$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Araştırma protokolü, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin İkinci Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (No. 2025-0581). Tüm deneyler ve prosedürler Helsinki Bildirgesi'ne (2013'te revize edilen) göre gerçekleştirildi. Bu retrospektif çalışma, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin İkinci Bağlı Hastanesi'nde LETM nedeniyle hastaneye yatırılan 47 hastayı içerdi. Bu çalışma, tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay aldı. Bu retrospektif kohort çalışması tüm uygun hastaları içeriyordu. Örneklem büyüklüğünün yeterliliğini değerlendirmek için sonradan bir güç analizi yapıldı. Sonuçlar, mevcut örneklem büyüklüğüyle gözlemlenen etki boyutunun 1.213515 olduğunu ve elde edilen gücün (1-β hata olasılığı) 0.9659161 olduğunu, bu da geleneksel eşik olan 0.8'i aştığını gösterdi. Böylece, örneklem büyüklüğü istatistiksel gereksinimleri karşılar.
Hasta alımı
Dahil etme kriterleri: Akut ataklar geçiren, tam klinik verilere sahip, serumu MOG, AQP4 ve GFAP antikorları için negatif çıkan ve etkilenen segmentleri üç18'den fazla veya eşit olan hastaları dahil edin. Dışlama kriterleri: Engelliliğe yol açabilecek diğer hastalıkları yaşayan ve akut başlangıçta efgartigimod kabul etmiş hastalarıhariç tutun 18. Hasta bilgi toplama: Yaş, cinsiyet, hastalık süresi ve ilgili omurga segmentlerinin uzunluğu dahil olmak üzere demografik bilgiler kaydedildi.
Tedavi ve klinik değerlendirme
Hastaları ilgili tedavi rejimlerine göre gruplandırın. Hastalar iki gruba ayrıldı: efgartigimod tedavi grubu (n = 11) ve konvansiyonel tedavi grubu (n = 36). Efgartigimod grubunda, hastalar 2 hafta boyunca 400 mg efgartigimod uygulaması ve 1.000 mg metilprednizolonun 500 ml %10 glukoz çözeltisi karışımı intravenöz infüzyonu ile 2 haftalık tedavi süresi boyuncauygulandı 16. Geleneksel tedavi grubunda, hastalar 1.000 mg metilprednizolon ve 500 mL %10 glikoz çözeltisi karışımı damar içi infüzyonla tedavi edildi ve 2 haftalık tedavisüresi boyunca uygulandı 19.
Hastaların klinik değerlendirme parametreleri
Hastaların engelliliği, genişletilmiş engellilik durumu ölçeği (EDSS) ve klinik kırılganlık ölçeği (CFS) dahil olmak üzere bir dizi indeksle değerlendirildi (CFS)20,21. Hastaların yaşam kalitesi, fiziksel işlevsellik (PF), ruh sağlığı (MH), ağrı (PA), genel sağlık (GH), canlılık (VT), sosyal işlevsellik (SF), rol-duygusal (RE) ve roller-fiziksel (RP)22 dahil olmak üzere Sağlık Anketi Kısa Form-36 (SF-36) ile değerlendirildi.
İnterlökin-6 (IL-6), IL-10 ve IL-41 ölçümü
Sabah oruç kan örnekleri alındı. Serum, 10 dakikalık santrifüjle 1.000 x g ölçüsünde kandan izole edildi ve sonraki analiz için -80 °C'de saklandı. Tüm örneklerin depolama süresi 6 ila 48 ay arasında değişiyordu.
IL-6, IL-10 ve IL-41 serum seviyeleri, üreticinin talimatlarına (Materyal Tablosu) uygun olarak enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitleri kullanılarak ölçüldü. ELISA kitinden tüm reaktifleri testten önce 20 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin. Standart, örnek ve boş kuyular kullanıldı. Farklı konsantrasyonlarda (0-100 pg/mL) standart çözelti 50 μL standart kuyulara eklendi, örnek kuyruklarına 50 μL serum örneği eklendi ve boş kuyulara 50 μL numune sulaştırıcı eklendi. Konsantre yıkama çözeltisi çift damıtılmış suyla 1:24 oranında seyreltilerek bir yıkama tamponu hazırlandı. Hazırlanan tampon aynı gün kullanıldı ve optimum yıkama verimliliği sağlandı.
Deneysel gereksinimlere göre çalışma çözelti hacmi hesaplandı (100 μL kuyu başına). Kullanımdan 15 dakika önce, 100x konsantre biyotinillenmiş antikoru 7.150 x g ile 1 dakika boyunca santrifüj yaptı ve biyotinillenmiş antikor seyreltme tamponu ile 1:99 oranında seyreltilerek 1x çalışma konsantrasyonu elde edildi. Hazırlanmış çalışma çözümünü hemen kullanarak etkinliğini sürdürdü. HRP konjugatı, HRP ile konjuge edilmiş streptavidinden oluşuyordu. Deneysel gereksinimlere göre gerekli hacmi hesapladı (100 μL per kuyyu), yeterli miktar için ek 100-200 μL hazırlandı. Kullanımdan 15 dakika önce, 100x konsantre HRP konjugatı 11.173 x g ile 1 dakika boyunca santrifüj edildi ve ardından HRP konjugat seyreltme tamponu ile 1:99 oranında seyreltilerek 1x çalışma konsantrasyonu elde edildi. Hazırlıklı çalışma çözümünü hemen kullanarak etkinliğini sürdürdü.
Standart kuyular (100 μL seyreltilmiş standart), boş kuyular (100 μL standart ve numune seyreltme tamponu) ve örnek kuyuları (100 μL seyreltilmiş test örneği) buna göre hazırlandı. Çözeltiler eklendikten sonra plakayı bir zarla mühürleyin ve oda sıcaklığında 1,5 saat kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, yıkamadan önce kuyudaki sıvıyı çıkarın. Daha sonra, her kuyuya 100 μL biyotinile edilmiş antikor çalışma çözeltisi eklendi. Plakayı mühürleyin ve biyotinile edilmiş antikorun antijen-antikor komplekslerine bağlanmasını kolaylaştırmak için 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, kuyulardaki sıvıyı çıkarın ve tabağı temiz, emici kağıtta kurulayın. Her kuyuyu 350 μL yıkama tamponu ile doldurun ve 1 dakika bekletin. Sıvıyı çıkardıktan sonra, tabağı emici kağıt üzerinde tekrar kurutun. Bu yıkama prosedürünü 4 kez tekrarladım.
Yıkamadan sonra, her kuyuya 100 μL enzim konjugat çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın, böylece HRP konjugatı ile biyotinilen antikor arasında tam bir bağlanma sağlanır. İnkubasyondan sonra, sıvıyı kuyulardan tamamen çıkarın ve tabağı temiz, emici kağıtta kurutulun. Yukarıda tarif edilen yıkama prosedürünü 5 kez tekrarlayarak bağlanmamış enzim konjugatlarını iyice çıkarın ve spesifik olmayan reaksiyonları en aza indirin. Yıkamadan sonra, her kuyuya 90 μL substrat çözeltisi ekleyin. Plakayı sızdırın ve yaklaşık 15 dakika boyunca karanlıkta 37 °C'de kuluçka yapın. Mikroplaka okuyucuyu 15 dakika önceden ısıtarak tespit doğruluğunu garanti altına aldım. İnkubasyon sonrası, renk gelişimi ve enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için her kuyuya 50 μL stop çözeltisi eklendi. Reaksiyon sona erdikten sonra, her kuyunun 450 nm'sindeki optik yoğunluk (OD) hemen ölçüldü ve sonuçlar sonraki veri analizi ve hesaplama için mikroplaka okuyucu kullanılarak kaydedildi.
İstatistiksel analiz
İstatistiksel analiz SPSS 27.0 ve GraphPad Prism 8.4.3 üzerinde gerçekleştirildi. İki grup arasındaki temel verileri karşılaştırmak için bağımsız örnekler t-testi ve χ2 testi kullanıldı. Tedavi öncesi ve sonrası klinik skorlar ile yaşam kalitesi puanlarını karşılaştırmak için eşleştirilmiş örnek t-testi veya Wilcoxon testi kullanıldı. Ayrıca, serum IL-6, IL-10 ve IL-41 seviyeleri, tedavi öncesi ve sonrası eşleştirilmiş bir t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. İki grup arasında bağımsız bir örnek t-testi kullanılarak karşılaştırma yapıldı. Pearson korelasyon katsayısı, iltihap faktörleri ile EDSS seviyeleri arasındaki korelasyonu ölçmek için kullanıldı. Farklar istatistiksel olarak anlamlı olarak p < 0.05 olarak kabul edildi.