Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hastalık Tanısı ve Tedavilerde Bireysel SEV'lerin Yüzeye Güçlendirilmiş Raman Saçılmasına Dayalı Biyosensörleme'nin Uygulanmasını Araştırmak

405 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69258

⸱

13 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, etiketsiz yüzey takviyeli Raman spektroskopisi (SERS) kullanılarak bireysel küçük ekstrasellüler veziküllerini (sEV) analiz etmek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol, minimal invaziv hastalık teşhisi ve sEV'lerin terapötik teslimat araçları olarak değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

Özet

Bu protokol, yüzey üzerinde geliştirilmiş Raman spektroskopisini (SERS) makine öğrenimi (ML) ile entegre eden, tanısal ve tedavi uygulamaları için bireysel küçük ekstrasellüler vezikülleri (sEV) moleküler olarak tespit edip profil olarak profil veren kapsamlı ve etiketsiz bir platform sunmaktadır. Yöntem, boyut dışlama kromatografisi veya ultrasantrifüjasyon kullanılarak sEV izolasyonu ile başlar. İzole veziküller, tekli vezikül hassasiyetine sahip mühendislik yapımı plazmonik altın nanopiramit 2D dizi alt tabakalarında analiz edilir. Protokol, içsel Raman biyokimyasal parmak izlerini kullanarak harici etiketler olmadan yüksek özgüllük tespitini mümkün kılar. Spektral edinimden sonra, veriler ön işlemeye tabi tutulur ve hastalık durumlarını sınıflandırmak için eğitilmiş makine öğrenimi algoritmaları (örneğin LDA, SVC) kullanılarak analiz edilir; doku, plazma ve tükürükten alınan sEV'ler kullanılarak mide kanseri sağlıklı kontrollerden başarıyla ayırt edilir; bu sınıflandırma doğruluğu %90,1, %70,9 ve %60,7 olarak belirlenir. Ayrıca, terapötik uygulaması, tek sEV'lerde doksorubisin yükünün nicelendirilmesiyle gösterilmektedir; bu ölçüm, grafen kaplı substratların iç standart olarak kullanılmasıyla geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, erken hastalık tespiti ve tek vezikül seviyesinde ilaç yükleme verimliliğini anlamak için gerekli olan popülasyon heterojenliğini yakalayan yüksek verimli analizlere olanak tanır.

Giriş

Genellikle çapı 30 ila 200 nm arasında değişen küçük ekstrasellüler veziküller (sEV'ler), hücreler tarafından doğal olarak biyolojik sıvılara salgılanır ve kökenhücrelerinin 1,2,3'e işaret eden proteinler, lipidler ve nükleik asitler taşır. Tükürük, idrar ve diğer vücut sıvılarında bulunan invaziv olmayan biyobelirteçler4 olarak, erken hastalık teşhisi, prognoz ve özellikle onkolojide tedavi amaçlı izleme için umut vaat ediyorlar 5,6,7. Ancak, klinik translasyonları yüksek heterojenlikleri ve karmaşık biyolojik matrislerdeki düşük bollukları nedeniyleengellenmektedir 8. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu protokol yüzeyle güçlendirilmiş Raman spektroskopisini (SERS) kullanır; bu, plazmonik substratlar 9,10,11 üzerinden Raman saçılmasını 10 10-10 11 kez artırabilen güçlü bir analitik yöntemdir. SERS, bireysel sEV'lerin içsel moleküler "parmak izi" spektrumlarını saniyeler içinde yakalarak ultra hassas tek vezikül analizini mümkün kılarak uzun test sürelerinden kaçınır.

Yöntemimiz, etiketsiz tabanlı SERS'leri sinerjik olarak birleştirerek bireyselsEV'lerin hızlı ve ultra hassas karakterizasyonunu sağlamaktadır 12,13,14,15,16. Etiketsiz SERS, içsel biyokimyasal imzaları yakalar ve LDA gibi makine öğrenimi modelleri ile birleştiğinde, SVC, sağlıklı ve hasta hücrelerden türetilen sEV'leri yüksek özbaşılığa sahip olarak ayırt ettiğigösterilmiştir 13. Platformumuzun tekrarlanabilirliğini ve nicel kapasitesini daha da artırmak için, yöntemimiz grafen kaplı Ramansubstratları 16 ile tam uyumludur. Tek katmanlı grafen, plazmonik sıcak noktaları stabilize eden ve moleküler adsorpsiyonu artıran kimyasal olarak düzgünlü bir yüzeysunar 17,18; daha da önemlisi, tek katmanlı grafen SERSsinyallerinin 12,19'nun "dabarı" göstergörü olarak hizmet eder ve tespit edilen moleküllerin nicelik yeteneğini sağlar. Raman lazer ışını çapı (~ 1 μm) tipik sEV'den daha büyük olmasına rağmen, platformumuz fiziksel ve istatistiksel mekanizmaların benzersiz etkileşimi sayesinde etkili tek vezikül çözünürlüğü sağlamaktadır. Yarı-periyodik altın nanopiramit alt tabakası, 100 nm'den küçük boyutlarda yüksek lokalize plazmonik "sıcak noktalar" üretir ve Raman sinyallerini süper doğrusal bir şekildegüçlendirir 12. Sonuç olarak, ışın içindeki en yoğun sıcak noktaya stokastik olarak en yakın olan sEV'den gelen sinyal spektrumu domine eder. Ayrıca, SEM görüntüleme, sEV'lerin iyi aralıklı (1 μm >aralıklı) olduğunu doğrular; bu da spektral örtüşmeyi en aza indirirken, Raman yoğunluk haritaları sinyal lokalizasyonunun bireysel veziküllerinboyutuna (13,14) uyduğunu gösterir. Bu özellikler birlikte, toplanan her spektrumun ağırlıklı olarak tek bir sEV'ye karşılık gelmesini sağlar ve istatistiksel olarak sağlam, etiketsiz tek vezikül analizini sağlar. Western blot, kütle spektrometrisi veya düzenli Raman saçılması gibi büyük örnek hacmleri gerektiren ve tekvezikülleri çözemeyen geleneksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, tek veziküllü SERS platformumuz üstün hassasiyet, verimlilik ve moleküler çözünürlük sunar. Bu iş akışı, minimal invaziv, yüksek çözünürlüklü tanı araçları geliştirmeyi amaçlayan araştırmacılar veya bireysel terapötik çalışmalarda sEV heterojenliği ve ilaç yükleme verimliliğini araştırmayı amaçlayan araştırmacılar için uygundur. Bu protokolde, SERS platformumuzun hastalık tespiti ve özellikle kanser alanında tedavi uygulamalarını mümkün kılmak için tek sEV'leri nasıl kullandığını gösteriyoruz; vezikül izolasyonu, plazmonik substrat hazırlığı, Raman edinimi ve makine öğrenimi ile veri analizi gibi tüm iş akışını içeriyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan örneklerinin toplanması, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü ve UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı. Tüm bağışçılar, çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay vermiştir.

NOT: Bu çalışmada ticari bir satıcıdan satın alınan toplam 4 hücre hattı kullanıldı: AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869). Bu hücre hatları, satıcının talimatları ve reaktiflerine uygun olarak sıkı bir şekilde kültürlenip geçirildi. Koşullandırılmış ortamlar toplanıp -20 °C sıcaklıkta saklandıktan sonra işlendi. Kore'deki Samsung Tıp Merkezi'nde bağışçılar gönüllü olarak doku, plazma ve tükürük örnekleri sağladılar. Cerrahi rezeksiyon sırasında mide kanseri dokusu alınırken, kanser dışı kontrollerden biyopsiler endoskopi yoluyla toplandı. Plazma, standart klinik protokollere göre EDTA tüplerinde toplandı. Her deneden yaklaşık 5 mL uyarılmamış tüm tükürük toplandı, ardından 2.600 × g ile 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edildi. Ekstrasellüler RNA'yı korumak için, süpernatan 20 U/mL seviyesinde SUPERase-In RNase inhibitörü ile takviye edildi. Tüm örnekler, daha fazla işlemeye kadar -80 °C sıcaklıkta tutuldu. sEV'ler, belirlenen protokollere uygun olarak koşullu ortam ve klinik örneklerden izoleedildi 21.

1. sEV izolasyonu ve karakterizasyonu

  1. SEV örnekleri hazırla
    1. Temizlenmiş hücre kültürü süpernatantını tamamen oda sıcaklığında çöz.
    2. Üst filtreyi steril bir 0.22 μm şırınga filtresinden geçirerek kalıntıları ve daha büyük kirleticileri temizleyin.
    3. 35 nm boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1× PBS çözeltisi ile dengeleyin.
    4. Filtrelenmiş örnekten 500 μL kolona uygulayın.
    5. Üreticinin talimatlarına göre örneği 1x PBS ile elüetleyin.
    6. EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonları topla ve −20 °C'de temiz şişelerde saklıyor.
  2. Parçacık konsantrasyonu ve boyutunu belirleyin
    1. SEV'leri steril DPBS'de seyreltirin ve son parçacık konsantrasyonu 107-10 9 parçacık/mL olarak elde edilir.
    2. Nanopartikül takip analiz cihazı kullanarak, her örnek başına beş adet 60 saniyelik video kaydedin. Kamera seviyesi 14 ve sabit akış hızı ayarı 25 kullanın.
    3. Videoları cihazın yazılımıyla analiz edin; seyreltme faktörünü uygulayarak nihai parçacık konsantrasyonunu (partikül/mL) ve ortalama çapı (nm) belirleyin.
  3. Tetraspanin ifadesini karakterize edin
    1. Temel sinyal oluşturmak için ön tarama yapılan insan tetraspanin çipleri (1 cm × 1 cm, anti-CD9, anti-CD63 ve anti-CD81 ile önceden kaplanmış).
    2. Sulandırılmış sEV örneklerini kapalı 24 kuyu plakasında çiplere yükleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka yapın.
    3. 35 μL tespit antikoru (anti-CD9 CF488, anti-CD63, CF647, anti-CD81 CF555) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
    4. Çipleri üreticinin protokolüne göre yıkayın.
    5. Veziküler tetraspanin ifadesini biyomarker karakterizasyon okuyucusu ve ona bağlı tarama yazılımı kullanarak ölçin.
  4. TEM ile sEV morfolojisini doğrulayın
    1. ~100 μL sEV'leri ~100 μL %4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitleyin.
    2. Yaklaşık 100 μL sabit sEV'leri 300 ağlık bakır ızgaralara yükleyin ve 5 dakika kuluçka yapın.
    3. Izgaraları deiyonize suyla durulayın.
    4. Izgaraları, damıtılmış suda %1 uranil asetat (~ 20 μL) çözeltisiyle boyan.
    5. Son bir durulama işlemi suyla yapın ve ızgaraların tamamen hava kurumasına izin verin.
    6. Örnekleri iletim elektron mikroskopisi (TEM) ile görüntüleyin ve sEV boyutunu ve morfolojisini doğrulayın.

2. SERS plazmonik substrat üretimi 12,18,19

  1. Nanoküre monokatmanı oluşturun
    1. Langmuir-Blodgett çukuru içinde su yüzeyine 500 nm çapında polistiren küreler yayılmıştır.
    2. Küreleri nazikçe sıkıştırarak yakın paketlenmiş altıgen bir monokatman oluşturun.
    3. Küre monokatmanını, waferi çukura batırıp yavaşça yukarı çekerek 4 inçlik Si levhaya (~50 nm termal SiO2 ile) aktarın.
  2. Etch nanosfer dizisi
    1. Küre çapını 500 nm'den ~250 nm'ye indirin; oksijen plazmalı reaktif iyon aşındırma sistemi (O2 gaz akışı 100 sccm, 50 s, 200 W güç). Üretim süreciyle ilgili daha fazla detay için lütfen önceki çalışmamız 12,18,19'daki yayına bakınız.
    2. Elektron-ışını buharlaştırmasıyla küçültülmüş küre dizisi üzerine 1,5 Å/s hızında 50 nm Cr tabakası biriktirin.
    3. Polistiren küreleri aseton kullanarak kaldırarak SiO2 yüzeyinde delikli bir Cr maskesi bırakın.
    4. Açık SiO2 katmanını, 200W RIE gücüyle 25 sccm Ar, 25 sccmCHF 3 karışımıyla Cr açıklıklarında aşındırın.
  3. Ters piramitler üretin
    1. Waferi 60 °C'de %60 KOH'da 2 dakika boyunca daldırarak tersleşmiş piramidal çukurları silikona oyulur.
    2. Cr maskesini Cr etchant ile 5 dakika boyunca çıkarın.
    3. SiO2 katmanını 6:1 tamponlu oksit etchant'ta tamamen temizlenene kadar çıkarın.
    4. Elektron ışını buharlaştırılması kullanarak ters piramitlerin üzerine 200 nm Au filmi konformel şekilde yerleştirin.
  4. Plazmonik substratı kesinleştirin
    1. Hızlı kürlenen epoksi (~1 mL) ayrı bir SiO2/Si alt tabakasına uygulayın. Altın kaplamalı wafli epoksiye bastırarak ortasında altın tabaka olan sandviç yapısı oluşturulur.
    2. Epoksi tamamen kürlendikten sonra silikon kalıptan epoksini soyarak serbest duran bir Au plazmonik substrat oluşturun.

3. Grafen Plazmonik Substrata Aktarım

  1. Grafen filmi hazırla
    1. 1 M FeCl3 çözeltisi hazırlayın (81 g FeCl3'ün deiyonize suda çözülüp 500 mL nihai hacme kadar seyreltilmesiyle 1 M sıvısız ferrik klorür karışımı 1 M stok çözeltisi, PMMA kaplı monokatmanlı grafen tabakasından bakır altını aşındırmak.
    2. Grafen kaplı bakır levhayı, bakır tamamen çözünene kadar FeCl3 çözeltinin yüzeyine yüzü aşağı yerleştirilir.
  2. Durulama grafen filmi
    1. Temiz bir cam slayt kullanarak, yüzen grafen filmini dikkatlice deionize su banyosuna aktararak etchant kalıntılarını durulayın.
    2. Bu durulama adımını üç kez tekrarlayın.
  3. Grafen substrata aktarma
    1. SERS plazmonik substratını grafen filminin altına son DI su banyosunda yüzdürür.
    2. Grafeni yüzeyine eşit şekilde yerleştirmek için substratı nazikçe kaldırın.
    3. Grafen kaplı altı oda sıcaklığında 1 saat hava ile kurutulur.
    4. Vakum odasına aktarın ve 180 °C basınçta 1 saat kurutun.
  4. Temiz son altlık
    1. Kurutulmuş substratı 50 °C'de aseton banyosuna 1 saat batırarak PMMA'yı çözebilirsiniz.
    2. Substratı izopropil alkolle üç kez durulayın.
    3. Temizlenmiş, grafen ile aktarılmış plazmonik substratı kullanmadan önce bir kurutucu içinde kurutun.

4. SERS örnek hazırlığı ve spektrum alımı

  1. Numuneyi alt tabaka üzerinde hazırlayın
    1. Yaklaşık 5 μL sEV örneğini uygun plazmonik substrata pipetleyin.
      NOT: İlaç yüklü sEV'lerin niceliği için, vezikülleri altın-grafen substratına uygulayın. Diğer tüm deneyler için sade altın plazmonik bir alt tabaka kullanın.
    2. Substratı bir kurutucuya yerleştirin ve damlanın tamamen kurumasına izin verin (~15 dakika).
  2. Raman Kalibrasyon sistemi
    1. Substratı konfokal Raman mikroskobuna aktarın.
    2. Enstrumanın yazılımını kullanarak veri toplamaya başlayın (WiRE sürüm 4.4).
    3. Uyarılma lazerini 5 mW'de 785 nm olarak ayarlayın.
    4. Sistemi silikon referans zirvesini 520 cm-1 olarak hizalayarak kalibre edin.
  3. Altın substratından spektrum alın (tanılama)
    1. 300 μm × 300 μm alanda tek vezikülleri bulmak için statik modda aşağıdaki ayarlarla bir keşif taraması yapın: %50 güç, 0,1 saniye pozlama, 10 μm adım boyutu.
    2. SEV'leri bulduktan sonra, 5 × 5 ızgarada statik modda yüksek çözünürlüklü eşleme yaparak aşağıdaki ayarlarla gerçekleştirilin: 1 μm adım boyutu, %50 güç, nokta başına 0,2 saniye pozlama.
  4. Grafen substratından spektrum elde etmek (terapötikler)
    1. 300 μm × 300 μm alanda bir keşif taraması yaparak statik modda bireysel vezikülleri tespit etmek için aşağıdaki ayarlarla gerçekleştirilin: %50 lazer gücü, 0.1 saniye pozlama, 10 μm adım boyutu.
    2. Genişletilmiş modda 2 × 2 ızgarayla yüksek çözünürlüklü eşleme yaparak aşağıdaki ayarlarla gerçekleştirilin: 1 μm adım boyutu, %1 lazer gücü, 10 saniye pozlama.

5. Veri ön işleme

  1. Spektral kalite kontrolü gerçekleştirin
    1. Başlangıçta ham spektrumları taramak, yüksek gürültülü sinyalleri veya anormal şekillere sahip spektrumları dışlayın.
    2. İzole kozmik ışın siktirmelerini eşik tabanlı tespit veya yerel sapma filtreleme yöntemiyle ortadan kaldırın.
  2. Spektrumları filtrele ve normalize et
    1. Her spektruma bir Savitzky-Golay filtresi uygulayarak floresans arka planını azaltın ve veriyi düzleştirin.
    2. Her spektrumun sinyal-gürültü oranını (SNR) hesaplayın; genellikle tepe-baz oranı veya standart sapma yöntemi kullanılarak kullanılır. Daha fazla açıklamak gerekirse, genellikle her spektrum için SNR, temsil bir Raman bandındaki taban çıkarma sonrası zirve yoğunluğun gürültünün standart sapmasına oranı olarak hesaplanmıştır. Gürültü, orijinal spektrumdan Savitzky-Golay düzleştirilmiş spektrumun (pencere boyutu = 11, polinom düzeni = 3) çıkarılarak elde edilen kalıntı spektrumdan tahmin edildi ve böylece yüksek frekanslı dalgalanmalar izole edildi. Uygun bir SNR eşiğini ampirik olarak belirlemek için tüm spektrumlar SNR'nin artan sırasına göre sıralanmış ve karakteristik biyokimyasal zirvelerin - özellikle fenilalanin bandı (~1002 cm-1 , amino asit), amid I bandı (~1650 cm-1 , protein) ve CH2 deformasyon bandı (~1440 cm-1 , lipid) - kalıcılığı sıralanmış spektrumlar boyunca değerlendirildi. Eşik, bu tanısal zirvelerin herhangi birinin sürekli olarak temel gürültüye karıştığı noktada belirlendi. Altın-nanopiramit SERS altlığı ve alım parametrelerimiz (785 nm uyarılma, 5 mW lazer gücü, 0.2 s entegrasyon) için bu, ampirik olarak 28 SNR eşiğine karşılık geldi.
    3. Yukarıdaki 5.2.2'ye göre SNR eşiğinin altına düşen spektrumları hariç tutun. İş akışımızda, SNR'si 28'in altında olan spektrumlar eğitim veri setinden dışlandı; çünkü bu seviyede eşik belirlendiğinde, sadece yüksek kaliteli spektrumların aşağı akış analizi ve model dayanıklılığının artırılması için korunmasını sağlıyor.
    4. Her spektrumu ya maksimum zirve yoğunluğuna ya da eğrinin altındaki toplam alana normalize edin.

6. Makine öğrenimi ile spektral analiz

  1. Modeli Eğit
    1. Her spektral ölçümlere, kökenine göre bir etiket atayın (örneğin, mide kanseri hastası ile sağlıklı kontrol arasında gibi).
    2. Spektral verileri, doğrusal bir çekirdek ile bir Destek Vektör Sınıflandırıcısına (SVC) girin.
    3. 5 kat çapraz doğrulama için katmanlı bir karıştırma bölmesi kullanın.
    4. Model performansını değerlendirmek için her katlamadan doğruluk metriklerini ortalayın.
  2. Boyutluluğu azaltın ve sınıflandırın
    1. Yüksek boyutlu SERS verilerini küçültülmüş boyutlarda görselleştirmek için Lineer Ayrımcı Analizi (LDA) kullanın.
    2. Örnek grupları arasında doğrudan sınıflandırma için LDA modelini kullanın.
  3. Modeli Değerlendirin
    1. Kör hasta örneklerinden oluşan bir sette eğitilen modelleri değerlendirerek gerçek dünyada tanı senaryosunu simüle edin. Daha fazla bilgi için lütfengrubumuz 13,15,22 numaralı bu yayınlara bakınız.
      NOT: Tüm adımları tozsuz bir ortamda temiz aletlerle yapın. Monokatmanlı grafen, bakır bir alt tabaka üzerinde yetiştirilmiş veya temin edilmiş ve transfer sırasında korumak için PMMA tabakası ile kaplanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tek veziküllü SERS protokolünün başarılı uygulanması, bireysel sEV'lerden farklı Raman spektrumları elde eder; böylece aşağıya doğru tanı sınıflandırması ve terapötik ilaç yükleme izlenmesi mümkün olur. Şekil 1 , burada rapor edilen protokolümüz kullanılarak mide kanseri için tanı çalışmasının iş akışını ve ilaç yüklü sEV'ler izleme uygulamasının iş akışını göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün önemli bir yönü, substrat hazırlama ve sEV saflatmasıdır. Etiketsiz SERS'in performansı, güçlü güçlendirme "sıcak noktası" olan uniform, yüksek konformal plazmonik substratların üretmesine büyük ölçüde bağlıdır. Benzer şekilde, yüksek saflıkta boyut dışlama kromatografisi ile sEV izolasyonu, güvenilir ve tekrarlanabilir SERS spektrumları oluşturmak için gereklidir. Protein agregaları veya lipoproteinler gibi safsızlıklar sadece vezikül sinyalini zayıflatmakla kalma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmayla ilgili çıkar çatışmaları olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleme Merkezi tarafından 4UH3TR002978-03 ve 1U18TR003778-01 numaralı ödül numaralarıyla desteklendi ve Kaliforniya Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tarafından verilen bir hibe (Grant Numarası TRAN1-14649) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
300 ağlık bakır ızgaraElektron Mikroskopi BilimleriEMS200-Cu
%4 paraformaldehit çözeltisiSigma Aldrich1004960700
4″ Si waferler MSE MalzemeleriWA0810(100) yönlendirme 
A549 hücre hattıATCCCCL-185 
AGS hücre hattıATCCCRL-1739
Santrifüj Rotoru F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/e-ışın buharlaştırma
Cr etchant çözümüSigma Aldrich651826-500ML
Doxorubicin  D-4000LC LaboratuvarlarıD-4000_3g
ExoView R100 sistemi ve ExoView İnsan Tetraspanin KitiNanoView Biyobilimlerihttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3D-product-illustrations
FeCl3 çözümüSigma Aldrich451649
HF çözümüSigma Aldrich695068-500ML
Hs 738.St/Int hücre hattıATCCCRL-7869
konfokal Raman mikroskobu aracılığıylaRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH çözümüSigma Aldrich417661
MaxQ 4000 Tezgah Üstü Inkubasyon/Soğutma ÇalkalayıcılarıTermo BilimselSHKA4000 (4320)
MCO-19AIC kuluçka makinesiSANYO8380-30-0035
Millex-GP FiltresiMilliporeSigmaSLGPM33RS  0.22 & mikro; m
NanoSEM 230 mikroskobuFEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/product-support
/nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87 hücre hattıATCCCRL-5822
Optima TLX UltrasantrifüjBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
ürünler/RIE/plasmapro-800-rie
Polistirol küreleriAlfa AesarAA42711AB500 nm
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
Tek katmanlı grafenMSE MalzemeleriME0408
T-75 şişesiVWR156800
TF20 Yüksek çözünürlüklü EMFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Uranil asetat çözeltisiElektron Mikroskopi Bilimleri22400-1

Kaynaklar

  1. Van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (5), 369-382 (2022).
  2. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Möller, A., Lobb, R. J. The evolving translational potential of small extracellular vesicles in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (12), 697-709 (2020).
  5. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  6. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-347 (2011).
  7. Kahroba, H., Hejazi, M. S., Samadi, N. Exosomes: From carcinogenesis and metastasis to diagnosis and treatment of gastric cancer. Cell Mol Life Sci. 76 (9), 1747-1758 (2019).
  8. Ferguson, S. W., Nguyen, J. Exosomes as therapeutics: The implications of molecular composition and exosomal heterogeneity. J Control Release. 228, 179-190 (2016).
  9. Stiles, P. L., Dieringer, J. A., Shah, N. C., Van Duyne, R. R. Surface-enhanced Raman spectroscopy. Annu Rev Anal Chem. 1, 601-626 (2008).
  10. Jeon, T. Y., Kim, D. J., Park, S. G., Kim, S. H., Kim, D. H. Nanostructured plasmonic substrates for use as SERS sensors. Nano Converg. 3, 1-10 (2016).
  11. Nie, S., Emery, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  12. Wang, P., et al. Ultra-sensitive graphene-plasmonic hybrid platform for label-free detection. Adv Mater. 25 (35), 4918-4924 (2013).
  13. Liu, Z. R., et al. Gold nanopyramid arrays for non-invasive surface-enhanced Raman spectroscopy-based gastric cancer detection via sEVs. ACS Appl Nano Mater. 5 (9), 12506-12517 (2022).
  14. Jonak, S. T., et al. Analyzing bronchoalveolar fluid derived small extracellular vesicles using single-vesicle SERS for non-small cell lung cancer detection. Sens Diagn. 2 (1), 90-99 (2023).
  15. Liu, Z. R., et al. Label-free single-vesicle based surface enhanced Raman spectroscopy: A robust approach for investigating the biomolecular composition of small extracellular vesicles. PLoS One. 19 (6), e0304287(2024).
  16. Liu, J., et al. On the feasibility of SERS-based monitoring of drug loading efficiency in exosomes for targeted delivery. Biosensors (Basel). 15 (3), 198(2025).
  17. Ling, X., et al. Can graphene be used as a substrate for Raman enhancement. Nano Lett. 10 (2), 553-561 (2010).
  18. Wang, P., et al. Giant optical response from graphene-plasmonic system. ACS Nano. 6 (7), 6244-6249 (2012).
  19. Wang, P., et al. Label-free SERS selective detection of dopamine and serotonin using graphene-Au nanopyramid heterostructure. Anal Chem. 87 (20), 10255-10261 (2015).
  20. Qiu, L., et al. Current advances in technologies for single extracellular vesicle analysis and its clinical applications in cancer diagnosis. Biosensors (Basel). 13 (1), 60(2023).
  21. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. J Vis Exp. (170), e64102(2021).
  22. Li, T., et al. Label-free SARS-CoV-2 detection platform based on surface-enhanced Raman spectroscopy with support vector machine spectral pattern recognition. Eng Sci. 23, 862-870 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Raman SpektroskopisiKüçük Hücre Dışı VeziküllersEV İzolasyonuMakine Öğrenmesi SınıflandırmasıPlazmonik Alt TabakaAltın Nanopiramit DizisiGrafen Alt TabakaDoksorubisin Yüklemesi
Hastalık Tanısı ve Tedavilerde Bireysel SEV'lerin Yüzeye Güçlendirilmiş Raman Saçılmasına Dayalı Biyosensörleme'nin Uygulanmasını Araştırmak
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.