Kütle Spektrometrisi ile Plazma Proteomikleri İçin Kapsamlı Bir İş Akışı: Sistemik İnsan Hastalıklarında Biyomarker Keşfi Stratejisi

Özet

Plazma proteomikleri, minimal invaziv örnekleme yoluyla sistemik hastalıklar için biyobelirteç keşfini sağlar. Plazma karmaşıklığının yarattığı analitik zorluklara rağmen, bu çalışma proteom kapsamını artıran, değişkenliği azaltan ve tekrarlanabilirliği artıran optimize edilmiş sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) iş akışını sunarak hastalık ile kontrol örnekleri arasında doğru karşılaştırmalar yapılmasını sağlamaktadır.

Özet

Kanın hücresiz bileşeni olan plazma, minimal invaziv ve zengin bir biyomoleküler bilgi kaynağı sunar; bu da sistemik hastalıkların araştırılması için ideal bir yöntemdir. Yüksek verimli proteomik teknolojilerin ortaya çıkışı, dolaşımdaki proteinlerin büyük ölçekli tanımlanması ve nicelendirilmesini mümkün kılarak plazma analizinde devrim niteliğinde kök salmıştır. Bu gelişmeler, kanserler ve iltihap hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların erken teşhisi, prognozu ve terapötik hedeflenmesi için biyobelirteç keşfini kolaylaştırmıştır. Ancak, plazmanın doğasında olan karmaşıklık ve tutarsız örnek hazırlama ve analiz yöntemleri, tarihsel olarak proteom kapsamasını ve tekrarlanabilirliğini sınırlamıştır. Ham plazma analizine dayanan erken yaklaşımlar genellikle düşük tutarlılık ve önemli parti etkileri nedeniyle klinik kohortlar arasında güvenilir karşılaştırmalı çalışmaları engelledi.

Bu sınırlamaları aşmak için mevcut çalışma sağlam ve ölçeklenebilir bir plazma proteomiği iş akışı sunmaktadır. Protokol, immünodeplisyon, moleküler ağırlık kesme filtrasyonu, lyofilizasyon, protein nicelenmesi ve normalizasyonu, enzimatik sindirim ve LC-MS/MS profilleme gibi temel hazırlık adımlarını entegre eder. Bu optimize edilmiş strateji, proteom derinliğini önemli ölçüde artırır ve değişkenliği azaltır; böylece hastalık vakaları ile sağlıklı kontroller arasında daha doğru ve tekrarlanabilir diferansiyel protein ekspresyonu analizini mümkün kılar. Bu iş akışı, plazmadan yüksek kaliteli proteomik veri üretmeyi hedefleyen araştırmacılar için değerli bir platform sağlar ve nihayetinde biyomarker odaklı tanı ile kişiselleştirilmiş tıbbın ilerlemesine katkıda bulunur.

Giriş

Kanın hücresiz bileşeni olan plazma, hastalık çalışmaları için önemli biyolojik bilgi deposu olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. Proteinlerden metabolitlere kadar çeşitli dolaşımda bulunan biyomolekülleri taşır; bu da organizmanın fizyolojik ve patolojik durumunun aynasıdır. Plazmanın bu sistemik yapısı, kanserden metabolik ve inflamatuar bozukluklara kadar uzanan hastalık patofizyolojisinin araştırılması için ideal bir biyonumune yapar. Plazmayı örnek olarak kullanmanın önemli faydalarından biri, klinik ortamlarda tekrar tekrar numune almayı mümkün kılan minimal invaziv toplama yöntemidir; bu da hastalık ilerlemesi veya terapötik yanıt gözlemi için önemlidir. Ancak plazma, albümin ve immünoglobulin seviyeleri gibi proteinlerin on büyüklük mertemesini aştığı son derece karmaşık bir proteomik matriks sergiler; bu da tanımlamayı^gizler.

Son yirmi yılda, plazma proteomiği, büyük ölçekli protein analiz teknolojilerindeki ilerlemelerle beta-insan korionik gonadotropini (β-hCG) ve troponin I gibi klinik açıdan ilgili biyobelirteçlerin tanımlanmasını mümkün^{kıldı 2}. Bu araçlar, girdi olarak son derece hassas bilgileri kabul eder ve yüksek verimlilikleriyle plazma proteinlerinin geniş ölçekli profillenmesini sağlar. Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) platformlarının ortaya çıkışıyla, binlerce protein türünü 10-50 μL kadar az plazma girdisi kullanarak analiz etmek mümkün olmuş ve dinamik tespit aralığı birkaç büyüklük^{mertebesini kapsayan 3,4} büyüklükleri aşmaktadır. Bu, translasyonel araştırmalarda plazma proteomiklerinin kullanımını artırmıştır: erken hastalık tespiti, geliştirilmiş prognostik modeller ve yeni terapötik hedeflerin^{keşfi 5}.

Bu alandaki önemli bir dönüm noktası, plazma proteinlerini sistematik olarak kataloglayan ve plazma proteomiğin yerleşik bir alan olarak uygulanabilirliğini gösteren İnsan Plazma Proteom Projesi'nin (HUPO-HPPP)^{kurulmasıdır 6}. Daha sonra, Klinik Proteomik Tümör Analiz Konsorsiyumu (CPTAC), proteomik araştırmaları daha önce kafa karıştıran tekrarlanabilirlik konularını ele almak için titizlikle doğrulanmış protokoller ve laboratuvarlar arası çalışmalar^benimsedi. Bu girişimler, standartlaştırma ihtiyacını vurguladı ve standart plazma işleme, bol proteinlerin tükenmesi, enzimatik sindirim ve tutarlı LC-MS/MS parametreleri gibi temel prosedürleri vurguladı. Geyer ve meslektaşlarının son çalışmaları, standart metodolojiler kullanıldığında plazma proteomik imzalarının birçok bireyde güvenilir şekilde üretilebileceğini göstererek, popülasyon düzeyinde çalışmalar ve biyobelirteç doğrulama süreçleri için temel^{oluşturduğunu 8}.

Plazma proteomiklerinin ilerlemesi, kalite kontrolü (QC) ve performans metriklerinin deneysel tasarımın kritik bileşenleri olarak tanınmasıyla önemli ölçüde şekillenmiştir. Geleneksel olarak, sindirim verimliliği, peptid tanımlama oranları ve cihaz performansındaki farklılıklar, araştırma çalışmalarında tutarsızlıklara yol açmış ve bu da tekrarlanabilirliği etkilemiştir. Bu sorunları ele almak için birçok çalışma yapılmıştır. Gawor ve ark., örnek hazırlama ve kütle spektrometrisi performansı için ölçülebilir kalite göstergelerini belirlemiş ve böylece protein profilleme boru hattının sağlamlığını değerlendirmek için sistematik^{bir yöntem sağlamıştır9}. Tsantilas ve ark., araştırmacıların platformlar ve laboratuvarlar arasında veri setlerini karşılaştırmasını sağlayan bilgisayarlı kıyaslama araçları sunmuş, böylece proteomik verilerinin sunumunda şeffaflığı^{artırmıştır 10}. Ayrıca, immünodeplisyon, boyut dışlama fraksiyonasyonu ve Veri-bağımsız edinim (DIA) gibi metodoloji ilerlemeleri, proteom kapsamasını artırmış ve teknik yanlılığı^{azaltmıştır 11,12}. Bu kalite güvence önlemleri, plazma proteomik verilerinin tekrarlanabilir olmasını ve gelecekteki klinik çeviri çalışmaları için bir iskele işlevi görmesini sağlar.

Bu önemli ilerlemelere rağmen, plazmanın doğasında bulunan karmaşıklık hâlâ zorluklar barındırmaktadır. Ham plazmanın doğrudan analizinin optimal olmayan proteom kapsamı elde edilmesi yaygındır; çünkü çok bol proteinler, düşük bolluklu analitleri gölgede bırakır ve bunların çoğu en umut vadeden biyobelirteç adaylarıdır. Ayrıca, değişken protein miktarı, eksik sindirim ve yetersiz temizlikten kaynaklanan teknik farklılıklar, parti artefaktlarına ve kohort karşılaştırılabilirliğinin azalmasına katkıda^{bulunabilir 13}. Bu sınırlamalar, proteom derinliği, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirliği dengeleyen son derece optimize edilmiş iş akışlarına olan ihtiyacı vurgular. Bu çalışma protokolü, immünodeplisyon, moleküler ağırlık kesim filtrasyonu, lyofilizasyon, protein normalizasyonu ve niceliklendirme, enzimatik sindirim ve LC-MS/MS profillemesini birleştiren optimize edilmiş plazma proteomik iş akışını göstererek bu ihtiyacı karşılamaktadır. Proteom kapsamını artırarak ve teknik çeşitliliği azaltarak, metodolojik çerçeve hastalık etkilenen ve kontrol grupları arasında tutarlı göreceli nicelik sağlar. Ölçeklenebilirlik getirerek ve sonraki analizleri karşılayarak, iş akışı plazma proteomiklerinden klinik olarak önemli bilgileri çıkarmak için kullanılabilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.

Protokol

Bu protokol, sistemik inflamatuar hastalıklarda biyobelirteç keşfi için plazma proteomiklerini geliştirmek amacıyla tasarlanmış sade bir iş akışını^{öngörür 14,15}. Çalışma, Kurumsal Etik Komitesi ve 2000 yılında revize edilen 1975 Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yapılmıştır. Katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alındı. Başlangıçta, plazma örnekleri yüksek bolluklu proteinleri çıkarmak için immünodeplisyona geçirilir, ardından örnek karmaşıklığını azaltmak için moleküler ağırlık bazlı filtreleme yapılır. Numuneler daha sonra liyofilize edilip protein konsantrasyonunun aşağı akım işleme için yeterli olduğundan emin olmak amacıyla nicelendirilir. Normalizasyondan sonra, proteinler analiz için uygun peptidler üretmek için triptik sindirime tabi tutulur. Son olarak, kütle spektrometrisi düşük bolluklu proteinleri tespit etmek ve niceliklendirmek için kullanılır; böylece sağlıklı ve hastalık durumları arasında güvenilir karşılaştırmalar yapılmasını kolaylaştırır (Şekil 1) kan proteomik boru hattını gösterir.

1. Örnek koleksiyonu:

1. Antekubital damardan aseptik koşullarda venipunkturla Etilenediaminetetraacetic acid (EDTA) vakutainer tüpleri kullanan katılımcılardan 3 mL kan alın. Bu eğitimli bir flebotomist tarafından yapılır.
2. Plazmayı ayırmak için, örnekleri (sabit açılı rotor, 12 × 15 mL) 10 dakika boyunca 704 g ağırlığında santrifüj yapın. Plazma örneklerini sonraki incelemeye kadar -80 °C sıcaklıkta depoda tutun.

2. İmmünodeplisyon

NOT: İmmünodeplisyon, serum, plazma ve beyinomurilik sıvısı (CSF) gibi biyolojik sıvılardan yüksek bolluklu proteinleri seçici olarak almak için kullanılan affinite kromatografi tabanlı bir yöntemdir. İmmobilize edilmiş antikorlar içeren spin kartuş, albümin, immünoglobulinler (IgG, IgA, IgM), transferrin ve komplement C3 dahil olmak üzere 14 yaygın yüksek bolluklu proteini hedef alır ve yakalar. Bu proteinler kartuşta tutulurken, düşük bolluklu proteinler daha fazla analiz için geçer. Bu teknik, örnek karmaşıklığını azaltarak ve potansiyel biyobelirteçlerin tespitini iyileştirerek proteomik profillemeyi geliştirir. Bu yaklaşım, plazma proteomiklerinde hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği artırmak için yaygın olarak^{benimsenmiştir 16,17}.

1. Kartuş hazırlığı
   1. 0.45 mL spin kartuşunu buzdolabından çıkarın. Çevre sıcaklığına göre dengelenmesine izin verin.
   2. İşlenen örnek sayısına göre Buffer A Equil/Load/Wash ve Buffer B Elution'u hazırlayın. 10 μL plazma örneği başına yaklaşık 5 mL Tampon A ve 2 mL Buffer B uygulanır. 50 mL steril santrifüj tüplerine dekant yapın.
   3. İki steril Luer-Lok 5 mL şırıngasını A için A ve Tampon B için B olarak etiketleyin.
2. Plazma örneği hazırlama
   1. Her 10 μL plazma örneğini 190 μL Tampon A ile birlikte 200 μL nihai hacme kadar seyreltirin.
      NOT: İşlem sırasında plazma proteinlerinin bozulmasını önlemek için Buffer A'ya proteaz inhibitörleri ekleyin.
   2. Bir plazma örneği partikül madde içerebilir. Kartuşu tıkayabilir. Tıkanmayı önlemek ve numune berraklığını artırmak için, seyreltilmiş örneği 0,22 μm spin filtresinden 1 dakika boyunca 16.000 ×g ve 4 °C'de santrifüj yapın.
3. Kartuş kurulumu
   1. Kartuş kapağını ve alt kapağını çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.
   2. Spin kartuşuna bir Luer-Lok adaptörü takın.
   3. "A" etiketli şırıngaya 4 mL Buffer A çekin ve şırıngayı Luer-Lok adaptörüne bağlayın.
   4. Buffer A'yı kademeli olarak kartuştan geçirerek reçinenin dengelenmesini ve hapsolmuş havayı yerinden çıkarmasını sağlar.
   5. Kartuşu üst kısmındaki fazla tamponu steril bir mikropipetle aspire edin.
   6. Luer-Lok adaptörünü çıkarın ve spin kartuşunu F1 etiketli vidalı kapaklı toplama tüpüne yerleştirin.
4. Örnek yükleme ve fraksiyon toplama
   1. Reçine yatağına doğrudan 200 μL filtrelenmiş, seyreltilmiş plazma ekleyin.
   2. Kartuşu 100 × g sıcaklığında 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüjlendirin. Kartuşu kapapasız veya gevşek şekilde kapatarak düzgün akış sağlanır.
   3. Akış kesimi F1'i etiketli toplama tüpünde toplayın. Santrifüjasyondan sonra reçine yatağı ve frit nemli kaldığından emin olun.
   4. Kartuşu oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
5. Akış kesirlerinin yıkımı ve geri kazanımı
   1. Reçine yatağına 400 μL Buffer A ekleyin ve 100 × g'de 4 °C'de 2,5 dakika boyunca santrifüj yapın. Bu eluatı F1 toplama tüpüne ekleyin.
   2. Kartuşu F2 etiketli yeni bir toplama tüpüne aktarın.
   3. 400 μL daha Buffer A ekleyin ve 100 × g'de 4 °C'de 2,5 dakika boyunca santrifüj yapın. Eluatı F2 tüpünde toplayın.
6. Bağlı proteinlerin elüsyonu
   1. F2 tüpünden kartuşu çıkarın ve Luer-Lok adaptörünü takın.
   2. "B" etiketli şırıngayı 2.5 mL Buffer B ile doldurun ve kartuşa takın.
   3. Buffer B'yi yavaşça kartuştan geçirerek bağlı yüksek bolluklu proteinleri yeni bir toplama tüpüne elüasyon yapın.
      NOT: Daha fazla analiz gerekirse bağlı kesri kaydedin; aksi takdirde, uygun şekilde atabilirsiniz.
7. Kartuşun yeniden dengelenmesi
   1. Tampon B içeren şırıngayı kartuştan çıkarın ve 5 mL Tampon A içeren "A" etiketli şırıngayı takın.
   2. Buffer A'yı reçine yatağından yavaşça iterek kartuşu dakikada 0,5 mL akış hızında yeniden dengeleyin.
      NOT: Reçine yatağı veya frit kurumasına izin vermeyin. Depolama sırasında frit'in üzerine az miktarda tampon bırakın.
   3. Dengeye getirildikten sonra kartuş bir sonraki örnek için hazırdır.
8. Aşağı akış kullanımı
   1. Düşük bolluklu proteinlerin maksimum geri kazanımı için F1 ve F2 akış fraksiyonlarını birleştirin.
      NOT: F1 ve F2, diferansiyel analiz gerekiyorsa ayrı ayrı da analiz edilebilir. Eklenen tampon 1 mL'dir, bu nedenle birleşik F1 fraksiyonu iyi bir geri dönüş sağlamak için ~850 μL olabilir. Ham plazma, akış ve elüat analizi Sodyum Dodekil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edilerek en yüksek bolluklu proteinlerin akıştan çıkarıldığını doğrulayın. F1, ham plazma ve eluat üzerinden geçen 12,5 μL akış, jel içinde 25 μL bir kuyu hacmi oluşturmak için kullanılacak (Laemmli örnek tamponu: örnek oranı 2:1)

3. 5 kDa spin konsansantasyon kullanılarak protein konsantrasyonu

NOT: Bir örnek 5 kDa spin konsantretör kullanılarak konsantre edilmesi, hedef biyomoleküllerin tek bir tüpte hızlı konsantrasyon ve yüksek geri kazanımı için boyut dışlanması ve moleküler filtreleme prensibine dayanır. Bu, çözücü ve tampon değişiminin alınması veya protein çözeltinin tuzdan arındırılması yoluyla proteinlerin konsantrasyonunu sağlar.

1. Spin konsantretörünü 4 mL'ye kadar protein örneğiyle doldurun.
2. Spin konsansantörü soğutmalı bir santrifüje yerleştirin.
3. Santrifüj 5.000 × g sıcaklıkta 10 °C'de 30 dakika boyunca veya istenen hacim azalması (örneğin 30× konsantrasyon) sağlanana kadar kullanılır.
4. Spin konsantratörünü santrifüjden çıkarın ve konsantre numuneyi mikropipet kullanarak retentat odasının altından geri alın. İyi bir geri dönüş sağlamak için, toplam 850 μL protein örneğinden ~150 μL konsantre elde edilmesi beklenmektedir.
   NOT: Santrifüj sırasında protein bütünlüğünü ve geri kazanım verimliliğini korumak için membranın kurumadığından emin olun.

4. Tuz arındırma ve tampon değişimi

1. Konsantrasyonun alt haznesinden filtreyi at.
2. Santrifüj tüpünü eşit hacimde 50 mM amonyum bikarbonat tamponu (pH 7.2-7.4) ile doldurun. (Örneğin, retentat 150 μL ise, 150 μL tampon ekleyin)
3. Orijinal konsantrasyon sağlanana kadar tekrar 5.000 × g 10 °C'de santrifüj yapın.
4. Bu tampon değişim sürecini üç kez tekrarlayarak tuz veya üre gibi küçük molekül kirleticilerin yaklaşık %99'unu çıkarabilirsiniz.
5. Protein örneklerini hızlı vakum liyofilizatör kullanarak dondurarak konsantre edin.
   NOT: Sonraki uygulamalar için gereken tuz arındırma derecesine göre döngü sayısını ayarlayın.

5. Bicinchoninic asit (BCA) testi kullanılarak protein niceliklendirmesi

NOT: Örneklerin protein konsantrasyonu, standart olarak sığır serum albümini (BSA) olan BCA protein testi kullanılarak belirlenmiştir. BCA testi, deterjan uyumlu, bisinkoninik asit bazlı bir kolorimetrik yöntemdir ve toplam proteini tespit etmek ve nicelendirmek için kullanılır. Bu yöntem, proteinler tarafından alkali ortamda Cu²⁺'nin Cu⁺'ya indirgenmesine (Biuret reaksiyonu) ve ardından bisinchoninik asit içeren bir reaktif kullanılarak bakus iyonun (Cu⁺) son derece hassas ve seçici kolorimetrik tespitine dayanır. Test, bir güperli iyonun iki molekül BCA ile şelatasyonuyla oluşan mor renkli bir kompleks üretir. BCA testi, BSA ile tutarlı, doğrusal bir yanıt üreterek güvenilir bir standart eğri referansı sağlar. BCA testinde farklı proteinlerin farklı yanıtlar verdiği bilinse de, BSA kullanımı çeşitli örnekler arasında tekrarlanabilir göreceli nicelik sağlar. Amacımız, her türün mutlak nicelenmesi yerine eşit protein yükü için normalleştirme olduğundan, BSA tabanlı kalibrasyon en sağlam ve tekrarlanabilir yaklaşımı sundu.

1. Prosedür
   1. Her BSA standardından 25 μL (çalışma aralığı 20-2000 μg/mL) ve bilinmeyen protein örneğini 96 kuyuyla belirlenmiş bir plakanın deliklerine ekleyin.
   2. Her kuyuya 200 μL BCA çalışma reaktifini ekleyin.
   3. Mikro plaka çalkalayıcı ile 30 saniye iyice karıştırın.
   4. Tabağı kapatın ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
   5. Tabağı oda sıcaklığına getirin.
   6. 562 nm'de mikroplaka okuyucu kullanarak soğurma noktasını ölçün.
2. Veri analizi
   1. Tüm örnek ve standart absorbans değerlerinden boşluğun ortalama emilimini (sıfır protein) çıkarın.
   2. Emilimi ve BSA konsantrasyonunun (mikrogram/mikrolitre) standart eğrisini çizin.
   3. Eğrideki regresyon denklemini kullanarak bilinmeyen örneklerdeki protein konsantrasyonlarını hesaplayın.

6. Protein konsantrasyonunun normalleştirilmesi

1. Prosedür
   1. Her plazma örneğinin protein konsantrasyonunu uygun bir nicelendirme yöntemiyle ölçin.
   2. Her örnekin konsantrasyonunu ve toplam hacmini kaydedin.
   3. Sulandırıcı olarak 50 mM amonyum bikarbonat tamponu (pH 7.8) hazırlanır.
   4. Gerekli seyreltme formülü C₁V₁ = C₂V₂ kullanılarak hesaplanın.
   5. 1.3 mg/mL konsantrasyona ve 100 μL hacme sahip bir örnek için, 1 mg/mL'ye ulaşmak için gereken nihai hacmi hesaplayın:[V₂ = \frac{1.3 \çarpı 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Toplanacak tampon hacmini nihai hacimden ilk hacmi çıkararak hesaplayın: Tampon hacmi = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. 100 μL plazma örneğine 30 μL 50 mM amonyum bikarbonat (pH 7.8) ekleyin.
   8. Örneği pipetleme veya kısa bir vorteks ile nazikçe karıştırın.
   9. Son hacmin 130 μL olduğunu, normalize edilmiş 1 mg/mL konsantrasyonda olduğunu doğrulayın.
   10. Aşağı akış proteomik örnek hazırlığına devam edin.
       NOT: BCA testi sonuçlarına dayanarak gerekli seyreltme faktörünü hesaplayarak doğru konsantrasyon ayarlamasını sağlayın. Her adım doğrulanır ve veriler tamamlayıcı veri olarak verilir (Ek Tablo 1).

7. Numune hazırlama ve triptik sindirim

1. Protein indirgemesi
   1. Protein çözeltisine amonyum bikarbonat tamponunda uygun bir indirgeme maddesi (örneğin, 1,4-ditiothreitol [DTT]) ekleyin ve nihai konsantrasyon 100 mM'dir.
   2. Karışımı 60 °C'de termomikser veya ısıtma blokunda 30 dakika kuluçka yapın.
      DIKKAT: DTT tahriş edici bir maddedir ve eldivenle bir buhar davlumbazının içinde ele alınmalıdır.
      NOT: Sindirimde kullanılan tripsin hakkında ek bilgiler Malzeme Tablosu'nda verilmiştir. Kısaca, dizeleme derecesinde Tosilfenilalanil Klorometil Keton (TPCK) ile işlenmiş tripsin (şimotriptik aktiviteyi ortadan kaldırmak için) lizin ve arginin kalıntılarında bölünme için yüksek spesifiklik sağlamak amacıyla kullanılmıştır. Enzim aktivitesi, üretici spesifikasyonlarına göre doğrulandı ve yaklaşık mg protein başına 1 birim N-Benzoil-L-Arginine Etil Ester (BAEE) aktivitesine karşılık geldi. DTT ve İyodo asetamid (IAA) konsantrasyonları açısından, 100 mM DTT ve 200 mM IAA'nın reaksiyonda kullanılan nihai konsantrasyonları değil, stok çözeltilerine işaret ettiğini doğruluyoruz. İngeleme ve alkilasyon sırasında nihai çalışma konsantrasyonları standart aralık içindeydi (genellikle sırasıyla 5-10 mM DTT ve 10-20 mM IAA).
2. Sistein kalıntılarının alkilasyonu
   1. İnceltasyondan sonra örneği oda sıcaklığında 5 dakika soğutun.
   2. Kısa bir süreliğine tüpün dibinde yoğunsu toplamak için santrifüj yapın.
   3. İngengen sistein kalıntılarını alkillemek için 50 mM Amonyum Bikarbonat (ABC) tamponunda hazırlanmış 200 mM IAA ekleyin.
   4. IAA bozulmasını önlemek için numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka edin.
      NOT: İyodoasetamide ışığa duyarlıdır ve potansiyel olarak toksiktir; Maruz kalmaktan kaçının ve hafif ışıkta kullanın.
3. Enzimatik sindirim
   1. Kullanımdan hemen önce 50 mM ABC tamponunda dizileme derecesinde modifiye tripsini hazırlayın.
   2. Her numuneye tripsin-protein oranı 1:25 (w/w) ile ekle.
   3. Reaksiyonu 37 °C'de 17 saat kuluçka edin, böylece tam enzimatik sindirim sağlanır.
      NOT: Uzun sindirim süreleri aşırı sindirime yol açabilir; kuluçka boyunca sıcaklık stabilitesini sağla.
4. Tepkiyi Söndürmek
   1. Her numuneye formik asit ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun; böylece nihai konsantrasyon %1,0 (v/v) elde edilir.
   2. 37 °C'de 20 dakika boyunca kuluçka yapın, böylece kalıntı tripsini denatüre edin ve peptid karışımı stabilize ediler.
      DIKKAT: Formik asit aşındırıcıdır; uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın ve kimyasal bir buhar kapasası içinde çalışın.
5. Peptit geri kazanımı
   1. Çözünmeyen maddeyi çıkarmak için sindirilmiş peptid karışımını 3500 g oda sıcaklığında 12 dakika boyunca santrifüjleyin.
   2. Sindirilmiş peptitleri içeren şeffaf üst yüzeyi peleti rahatsız etmeden dikkatlice otomatik numune alan şişelere aktarın.
   3. Peptit çözeltilerini -20 °C'de depolayın ve daha fazla LC-MS/MS analizi yapılın.
6. LC-MS analizine hazırlık
   1. Peptit örneklerini doğrudan iyon hareketliliğiyle donatılmış LC-MS sistemine yükleyin; bu sistem peptid ayrımı ve analizi için yapılır.
   2. Tüm şişelerin buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için düzgün şekilde kapatıldığından emin olun.

8. LC MS-MS analizi

1. Peptit yüklemesi ve tuzdan arındırılması
   1. Kısmi döngü enjeksiyon modunda bir örnek döngüsüne 1 μg peptid örneğini yükleyin.
   2. Peptitleri, %0,1 formik asit içeren sulu çözücüyle 15 μL/dakika akış hızında 1 dakika boyunca yıkayarak C18 tuzak kolonu kullanarak tuzdan arındırın.
      NOT: Çözüm A olarak %0,1 formik asit içeren su ve Solvent B olarak %0,1 formik asit içeren asetonitril kullanın.
2. Peptit ayrımı
   1. Tuzak kolonunu analitik ters faz C18 sütununa hat içinde bağlayın.
   2. Peptidleri 55 dakika boyunca %3 ile %40 arası doğrusal bir gradyan kullanarak 300 nL/dakika akış hızında Solvent B'yi elüte edin.
   3. Kolonu %80 Solvent B ile 7,5 dakika boyunca durulayın, böylece kalan bileşenler çıkarılır.
   4. Bir sonraki enjeksiyondan önce kolonu %3 Solvent B ile yeniden dengeleyin.
   5. Çalışma sırasında sütun fırınını 35 °C'de, otomatik numune cihazını ise 4 °C'de tutun.
      NOT: Taşınmayı en aza indirmek için örnekler arasında boş enjeksiyonlar ekleyin.
3. Kütle spektrometrisi alım ayarları
   1. Eluting peptitlerin kütle spektral analizi
      1. UPLC sistemini kurup doğrudan Yüksek Çözünürlüklü MS'ye bağlayın.
      2. Sistemi MS yazılımı ile kontrol edin.
      3. Kütle spektrometresinin hibrit bir quadrupole-ion hareketlilik-ortogonal ivmelenme-uçuş süresi (oa-TOF) olarak yapılandırıldığından emin olun.
      4. Tüm azot ve kilit-püskürtme gaz bağlantılarının güvenli ve sızıntısız olduğundan emin olun.
         DIKKAT: Yüksek voltajlı bağlantıları ve basınçlı gazları laboratuvar güvenlik standartlarına uygun şekilde kullanın.
   2. İyonizasyon kurulumu
      1. Kütle spektrometresini çift elektrosprey iyon kaynağı kullanarak pozitif elektrosprey iyonizasyon (ESI) modunda çalıştırın.
      2. Nano-ESI kapiler voltajını 3.4 kV'a ayarlayın.
      3. Örnek konisi voltajını 40 V'a, ekstraksiyon konisi voltajını ise 4 V'a ayarlayın.
      4. İyon hareketlilik spektrometrisi (IMS) azot gazı akışını 90 mL/dakika olarak ayarlayın.
      5. Püskürtme stabilitesini kontrol edin ve devam etmeden önce iyon akımının tutarlı olduğundan güvenin.
   3. İyon hareketlilik ayrımı
      1. İyon iletimi sırasında IMS ion kılavuz darbe yüksekliğini 40 V'a ayarlayın.
      2. IMS ion kılavuz hızını 800 m/s'ye ayarlayın.
      3. Hareket kabiliyetiyle optimal iyon ayrımı sağlamak için hareket dalgası yüksekliğini tam IMS döngüsü boyunca 8 V'dan 20 V'a doğrusal olarak artırın.
         DIKKAT: IMS gaz akışının stabil olmasını sağla; dalgalanmalar, iyon ayrımını ve sürüklenme süresinin tekrarlanabilirliğini etkileyebilir.
   4. Kilit kütle kalibrasyonu
      1. Uçuş zamanı (TOF) analizörünü 2 μg/μL sodyum iyodid (NaI) çözeltisi kullanarak kalibre edin.
      2. Kalibrasyon aralığını iyonları 50 m/z ile 2000 m/z arasında tespit edecek şekilde ayarlayın.
      3. Gerçek zamanlı kütle düzeltmesi için çift elektrosprey iyon kaynak kanalını kullanarak her 45 saniyede bir kilit kütle referans spektrumları edinin.
      4. Veri toplamaya geçmeden önce kalibrasyon eğrisinin kütle doğruluğunu ±5 ppm içinde sağladığını doğrulayın.
4. Veri toplama
   1. Veri edinmek, iki fonksiyon arasında dönüşümlü olarak süreklilik modunda:
      1. Fonksiyon 1 (Düşük Enerjili MS): Düşük enerjili öncü iyon spektrumlarını kaydetmek.
      2. Fonksiyon 2 (Yüksek Enerjili HDMSE): Parça iyon spektrumlarını iyon hareketliliği ayrılmasıyla yüksek çarpışma enerjisinde kaydetmek.
   2. Fonksiyon 2'de, Trap bölgesindeki çarpışma enerjisini 4 eV olarak ayarlayın.
   3. Transfer bölgesindeki çarpışma enerjisini 20 eV'den 45 eV'ye yükseltmek için kontrollü peptid parçalanmasını elde edin.
   4. Fonksiyon başına spektral alım süresini 0,9 saniye, taramalar arası gecikmeyi ise 0,024 saniyeye ayarlayın.
   5. Toplam iyon kromatogramını (TIC) izleyerek çalışma boyunca tutarlı enstrüman yanıtı doğrulayın.
   6. Ham verileri proteomik analiz yazılımına (örneğin, Progenesis QI veya eşdeğeri) aktarın.
   7. Varsayılan hizalama referansı veya manuel seçilmiş referans koşusu kullanarak koşular arasında kromatografileri hizalayın.
   8. Seçilmiş bir veritabanı kullanarak peptidleri ve proteinleri belirleyin (örneğin, sadece incelenen girişler için UniProt Human kaynaklı).
   9. Aşağıdaki arama parametrelerini ayarlayın:
      Enzim: Tripsin
      Sabit modifikasyon: Karbamidometilasyon (C)
      Değişken modifikasyon: Oksidasyon (M)
      Peptit toleransı: Cihaz çözünürlüğüne göre
      Kaçırılmış bölünmeler izin verilen: 1
      Yanlış Keşif Oranı (FDR): ≤ %1
   10. Tüm proteinlere normalize yöntemiyle normalizasyon yapın.
   11. Filtreleme eşikleri uygulanır: protein başına ≥2 peptid, ≥1 benzersiz peptid, katlama değişimi ≥1.5 ve ayarlanmış p-değeri <0.05.
       NOT: Bu genel laboratuvar güvenliği rehberidir—kurumun EHS (Çevre Sağlığı ve Güvenliği) düzenlemelerine ve yerel yasal gerekliliklere her zaman uyun.
5. Kalite kontrolü
   1. Kütle doğruluğunu doğrulamak için NaI standardı kullanarak ön ve sonrası kalibrasyon kontrolleri yapın.
   2. Kilit kütle referansının analiz boyunca stabil kaldığından emin olun.
   3. Tutma süresi, sürüklenme süresi ve spektral yoğunlukta tekrarlanabilirliği doğrulamak için tekrarlanan enjeksiyonları değerlendirin.
      DIKKAT: Sodyum iyodid bir tahrişleyicidir. Dokunurken eldiven kullanın ve soluma veya ciltle temas etmekten kaçının.
      NOT: Atık bertaraf rehberliği için Ek Dosya 1'e bakınız. Plazma örneklerini tutarken protein bozulmasını önlemek için her zaman soğuk ortamda veya buz üzerinde çalışın. Biyolojik örnekler ve tamponlar ile ilgilenirken Nitryl eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması giyin. 4 °C'ye kadar önceden soğutturulmuş soğutmalı santrifüj kullanarak santrifüj adımlarını gerçekleştirin. Kullanılan tüm santrifüj tüpleri ve şırıngaların steril olduğundan ve çapraz kontaminasyondan kaçınmak için düzgün etiketlenmiş olduğundan emin olun. Tampon hazırlamak için her zaman proteomik kalitede su kullanın.

Sonuçlar

Plazma örnekleri, spin kartuş kullanılarak albümin, IgG, IgA, transferrin, haptoglobin, antitripsin, fibrinogen, alfa2-makroglobulin, alfa1-asit glikoprotein, IgM, apolipoprotein AI, apolipoprotein AII, komplement C3 ve transtiretin olmak üzere seçici olarak çıkarıldı. Bu azalma adımı, aşağı proteomik analizde düşük bolluklu biyobelirteçlerin tespit edilmesini artırmak için kritik öneme sahipti. Her plazma örneği (8-10 μL) seyreltildi, 0,22 μm spin filtrasyonu ile berrak edildi ve affini...

Tartışma

Plazmanın biyolojik bir matris olarak içsel karmaşıklığı, proteomik analiz için büyük bir zorluk teşkil eder. Protein konsantrasyonlarının devasa dinamik aralığı ve birkaç yüksek bolluklu türün baskınlığı, klinik olarak önemli düşük bolluklu proteinlerin tespitini gizleyebilir. Bu mevcut çalışmada, orta ve düşük bolluklu proteinleri seçici olarak zenginleştirmek ve örnekler arasında analitik tutarlılığı korumak için tasarlanmış çok aşamalı, standart bir numune hazırlama boru hattı kullan...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5 kDa Moleküler Ağırlık Kesme Spin Konsantratör	Agilent Teknolojileri	5185 ve eksi; 5991	Tampon değişimi ve tuz tahliyesi için kullanılır; 5 kDa'nın üzerindeki proteinleri tutar
Amonyum Bikarbonat (ABC)	Sigma Aldrich	Kat No: T6567	Triptik sindirim için kullanılır
Buffer A Equil/Load/Wash	Agilent Teknolojileri	5185-5987
Buffer B Elution	Agilent Teknolojileri	5185-5988
Soğuk santrifüj	CPR-30 Plus Soğutmalı Santrifüj	Yok	Protein örneklerinin düşük sıcaklıkta santrifüjlenmesi için kullanılır
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Triptik sindirim için kullanılır
Elektroforetik aparat	BIO RAD	1658004	SDS PAGE için kullanılıyor
IAA	Sigma Aldrich	CAS No: 144-48-9	Triptik sindirim için kullanılır
IMS T-Wave	Sular	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMoreCompleteCharacterizationof Mi xturesandMolecules-720004176.pdf	İyon hareketlilik ayrımı (IMS)
Infinite M Plex Çok modlu okuyucu	TECAN		Çok plakalı okuyucu
LC-MS sistemi	Sular	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
MassLynx 4.1 SCN781 yazılımı	Sular	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Kütle spektrometrisi yazılımı
Çoklu Affinity Removal Spin Kartuş Human 14 (MARS Hu-14)	Agilent Teknolojileri	5188 ve eksi; 6560	Albümin, IgG, IgA, transferrin gibi 14 yüksek bolluklu plazma proteinini tüketmek için kullanılır.
nanoACQUITY UPLC sistemi	Sular	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Sular	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operon FDU-7003	Operon	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Hızlı vakum liyofilizer
Pierce BCA protein test kiti	Termo Bilimsel	23225	Kolorimetrik test kullanarak protein konsantrasyonunu niceltmek için kullanılır
Proteomics  için Progenesis QI;	Sular	V4.2
R-8C BL Laboratuvar santrifüjü, sabit açılı rotor, 12 & times ile; 15 mL	REMI		Santrifüj
SYNAPT G2 yüksek çözünürlüklü MS	HDMSE Sistemi, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Hibrit dörtlü IMS ortogonal ivmelenme uçuş süresi (oa-Tof) kütle spektrometresi
Toplam kurtarma şişesi	Sular	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Tripsin	Sigma Aldrich	Kat No: T6567	Triptik sindirim için kullanılır