Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Lipoik asit, konak odaklı sitoprottektiv mekanizmalarla mantar keratitinde iltihabı bastırmak için Nrf2/HO-1 yolunu modüle eder

403 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69362

⸱

9 Aralık 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan 2nd People's Hospital

Bu makalede

Özet

Lipoik asit, mantar keratitinde Nrf2/HO-1 sitoprotiftif yolunu aktive eder ve inflamatuar sitokinler ve kornea hasarı seviyelerini azaltır. Bu konak odaklı tedavi, geleneksel antifungallere kıyasla üstün güvenlik profilleri sunarken, oksidatif stres kaynaklı göz hastalıklarının tedavisinde endogen antioksidan yol geliştirme yoluyla mekanik içgörüler sunar.

Özet

Göz güvenliği profiline sahip bir ditiol antioksidanı olan lipoik asit (LA), mantar keratitini tetikleyen oksidatif-inflamatuar ortamı hafifletme kapasitesi nedeniyle araştırıldı. İnsan kornea epitel hücreleri, LA'yı 60 μM'ye kadar canlı kaybı olmadan tolere etti ve Aspergillus fumigatus meydan okumasında, LA, nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) nükleer translokasyonunda üç kat artış ve aşağı akış efektörü heme oksijenaz-1'de (HO-1) beş kat artış yarattı. Nrf2'nin farmakolojik susturulması ML385 ile veya HO-1'in kalay protoporfirin IX ile katalitik blokajı bu moleküler olayları ortadan kaldırdı ve interlökin-1β ile tümör nekroz faktörü-α ifadesini yeniden başlattı, böylece Nrf2/HO-1 bağımlılığı kesin olarak doğrulandı. Bir fare keratit modelinde yapılan paralel deneyler in vitro gözlemleri doğruladı: topikal LA, kornea opasitesi ve inflamatuar skorlarını %47 oranında azalttı, aynı anda kornea Nrf2 ve HO-1 ekspresyonunu artırırken sitokin transkriptlerini yarıya indirdi; SnPPIX'in ortak uygulanması bu faydaları geçersiz bıraktı. Toplu olarak, veriler LA'nın klinik olarak ulaşılabilir konsantrasyonlarda Nrf2 protein seviyelerini artırdığı, nükleer translokasyonu artırdığı, HO-1 aktivitesini güçlendirdiği ve böylece patojenlerin tetiklediği sitokinik türbülansı bastırdığı tutarlı bir mekanik hiyerarşi tanımlar. Bu bulgular, LA'yı antifungal kemoterapiyi tamamlayabilen kolayca aktarılabilir, konak yönlendirimli bir yardımcı olarak konumlandırıyor ve görme tehlikesi oluşturan kornea iltihabının Nrf2 merkezli modülasyonu için daha geniş terapötik bakış açıları sunuyor.

Giriş

Mantar keratiti (FK) artık yaygın bir oftalmik acil durum olarak kabul edilmektedir; her yıl 1 milyondan fazla kültürde kanıtlanmış vaka ve tropikal ile subtropikal bölgelerde kornea körlüğünün orantısız bir payına nedenolmaktadır 1,2. Amerika Birleşik Devletleri'nde 100.000 kişide 6-8'e yaklaşan ve tarımsal ekonomilerde daha da yüksek olan vaka tahminleri, bitki travması veya kontakt lens kullanımı sonrası çalışma çağındaki nüfusları tercihen etkileyen artan küresel tehdidivurguluyor 3,4. Filamentli mantarlar, özellikle Fusarium ve Aspergillus türleri, etiyolojik manzaraya hakimdir; sıcak ve nemli iklimlerde gelişir ve enfeksiyonu başlatmak için göz mikro yaralanmalarınıkullanırlar.

Yarım yüzyıllık klinik kullanıma rağmen, natamisin %5 hala FK için özel olarak onaylanmış tek topikal ajan olarak kalmaktadır; ancak polien kimyası, kornea nüfuzunu zayıf sağlar, sık doz gerektirir ve evrensel olarak mevcutdeğildir 6,7. Endişe verici bir şekilde, Güney Asya'dan yapılan ardışık bir gözetim çalışması, hem natamisin hem de triazollerin minimal inhibitör konsantrasyonlarında kademeli artışlar ortaya koymuştur; Fusarium izoleleri natamisin direncinde yıllık %≥6 artış vevorikonazol 8 için paralel bir eğilim göstermiştir. Bu veriler, terapötik başarısızlık klinik raporlarıyla örtüşüyor ve FK tedavileri pazarının 2023'te 0,9 milyar USD'den 2033'e kadar 1,48 milyar USD'ye çıkacağı öngörülerini pekiştiriyor; bu proje büyük ölçüde mevcut farmakoterapinin yetersizlikleri nedeniyle gerçekleşiyor. Konjonktival flaplar veya nüfuz eden keratoplasti gibi geçici cerrahi önlemler, inatçı ülserlerde anatomiyi kurtarır, ancak kaynak yoğun ve görmekısıtlayıcısıdır 9. Bu eksiklikler topluca, sadece fungistatik etkinin ötesine geçen konak odaklı veya çoklu hedefli stratejilere olan ihtiyacı vurgular.

Oksidatif stres ve buna bağlı olan iltihap zinciri, artık mantar patogenezi ve kornea skarışıklığının temel belirleyicileri olarak kabul edilmektedir. Mantar invazında, kornea epitel hücreleri ve konjonktival mast hücreleri, limbal dendritik hücreler ve stromal keratositler dahil olan yerleşik bağışıklık popülasyonları, Dectin-1 ve Toll benzerireseptörler 10 gibi desen tanıma reseptörleri aracılığıyla doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını başlatır. Nötrofilden türetilen reaktif oksijen türleri (ROS), antimikrobiyal oksidatif patlamanın bir parçası olarak enfekte stromada birikirken, sızan makrofajlar ve T lenfositler sitokinamplifikasyonu 11 yoluyla kronik iltihabı sürdürür. Paradoksal olarak, filamentli mantarlar bu düşmanca ortamda hayatta kalmak için kendi antioksidan devrelerini (örneğin, Yap1 ile düzenlenmiş süperoksit dismutazları) yukarı düzenler. Fazla ROS ise IL-1β, TNF-α ve diğer pro-inflamatuar aracıların NF-κB-bağımlı transkripsiyonunu aktive eder; bu ilaçlar doku yok oluşunu ve korneal opafikasyonutetikler. Endojen sitoprotektasyonun merkezinde, çekirdek içine translokasyonu, hem oksijenaz-1 (HO-1) ve epitel hücreleri, keratositler ve endotel hücreleri dahil olmak üzere birden fazla korneal hücre tipinde detoksifikasyon enzimleri dizisi olan nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) bulunur13,14. Yaşlanma, diyabet ve kronik iltihaplanma bu ekseni aşağı ayarlar, göz dokularını oksidatif zararlara karşı savunmasız kılarken, Nrf2'nin genetik veya farmakolojik artışı epitel yara kapanmasını hızlandırır ve çeşitli kornea yaralanmalarında sitokin artışınıbastırır.

Kavram kanıtı çalışmaları FK'da bu yolu kullanmaya başladı. Perillaldehit16, gallik asit17,hidroksitirozol 18 ve organoselenyum bileşiği ebselen19 gibi doğal küçük moleküller, Nrf2-HO-1 sinyalini güçlendirerek mantarın canlılığını doğrudan bozarak çift antifungal ve anti-inflamatuar etkiler sağlar. Antifungal ve antiantioksidanları birlikte sağlayan nanomedikal platformlar, patojenin temizlenmesini konak savunma güçlendirmesiyle birleştirmenin terapötik vaatinidaha da göstermektedir 20,21. Ancak bu adayların birçoğu, formülasyon karmaşıklığı veya kanıtlanmamış göz güvenliğiyle ilgili translasyon engelleriyle karşı karşıyadır.

Lipoik asit (LA), yaygın bir ditiol antioksidandır ve iyi bilinen sistemik güvenlik siciline ve olağanüstü farmakodinamik çok yönlülüğe sahiptir. Karaciğer ve sinir dokularında yapılan çalışmalaradayanarak, 10,12 LA'nın Kelch benzeri ECH-ilişkili protein-1 (Keap1) üzerindeki sistein kalıntılarını (özellikle Cys151, Cys273 ve Cys288) doğrudan değiştirerek, Nrf2 ile etkileşimini bozarak Nrf2'nin ubiquitinasyonunu ve proteazomal bozulmasını önlediği önerilmiştir; bu da Nrf2 protein seviyelerinin artmasına, nükleer translokasyonun artmasına ve HO-1 transkripsiyonunun artmasına yol açar. Ancak, kornea epitel hücrelerinde Keap1-LA etkileşiminin doğrudan gösterilmesi gelecekte araştırma gerektirir. LA, oksidatif yaralanmanın karaciğer, sinir ve göz modellerinde sitoprotifektif faydalargöstermiştir 13,15. Amfipatik yapısı, polienlerde gözlemlenen zar toksisitesi olmadan doku nüfuzunu kolaylaştırır ve topikal ve sistemik endikasyonlar için klinik formülasyonlar zaten mevcuttur. Buna rağmen, LA'nın kornea inflamatuar mikro-ortamını modüle etme ve böylece FK'yı iyileştirme kapasitesi titizlikle sorgulanmamıştır.

Bu nedenle mevcut çalışma, LA'nın Nrf2/HO-1 eksenini aktive ederken pro-inflamatuar sitokinleri bastırarak A. fumigatus kaynaklı keratopatiyi hafifledip azaltamayacağını araştırdı. İnsan kornea epitel hücreleri ve doğrulanmış bir fare FK modeli kullanılarak, doz-yanıt özelliklerini belirledik, mekanik bağımlılıkları seçici inhibitörlerle disseksiye ettik ve enfekte olmayan kontroller ile enfekte araç tedavisi gören gruplarla terapötik sonuçları karşılaştırdık. Bildiğimiz kadarıyla, bu, lipoik asidin mantar keratitinde terapötik etkinliğini kapsamlı doz-yanıt karakterizasyonu, hem Nrf2 hem de HO-1'in seçici farmakolojik inhibitörleriyle mekanik diseksiyon ve hem hücresel hem de hayvan modellerinde doğrulama yoluyla ortaya koyan ilk sistematik araştırmayı temsil etmektedir. Bu çalışma, moleküler, hücresel ve translasyonel okumaları benzersiz bir şekilde entegre ederek LA'nın anti-enflamatuar etkilerinin altında yatan Nrf2/HO-1 yol bağımlılığına dair kesin kanıtlar sunmaktadır. Moleküler, hücresel ve in vivo okumaları entegre ederek, FK'da patojenlerin yok edilmesi ve inflamatuar kısıtlamanın ikiz gerekliliğini ele alan, kolayca çevrilebilen, konak odaklı bir tedavi olarak LA'nın kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamayı amaçladık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol numarası: IACUC-2024-FK-007) tarafından onaylanmış ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Açıklaması'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 8-10 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57BL/6 fareler, 22 ± 2 °C ve %50-60 bgöreli nem koşullarında, 12:12 saat açık-karanlık döngüsüyle kontrol edilen bireysel havalandırmalı kafeslerde tutuldu. Bu özel patojensiz hayvanlar Charles River Laboratuvarları'ndan elde edilmiştir ( bkz. Materyal Tablosu). Tüm fareler, deneysel prosedürlerden önce yeni ortama uyum sağlamak için 1 haftalık bir alışma dönemi geçirdi; standart kemirgen yemeği ve suya sınırsız erişim sağlandı.

DIKKAT: Aspergillus fumigatus , biyogüvenlik seviye 2 muhafaza gerektiren patojenik bir organizmadır. Tüm mantar kültürleri, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruma gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla sertifikalı biyolojik güvenlik dolabında ele alınmalıdır. Dimetil sülfoksit (DMSO) yanıcıdır ve cildi nüfuz edebilir; İyi havalandırılan alanlarda tutun ve doğrudan temastan kaçının. Ketamin ve ksilazin, kurumsal düzenlemelere uygun şekilde güvenli depolama ve uygun belgeler gerektiren kontrollü maddelerdir.

Deneysel hazırlık
Tüm gerekli reaktifler, ilaçlar ve malzemeler deneysel iş akışına göre hazırlandı (şematik için Materyal Tablosu ve Ek Şekil 1'e bakınız). Rasemik (±)-α-Lipoik asit (LA) stok çözeltileri, oksidatif bozunmayı önlemek için DMSO'da çözünmüş racemik α-lipoik asit (1,2-ditiolane-3-pentanoik asit) kullanılarak hazırlanmış ve oksidatif bozulmayı önlemek için -80 °C sıcaklıkta tek kullanımlık alikotlarda saklanmıştır. Nrf2 inhibitörü ML385 ve HO-1 inhibitörü SnPPIX de donma-çözülme döngülerini önlemek için tek kullanımlık olarak benzer şekilde hazırlanmış ve aliquote edilmiştir. Tüm hücre kültürü ortamları ve takviyeler steril koşullarda hazırlanmış ve kullanımdan önce 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmıştır.

Mantar kültürleriyle kirlenmiş tüm malzemeler, agar plakaları, kültür tüpleri ve tek kullanımlık plastikler dahil olmak üzere 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlanarak biyolojik tehlike atık konteynerlerine atıldı. Organik çözücüler içeren kimyasal atıklar ayrı ayrı toplanıp kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği protokolleriyle bertaraf edilmiştir. Hayvan dokuları ve leşleri, onaylı biyomedikal atık hizmetleri aracılığıyla yakıldı.

Mantar kültürü ve enfeksiyon hazırlığı
Aspergillus fumigatus, Sabouraud dekstroz aga'sında 37 °C'de 5-7 gün boyunca yetiştirildi ve olgun konidial oluşum gözlemlendi. Konidiyalar, %0,05 Tween-80 içeren steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) olgun kültürlerin su basması ile hasat edildi ve konidial süspansiyonlar steril gazlı bezden süzülerek hipal parçaları çıkarıldı. Konidial konsantrasyon bir hemositometre kullanılarak belirlenmiş ve yayımlanmış mantar keratit modellerine göre belirlenmiş konsantrasyonlara göre ayarlanmıştır. In vitro deneyler için, 1 x 106 konidiya/mL (enfeksiyonun çokluğu 10:1) önceki çalışmalara dayanarak seçilmiştir; bu çalışmalar bu konsantrasyonun korneal epitel hücrelerinde güçlü inflamatuar yanıtlar tetiklediğini ve sonraki analizler için yeterli hücre canlılığınıkorurken 16,17. In vivo çalışmalar için, bu aşı, enfeksiyon sonrası 5. güne kadar tekrarlanabilir hastalık puanlarıyla tutarlı, orta şiddette keratit üretir ve aşırı ölüm olmadan terapötik etkinliği değerlendirmek için yeterli dinamik aralık sağladığı için in vivo çalışmalar için 1 x 107 konidiya/mLseçilmiştir 16,19.

Hayvan tedavisi ve kornea enfeksiyonu
Genel anestezi altında (intraperitoneal ketamin 100 mg/kg ve ksilazin 10 mg/kg enjeksiyonu), mantar keratitisi merkezi korneada steril 25G iğne kullanılarak üç adet 1 mm lineer çizik oluşturularak indüklendi, ardından 5 μL A. fumigatus konidial süspansiyonu topikal olarak uygulandı. Fareler tedavi gruplarına rastgele ayrıldı (grup başına n=8): kontrol (enfekte olmayan), enfekte kontrol, enfekte + LA tedavisi (günde 4 kez topikal olarak 60 μmol/L) ve enfekte + LA + SnPPIX tedavisi (LA artı 5 mg/kg intraperitoneal günlük SnPPIX). Klinik değerlendirme ve doku toplama işlemi enfeksiyon sonrası 5. günde gerçekleştirildi.

Hayvan taşıma önlemleri: Anestezi altındaki hayvanlarla ilgili tüm işlemler aseptik koşullarda yapılmalıdır. Anestezi sırasında hayvanları solunum depresyonu için sürekli izleyin. Kontamine yatak takımları, cerrahi atıklar ve enfekte dokular otoklavlama yoluyla ve ardından kurumsal biyolojik tehlike atık yönetim protokollerine göre yakma yoluyla bertaraf edilir.

Hücre kültürü ve tedavisi
İnsan kornea epitel hücreleri (HCECs) ATCC'den alındı ve %10 fetal sığır serumu, %1 penisillin-streptomisin ve %1 L-glutamin ile desteklenmiş, 37 °C sıcaklıkta nemlendirilmiş %5 CO₂ atmosferinde %10 fetal sığır serumu ve %1 L-glutamin takviyesi ile tutuldu. Hücreler, %80-90 birleşimine ulaştıklarında her 3-4 günde bir alt kültür yapıldı ve tutarlılığı sağlamak için 3-8 pasajlar arasında kullanıldı. Deneysel tedaviler için, hücreler uygun plakalarda her kuyu başına 5 x 10⁴ hücre olarak tohumlanmış ve tedaviden önce 24 saat yapışmaları beklenmiştir. Tüm in vitro mekanik deneylerde, hücreler önce enfeksiyon oluşturmak için 4 saat boyunca 10:1 enfeksiyon oranında (MOI) Aspergillus fumigatus conidia ile maruz kalmış, ardından LA (60 μM), ML385 (5 μM) veya SnPPIX (1 μM) tek başına veya kombinasyon halinde 24 saat daha eklenmiştir. Bu ardışık tasarım, LA'nın belirlenmiş mantar sorunu üzerindeki terapötik etkilerinin profilaktik tedavi yerine değerlendirilmesine olanak tanır.

Hücre yaşama değerlendirmesi (CCK-8 analizi)
Hücre canlılığı Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) kullanılarak değerlendirildi. Hücreler, 96 kuyu ölçüsünde 5 x 104 hücre ölçüsünde tohumlanarak tedavi edilmeden önce 24 saat kuluçka altına alındı. İlaç maruziyetinden sonra, her kuyuya 10 μL CCK-8 çözeltisi eklendi ve plakalar 37 °C'de 2 saat inkübe edildi. Absorbans, Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu kullanılarak 450 nm olarak ölçüldü. Her deneysel koşul oktüuplikat olarak gerçekleştirildi ve deneyler bağımsız olarak üç kez tekrarlandı. Sitotoksik etkileri önlemek için araç kontrol (DMSO) konsantrasyonu %0,1'in altında tutuldu.

RNA çıkarımı ve nicel gerçek zamanlı PCR
Toplam RNA, üreticinin protokolüne göre RNeasy Mini Kit kullanılarak kültürlenmiş hücreler ve kornea dokularından izole edildi. Doku örnekleri, doku homojenizatörü kullanılarak RLT tamponunda 50 Hz'de 2 dakika boyunca homojenleştirildi. RNA kalitesi ve konsantrasyonu spektrofotometre kullanılarak değerlendirildi; örnekler 1.8-2.0 oranlarında 260/280 oranlarına sahip oldu ve sonraki analiz için kullanıldı. İlk zincirli cDNA sentezi, her reaksiyon başına 1 μg toplam RNA ile Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti kullanılarak gerçekleştirildi. Nicel PCR, SYBR Green bazlı qPCR master karışımı kullanılarak gerçek zamanlı PCR sisteminde yapıldı; ilk denatürasyon 95 °C'de 2 dakika sürdü, ardından 15 saniye boyunca 95 °C ve 1 dakika boyunca 60 °C ile 40 döngü yapıldı. Amplikon özgüllüğünü doğrulamak için erime eğrisi analizi yapıldı. Tüm primerler kullanımdan önce verimlilik (%90-%110) ve özsellik açısından doğrulandı. Göreli mRNA ifadesi, referans gen olarak GAPDH ile 2(-ΔΔCT) yöntemiyle hesaplandı.

Protein ekstraksiyonu ve Western Blot analizi
Toplam protein ekstraksiyonu için, hücreler ve dokular RIPA tamponunda proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteylleriyle desteklenerek lizedilmişti. Üretici protokolüne göre NE-PER Nükleer ve Sitoplazmik Ekstraksiyon Reaktifleri kullanılarak nükleer ve sitoplazmik protein fraksiyonları hazırlandı. Protein konsantrasyonları Bradford testi kullanılarak belirlendi. Eşit miktarda protein (30-50 μg) SDS-PAGE ile ayrılarak PVDF membranlarına aktarıldı. %0,1 Tween-20 içeren Tris tamponlu tuzlu sümle %5 yağsız sütle 1 saat bloke edildikten sonra, membranlar 4 °C'de gece boyunca primer antikorlarla inkübe edildi, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar uygulandı. Protein bantları, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 30-180 saniye kadar pozlama süreleriyle geliştirilmiş kemimilüminesans reaktifi kullanılarak görselleştirildi. Bantlar, ImageJ yazılımı kullanılarak nicelendirildi; toplam proteinler için yükleme kontrolü olarak β-aktin, nükleer proteinler için lamin B1 ise kullanıldı.

Klinik değerlendirme ve histolojik analiz
Kornea hastalığının şiddeti, fare mantarkeratiti 22 için belirlenmiş protokollere dayanan standart bir klinik puanlama sistemi kullanılarak değerlendirildi. Puanlama sistemi, 0-4 ölçekli üç parametreyi değerlendirir: kornea opaklığı (0 = temiz, 4 = tamamen opak), yüzey düzensizliği (0 = pürüzsüz, 4 = perforasyonlu şiddetli ülserasyon) ve inflamatuar yanıt (0 = infiltrasyon yok, 4 = hipopiyonlu yoğun infiltrasyon), toplam puanlar 0 ile 12 arasında elde edilir. Tüm klinik değerlendirmeler, tedavi grubu atamalarına maskeli iki bağımsız gözlemci tarafından yapıldı ve gözlemciler arası anlaşma %90'ı aştı. Kornea fotoğrafları, dijital kamerayla donatılmış yarık lambalı biyomikroskop kullanılarak çekildi. Histolojik analiz için gözler enukleasyon, %4 paraformaldehit ile sabitlenmiş, parafinli gömülü ve 5 μm kalınlıkta kesitlenmiştir. Kesitler genel morfoloji değerlendirmesi için hematoksilin ve eosin ile boyandı.

Enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA)
Hücre kültüründeki süpernatantlar ve kornea dokusu homojenatlarında salgılanan IL-1β ve TNF-α seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre ticari ELISA kitleri kullanılarak nicelendirildi. 24 saatlik tedaviden sonra hücre kültürü süpernatantları toplanırken, kornea dokuları proteaz inhibitörleri içeren PBS ile homojenleştirildi. Örnekler 12.000 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlendi ve ELISA analizi için süpernatanlar kullanıldı. Tüm örnekler çift olarak analiz edildi ve sitokin konsantrasyonları standart eğrilerden hesaplandı.

İstatistiksel analiz
Tüm deneyler uygun biyolojik kopyalarla ( in vitro çalışmalar için n ≥6, hayvan çalışmaları için n =8) yapıldı ve en az 3 kez bağımsız olarak tekrarlandı. Veriler, ortalama ± ortalama standart hatası (SEM) olarak sunulur. Veri analizi GraphPad Prism sürüm 9.0 kullanılarak gerçekleştirildi. Özellikle, veri dağılımını değerlendirmek için normallik testi fonksiyonunu (Shapiro-Wilk), iki gruptan fazla deney için Tukey'nin çoklu karşılaştırma testiyle tek yönlü ANOVA ve iki grup karşılaştırmaları için eşleşmemiş Student'in t-testini kullandık. Grafikler, bireysel veri noktalarının üzerine dağılma grafikleri olarak yerleştirildiği gruplanmış çubuk grafikler olarak oluşturulmuş, hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deneysel iş akışı, lipoik asit tedavisinin mantar keratit modellerinde iltihabı bastırmak için Nrf2/HO-1 sinyal yolunu etkili bir şekilde modüle ettiğini gösterdi.

Lipoik asit ve yol spesifik inhibitörlerin sitotoksisite değerlendirmesi
Bu araştırmada kullanılan her bileşik için optimal konsantrasyonları belirlemek amacıyla ilk doz-yanıt çalışmaları yapılmıştır. LA, HCEC'lerle mükemmel biyouyumluluk göstermiş, 24 saatlik maruziyetten sonra hücre canlılığını 60 μM'e kadar ol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut bulgular, lipoik asidi (LA)'nın Nrf2/HO-1 ekseninin güçlü bir indüktörü olduğunu doğrulamaktadır; bu durum, pro-inflamatuar sitokin ekspresyonunu azaltarak ve kornea mimarisini koruyarak mantar keratitini (FK) hafifletmektedir. Oksidatif bozukluklarda ditiolan bileşiklerinin güçlü Nrf2 aktivasyonunu gösteren sonçalışmalarla uyumlu olarak, LA HO-1 transkriptlerinde beş kat artış sağladı ve IL-1β/TNF-α salgılanmasını yarıya indirerek göz iltihabı için bildiri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmayla ilgili çıkar çatışması belirtmemektedir. Çalışmanın tasarımı, yürütülmesi veya yorumlanmasını dış bir finansman veya ticari ilişki etkilemedi.

Teşekkürler

Bu araştırma, Jinan 2. Halk Hastanesi Oftalmoloji Bölümü'nden gelen iç fonlarla desteklenmiştir. Yazarlar, laboratuvar personelinin hücre kültürü bakımı ve hayvan modeli prosedürleri için sunduğu teknik desteği minnettarlıkla takdir etmektedir. Protokol incelemesi ve onayı için Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne özel teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-HO-1Hücre Sinyal Teknolojisi, Danvers, MA, ABD#8803
Anti-β-aktinSigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABDA5441
Anti-lamin B1Abcam, Cambridge, MA, ABDAB16048
Anti-NRF2Abcam, Cambridge, MA, ABDab62352
Aspergillus fumigatusATCC 204305Yok
Bradford Analiz KitiBio-Rad Laboratuvarları5000006
C57BL/6 fareleriCharles River LaboratuvarlarıYok
Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8)Dojindo Laboratuvarları, Kumamoto, Japonya343-07623
DMEM/F-12 ortaGibco, Thermo Fisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
ECL reaktifiThermo Fisher Scientific32106
Fetal sığır serumuGibco, Thermo Fisher Scientific16000044
GAPDH İleri ön adımÖzel sentezÖzel Yapı
GlutaMAXGibco, Thermo Fisher Scientific35050061
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiUygulamalı Biyosistemler, Thermo Fisher Scientific4368814
HO-1 Ön primerÖzel sentezÖzel Yapı
HO-1 Ters primerÖzel sentezÖzel Yapı
HRP ile konjuge edilmiş anti-fare IgGAbcam, Cambridge, MA, ABDab205718
HRP ile konjuge edilmiş anti-tavşan IgGAbcam, Cambridge, MA, ABDab205719
İnsan kornea epitel hücreleri (HCECs)ATCC, Manassas, VA, ABDCRL-11135
IL-1β ELISA KitiR& D Systems, Minneapolis, MN, ABDDY201
Lipoik asit (LA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABDT1395
ML385 (Nrf2 inhibitörü)MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABDHY-100523
NanoDrop 2000 spektrofotometreThermo Fisher ScientificND-2000
NE-PER Nükleer ve Sitoplazmik Ekstraksiyon ReaktifleriThermo Fisher Scientific78833
Nrf2 İleri primerÖzel sentezÖzel Yapı
Nrf2 Ters astarlamaÖzel sentezÖzel Yapı
PBS ile %0,05 Tween-80Özel hazırlıkÖzel Yapı
Penisillin-streptomisinGibco, Thermo Fisher Scientific15140122
PowerUp SYBR Yeşil Ana MixUygulamalı Biyosistemler, Thermo Fisher ScientificA25741
QuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermo Fisher ScientificA28140
RIPA tamponuÖzel hazırlıkÖzel Yapı
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Almanya74104
Sabouraud dekstroz agarÖzel hazırlıkÖzel Yapı
Yarık lambalı biyomikroskopÖzel ekipmanYok
SnPPIX (HO-1 inhibitörü)Frontier Scientific, Logan, UT, ABDF6140
Synergy HTX Çok Modlu Mikroplaka OkuyucuBioTek Instruments, Winooski, VT, ABDSYNHXTTR
TBS-T (%0,1 Tween-20)Özel hazırlıkÖzel Yapı
TissueLyser LTQiagen69980
TNF-α ELISA KitiR& D Systems, Minneapolis, MN, ABDDY210

Kaynaklar

  1. Kam, K. W., Rao, S. K., Young, A. L. The diagnostic dilemma of fungal keratitis. Eye. 37 (3), 386-387 (2023).
  2. Shaikh, N. R., Choudhary, K. G. Fungal keratitis- an update on the global threat. Int J Adv Res. 11 (03), 51-55 (2023).
  3. Lambert, L. H., Finger, G. E., Tompkins, B. L. Case Report: Vision-Threatening Fungal Keratitis in a Service Member Stationed at Guantanamo Bay. Military Med. 189 (1-2), 379-383 (2023).
  4. Arboleda, A., Ta, C. N. Overview of Mycotic Keratitis. Cornea. 43 (9), 1065-1071 (2024).
  5. Gautam, M., et al. An Emerging Global Threat of Mycotic Keratitis Caused by Uncommon Fungal Species: A Systematic Review and Meta-Analysis. Transl Vis Sci Technol. 14 (4), 4(2025).
  6. Qiu, S., et al. Natamycin in the treatment of fungal keratitis: a systematic review and Meta-analysis. Int J Ophthalmol. 8 (3), 597-602 (2015).
  7. Hoffman, J. J., et al. Topical Chlorhexidine 0.2% versus Topical Natamycin 5% for the Treatment of Fungal Keratitis in Nepal: A Randomized Controlled Noninferiority Trial. Ophthalmology. 129 (5), 530-541 (2022).
  8. Prajna, N. V., et al. Patterns of Antifungal Resistance in Adult Patients With Fungal Keratitis in South India: A Post Hoc Analysis of 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmol. 140 (2), 179-184 (2022).
  9. Khalil, A. S., Baioumy, S. A., Hegab, M. A., Khairy, M. A., Ali, A. G. Temporary Conjunctival Flap Plus Medical Treatment Versus Medical Treatment Only for High-Risk Fungal Keratitis: A Randomized Controlled Trial. Cornea. 44 (7), 866-873 (2025).
  10. Wang, B., et al. Oxidative Stress Initiates Receptor-Interacting Protein Kinase-3/Mixed Lineage Kinase Domain-Like-Mediated Corneal Epithelial Necroptosis and Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like Receptor Protein 3 Inflammasome Signaling during Fungal Keratitis. Am J Pathol. 193 (7), 883-898 (2023).
  11. Barnes, T. C., Anderson, M. E., Edwards, S. W., Moots, R. J. Neutrophil-derived reactive oxygen species in SSc. Rheumatology (Oxford). 51 (7), 1166-1169 (2012).
  12. Mendoza-Martínez, A. E., Cano-Domínguez, N., Aguirre, J. Yap1 homologs mediate more than the redox regulation of the antioxidant response in filamentous fungi. Fungal Biol. 124 (5), 253-262 (2020).
  13. Zhang, Y. N., Ouyang, W. J., Hu, J. Y., Liu, Z. G. Targeting Nrf2 signaling in dry eye. Int J Ophthalmol. 17 (10), 1911-1920 (2024).
  14. Wang, M. X., et al. Potential Protective and Therapeutic Roles of the Nrf2 Pathway in Ocular Diseases: An Update. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9410952(2020).
  15. O'Rourke, S. A., Shanley, L. C., Dunne, A. The Nrf2-HO-1 system and inflammaging. Front Immunol. 15, 1457010(2024).
  16. Fan, Y., et al. Perillaldehyde Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis by Activating the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway and Inhibiting Dectin-1-Mediated Inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (6), 51(2020).
  17. Luan, S., et al. Gallic Acid Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis Through Reducing Fungal Load and Suppressing the Inflammatory Response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (12), 12(2022).
  18. Gu, L., et al. Hydroxytyrosol downregulates inflammatory responses via Nrf2/HO-1 axis during fungal keratitis and exerts antifungal effects. Int Immunopharmacol. 149, 114202(2025).
  19. Yu, B., et al. Ebselen improves fungal keratitis through exerting anti-inflammation, anti-oxidative stress, and antifungal effects. Redox Biol. 73, 103206(2024).
  20. Liu, X., et al. Macrophage Membrane-Coated Nanoparticles for the Delivery of Natamycin Exhibit Increased Antifungal and Anti-Inflammatory Activities in Fungal Keratitis. ACS Appl Mater Interf. 16 (44), 59777-59788 (2024).
  21. Liu, F., et al. Synergistic wall digestion and cuproptosis against fungal infections using lywallzyme-induced self-assembly of metal-phenolic nanoflowers. Nat Comm. 15 (1), 9004(2024).
  22. Leal, S. M., et al. Distinct Roles for Dectin-1 and TLR4 in the Pathogenesis of Aspergillus fumigatus Keratitis. PLoS Pathogens. 6 (7), e1000976(2010).
  23. Awad, R., Ghaith, A. A., Awad, K., Mamdouh Saad, M., Elmassry, A. A. Fungal Keratitis: Diagnosis, Management, and Recent Advances. Clin Ophthalmol. 18, 85-106 (2024).
  24. Qu, S., Zheng, S., Muhammad, S., Huang, L., Guo, B. An exploration of the ocular mysteries linking nanoparticles to the patho-therapeutic effects against keratitis. J Nanobiotechnol. 23 (1), 184(2025).
  25. Kim, L. N., Karthik, H., Proudmore, K. E., Kidd, S. E., Baird, R. W. Fungal Keratitis, Epidemiology and Outcomes in a Tropical Australian Setting. Trop Med Infect Dis. 9 (6), (2024).
  26. Puumala, E., Fallah, S., Robbins, N., Cowen, L. E. Advancements and challenges in antifungal therapeutic development. Clin Microbiol Rev. 37 (1), e0014223(2024).
  27. Yagishita, Y., Gatbonton-Schwager, T. N., McCallum, M. L., Kensler, T. W. Current Landscape of NRF2 Biomarkers in Clinical Trials. Antioxidants (Basel). 9 (8), (2020).
  28. Li, X., et al. Developing the biomarker panels and drugs by proteomic analysis for autoimmune uveitis and posterior scleritis. iScience. 27 (12), 111389(2024).
  29. Jin, K., Zhang, C. Personalized Medicine in Ophthalmic Diseases: Challenges and Opportunities. J Pers Med. 13 (6), (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nrf2 YolağıHO-1 EkspresyonuOksidatif StresKorneal İnflamasyonKonakçı Yönelimli TerapiAntioksidan YanıtSitokin Baskılanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.