama kaseleri/lenf tankları), siyah cam, 4x4 cm, şeffaf cam kapaklı
Dumont #3 PensetlerGüzel Bilim Araçları11231-30Dumoxel düz uçlu 12 cm forseps, 0.17 x 0.1 mm uç ve nbsp;
Dumont #5 PensetlerGüzel Bilim Araçları11252-20Inox düz uçlu 11 cm forseps, Biyoloji sınıfı, 0.05 x 0.02 mm uç ve nbsp;
EGTA (Egtazik Asit)Millipore Sigma324626
Etanol, Mutlak (200 Proof)Fisher ScientificBP28184Moleküler Biyoloji Derecesi
Fisherbrand Premium Kapak Camı (18 x 18 mm), kapak kaydırmalarıFisher Scientific12548ACam, Kare, #1 kalınlık (0.13 - 0.16 mm)
Fisherbrand Premium Kapak Cam (22 x 22 mm), kapak kaydırmalarıFisher Scientific12548BCam, Kare, #1 kalınlık (0.13 - 0.16 mm)
Düz tabanlı hücre kültür plakaları (24 kuyruklu)Fisher Scientific7200740
Floresan diseksiyon mikroskop kamerası, Infinity8 kameraTeledyne (Görsel Dynamix)6 megapiksel, düşük ışık, monokromatik
Fly: Smn[E33]Sinek stok; Gregory Matera'nın hediyesi
Sinek: w[1118]Bloomington Stok MerkeziRRID:BDSC_3605Uçan stok
gliserolFisher ScientificBP229-1Moleküler Biyoloji Derecesi
Glyoxal çözeltisi (H2O içinde %40 wt)Millipore Sigma128465  Bu %40 stok çözümdür
Görüntü işleme yazılımı, Affinity Designer 2Yakınlıkhttps://affinity.serif.com/en-us/
Görüntü işleme yazılımı, Image J (Fiji)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Böcek iğneleriGüzel Bilim Araçları26002-10paslanmaz çelik, 0.1 mm çapında (küçük pinler)
Magnezyum klorür (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Metanol (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4-20'de rahatlamak mı? Kullanımdan önce
Mikroskop slaytları, buzluFisher Scientific12-550-400yazı alanı, şarj edilmemiş, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Mikroskop slaytları, düz camFisher Scientific12-544-4Ön temizlik, 75 mm x 25 mm
MX35 Ultra mikrotom bıçaklarıepredia (Fisher Scientific)3053835Düşük profil, 34 derece kesme açısı; C35 tüy 80mm bıçaklar iyi çalışıyor
Tırnak oje, şeffaf (Sally Hansen Xtreme Wear Tırnak Ojesi)Amazon0.4 fl. oz.
Normal keçi serumuMillipore SigmaS26-LITRE
Nutator (Mini Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 rpm, sabit; 8 x 6 inç. gamzeli paspaslı platform
Fırça (0. Tur)Amazon0. tur veya benzeri bir fırça, herhangi bir sanat malzemesinden
Paraformaldehit (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS): KClMillipore Sigma529552-250GMPBS'yi Cold Spring Harb Protoc'a göre hazırlayın; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS): KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GPBS'yi Cold Spring Harb Protoc'a göre hazırlayın; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS): Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GPBS'yi Cold Spring Harb Protoc'a göre hazırlayın; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosfat Tamponlu Tuzlu Çay (PBS): NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1PBS'yi Cold Spring Harb Protoc'a göre hazırlayın; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
PR1MA Pipet uçları (10 ve mikro; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniversal 10 & mikro; L pipet uçları
PR1MA Pipet uçları (1000 µ L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 µ L pipet uçları
PR1MA Pipet uçları (200 & mikro; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 & micro; L pipet uçları
Rodamin-falloidinInvitrojen, Moleküler ProblarR415
Scotch çift taraflı bantİskoç/3M (Zımbalar)649280Her iki tarafı yapıştırıcı ile kaplanmış, 0.5" x 7 yard, çoğu ofis malzemesi taşıyıcısında mevcut
Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat (NaH2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Yazılım: GraphPad PrismGraphPad Prizmasıwww.graphpad.com
Yazılım: Infinity Analyze 7Teledyne (Görsel Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Yazılım: Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
doku/ Kimtech Science Kimwipes Hassas İş Silecekleri, 1 katFisher Scientific06-666Standart mendil mendilleri
Transfer pipetiFisher Scientific13-711-9AMMDPlastik pipet
Trition X-100Millipore SigmaT9284-100ML
Vannas yay makasıGüzel Bilim Araçları15000-003 mm kesme kenarı, uç çapı 0,05 mm, uzunluk 8 cm
DAPI ile VectashieldVektör LaboratuvarlarıH-2000
DAPI olmadan VectashieldVektör LaboratuvarlarıH-1900
Whatman kağıdıMillipore SigmaWHA1004070Filtre kağıdı daireleri, 4. sınıf, 70 mm
Z10 floresan stereo disseksiyon mikroskobuVisual Dynamix (Orta Batı Bilimci)http://www.visualdynamix.net/
Z850 Ergonomik Stereo Zoom Diseksiyon MikroskobuVisual Dynamix (Orta Batı Bilimci)http://www.visualdynamix.net/

Kaynaklar

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila U u KaslarKas DiseksiyonuMiyogenez ModeliSarkomer Morfolojisimm nofloresan MikroskopiPupa Kas Geli imiMiyofibril Yap sFiksasyon Y ntemleriKas Hastal Modeli
Mikroskopi Yaklaşımları için Drosophila melanogaster Dolaylı Uçuş Kaslarının Diseksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.