Kronik Hipoksi Bir Sare Modelinde Elektroakupunktur ile Kardiyo-Beyin Koruması

Özet

Bu çalışma, elektroakupunkturun kardiyo-serebral korunmasını araştırmak için 12 haftalık kronik hipoksi fare modeli oluşturmuştur. Bulgular, bilişsel fonksiyonu geliştirmek için yaygın olarak kullanılan akupunktur noktalarında elektroakupunktur uyarısının sadece bilişsel işlevi geliştirmekle kalmayıp kalp fonksiyonunu hafiflettiğini ve miyokardiyal dokudaki patolojik hasarı azalttığını gösterdi.

Özet

Bu çalışma, elektroakupunkturun kardiyo-serebral koruyucu etkilerini araştırmak için 12 haftalık kronik hipoksi fare modeli oluşturdu. Hipoksiye bağlı hastalıklar için mevcut tedavi yaklaşımları, örneğin hiperbarik oksijen tedavisi ve bazı ilaçlar, genellikle kötü erişilebilirlik veya tek hedef mekanizmaları nedeniyle kısıtlanır. Bu boşluğu gidermek için, geleneksel olarak bilişsel geliştirme için kullanılan akupunktur noktalarında EA uyarısının kronik hipoksik koşullarda hem bilişsel hem de kardiyak fonksiyonları aynı anda iyileştirebileceğini varsayımdık. Otuz erkek C57BL/6J faresi rastgele olarak üç gruba ayrıldı: kontrol grubu (Con), kronik hipoksi model grubu (CH) ve kronik hipoksi ve elektroakupunktur tedavi grubu (CH+EA). CH ve CH+EA grupları, 12 hafta boyunca günde 8 saat boyunca hipoksik ortama (%10,0 ± %0,5 O₂) maruz kaldı; CH+EA grubu ise son 2 hafta boyunca GV20, GV24 ve çift taraflı ST36 seviyelerinde günlük EA uyarısı aldı. Davranışsal testler, ekokardiyografik değerlendirme ve histopatolojik analizler, EA'nın sadece kaygı benzeri davranışları önemli ölçüde hafifletmekle kalmayıp, mekansal hafızayı iyileştirdiğini, aynı zamanda birden fazla kalp fonksiyonu parametresini geliştirdiğini, hipokampal nöron hasarını ve miyokard yeniden yapılandırmasını azalttığını ortaya koydu. Bu bulgular, EA'nın kardiyo-serebral koruyucu etkiler sağladığını ve bunun Geleneksel Çin Tıbbı "bütünsel kavramı" ile uyumlu olduğunu ve böylece hipoksiye bağlı kardiyoserebral komorbiditeler için farmakolojik olmayan yeni bir müdahale stratejisi sağladığını göstermektedir.

Giriş

Hipoksi, yüksek irtifa ortamları, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kardiyoserebrovasküler hastalıklar ve havacılık ile dalış operasyonları gibi özel durumlar gibi çeşitli durumlarda yaygın bir patolojik zorluk olarak görülür; bu durum potansiyel olarak çok organlı fonksiyonel bozulmaya yol açabilir. Vücutta en yüksek oksijen tüketimine sahip organlar olan beyin ve kalp özellikle hipoksik hasara karşı savunmasızdır. Çalışmalar, KOAH hastalarında bilişsel bozukluk yaygınlığının %32 ile %88 arasında değiştiğini^, kalp fonksiyon bozukluğunun ise %70'e kadar ulaştığını ^{göstermektedir.} Çalışmalar, kronik hipoksiyanın beyin mitokondriyal disfonksiyonunu indükte ettiğini, bunun sonucunda oksidatif stres, kalsiyum aşırı yüklenmesi ve nöroinflamasyona yol açtığını, bunun da hipokampus ve beyin korteksinde nöronal hasara yol açtığını, öğrenme ve hafıza fonksiyonlarını^{bozduğunu göstermiştir 4,5,6}. Aynı zamanda, hipoksi hem sempatik sinir sistemini hem de renin-anjiyotensin-aldosteron sistemini (RAAS) aktive eder; bu da vazokonstriksiyona, yüksek tansiyona, artan kalp sonrası yüke ve miyokard hipertrofi ile fibrozisi teşvik eder, bu da nihayetinde kalp^{yetmezliğine yol açar 7,8,9}. Bu eşzamanlı kardiyo-beyin yaralanması, hastalar için klinik yönetimin zorluğunu önemli ölçüde artırır ve etkili ve erişilebilir terapötik stratejilerin geliştirilmesini karşılanmamış kritik bir klinik ihtiyaç haline getirir.

Hipoksi kaynaklı bilişsel bozukluk ve kalp disfonksiyonu için mevcut terapötik stratejiler öncelikle hiperbarik oksijen tedavisi, beyin metabolik güçlendiriciler (örneğin, piracetam, oksiraasetam), nörotrofik faktör tedavisi^10,11 ve β-blokerler (örneğin, metoprolol)¹² içermektedir. Ancak bu yaklaşımlar önemli sınırlamalar sunar: hiperbarik oksijen tedavisi özel ekipman gerektirir ve erişilebilirlik yoktur; Farmakolojik müdahaleler genellikle yan etkilere yol açar ve genellikle tek patolojik yolları hedef alır; Nörotrofik faktör terapisi ise kan-beyin bariyerinin nüfuz ve stabiliteyle ilgili zorluklarla karşı karşıyadır. Bu nedenle, eşzamanlı kardiyo-serebral tedavi için verimli ve erişilebilir stratejilerin belirlenmesi, önemli bir araştırma yönü haline gelmiştir.

Geleneksel Çin Tıbbı'nın (TCM) temel bir bileşeni olan akupunktur, çok hedefli düzenleme talebiyle uyumlu bütünsel bir terapötik bakış açısını vurgular. Hem nörolojik hem de kardiyovasküler bozukluklar için benzersiz terapötik potansiyel gösterir. Elektroakupunktur (EA), geleneksel iğneleme ile elektriksel uyarımın bütünleştirilmiş modern bir evrimi olan akupunktur, sinirsel elektrofizyolojik aktivitenin daha hassas modülasyonunu^{sağlar 13,14}. EA, beyin iskemi-reperfüzyon yaralanmasını etkili bir şekilde iyileştirir, miyokard enzimi (GPBB, H-FABP) salınımını azaltır ve önemli kardiyoprotektif^{uygular 15,16}. Özetle, geleneksel akupunkturun modern bir yeniliği olarak elektroakupunktur, çok mekaniksel ve çok hedefli düzenleme uygular; nörolojik ve kardiyovasküler hastalık tedavisinde net uygulama değeri ve klinik potansiyel gösterir ve TCM'yi modern tıpla birleştirir.

Ancak, hipoksik bilişsel bozukluk ve kalp hasarı için EA üzerine yapılan mevcut çalışmalar çoğunlukla tek organ/sistem etkileriyle sınırlıdır ve eşzamanlı kardiyo-beyin tedavisindeki potansiyelini keşfetmemektedir. TCM'nin "bütüncül kavramı" ve uzun süreli kronik hipoksi tarafından indüklenen kardiyo-pulmoner-serebral disfonksiyon komorbiditesinin klinik gerçekliğine dayanarak, bu çalışma EA'nın "eşzamanlı kardiyo-serebral tedavi" üzerindeki etkisini araştırmayı, hipoksi kaynaklı nöron hasarını, miyokard hipertrofisi/fibrozisi ve ilgili fonksiyonel bozuklukları eşzamanlı iyileştirmedeki rolünü netleştirmeyi ve kardiyo-pulmoner-serebral ilişkili için bütüncü, hedeflenmiş farmakolojik olmayan bir rejim sunmayı amaçlamaktadır hastalıklar.

Protokol

7-8 haftalık ve 18-22 g ağırlığında otuz erkek C57BL/6J faresi, Hebei Yiling İlaç Araştırma Enstitüsü'nün Yeni İlaç Değerlendirme Merkezi'ndeki SPF tesisinde tutuldu. Ortam sıcaklığı, 12/12 saatlik ışık/karanlık döngü altında 20-26 °C arasında tutuldu ve bilgili nem %40%-70 arasında değişti. Farelerin standart laboratuvar kemirgen yemeği ve temiz suya ima kadar erişimi vardı. 1 haftalık bir aklimatlaşma döneminden sonra fareler rastgele üç gruba (n = 10) ayrıldı: normal kontrol grubu (Con), kronik hipoksi model grubu (CH) ve kronik hipoksi ve elektroakupunktur tedavi grubu (CH+EA). Tüm deneysel prosedürler, Hebei Yiling İlectik Araştırma Enstitüsü Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No: TTN-2025001) ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı yönergelerine sıkı bir şekilde uygulanmıştır.

Kronik hipoksi fare modelinin kurulması (Şekil 1)

Kronik hipoksi fare modeli, daha önce tanımlanmış bir yönteme ve¹⁷ modifikasyonla kurulmuştur. Hipoksik bir ortam oluşturmak ve sürdürmek için otomatik bir gaz kontrol ve dağıtım sistemi kullanıldı. Bu sistem, saf oksijen ve azotu belirli bir oranda karıştıran solenoid valfleri hassas bir şekilde düzenlemek için programlanmıştı ve karışımı özel yapımı paslanmaz çelik bir hipoksi odasına iletmiştir. Bu kurulum, gaz teslimatının zamanlaması ve konsantrasyonu üzerinde doğru kontrol sağladı. Odadaki oksijen konsantrasyonu, dijital oksijen analizörü kullanılarak sürekli izlendi ve gaz akışını buna göre ayarlayan bir geri besleme mekanizmasıyla %10,0 ± %0,5 arasında tutuldu. CH ve CH+EA gruplarındaki fareler hipoksi odasında ortak olarak tutuldu ve günde 8 saat (9:00'dan 17:00'e kadar) hipoksik koşullara maruz bırakıldı, ardından günün geri kalanında normoksik koşullara geri getirildi. Bu protokol 12 hafta boyunca günlük tekrarlandı. Hipoksik maruziyet boyunca, hayvanlar ima kadar yiyecek ve suya erişimi oldu. İlk azot infüzyonunda oksijen konsantrasyonunu azaltmak için özel özen gösterildi; Bu süreç, oksijen seviyelerinin hızlı düşüşünden kaynaklanan akut hayvan ölümlerini önlemek için kademeli olarak gerçekleştirildi. Con grubundaki fareler, normoksik koşullar altında bitişik bir odada tutulmuş, diğer tüm barınma koşulları deneysel gruplarakiyle aynıydı.

Anestezi (Şekil 2)

Elektroakupunktur müdahalesi sırasında hayvan stabilitesini sağlamak ve fizyolojik stresin sonuçlara müdahalesini en aza indirmek için, bu çalışmada anestezi için solunma izofluran^{kullanılmıştır 17}. Tutarlı operasyonel koşullar sağlamak için prosedürler sırasında deneysel gruplar arasında tüm farelere anestezi uygulandı. Anestezi öncesi, işlem sırasında hayvanlarda hipotermiyi önlemek için küçük hayvan anestezi makinesi ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 37 °C sıcaklıkta termostat kontrollü bir ısıtma pedi hazırlanmıştı. Anestezi indüksiyonu, yaklaşık 1 dakika boyunca %2%-2,5 isofluran (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak kapalı bir indüksiyon odasında gerçekleştirildi. Kendiliğinden hareket kaybı ve kas tonunda önemli bir azalma gözlemlendikten sonra, her fare ısıtma pedine aktarıldı. Burun kısmına nazikçe yerleştirilen özel olarak tasarlanmış minyatür bir maske, %0,5-1,2 izofluran içeren anestezi sürdürmek için yerleştirilmiştir. Anestezinin etkin derinliği, göz kırpma refleksinin olmaması ve plantar uyarıya yanıt olarak belirgin bir yoksunluk refleksinin olmaması ile belirlendi. Bu anestezi protokolü, farelerde 30 dakikadan fazla stabil bir anestezik durumunu korudu ve bu, sonraki tüm işlemlerin tamamlanması için yeterliydi.

Elektroakupunktur tedavisi

Elektroakupunktur müdahalesi, kronik hipoksi maruziyetinin 11. haftasında CH+EA fare grubu için başladı. Seçilen akupunktur noktaları başta Baihui (GV20) ve Shenting (GV24) ile çift taraflı Zusanli (ST36) idi. GV20, kranial tepenin orta hattında, yaklaşık iki kulak^{ucu 18} arasındaki orta noktada yer alır. GV24, alın orta hattında, gözlerin iç kantisini birleştiren çizginin orta noktasından yaklaşık 1-2 mm yukarıda^{yer alır 19}. ST36, arka uzuvda, diz ekleminin alt ve lateral yerinde, fibular başın alt sınırının yaklaşık 2 mm altında bir^{çukurda bulunur (20,21}). Fareler stabil anestezik durumuna geldikten sonra, operatör sağ elinde tek kullanımlık steril paslanmaz çelik akupunktur iğnesini (spesifikasyon: 0.18 × 7 mm; bkz. Malzemeler Tablosu'na bakınız) tuttu. Baş akümut noktaları (GV24 ve GV20) için saç derisi sol elle nazikçe kaldırıldı ve iğne 15-30° açı ile deri altına yerleştirilerek yaklaşık 2 mm derinliğe doğru ilerledi. Alt uzuvdaki ST36 akupunktur noktası için iğne yaklaşık 3-4 mm derinliğe dik olarak yerleştirildi. Elektroakupunktur cihazının çıkış elektrotları (bkz. Malzeme Tablosu) iğne kollarına bağlandı: bir kablo seti GV20 ile sol ST36'yı bağlarken, diğer set GV24 ve sağ ST36'yı bağladı. Eşzamanlı elektroakupunktur uyarısı iki tel seti aracılığıyla uygulandı. EA parametreleri şu şekilde ayarlandı: sürekli dalga, 2 Hz frekans^22,23. Akım yoğunluğu kademeli olarak 0.1 mA'dan çıkarıldı ve yerel uzuvda hafif ritmik seğirme gözlemlendi (genellikle 2 mA civarında tutuldu). Elektroakupunktur günde bir kez, 30 dakika boyunca, 6 gün boyunca kesintisiz olarak 1 gün dinlenme ile toplam 2 haftalık bir kurs olarak gerçekleştirildi. Bu arada, Con ve CH gruplarındaki fareler aynı sürede ve koşullarda anestezi ve kısıtlama tedavisine maruz kalmış, ancak iğne yerleştirilmemiş veya elektroakupunktur cihazı aktive edilmişti.

Açık alan testi

Açık Alan Testi (OFT), yeni bir ortamda farelerin spontan hareket aktivitesi, keşif davranışı ve kaygı benzeri tepkilerini değerlendirmek için^{yapıldı 24}. OFT cihazı, davranışsal analiz için neredeyse 25 karelik (her biri 10 cm 10 cm) bir ızgaraya bölünmüş beyaz bir kabin (50 cm 50 cm 30 cm) idi. Resmi testten önce, tüm fareler çevresel değişimin yarattığı stresin davranışsal sonuçlar üzerindeki etkisini en aza indirmek için test odasına 1 saat boyunca alıştırıldı. Test sırasında, her fare nazikçe cihazın ortasına yerleştirildi. 2 dakikalık bir alışma döneminden sonra, davranışı resmen 10 dakika kaydedildi. Tüm oturum, hareket yörüngeğini otomatik olarak takip etmek için video takip sistemi ( bkz. Materyaller Tablosu) kullanılarak kaydedildi. Analiz edilen parametreler arasında toplam yol kat edilen mesafe, merkez bölgede geçirilen süre, merkez bölgedeki hız ve merkez bölgesine giriş sayısı yer alıyordu. Tüm fareler keşfe aynı merkezi konumdan başladı ve her fare sadece bir kez test edildi. Koku parazitini önlemek için, her fare test edildikten sonra cihaz %75 etanol ile iyice temizlendi

Morris su labirenti (MWM)

Morris su labirenti (MWM) testi, hafıza fonksiyonunu değerlendirmek için standart bir yöntem olup, öncelikle farelerde mekânsal öğrenme ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek^{için kullanılmıştır 25}. Cihaz, 120 cm çapında ve 30 cm derinliğinde dairesel bir havuzdan oluşuyordu ve kavramsal olarak dört eşit dörtre (I, II, III, IV) ayrılmıştı. Dış dikkat dağıtıcıları en aza indirmek için havuzun etrafına karartma perdeleri asıldı ve yukarıdaki duvarlara belirgin görsel ipuçları sabitlendi, deney boyunca sabit kaldı. Havuz, 22-24 °C sıcaklığında tutulan suyla dolduruldu ve su seviyesi platform yüzeyinden yaklaşık 1 cm üzerinde tutuldu. Toksik olmayan titanyum dioksit tozu suyun %20 konsantrasyonunda eklenerek opak hale getirildi ve böylece fare ile arka plan arasındaki kontrastı artırarak daha doğru video takibi sağlandı. Deneysel prosedür, 5 günlük uzaysal alım eğitim aşaması ve ardından 1 günlük uzaysal sonda deneme denemesi içeren 6 gün ardışık 6 gün sürdü. Eğitim aşamasında, III kvadrantta 10 cm çapında dairesel bir platform yerleştirildi ve hedef konumu olarak hizmet verdi. İlk gün, platform, farelerin kaçış hedefi ile tanışması için su yüzeyinin biraz üzerinde (~1 cm) konumlandırıldı. 2. ila 5. günler arasında, platform, mekânsal öğrenme değerlendirmek için su yüzeyinin yaklaşık 1 cm derinliğinde su altında bırakıldı. Her gün, her fare, dört dörtlükten her birinden havuz duvarına bakan suya sıralı olarak yerleştirilirdi. Deneyci, hayvanı yerleştirdikten sonra istemeden bir mekansal işaret haline gelmemek için hemen odadan çıktı. Gizli platformun bulunması için harcanan süre (kaçış gecikmesi) her deneme için kaydedildi. Eğer bir fare platformu 90 saniyelik kesim süresi içinde bulamazsa, platforma nazikçe yönlendirilir ve mekansal öğrenmeyi güçlendirmek için 30 saniye orada kalmasına izin verilir, gecikmesi 90 saniye olarak kaydedilirdi. Fare platformu 90 saniye içinde bulursa, 10 saniye boyunca üzerinde kalmasına izin veriliyordu. Her antrenmandan sonra fare bir havluyla kurutulup ev kafesine geri götürülürdü. Başlangıç dörtlü dizisi sistematik olarak değiştirildi; her fare için yaklaşık 20 dakikalık bir deneme arası aralık verildi. Bir video takip sistemi ( bkz. Materyal Tablosu) yüzme mesafesi, hız ve kaçış gecikmesi gibi parametreleri otomatik olarak kaydeder. 6. günde, mekânsal hafızayı değerlendirmek için bir prob denemesi yapıldı. Platform hedef kvadrantından (III kvadrant) çıkarıldı ve her fare, önceki hedef konumunun karşısındaki (I. kvadrant) kuvardan serbest bırakıldı ve 90 saniye boyunca serbestçe yüzmesine izin verildi. Platform daha önce bulunduğu hedef kadranda geçirilen süre, tam olarak eski platform konumu üzerinden geçiş sayısı ve yüzme yörüngesi kaydedildi. Deney denemesinden hemen sonra, fare iyice kurutuldu ve hipotermiyi önlemek için ısı kaynağı altında ev kafesine geri getirildi. Tüm deney boyunca, labirenti çevreleyen tüm görsel ipuçlarının konumları değişmeden kaldı, böylece deneysel koşullarda tutarlılık sağlandı.

Ekokardiyografi

Farelerde ekokardiyografi, kardiyak yapı ve fonksiyonun değerlendirilmesi için kritik olan, invaziv olmayan, gerçek zamanlı görüntüleme tekniğidir ve kardiyovasküler hastalık model araştırmalarında yaygın olarak uygulanmıştır. Muayene, işlem boyunca daha önce belirtilen protokol kullanılarak anestezi durumu korunarak genel anestezi altında yapılır. Fare, 37 °C'de tutulan termostat kontrollü bir platformda sırtüstü konumlandırılır. Uzuvlar nazikçe sabitlendikten sonra, torakal ve karın bölgesine eşit şekilde depilyatör krem uygulanır. Tüm saç ve kalan krem, optimum ultrason iletim kalitesi için 1-2 dakika sonra iyice çıkarılır. Gerçek zamanlı fizyolojik izleme için, uzuvlara iletken jel ile bağlı elektrot yamaları elektrokardiyogram ve solunum hızını sürekli kaydetmek için kullanılır. Standart ultrason görüntüleri elde etmek için farenin konumu, başının kuyruğundan biraz daha yüksek olacak şekilde ayarlanır; böylece kalbin uzun ekseni platforma paralel olur. Probla göğüs duvarına aşırı baskı uygulanmaması özellikle dikkat edilir; çünkü bu kalp geometrisini değiştirebilir ve ölçüm doğruluğunu etkileyebilir. Tıraş edilen bölgeye bolca miktarda baloncuksuz ultrason jeli (2-5 mm kalınlığında) uygulanır. Yüksek frekanslı lineer dizi probu (30-50 MHz) kullanılır ve probun yönelim işaretçisi tutarlı olarak farenin kafasına doğru yönelir. Prob başlangıçta farenin gövdesinin uzun eksenine paralel konumlandırılır ve ardından yaklaşık 30°-45° saat yönünün tersine döndürülür. Sol ventrikülün parabernernal uzun eksenli net bir görünümü elde etmek için ince ayarlamalar yapılır. Dinamik görüntü alımı, ultrason görüntüsü sol ventriküler odası, aort ve mitral kapakları net bir şekilde gösterdiğinde ve kardiyak apeksin aort çıkış yoluyla yatay hizalanmasını gösterdiğinde başlar. Tüm görüntüler, veri karşılaştırılabilirliğini sağlamak için tutarlı parametre ayarları kullanılarak deneyimli bir operatör tarafından alınır. Muayeneden sonra, ultrason probu standart prosedürlere uygun şekilde temizlenir ve farenin vücudundaki kalan jel temizlenir. Fare daha sonra anesteziden tamamen iyileşene ve normal yürüyüşe kavuşana kadar yakın izleme için sıcak bir kafese nakledilir.

Parafin kesitlerinin hazırlanması

Davranışsal testler tamamlandıktan sonra, fareler intraperitoneal sodyum pentobarbital (20 mg/kg) enjeksiyonuyla anestezi edildi. Sistemik fiksasyon, ardından tuzlu sin ile transkard perfüzyon ve %10 paraformaldehit ile sağlandı ( bkz. Materyal Tablosu). Beyin dokuları dikkatlice çıkarıldıktan sonra, oda sıcaklığında 72 saat fiksasyon süresi boyunca %10 paraformaldehit içine daldırıldı. Kardiyak perfüzyonun miyokard mikroyapısını değiştirdiği için, bu çalışmada histolojik analiz için kullanılan kalp örneklerinin özellikle perfüzyon prosedüründen geçmeyen farelerden alındığını, diğer tüm işlem koşullarının ise aynı kaldığını belirtmek önemlidir. Fiksasyon tamamlandıktan sonra, dokular akan suyun altında 6 saat boyunca durulandı. Sonraki gradyan dehidrasyonu, otomatik doku işlemci kullanılarak ( bkz. Materyal Tablosu) gerçekleştirildi; ardışık olarak 60%, %70 ve %90 etanol ile 1 saat süreyle daldırıldı, ardından %95 ve %100 etanol her biri 2 saat uygulandı. Susuz bırakılmış örnekler 2 saat boyunca ksilen içinde temizlendi ve 60°C'de 3 saat boyunca parafinle infiltrasyon yapıldı. Son olarak, dokular gömülü makine kullanılarak parafine gömülerek standart anatomik yönelim sağlandı. Gömülü bloklar tamamen katılaştıktan sonra, 4 μm kalınlığında seri kesimler döner mikrotomla kesilmiş, poli-L-lizin kaplı cam slaytlara monte edilmiş, hava kurutulmuş ve sonraki boyama ve analiz için depolanmıştır.

Hematoksilin-eozin boyama

Beyin ve kalp dokularının histolojik muayenesi, hipoksik hasarı değerlendirmek ve elektroakupunktur müdahalesinin terapötik etkilerini değerlendirmek için hematoksilin ve eosin (HE) boyama kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 4 μm kalınlığında doku kesitleri önce ksilen I ve ksilen II ile (her biri 10 dakika) deparafinize edildi, ardından 2 dakika boyunca derecelendirilmiş etanol serisi ile yeniden nemlendirildi, ardından damıtılmış suyla son durulama yapıldı. Boyama için, bölümler 3-8 dakika boyunca hematoksilin çözeltisine batırıldı, berrak nükleer boyama sağlanana kadar duruldu, akan su altında durularak mavızıltıya indüklendi ve ardından sitoplazmada uygun pembe renk elde edilmek için 1-3 dakika boyunca eosin ile karşı boyandı. Son olarak, boyalı bölümler mutlak alkolle kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve nötr balsamla örtülmüştür.

Nissl boyama

Hipokampal bölgedeki nöronların hayatta kalma durumunu değerlendirmek için, Nissl bedenlerinin dağılımını ve hücresel morfolojisini nöronlar içinde gözlemlemek amacıyla Nissl boyama yöntemi kullanıldı. Beyin dokusu parafin kesitlerinin deparafinizasyonu ve rehidrasyonu sonrasında, dilimler önceden ısıtılmış toluidin mavisi boyama çözeltisine daldırıldı ve 56 °C'de sabit sıcaklıkta 1 saat kuluçka içinde kuluçka edildi. Boyamadan sonra, bölümler damıtılmış suyla nazikçe duruldu ve ardından birkaç saniye boyunca 2 dakikaya kadar Nissl farklılaştırma çözeltisine aktarıldı. Farklılaşma süreci, arka plan neredeyse renksiz hale gelene kadar mikroskop altında dikkatlice izlendi. Daha sonra, farklılaşan bölümler mutlak etanol serisi ile hızla kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve kalıcı koruma ve gözlem için nötr reçine ile donatılmıştır.

Masson trikrom boyama

Klasik bir bağ dokusu boyama tekniği olan Masson trikrom boyama, esas olarak kalp dokusunda kolajen liflerini kas liflerinden ayırt etmek için kullanılmıştır. Kardiyak parafin kesitlerinin deparafinizasyonu ve rehidratasyonundan sonra, boyama işlemi üreticinin Masson trikrom boyama kiti ile verilen talimatlara göre gerçekleştirildi (bkz. Malzeme Tablosu). Boyama protokolü aşağıdaki şekilde uygulandı. Başlangıçta, bölümler 4 dakika boyunca yeni hazırlanmış Weigert demir hematoksilin çalışma çözeltisine batırıldı ve çekirdekler boyandı, böylece denge düzgünü sağlanması için hafif bir çaltlama uygulandı. Daha sonra, bölümler akan su altında durulandı, %1 asit alkolle 5-10 saniye boyunca farklılaştırıldı ve ardından 4 dakika boyunca mavi-mor nükleer boyama elde edilmek için mavi-mor bir çözeltiyle işlendi. Bölümler daha sonra 5 dakika boyunca Ponceau-asit fuchsin çözeltisiyle boyandı, ardından %0,2 fosfomolibdik asit çözeltisiyle 1 dakika diferensiya edildi. Zayıf bir asit çalışma çözeltisinde 1 dakika kısa bir durulama yaptıktan sonra, bölümler 2 dakika boyunca %0,2 anilin mavisi çözelti (pH 6,8) ile karşı boyanarak kollajen liflerini vurguladı. Boyama aşamaları tamamlandıktan sonra, bölümler bir derecelendirilmiş etanol serisi ile kurutuldu, ksilen ile temizlendi ve sonunda nötr balsamla monte edildi. Tüm monte edilmiş bölümler, sonraki analiz için tam otomatik bir slayt tarama sistemi ( bkz. Malzemeler Tablosu) kullanılarak dijital olarak yakalanmıştır.

İstatistiksel analiz

Elde edilen sonuçlar, ortalama ± SEM olarak sunulur. Veriler, tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve ardından LSD post hoc testi veya t-testi yapıldı. OFT ve MWM'den gelen verilerin analizi için iki yönlü ANOVA kullanıldı. p < 0.05 önem seviyesi olarak kabul edildi. İstatistiksel analiz ve grafikler GraphPad Prism 9.0 yazılımı tarafından oluşturulmuştur.

Sonuçlar

Elektroakupunktur, farelerde kronik sürekli hipoksi nedeniyle oluşan kaygı benzeri davranış ve bilişsel işlev bozukluğunu hafifleder.

CH'ye maruz kalan farelerde anksiyete benzeri davranışlar ilk olarak OFT kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3A). Yörünge grafikleri belirgin davranışsal kalıplar ortaya koydu: kontrol fareleri, yeni ortamda güçlü keşif eğilimleri sergiledi; hareket desenleri tüm arenayı kaplarken a...

Tartışma

Bu çalışma, uzun süreli kronik hipoksinin farelerde kaygı benzeri davranışlar ve mekansal hafıza bozukluğuna yol açabileceğini doğrulamaktadır; bu da önceki araştırma bulgularıyla^{tutarlıdır 26,27}. Bu arada, uzun süreli kronik hipoksinin kalp fonksiyon bozukluğu ve miyokard yapısal hasarına da yol açabileceğini bulduk. Ancak, şu anda hipoksi kaynaklı bilişsel ve kardiyak bozuklukları aynı anda hafifletebilecek terapötik stratejile...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%10 paraformaldehit çözeltisi	Bioroyee (Pekin) Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	RL3234
ANY-MAZE	Bilim	SA201	Video takip sistemi
C75BL/6J fareleri	PEKİN HFK BİYOLOJÎ CO., Ltd	No.1103222220103041767	Cinsiyet: Erkek,  Ağırlık: 18 ve çizgi; 22 g
Tek kullanımlık akupunktur iğneleri	Huatuo	246076	Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleri (0,25 mm ve akut; 13 mm)
Elektroakupunktur cihazı	Büyük Seddi	KWD-808 I
HistoCore MULTICUT - Yarı Otomatik Döner Mikrotom	Almanya, Leica	RM2245	Parafin dilimleyici
Hwato akupunktur  iğne	Suzhou Tıbbi Cihaz Fabrikası	2655519
İzofluran	RWD Yaşam Bilimleri Co.,Ltd	R510-22
Masson' s Trikrom Leke Kiti	solarbio	G1340	Masson boyama kiti
Morris su labirenti	Sansbio	SA201	Morris su labirenti cihazı
NanoZoomer Dijital Patoloji	Hamamatsu Fotonik K. K	C9600-01
NDP. Bak 2	Japonya, Sakura		Kaydırma tarayıcı yazılımı
Küçük hayvan anestezi makinesi	RWD	YL-LE-A106
Doku Teknolojisi Prisma Plus	Japonya, Sakura	20B2X00014000034	Parafinli doku kesitleri, donmuş bölümler ve kaydırma montajlı hücreler gibi örneklerin boyalanması için tasarlanmış tam otomatik cihazdır.
Tissue-Tek TEC 6 Göme Modülü	Japonya, Sakura	M01-021E-02	Parafin göme makinesi