Yöntem makalesi

GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69369

⸱

5 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Benimseyen Hücre Tedavileri (ACT) ürünlerinin genişletilmesi için ölçeklenebilir bir yöntemi tanımlar; yani Kimerik Antijen Reseptörü (CAR)-T hücreleri ve Sitokin İndüklenen Katil (CIK) hücreleri, gaz geçirimli Hızlı Genişleme (G-Rex) cihazları kullanılarak, klinik açıdan ilgili bir ortamda verimli ve sağlam büyüme göstermektedir.

Özet

Benimseyen hücre tedavileri (ACT) son yıllarda hızla ilerlemiş, kanser immünoterapisinde önemli bir rol oynamış ve tedavi sonuçlarını önemli ölçüde etkilemiştir. Hücre tedavisi geliştirmede, hem preklinik hem de klinik aşamalarda kritik bir adım üretim sürecidir. Geleneksel statik kültür yöntemleri sık sık hücre manipülasyonu gerektirir ve genellikle gaz değişimi ve besin tedarikinin azalmasıyla sınırlanır; bu da hücre verimini ve fenotipini tehlikeye atabilir. Burada, gaz geçirimli Hızlı genleşme (G-Rex) cihazları kullanılarak, iki ACT ürününün ex vivo genişlemesi için adım badı, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz. G-Rex cihazları, besin değişimini artırmak ve yüksek yoğunluklu kültürleri minimum kullanıcı müdahalesiyle desteklemek için özel olarak tasarlanmıştır. Çeşitli ACT yaklaşımları arasında, CAR-T hücreleri hematolojik malignitelerin tedavisinde olağanüstü başarılar göstermiş ve deneysel araştırmalardan klinik uygulamalara hızlı bir ilerleme sağlamıştır. CAR-T hücrelerine ek olarak, CIK hücreleri karakteristik fenotipleri ve tedaviye bağlı yan etkilerin olmaması ile Greft-versus-Host Hastalığı (GvHD) nedeniyle klinik denemelerde yaygın olarak uygulanmıştır. Bu protokol, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) izolasyonu ve tohumlanmasıyla başlayan her iki hücre tipi için temel teknik adımları özetler. Kısa bir süreliğine, PBMC'ler anti-CD3/CD28 antikorlarıyla uyarılır, ardından CAR-T hücrelerini genişletmek için lentiviral transdüksiyon veya CIK hücreleri elde etmek için Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 antikor ve Interleukin 2 (IL-2) ile yapılır. Akış sitometrisi, hücrelerin canlılığı ve fenotipini izlemek için kullanılır ve hücre ürününün terapötik potansiyelini doğrulamak ve yaklaşımın ölçeklenebilirliğini doğrulamak için fonksiyonel testler yapılır. Genel olarak, bu protokol preklinik ortamda çok sayıda efektör hücre üretmek için pratik bir çözüm sunar ve çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarında klinik uygulamayı kolaylaştırır. Son olarak, yüksek verimli efektör hücre üretimi için ölçeklenebilir bir çözüm sunar.

Giriş

Benimseyen hücre tedavisi (ACT), kanser tedavisinde ileri tedavilerin önemli bir direği haline gelmiştir. Bu yaklaşım, anti-tümör etkinliğini sağlamak için ex vivo genişletilmiş hücresel ürünlerin uygulanmasınadayanmaktadır 1. Bugüne kadar, ACT'de birçok hücre tipi kullanılmıştır; örneğin, doğal katil (NK)2, sitokin kaynaklı katil (CIK)3,4, doğal öldürücü T (NKT)5 veya γδ Thücreleri 6, tümör sızdıran lenfositler (TILs)7 ve mühendislik hücre tabanlı tedaviler gibi çok spesifik ve kişiselleştirilmiş yöntemlere (örneğin kimerik antijen reseptörü (CAR)1, 8 ve T hücre reseptörü (TCR)hücreleri 9,10.

CAR-T hücreleri, belirli bir moleküler hedefi tanımak için tasarlanmış sentetik bağışıklık reseptörünü ifade etmek için ex vivo viral transdüksiyonla üretilen genetik olarak modifiye edilmiş T hücreleridir. CAR yapısı, antijene özgü tek zincirli değişken Fragment (scFv) antikoru ile TCRζ zinciri ve kostimulyatör moleküller dahil olmak üzere hücre içi sinyal alanları ile birleşir. Antijen etkileşimi olduğunda, hücre içi alan T hücresi çoğalmasını ve antitümör aktivitesini teşvik eden aktivasyonsinyalleri iletir.

CIK hücreleri, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) veya göbek kordonu kanından (UCB) ex vivo genişleme sırasında CD56 ekspresyonunu elde eden aktife T lenfositlerinin heterojen bir popülasyonudur. Bu genişleme, Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 monoklonal antikor ve Interleukin-2 (IL-2) ile uyarılmayı, ardından 14 gün boyunca IL-2'de kültürü içerir. CIK hücreleri işlevsel olarak hem NK hem de T hücrelerine benzer; hem ana histokompatibilite kompleksi (MHC)-bağımsız hem de bağımlı mekanizmalar aracılığıyla antitümöraktivitesi uygularlar 13,14,15,16. Bu özellikler, CIK hücrelerinin hem allogen hem de otolog terapötik ortamlarda kullanılmasını sağlar ve en az greft-konak hastalığı (GvHD)riski 17.

Klinik uygulamada, hem CAR-T hem de CIK hücre tedavileri çok sayıda hücre uygulanmasını gerektirir. CAR-T hücreleri, hasta başına 50-200 milyon dozdaenfuze edilir 18. Benzer şekilde, CIK hücreleri genellikle her infüzyon başına 10 milyar hücreye kadar dozda verilir ve hastalar genellikle tedavi protokolüne bağlı olarak birden fazla infüzyon alır19. Şişe veya plaka kullanılarak yapılan geleneksel hücre kültürü yöntemleri verimsizdir, zaman alıcıdır ve sık geçiş gerektirir; bu da büyük ölçekli genişlemeyi mümkün kılmaz ve kontaminasyon riskini artırır. Torba kültürleri veya biyoreaktörler kullanan otomatik veya yarı otomatik sistemler, büyük ölçekli genişlemeye olanak tanır ancak sınırlamaları vardır; örneğin, kesme gerilimi veya yoğunluk ayarlamaları ve sık sık ortaperfüzyon (20,21) ile aynı anda bir partinin işlenmesi gibi sınırlamalar vardır; bu da hem akademik hem de endüstriyel bağlamlarda yüksek maliyetlere yol açar. Bu zorlu durumda, alternatif olarak gaz geçirimli hızlı genleşme (G-Rex) cihazı temsil edilir; bu, kuyunun dibinde silikon membran bulunan statik bir kültür yöntemidir; bu yöntem, verimli oksijen değişimini ve damarların yüksekliğini artırır ve yüksek hacimli orta kapasiteye olanak tanır. Böylece sistem, orta iplasman veya yoğunluk ayarlaması olmadan hücrebüyümesini destekler 22,23. G-Rex-M sistemleri, 5000 mL'ye kadar ölçeklenebilirlik göstermiş olup, otomatik hasat sistemleriyle uyumludur; bu da gelişmiş terapi tıbbi ürünlerinin (ATMP) geliştirilmesi için akademik ortamlardan kliniklere kolayca dönüştürülebilecek, kontaminasyonsuz ve kapalı kültür platformu sağlar.24.

Özetlenen prosedürde, hem CAR-T hem de CIK hücrelerinin genişleme protokolünü optimize etmek için G-Rex cihazlarının avantaj ve özelliklerinden yararlandık. Her iki hücre tipinin de verimli şekilde genişletilebileceğini, farklı kültür sistemlerinde tutarlı fenotip ve fonksiyonel profil korunabileceğini gösterdik. Hem CIK hem de CAR-T hücreleri için genişleme protokolünün şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1: G-24 veya G-6M kültür cihazları kullanılarak CAR-T ve CIK hücre genişletme protokollerinin genel görünümü. CAR-T ve CIK hücreleri, 0. günden itibaren izole PBMC'lerden genişletilir. CAR-T hücrelerinin genişlemesi için, PBMC'ler 1. günde anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlarıyla uyarılır, 2. gün genetik olarak mühendislik edilir ve ardından her 3-4 günde bir hIL-7 ve hIL-15 takviyesi ile kültürlenir; fonksiyonel testler için son hasat 9. günde yapılır. G-6M formatında, sitokin takviyesi 2. günle sınırlıdır ve kültür dönemi boyunca ek sitokin beslemesi gerekmez. CIK hücrelerinin genişlemesi için, PBMC'ler 1. günde rhIFN-γ ile, 2. gün ise anti-CD3 antikor ve rhIL-2 ile uyarılır ve bu anti her 3-4 günde bir verilir. G-24'te, sitokin takviyesi ile eşzamanlı olarak orta bir değişim gereklidir. CIK hücreleri, 14. günde aşağı yönlü fonksiyonel testler için hasat edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Daha önce patojen kontaminasyonu yokluğu açısından test edilen sağlıklı buffy paltolardan (örneğin, HIV, HCV, HBV, frengi) anonimleştirilmiş buffy paltolar, yazılı bilgilendirme onayından önce Padova Hastanesi Kan Bankası'ndan alınmıştır. Kan örnekleri sertifikalı biyogüvenlik dolaplarında manipüle edildi ve personel uygun Kişisel Koruyucu Ekipman (PPE) giydi.

NOT: Lentiviral vektörlerle ilgili tüm işlemler, kurumsal yönergeler doğrultusunda Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) koşullarında gerçekleştirilmiştir. Lentiviral vektör işleme, çift eldiven gibi ek önlemler gerektirir. Biyotehlike atıkları (viral maddeler, transdüksiyon edilmiş hücreler ve insan kaynaklı örnekler dahil) bertaraftan önce otoklavlanmış, kimyasal atıklar (floresan boyalar ve reaktifler dahil) ise kurumsal tehlikeli atık protokollerine göre ayrılmıştır. Belirli biyogüvenlik gereksinimlerinin kurumlar arasında değişiklik gösterebileceği ve protokol uygulamadan önce doğrulanması gerektiği belirtilmelidir.

1. PBMC'lerin izolasyonu

  1. PBMC'leri sağlıklı donör buffy tüylerinden veya çevresel kan örneklerinden yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edin. Buffy kaplamayı eşit hacimde steril 1x Fosfat Tampon Salin (PBS) ile seyreldin ve seyreltilmiş kanı aynı hacimdeki Lymphoprep üzerine dikkatlice 50 mL konik bir tüpte katmanlayın. Periferik kan için 1x PBS ile seyreltme gerekli değildir. Oda sıcaklığında frensiz 20 dakika boyunca 400 x g santrifüj yapın.
  2. Santrifüjlemeden sonra, plazma-Lenforep arayüzündeki PBMC tabakasını toplayın ve steril 1x PBS ile yıkayınız. PBMC'leri %1 penisillin/streptomisin (bundan sonra cCM) takviye edilen hematopoietik hücre kültür ortamında santrifüj ve resüpsuzt olarak değerlendirin. Trypan Blue dışlama testi kullanarak hücre sayısını ve canlılığı değerlendirin.

2. G-24 kültür kaplarında PBMC'lerden CAR-T hücre genişlemesi

  1. PBMC'lerin aktivasyonu (0. Gün)
    1. 2 x 106 taze izole edilmiş PBMC'yi 2 mL cCM'ye takviye edilmiş ve %5 fetal sığır serumu (bundan sonra cCM-F) ile takviye edilmiş şekilde yeniden askıya alın; böylece nihai tohumlama yoğunluğu 1 x 106 PBMC/cm2/mL elde edilir ve 24 kuyruklu G-Rex (G-24) kültür kapının bir kuyusuna aktarılır. 1. Günde (Adım 2.2- 1. Gün) gerçekleştirilecek farklı transdüksiyon koşullarının sayısı kadar çok kuyu tohumu ekin.
    2. Her kuyuya 4 μl anti-CD3 (saf fonksiyonel derece, nihai konsantrasyon: 0.2 μg/mL) ve 20 μl anti-CD28 (saf fonksiyonel derece, nihai konsantrasyon: 1 μg/mL) antikor ekleyerek T hücrelerini aktive eder. Nemlendirilmiş kuluçka içindeki kültür hücreleri 37 °C, %5CO2 olarak tutulur.
  2. Lentiviral vektörlerle T hücresi transdüksiyonu (1. Gün)
    1. Gece boyunca uyarıldıktan sonra, aktive T hücrelerini Trypan Blue hariç testi kullanarak hasat edilip sayarak canlılığı değerlendirin. G-24'ün her kuyu için 1 x 106 canlı aktive hücre hesaplayın (2 cm2 kuyu alanı), bu da 0,5 x 106 hücre/cm² tohumlama yoğunluğuna karşılık gelir. Hücreleri bir tüpte aktarın ve 300 x g hassasiyetinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. Her kuyu için transdüksiyon ortamını, lentiviral vektör preparatının konsantrasyonuna (TU/mL) göre uygun lentiviral vektör hacmini (burada, St. Jude Çocuk AraştırmaHastanesi 25'ten alınan CD19-CAR-BBζ lentivirüs) ile birleştirerek hazırlayın; 5 μl transdüksiyon artırıcı protamin sülfat (8 mg/mL stok çözeltisi, protamin sülfatın 1x PBS'de çözülmesiyle elde edilir ve 0,2 μm filtre ile steril şekilde filtrelenir; nihai konsantrasyon 50 μg/mL). Penisilin / streptomisin eklemeden %5 FBS takviyesi olan CM ortamı kullanarak nihai hacmi 0,8 mL/well (0,4 mL/cm²) elde edinin. Transdüksiyon (UTD) kontrolü için, lentiviral vektör ekleyerek tanımlanan transdüksiyon ortamını hazırlayın.
    3. Peletli hücreleri (adım 2.2.1) 0.8 mL/kuyu transdüksiyon ortamında yeniden askıya alın ve yeni bir G-24 kuyusuna kaplamak. Gece boyunca 37 °C, %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.
      NOT: Aynı lentiviral vektörle birden fazla kuyunun transdüksiyonu planlanıyorsa, virüs içeren transdüksiyon ortamı ve protamin sülfatı istenen konsantrasyonda master karışımı hazırlanın. Homojenliği sağlamak için iyice karıştırın. Sonra, her bir pelet hücre tüpüne 0,8 mL bu ana karışımı aliquot ekleyin ve tüm örneklerde tutarlı transdüksiyon koşulları sağlansın.
  3. CAR-T hücrelerinin kültürü ve genişlemesi (2. günden 9. güne kadar)
    1. 2. günde, kültür hacmini son hacmi 8 mL/kuyuya çıkarmak, 7,2 mL taze cCM-F ekleyerek ve insan Interleukin-7 (hIL-7) ile takviye edilen, her biri 10 ng/mL nihai konsantrasyonda (kuyu başına toplam 8 mL hacmi göz önünde bulundurularak hesaplanan sitokin hacmi).
    2. 5. günde, her kuyunun altındaki hücreleri rahatsız etmeden dikkatlice 6 mL koşullandırılmış ortamı alıp yerine 6 mL taze cCM-F ile hIL-7 ve hIL-15 takviyesi ile değiştirin (nihai konsantrasyon: 10 ng/mL toplam kuyu başına 8 mL hacim dikkate alınarak hesaplanmıştır). Birden fazla kuyu ile çalışıyorsanız, sitokinlerin eşit dağılımını sağlamak için hIL-7 ve hIL-15 sitokinleriyle desteklenen cCM-F ortamından oluşan master bir karışım hazırlayın.
    3. 9. günde, CAR-T hücreleri verimli şekilde genişletilir ve sonraki uygulamalara hazır hale gelir. CAR-T hücrelerini toplamak için, 5 mL koşullu ortamı nazikçe çıkarıp atabilirsiniz. 1000 μL pipet kullanarak, kalan 3 mL maddedeki CAR-T hücrelerini yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe alın. CAR-T hücrelerini sayın ve Trypan Blue hariç tutma testiyle canlılıklarını kontrol edin. Genellikle, her G-24 kuyusundan yaklaşık 3 x 107 CAR-T hücresi (3,24 ± 1,67 x 107 hücre) elde edilir (Ek Tablo 1).

3. G-24 kültür kaplarında CIK genişlemesi

  1. PBMC'lerin aktivasyonu (0. Gün)
    1. Tohum 1 x 10 6 taze izole edilmiş PBMC, her bir G-24 kültür kabı için 0,5 x 106/cm² yoğunluğuna karşılık gelir; 8 mL cCM ve rekombinant insan Interferon-γ (rhIFN-γ, nihai konsantrasyon: 1000 IU/mL) ile desteklenmiştir. Hücreleri 37 °C, %5CO2 sıcaklıkta kuluçka edin.
  2. CIK hücre uyarısı ve genişlemesi (1. günden 14. güne kadar)
    1. 1. günde, rhIFNγ uyarısından 22-24 saat sonra, her kuyuya doğrudan 4 μL anti-CD3 antikor (nihai konsantrasyon: 50 ng/mL) ve 4 μL rekombinant insan Interleukin-2 (rhIL-2, nihai konsantrasyon: 500 IU/mL) eklenin. Hücreleri 37 °C, %5CO2 sıcaklıkta kuluçka edin.
    2. Her 3-4 günde bir (hücre kültürünün 5., 9. ve 12. günlerinde), 6 mL koşullu ortamı taze cCM ve rhIL-2 (nihai konsantrasyon: 500 IU/mL) ile değiştirin; böylece rhIL-2'nin nihai konsantrasyonu tam 8 mL hacmine göre hesaplanmaktadır.
    3. 14. günde, 5 mL koşullu ortam atılarak ve kalan 3 mL koşullu ortamda tekrar süzülerek CIK hücreleri alın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve Trypan Blue dışlama testi kullanılarak toplam hücre sayısı ile hücre canlılığını değerlendirin. Genellikle, her kuyudan yaklaşık 8 x 107 toplu CIK hücresi (8.6 ± 4.58 x 107 hücre) elde edilir (Ek Tablo 2).
      NOT: Ortam değişimleri sırasında, hücre tabakası popülasyonunu rahatsız etmemeye veya gaz geçirimli membrana temas etmemeye dikkat ederek süpernatantı dikkatlice aspire edin. Zarın hasarı gaz değişimini bozabilir ve hücre yaşamını olumsuz etkileyebilir.

4. Büyük ölçekli CAR-T ve CIK hücrelerinin üretimi

NOT: 2. ve 3. Bölümlerde açıklanan CAR-T ve CIK hücre genişletme protokolleri, daha büyük G-Rex kültür cihazlarına kolayca ölçeklendirilebilir, özellikle G-6M formatı. G-24 formatından (yüzey alanı: 2cm 2) G-6M cihazına (yüzey alanı: 10 cm2) geçiş yapılırken, tüm yoğunluklar ve yoğunluklar sabit tutulurken, tüm hacimler ve mutlak büyüklükler artan yüzey alanına uyacak şekilde orantılı olarak 5 kat artırılmıştır. Bu, hücre tohumlama yoğunluğu, ortam takviye konsantrasyonları ve sitokin konsantrasyonlarının değişmediği, ancak toplam ortam hacmleri, tohumlanan hücre sayısı ve eklenen mutlak sitokin miktarlarının orantılı olarak ölçeklendirileceği anlamına gelir. Bu ölçeklenebilirlik özelliği, küçük ölçekli araştırma protokollerinden preklinik veya erken klinik üretime önemli protokol değişiklikleri gerektirmeden sorunsuz bir geçişi sağlar ve böylece tutarlı efektör hücre özelliklerini korur.

  1. G-6M formatlı cihazlarda CAR-T hücrelerinin genişlemesi
    1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi, 0. Günde PBMC'lerin aktivasyonunu ve 1. Günde lentiviral transdüksiyonunu gerçekleştirin; tüm konsantrasyon ve yoğunlukları korurken, hacimleri ve mutlak miktarları 5 kat artırın.
    2. 2. günde, cCM-F ortamı kullanılarak kültür hacmini toplamda 100 mL'ye çıkarın. HIL-7 ve hIL-15'i hesaplayıp ekleyerek nihai konsantrasyon olan 10 ng/mL elde edin.
      NOT: G-24 formatının aksine, G-6M cihazının daha yüksek tasarımı daha büyük orta hacim sağlar ve kültür dönemi boyunca sürekli besin ve sitokin tedarikini sağlar ve ortam değişimine gerek kalmaz ("Doldur ve Unut" yaklaşımı). Bu nedenle, 5. gün ek sitokinlere ihtiyaç yoktur.
    3. 9. günde CAR-T hücreleri toplamak için, her kuyidan yaklaşık 90 mL ortamı serolojik pipet kullanarak atın ve kalan 10 mL'deki hücreleri tekrar süzülür. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve sonraki testler için kullanın.
  2. G-6M formatındaki cihazlarda CIK hücrelerinin genişlemesi
    1. PBMC'lerin tohumlanmasını Bölüm 3'te açıklanan protokole uygun olarak 0. Günde gerçekleştirin ve tüm hacimleri ve reaktifleri daha büyük cihaz formatına (G-6M) uyacak şekilde 5 kat faktör ölçeklendirin.
    2. 1. günde, cCM ortamı ile kültür hacmini toplamda 100 mL'ye ayarlayın. Her kuyuya son konsantrasyon olarak 500 IU/mL rhIL-2 ve 50 ng/mL anti-CD3 ekleyin.
    3. Her kuyuya (5, 9 ve 13. günlerde) her 3-4 günde 500 IU/mL rhIL-2 ekleyin, orta değişiklik olmadan.
    4. 14. günde, her kuyidan yaklaşık 90 mL ortam serolojik pipetle çıkararak CIK hücreleri alın. Kalan 10 mL'deki hücreleri yeniden askıya alın, 15 mL'lik bir tüpe alın ve sonraki testler için kullanın.

5. Akış sitometrisiyle efektör hücre fenotipi karakterizasyonu

NOT: Genişletme protokolünün sonunda, CAR-T ve CIK hücrelerinde akış sitometrisiyle yüzey işaretleyici analizi yapılır ve fenotipleri değerlendirilir; farklı farklılaşma durumları da dahil edilir; örneğin, Naif (CD45RA+CD62L+), Merkezi Bellek (CM, CD45RA-CD62L+), Efektör Bellek (EM, CD45RA-CD62L-) ve Efektör Bellek CD45RA-pozitif (EMRA, CD45RA+CD62L-; Ek Şekil 1A-B).

  1. Her boyama tüpü için 3 x 105 hücre toplayın. Hücreleri 1x PBS'de %1 FBS (PBS-F) ile yıkayın, 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve hücre pelletini boyanma tamponunda hazırlanmış 50 μL antikor karışımı çözeltisine (1 parça Parlak leke tamponu ve 1 parça PBS-F) istenen boyama paneline göre yeniden askıya alın (Tablo 1 ve Tablo 2).
  2. Hücreleri ışıktan korunan 4 °C'de 20 dakika kuluçka edin, ardından lekeli hücreleri ve santrifüjü yıkayın. İkinci bir boyama adımı gerekirse, daha önce tarif edildiği gibi belirli antikor karışımıyla boyama işlemi yapılabilir (adım 5.1).
  3. Son olarak, hücreleri yıkayın ve 50 μL 1x PBS içinde 1 °C'de 15 dakika kuluçka içinde kullanılabililik boyası olan Fixable Viability Boyası 780 (FVS780) ile boya yapın; ışıktan korunarak 4 °C'de 15 dakika kuluçka içinde kullanabilirsiniz. Canlı boyama yapıldıktan sonra yıkama adımı gerekmez. İnkubasyondan sonra, her numuneye 200 μL 1x PBS ekleyin ve akış sitometrik alımı işlemi devam eder. Ayrıntılı kapı stratejisi, Ek Şekil 1A-B'de gösterilmiştir.
HedefKlonFlorokromKonsantrasyon/SulandırmaAmaç
İlk boyama adımırhCD19-His//2 μg/mLCAR molekül tespiti
4 °C'de 20 dakika kuluçka
Yıkama adımı
İkinci boyama aşamasıOnunGG11-8F3.5.1PE1/50CAR molekül tespiti
CD3UCHT1BV5101/40Soy
CD4SK3BV6501/40Soy
CD8RPA-T8BV4211/20Soy
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Olgunlaşma
CD62LDREG-56FITC1/10Homing, aktivasyon
4 °C'de 20 dakika kuluçka
Yıkama adımı
Üçüncü boyama aşamasıFVS780//1/5000Canlı/Ölü hücre ayrımcılığı
4 °C'de 15 dakika kuluçka

Tablo 1: CAR-T hücrelerinin boyama için kullanılan antikor paneli. CAR ekspresyonu, T hücresi fenotipi ve farklılaşma durumunu değerlendirmek için kullanılan boyama paneli. İlgi duyulan her hedef için antikor klon, konsantrasyon ve konjuge florokrom rapor edilmiştir.

HedefKlonFlorokromSeyreltmeAmaç
İlk boyama adımıCD56HCD56PE1/40Soy
NKG2D1D11APC1/83Etkinleştirme
CD3UCHT1BV5101/40Soy
CD4SK3BV6501/40Soy
CD8RPA-T8BV4211/20Soy
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Olgunlaşma
CD62LDREG-56FITC1/10Homing, aktivasyon
4 °C'de 20 dakika kuluçka
Yıkama adımı
İkinci boyama aşamasıFVS780//1/5000Canlı/Ölü hücre ayrımcılığı
4 °C'de 15 dakika kuluçka

Tablo 2: CIK hücrelerinin boyama için kullanılan antikor paneli. CIK alt popülasyonlarını, fenotipini ve farklılaşma durumunu değerlendirmek için kullanılan boyama paneli. İlgi duyulan her hedef için antikor klon, konsantrasyon ve konjuge florokrom rapor edilmiştir.

6. CAR-T ve CIK hücrelerinin özgül sitotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi

NOT: CAR-T ve CIK hücrelerinin sitotoksik aktivitesi, hedef hücrelerle istenen efektör-hedef (E:T) hücre oranında birlikte kültürlenerek ölçülür. Test türü, hedef hücre türüne, katı tümörlerden veya hematolojik malignitelerden mı türetilmiş olmalarına bağlıdır. Bu protokolde, süspansiyon hücreleri için floresan hücre boyası bazlı akış sitometrisi testi ve yapışkan hücreler için empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi (RTCA) testini tanımlıyoruz.

  1. Floresan hücre boyası tabanlı akış sitometrisi testi
    NOT: Hematolojik malignitelere karşı antijen-spesifik sitotoksisite, floresan hücre boyası bazlı akış sitometrisi testi kullanılarak değerlendirilebilir. Ortak kültürden önce, hedef hücreler tanımlanması için floresan bir boya ile etiketlenir. Efektör hücrelerle birlikte kültür yapıldıktan sonra, hedef hücre ölümü canlılık boyası ile boyanarak değerlendirilir. Akış sitometrik analizi, antijen-spesifik öldürmenin nicelleştirilmesine olanak tanır; bu oran canlı olmayan floresan boya pozitif hücrelerin oranına dayanır.
    1. Her ortak kültür koşulu için 2 x 105 hedef hücre toplan ve bunları 400 μL tam kültür ortamında yeniden süzülerek 5 x 105 hücre/mL nihai konsantrasyon elde edilir. Floresan boya 5 μM nihai konsantrasyonda ekleyin (burada Cell Trace Violet boyası, CTV). 37 °C'de 30 dakika boyunca işık karşısında kuluçka yapın. İnkubasyon sonrası hücreleri tam ortamla bir kez yıkayın ve peleti son konsantrasyonda 4 x 105 hücre/mL olarak yeniden süzülür.
    2. Boyalı hedef hücre süspansiyonundan 500 μL (burada CD19+ askı hedef hücre modeli olarak 2 x 105 Raji hücresi) deneysel kuruluma göre temiz 5 mL tüplere dağıtılır. Akış sitometrisiyle başarılı boyama ile boyanmayı onaylayın; hedef hücreleri floresan boyaya pozitif hücreler olarak tanımlayın (SSC-A ile CTV). Floresan boya pozitif hücrelerin yaklaşık %98'i önerilir.
    3. Paralel olarak, her bir ko-kültür durumu için efektör hücreleri (burada 5 x 106 CD19 CAR-T hücresi) sayın ve hazırlanın. Hücreleri yıkayın ve istenen efektör-hedef (E:T) oranına uygun konsantrasyonda tam kültür ortamında yeniden süzülür. Her hedef hücre içeren tüplere 500 μL efektör hücre süspansiyonu ekleyin.
      1. 25:1 E:T oranı elde etmek için, her tüpte 2 x 105 Raji hedef hücresine 5 x 106 efektör CD19 CAR-T hücresi ekleyin ve deneysel tasarıma göre gerekli sayıda tüp hazırlanır.
    4. Ortak kültürleri %5CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C'de 6 saat kuluçka edin. Kendiliğinden hücre ölümünü ölçmek için yalnızca hedef hücreleri içeren bir kontrol durumu ekleyin. Bu kontrol, arka plan ölümünü efektör hücre spesifik sitotoksisiteden ayırt etmek için önemlidir.
    5. Birlikte kültürlenen hücreleri yıkayın ve 1x PBS ile seyreltilmiş FVS780 canlılık boyası ile boyanın (son seyreltme 1:5000). 4 °C'de ışıktan korunarak 15 dakika kuluçka yapın. Hücreleri yıkayın ve son hücre pelletini 600 μL PBS-F tamponunda yeniden askıya alın. Efektör hücre spesifik sitotoksisitesini değerlendirmek için akış sitometrisi edinimine devam edin.
      1. Akış sitometresi kapı stratejisini şu şekilde uygulayın: hedef hücreleri floresan boyaya pozitif hücreler olarak belirleyin (SSC-A ile CTV) ve ardından bu popülasyon içinde ölü hedef hücrelerin yüzdesini hesaplayın (SSC-A ile FVS780, Ek Şekil 1C). Efektör hücre-spesifik sitotoksisiteden (%FVS780+ CTV+ içinde, efektör-hedef ko-kültür durumunda) spontan hedef hücre ölümünü (%FVS780+ içinde CTV+ içinde) çıkararak Spesifik Lizisi hesaplayın.
  2. Gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) testi
    NOT: RTCA testi, efektör hücrelerin yapışkan hedef hücrelere karşı sitotoksik aktivitesinideğerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir 26. Hedef hücre ölümü, xCELLigence cihazına bağlanmış E-plaka hücrelerinin ayrılması nedeniyle empedans sinyalindeki bir fark olarak tespit edilir. Optimum test performansı ve tekrarlanabilirliği sağlamak için üreticinin önerdiği protokole uygun olarak RTCA testini gerçekleştirin.
    1. Altkültür hücreleri, testten bir gün önce (Gün -1) hedef alır ve 0. Güne kadar %60-80 birleşime ulaşmasını sağlar. Bu adım, deneyin başında hücrelerin aktif proliferasyonda kalmasını sağlamak için kritiktir. Optimal hücre performansı sağlamak için 5-20 geçişler arasında hedef hücrelerin kullanılması tercih edilir; en az 1 hafta (3-4 geçiş) sonrası çözülme süresi beklenmektedir.
    2. 0. Günde, E-Plakanın her kuyusuna dikkatlice 50 μL kültür ortamı ekleyin, plakayı cihazın içine dahil edin ve arka plan sinyalini alın. Sonra, hücre tohumlama aşaması için plakayı tekrar kapüşe aktarın.
    3. Hedef hücreleri sayın ve gerekli toplam sayı temiz bir tüpe aktarın. Hücreleri uygun bir kültür ortamında yeniden askıya alın, böylece E-Plaka'ya tohumlama için istenen konsantrasyonu elde edin ve her kuyuya 100 μL hedef hücre aktarın (burada yapışkan tümör hücre hattı modeli olarak MCF-7 hücrelerinden 4 x 104 tane). Hedef hücrelerin eşit şekilde tutulması için plakayı kaputun içinde en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun. Cihazın içindeki plakayı 37 °C'de birCO2 kuluçka makinesine bağlayın ve gerçek zamanlı alımı başlatın (22 saat için 15 dakika alım aralı).
      NOT: Üreticinin önerdiği gibi yeni bir hedef hücre hattı kullanmadan önce hedef hücre titrasyonu yapın.
    4. 1. günde (hedef hücre tohumlanmasından yaklaşık 20-22 saat sonra), efektör hücreleri sayın ve onları taze kültür ortamında yeniden askıya alın, hücre konsantrasyonunu istenen efektör-hedef (E:T) oranına ulaşmak için ayarlayın. Örneğin, 10:1 E:T oranı elde etmek için, her kuyu için 4 x 104 MCF-7 hedef hücresine 4 x 105 efektör CIK hücresi ekleyin.
    5. Her işlem koşulunu steril 96 kuyuyla U-bottom plakası kullanarak teknik kopyalar halinde hazırlayın ve 37°C'de 15 dakika boyunca dengelendirin. Her koşul için çok kanallı pipet kullanarak efektör hücre süspansiyonundan 50 μL dağıtın. E-Plakayı tekrar enstrümana yerleştirin ve gerçek zamanlı alımı devam edin (15 dakika, 24 saat alınım arası). Aşağıdaki denklemi kullanarak Spesifik Lizisi hesaplayın:
      Denklem 1

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol, izole edilmiş PBMC'lerden, yani CAR-T ve CIK hücrelerinden elde edilen efektör hücrelerin ex vivo genişlemesi ve mühendisliği için verimli ve sağlam bir iş akışı sağlar. Bu yöntem, minimum hücre manipülasyonu gerektirir ve G-Rex cihazlarının gaz değişim kapasitesinden faydalanır; böylece geleneksel statik kültür sistemlerine kıyasla üstün besin bulunabilirliği ve oksijenasyon sağlar23,24. Bu protokolün temel avantajlarından biri, preklinik çalışmalar için uygun olan küçük ölçekli 24 kuyuklu cihazlardan (G-24) daha büyük 6M cihazlara (G-6M) kadar (translasyonel veya klinik üretim ihtiyaçlarıyla uyumlu) ölçü orantılı ölçeklendirme dışında protokol değişikliği gerektirmeden doğal ölçeklenebilirliğidir.

Bu protokol kullanılarak, hem CAR-T hem de CIK hücreleri, 2-4. Bölümlerde açıklandığı gibi, sağlıklı donör PBMC'lerden G-24 ve G-6M formatlarında paralel olarak başarıyla genişletilmiştir. Kültür döneminin sonunda, her iki hücre tipi de yüksek katlanma genişlemesi ve canlılık sergilemiş, iki cihaz formatı arasında benzer bir çoğalma gösterilmiş (Şekil 2, Ek Tablo 1, Ek Tablo 2), bu da protokolün farklı kültür ölçeklerinde tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır.

Kültür cihazlarının ölçeklenebilirliğini doğrulamak için, efektör hücreler fenotipik ve fonksiyonel olarak daha fazla karakterize edildi. CD19 CAR-T hücreleri için CAR ifadesini niceleştirdik ve CD4+ ile CD8+ alt kümelerini değerlendirdik; CD19 CAR+ CD8+ T hücrelerinin baskınlığını not ettik (Şekil 3A-B, Ek Tablo 1). CIK hücreleri için, T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) ve CIK (CD3+CD56+) popülasyonlarının (Şekil 3D) sıklığını ve aktive edici reseptör NKG2D'nin ifadesini değerlendirdik (Şekil 3E, Ek Tablo 2). Ayrıca, hem CAR-T hem de CIK hücreleri için G-24 ve G-6M kültür formatları arasında genel olarak karşılaştırılabilir fenotipler ve spesifik popülasyon belirteçlerinin ifadesini gözlemledik. CD19 CAR-T ve CIK hücre ürünlerinin farklılaşma durumu, CD62L ve CD45RA boyama ile analiz edildi (Şekil 3C-F, Ek Tablo 1, Ek Tablo 2), G-24 ve G-6M formatlarında kültürlenen hücreler arasında benzer hafıza ve efektör fenotipleri ortaya çıktı. Bu bulgular, sürecin ölçeklendirilmesinin genişletilmiş efektör hücre popülasyonlarının fenotipik bütünlüğünü veya farklılaşma durumunu bozmadığını göstermektedir.

Son olarak, fonksiyonel potensisi değerlendirmek için hedefe özgü sitotoksisite testleri kullandık. Her iki cihazda da genişleyen CD19 CAR-T ve CIK hücreleri güçlü sitolitik aktivite sergilemiş ve ölçek genelinde fonksiyonel özelliklerin korunduğunu doğrulamıştır (Şekil 4). Genel olarak, bu sonuçlar genişletilmiş ürünlerin preklinik modellerde ve potansiyel olarak klinik testlerde sonraki uygulamalara uygunluğunu desteklemektedir.

Şekil 2
Şekil 2: CD19 CAR-T ve CIK hücrelerinin çoğalması ve canlılığı. G-24 ve G-6M plakalarındaki PBMC'lerden genişletilen CAR-T hücreleri (n = 5) ve CIK hücreleri (n = 6), genişlemenin 9. ve 14. gününde sırasıyla toplanarak, hücre sayısı ve (A-C) kat artışı ile (B-D) yüzdesinin değerlendirilmesi için canlanabilir hücreler yapıldı. Histogramlar ortalama ifadeyi ± standart sapmayı (SD) temsil eder, noktalar ise tek bağışçıları gösterir (bireysel değerler için Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'ye bakınız). Veriler, iki kuyruklu çoklu çift t-testi (A-C) veya birden fazla iki kuyruklu Wilcoxon eşleştirilmiş çift sıralama testi (B-D) ile analiz edildi; çoklu karşılaştırmalar için Holm-Sidak düzeltmesi yapıldı (*p < 0,05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: G-24 ve G-6M cihazlarında genişletilen CD19 CAR-T ve CIK hücrelerinin fenotipinin değerlendirilmesi. CD19 CAR-T hücrelerindeki CAR moleküllerinin ifadesi (n = 5) akış sitometrisiyle analiz edilerek (A) G-24 ve G-6M genleşme protokollerindeki transdüksiyon verimliliği ile CD3+CAR+ alt kümesindeki (B) CD4+/CD8+ ve (C) naif/hafıza alt popülasyonlarının ekspresyonunu değerlendirdi. Toplu CIK hücrelerinin fenotipi (n = 6) akış sitometrisiyle analiz edilerek (D) CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) ve T (CD3+CD56-) yüzdesi, ayrıca (E) NKG2D ve (F) naiv/hafıza alt popülasyonu CD3+CD56+ alt kümesinde (G-24 n=5, G-6M n=6) incelendi. Naif (CD45RA+CD62L+), Merkezi Bellek (CM, CD45RA-CD62L+), Efektör Bellek (EM, CD45RA-CD62L-) ve Efektör Bellek CD45RA-pozitif (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramlar SD ± ortalama ifadesini temsil ederken, noktalar tek bağışçıları gösterir (bireysel değerler için Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'ye bakınız). Veriler, iki kuyruklu çoklu çift t-testi (B-C-D-F) veya iki kuyruklu Wilcoxon eşleştirilmiş rütbe testi (A-E) ile analiz edildi; çoklu karşılaştırmalar için Holm-Sidak düzeltmesi yapıldı (*p < 0.05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: CD19 CAR-T ve CIK hücre sitotoksisitesinin değerlendirilmesi. (A) CD19 CAR-T hücrelerinin (turuncu, n = 5) veya transdüksiyon edilmemiş (UTD) hücrelerinin (gri, n = 5) Burkitt lenfoma Raji hücre hattına karşı spesifik lizisi (süspansiyon hücre hattı modeli olarak) 6 saat akış sitometrisine dayalı öldürme testi ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, SD ± ortalama spesifik lizis olarak gösterilmiştir. (B) Meme kanseri MCF-7 hücre hattı (yapışkan hücre hattı modeli olarak) karşı G-24 (açık mavi, n = 7) veya G-6M (koyu mavi, n=6) içinde kültürlenen CIK hücrelerinin sitotoksisitesi (yapışkan hücre hattı modeli olarak) her 15 dakikada bir 24 saat boyunca gerçek zamanlı hücre analizörü kullanılarak izlenmiştir. Sonuçlar, SEM ± ortalama spesifik liz olarak gösterilmiştir. Veriler, Mann-Whitney testi, Holm-Sidak düzeltmesi ile çoklu karşılaştırmalar için analiz edilmiştir (*p < 0.05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Akış sitometrisi analizleri için kullanılan geçiş stratejisi. (A) CAR-T hücresi ve (B) CIK hücre fenotipik karakterizasyonu ile (C) floresan hücre boyası bazlı sitotoksisite testi için kapı stratejilerini gösteren temsilci grafikler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Bireysel bağışçılardan alınan CD19 CAR-T hücre kültürlerinin büyümesi, yaşamlılığı ve fenotipi. Her donör için G-24 ve G-6M cihazlarında kültürün 9. gününde alınan CD19-CAR T hücrelerinin toplam hücre sayısı, katlama artışı, canlılığı ve fenotipik karakterizasyonu gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Bireysel bağışçılardan alınan CIK hücre kültürlerinin büyümesi, canlılığı ve fenotipi. Her donör için G-24 ve G-6M cihazlarında kültürün 14. gününde elde edilen CIK hücrelerinin toplam hücre sayısı, katlanma artışı, canlılığı ve fenotipik karakterizasyonu gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, G-Rex kültür sistemleri kullanan PBMC'lerden iki farklı ACT ürününün, yani CAR-T ve CIK hücrelerinin üretilmesi için verimli ve ölçeklenebilir bir platformun uygulanmasını öngörüyor. Yaklaşımın ölçeklenebilirliğini doğrulamak için kavram kanıtı fonksiyonel ve fenotipik testler uyguladık. Ölçeklendirme sırasında hem fenotipin hem de genişlemiş hücrelerin aktivitesinin korunduğunu gösterdik; bu da sistemin araştırma uygulamaları ve doğrudan klinik çeviri için uygunluğunu garanti eder. Gerçekten de, hem CAR-T hem de CIK hücrelerinin yüksek hücre verimiyle verimli şekilde genişletilebildiğini, fonksiyonel efektör fenotipi ve farklı kültür cihazlarında güçlü antijen-spesifik sitotoksisiteyi koruyabileceğini başarıyla gösterdik.

Kültür cihazlarının gaz geçirimli membran teknolojisiyle birleştiğinde, bu genleşme protokolü daha hızlı genleşme kinetiği sağlar, manuel kullanımı azaltır ve bağışçılar arasında tutarlı yüksek verimler sağlar. Bu özellikler, protokolü standart kültür sistemlerine kıyasla oldukça tekrarlanabilir ve daha az emek gerektirenstandartlara (20,21) kıyasla; bu sistemler genellikle çoklu medya değişimleri ve hücre kaybı ile kontaminasyon riskini artırır.

Ayrıca, bu protokol üretim ölçekleri arasında kesintisiz geçişi mümkün kılar: küçük ölçekli açık sistemlerden (G-24, örneğin CAR yapıları, sitokin kombinasyonları veya bağışçı değişkenliği için preklinik araştırma ve tarama için uygun) daha büyük ölçekli açık sistemlere (GMP öncesi doğrulama için G-6M) ve nihayetinde daha büyük ölçekli kapalı sistemlere (GMP üretimi için). Bu çalışmada açıklandığı gibi, küçük ölçekli açık sistemlerden daha büyük ölçekli açık sistemlere geçiş, yalnızca hacim ve hücre girdisinin cihaz boyutuna göre orantılı ayarlamaları gerektirir ve bu da önemli bir pratik avantaj oluşturur. Benzer şekilde, GMP üretiminde açık sistemlerden kapalı sistemlere geçiş ve böylece G-6M protokolünü büyük ölçekli GMP üretimine uyarlamak için gereken tek uygulama, uygun GMP sınıfı reaktifler ve kapalı sistem cihazlarının (10 cm2 yüzey alanına sahip G-10M-CS, tek bir G-6M kuyusuna karşılık gelir, veya 100 cm² yüzey alanına sahip G-100M-CS) kullanmaktır. G-100M açık karşıtlığına karşılık gelir) protokolün kendisinde başka bir değişiklik yapılmadan gerçekleşir. Bu kapalı cihazlar, otomatik ortam işleme için steril boru bağlantılarının entegre edilmesinde açık muadillerinden farklıdır; bu bağlantılar, sıvı işleme pompası (GatheRex) ile birlikte çalışarak tamamen kapalı bir ortam oluşturur. Bu kapalı sistem yaklaşımı, manuel medya değişimini ortadan kaldırır ve kirlenme risklerini azaltır; bu da sterillik ve tekrarlanabilirliğin çok önemli olduğu GMP uyumlu üretim ortamları için ideal bir konuma sahiptir. Özellikle, ölçeklenebilirlik, özellikle sınırlı kaynaklara sahip akademik veya erken biyoteknoloji ortamlarında, erken aşama keşif ile klinik çeviri arasındaki boşluğu kapatmak için kritik bir özelliktir.

Bu protokolün tam GMP uyumuna yönelik daha fazla uygulanmasında, FBS içeren ortamlardan serumsuz/kseno-içermeyen formülasyonlara geçişi göz önünde bulundurulmalı; bu, FDA ve EMA'nın mevcut düzenleyici eğilimleriyle uyumlu olarak, partiden partiye değişkenliği ortadan kaldırmak, potansiyel ksenojenik kontaminasyon risklerini ortadan kaldırmak ve düzenleyici uyumu artırmakiçin 27.

Ayrıca, önerilen genişletme sisteminin gerektiren minimum müdahalesi, üretim prosedürleri sırasında fenotipik analizi karıştırabilecek prosedür kaynaklı artefaktları azaltarak çok boyutlu fenotipikprofilleme 28 uygulamak için ideal bir platform sağlar. Ayrıca, CAR-T ve CIK hücrelerinin ötesinde, sistem diğer lenfosit popülasyonlarına ve mühendislik edilmiş bağışıklık hücrelerine son derece uyarlanabilir ve immünoterapi geliştirmede faydasınıgenişletebilir 29,30.

Protokol sağlam ve değişiklik gerektirmemesine rağmen, birkaç adım başarı için özellikle kritiktir. CIK hücrelerinin genleşmesi için, sitokin ekleme zamanlaması, optimal farklılaşma ve genleşmeyi sağlamak için gereklidir. CAR-T hücreleri için, verimliliği en üst düzeye çıkarmak için transdüksiyon aktivasyondan 24 saat sonra gerçekleşmelidir ve lentiviral aliquotlar yalnızca bir kez çözülmelidir; çünkü tekrarlayan donma-çözülme döngüleri transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüdeazaltır 31.

Birincil hücre preparatları arasındaki biyolojik değişkenlik, doğal olarak genişleme hızları ve fonksiyonel aktivitedeki farklılıklara katkıda bulunur ve bu da bağışçıların çeşitliliğini yansıtır. Bu kaçınılmaz ve içsel değişkenlik, birden fazla bağışçıdan paralel genişlemeler yapılarak etkili bir şekilde yönetilebilir ve deneyler arasında sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlanır.

Sonuç olarak, bu protokol fonksiyonel efektör lenfositlerin doğrudan PBMC'lerden hızlı, ölçeklenebilir ve güvenilir şekilde yayılmasını sağlar ve hem erken aşama araştırmaları hem de büyük ölçekli klinik çeviri için esneklik sunar. Bu sistem, çeşitli hücre tiplerine ve genetik modifikasyonlara kolayca uyarlanabilir ve immünoterapi gelişimi için çok yönlü bir platform sağlar.

Teşekkürler

CAR yapısı, MTA kapsamında St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma, ScaleReady G-Rex Grant 2025 tarafından desteklendi; Padova Üniversitesi - SOMMAGGIO_BIRD24_01; AIRC Vakfı 5x1000 kapsamında 2019 - ID 22759 programı; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Bu araştırma, yayın maliyetlerini karşılamak için İtalyan Sağlık Bakanlığı'ndan "Ricerca Corrente" fonu aldı. Figürler GraphPad Prism 9 Software ve BioRender.com ile oluşturuldu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Parlak Leke TamponuBD Biosciences566349
CD28 Antikor, insan karşıtıMiltenyi Biotech130-093-375Klon 15E8
CD3 Antikor, anti-insanMiltenyi Biotech130-093-387OKT3 Klonu
CD3 BV510BD Biosciences740147Klon UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Biolegend320808Klon 1D11
CD4 BV650BD Biosciences563875Klon SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD Biosciences563429Clone HI100
CD56 PEBiolegend318306HCD56 Klonu
CD62L FITCBD Biosciences555543Klon FREG-56
CD8 BV450BD Biosciences562428Klon RPA-T8
CellTrace Mor Hücre Çoğalma KitiThermoFisher bilimselC34557
Dimetil sülfoksit (DMSO)ThermoFisher bilimselD2650
Dulbecco′ s Fosfat tamponlu tuzlu (D-PBS)Sigma AldrichD5652
E-plaka 16Çevik5469813001
Fetal Sığır Serumu (FBS), DeğerThermoFisher ScientificA5256701
Düzeltilebilir Yaşam Boyası 780 (FVS780)BD Biosciences565388
G-Rex 24 Kuyu Plakası Wilson Wolf80192M
G-Rex 6M Kuyu Plakası Wilson Wolf80660M
HEPES Tampon ÇözümüLonzaECM0180D
Onun AntikoruMiltenyi Biotech130-120-718
İnsan Albümini %20CSL Behring
İnsan IL-15 Rekombinant ProteiniPeproTech200-15
İnsan IL-7 Rekombinant ProteiniPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD Biosciences
LenforepSTEMCELL Teknolojileri18060
MCF-7ATCCHTB-22Meme kanseri hücre hattı 
Penisilin ve StreptomisinLonzaECB3001D
Fizyolojik çözelti (%0,9 Sodyum klorür)Monico
Protamin SülfatSigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Burkitt lenfoma hücre hattı 
Rekombinant İnsan IFN-gammasıR& D Sistemleri285-IF-100/CF
Rekombinant IL-2 (Proleukin)Novartis
rhCD19-HisInvitrogenA42607
Roswell Park Anı Enstitüsü 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
Stabil L-GlutaminLonzaECB3004D
Tripan-Mavi çözeltisiSigma AldrichT8154
xCELLigence Gerçek Zamanlı Hücre AnaliziÇevik
X-VIVO 15 Serumsuz hematopoietik hücre ortamıLonza02-053Q

Kaynaklar

  1. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  2. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  3. Cappuzzello, E., et al. How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits. Front Immunol. 14, 1229540(2023).
  4. Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. 30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective. J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).
  5. Bayatipoor, H., et al. Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed. Med Oncol. 40, 29(2022).
  6. Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. Cancer immunotherapy by γδ T cells. Science. 386, 6717(2024).
  7. Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option. J Immunother Cancer. 6, 102(2018).
  8. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  9. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).
  10. Zhang, J., Wang, L. The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review. Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).
  11. Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  12. Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells. Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).
  13. Palmerini, P., et al. A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks. Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).
  14. Pietà, A. D., et al. Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells. J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).
  15. Pievani, A., et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity. Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).
  16. Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies. OncoImmunology. 5, e1199311(2016).
  17. Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells. Front Immunol. 15, 1459175(2024).
  18. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).
  19. Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).
  20. Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy. J Biol Eng. 15, 13(2021).
  21. Smith, T. A. CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25. Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).
  22. Ludwig, J., Hirschel, M. Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform. Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).
  23. Vera, J. F., et al. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J Immunother. 33, 305-315 (2010).
  24. Bajgain, P., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).
  25. Talleur, A. C., et al. Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy. Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).
  26. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system. J Vis Exp. (66), e3683(2012).
  27. Eberhardt, F., et al. Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells. Int J Mol Med. 52, 58(2023).
  28. Cadiñanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).
  29. Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor. Front Immunol. 15, 1412378(2024).
  30. Noldner, P. K., et al. Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing. Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).
  31. Bandeira, V., et al. Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks. Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CAR T H creleriAdoptif H cre TedavisiG Rex CihazlarPeriferik Kan Monon kleer H creleriLentiviral Transd ksiyonAk SitometrisiH cre Geni letme Protokolnterl kin 2 Stim lasyonuTrypan Blue Analizi
GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.